DD236346A1 - Verfahren zur enzymatischen abspaltung von thiolschutzgruppen - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen abspaltung von thiolschutzgruppen Download PDF

Info

Publication number
DD236346A1
DD236346A1 DD27538785A DD27538785A DD236346A1 DD 236346 A1 DD236346 A1 DD 236346A1 DD 27538785 A DD27538785 A DD 27538785A DD 27538785 A DD27538785 A DD 27538785A DD 236346 A1 DD236346 A1 DD 236346A1
Authority
DD
German Democratic Republic
Prior art keywords
thiol
groups
enzymes
protecting groups
items
Prior art date
Application number
DD27538785A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Hermann
Georg Greiner
Original Assignee
Univ Halle Wittenberg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Halle Wittenberg filed Critical Univ Halle Wittenberg
Priority to DD27538785A priority Critical patent/DD236346A1/de
Publication of DD236346A1 publication Critical patent/DD236346A1/de

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die enzymatische Abspaltung von Thiol-Schutzgruppen bei Aminosaeure- und Peptidderivaten im Rahmen der Peptidsynthese. Das Verfahren dient der Gewinnung von Peptidderivaten, die Thiol-Komponenten enthalten, bei hoher Reinheit der Produkte, hoher Ausbeute und schonenden Reaktionsbedingungen. Die Erfindung beinhaltet die enzymatische Abspaltung von S-Phenacetamidomethyl- oder S-Phenoxyacetamidomethyl-Gruppen in einem Zwei-Stufen-Prozess, wobei Enzyme vom Typ der Penicillinamidohydrolasen zum Einsatz kommen. Die Enzympraeparate koennen auch in immobilisierter Form angewendet werden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren der Peptidsynthese und ihrer Randgebiete, soweit die Aminosäure Cystein bzw. ihre Homologen (wie z. B. Homocystein), die entsprechenden Desaminoderivate oder Decarboxyverbindungen Verwendung finden.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Zur Verwendung thiolgruppen-haltiger Verbindungen bei der Peptidsynthese ist es notwendig, die SH-Funktion temporär zu schützen. In der Fachliteratur sind dazu etwa 100 Schutzgruppen beschrieben (Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 1-15, The Royal Society of Chemistry, London 1968-1984; E. Wünsch [Ed.]: Synthese von Peptiden, Houben-Weyl Vol. 15/1 und 15/2,
G. Thieme Verlag, Stuttgart 1974). Allgemein ist bekannt, daß die Abspaltung von Thiolschutzgruppen drastische Bedingungen erfordert (z. B. Natrium in flüssigem Ammoniak, flüssiger Fluorwasserstoff, Iod in Methanol, Quecksilbersalze, Trifluormethansulfonsäure), wobei häufig Nebenreaktionen beobachtet werden, welche Ausbeute und Reinheit der Produkte beeinträchtigen.
Die vorteilhaften Eigenschaften von S-Acylamidomethyl-Schutzgruppen als S-Schutzgruppen bei der Synthese thiolhaltiger Peptide bzw. ihrer Disulfidderivate (D. F. Veber, J. D. Milkowski, R. G. Denkewalter, R. Hirschmann: Tetrahedron Lett. 1968, 3057;
D. F. Veber, J. D. Milkowski, S. L Varga, R. G. Denkewalter, R. Hirschmann: J. Amer. Chem. Soc. 94, 9456 [1972]; H. Arold, M. Eule in: Peptides 1972 [Eds. H. Hanson, H.-D. Jakubke] p. 78, North-Holland. Publ. Co, Amsterdam 1973; P. Hermann, E. Schreier: ibid.
p. 123; R. G. Denkewalter, D. F. Veber, F. W. Holly, R-. Hirschmann: J. Amer. Chem. Soc. 91, 502 [1969]; P. Hermann, E. Schreier: J.
prakt. Chem. 316, 719 [1974]) werden durch die bisher bekannten Abspaltungsmethoden (z. B. Hg2+-lonen, I2 in Methanol) eingeschränkt.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist, unter Beibehaltung der S-Acylamidorriethyl-Schutzgruppen für die Thiol-Funktion, bei der Synthese Thiol-haltiger Aminosäure- und Peptidderivate eine schonende, selektive, ökonomisch befriedigende Abspaltungsmethode für Thiolschutzgruppen einzuführen, die hochreine Produkte liefert.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Enzyme zur Abspaltung von S-Acylamidomethyl-Gruppen einzusetzen und damit die Mangel der bisherigen Verfahrensweise zu überwinden
Merkmale der Erfindung sind deshalb gemäß Schema 1
Sn z 37m' 'Acyl-ΠΗ-CrL.-S-R + H2O »· H2Ii-CH2-S-R + Acyl-OH
Schema 1 H2O
spontan
2V , CH2O, HS-R
- 2 - 7b3 8/
1. Die Abspaltung der S-Schutzgruppe in einem Zweistufenprozeß ablaufen zu lassen, wobei nur der erste Schritt enzymkatalysiert abläuft, der zweite Schritt spontan erfolgt und die gewünschte Thiolverbindung liefert.
2. In der 1. Phase solche Enzyme einzusetzen, die vom Amidohydrolase-Typ sind und deren Spezifität besonders auf den Acylrest der zu spaltenden Bindung ausgerichtet ist.
3. Solche Acylamidomethyl-Schutzgruppen einzusetzen, deren Acylrest den Erfordernissen der Spezifität der einzusetzenden Enzyme vom Amidohydrolase-Typ entspricht.
Erfindungsgemäß werden Enzyme vom Typ der Penicillinamidohydrolasen (EC 3.5.1.11) aus Mikroorganismen eingesetzt. Es werden Peptide, dieThiol-haltige Bausteine enthalten, unter Verwendung von S-Phenylacetamidomethyl- oder S-Phenoxyacetamidomethyl-Schutzgruppen oder anderen S-Acylamidomethyl-Schutzgruppen, die eine oben geschilderte Substratfunktion besitzen, aufgebaut und zum gewünschten Zeitpunkt der Synthese in wäßriger Lösung oder in der Mischung, von Wasser mit organischen Lösungsmitteln im pH-Bereich der optimalen Wirkung dem katalytischen Einfluß der Penicillinamidohydrolasen ausgesetzt. Dies kann im homogenen oder heterogenen System erfolgen, wobei auch die Penicillinamidohydrolasen an lösliche oder unlösliche makromolekulare Träger gebunden oder anderweitig immobilisiert sein können. Reaktionstemperatur und Enzym/Substrat-Verhältnis werden durch Vorversuche ermittelt und optimiert. Die nach diesem Abspaltungsprozeß erhaltenen Thiol-Verbindungen können in gewünschter Weise weiter umgesetzt werden, z. B. zu Disulfiden.
Ausführungsbeispiele
1. In einer Inertgasatmosphäre werden bei pH 7 und 310 Kin 10%igem Dimethylformamid 0,2 mmol
tert.-Butyloxycarbonyl-S-Phenoxyacetamidomethyl-L-cystein mit 1 mg teilgereinigter Penicillinamidohydrolase aus Bakterien (T. A. Savidge, M. Cole: Methods Enzymol. 43, 705 [1975]) oder Pilzen (H. Vanderhaeghe: Methods Enzymol. 43, 721 [1975]) inkubiert. Nach Erreichen des quantitativen Umsatzes wird das entstandene tert.-Butyloxycarbonyl-L-cystein nach bekannter Verfahren zum Disulfid oxydiert, isoliert und nach Rekristallisation aus Essigsäureethylester/Hexan werden in 90%iger Ausbeute Kristalle von Di-tert.-butyloxycarbonyl-L-cystin vom Fp. 418-419 K erhalten. Das Präparat ist in mehreren Lösungsmittelgemischen chromatographisch einheitlich.
2. Analog wie im Beispiel 1 werden 0,2 mmol S^henacetamidomethyl-glutathion, die nach bekannten Verfahren aus tert.-Butyloxycarbonyl-L-glutamyl-(a-tert.-butylester)-Y-S-phenacetamidomethyl-L-cysteinyl-glycin gewonnen wurden, mit 1 mg Penicillinamidohydrolase aus Bakterien inkubiert. Das entstandene Glutathion wurde mit Wasserstoffperoxid zum Disulfid oxydiert und durch Säulenchromatographie an einem Molsieb gereinigt. In 77%iger Ausbeute wird Glutathion-disulfid mit einem Fp. 448-453 K erhalten. [cc]2 D° = -105°.
3. Tert.-butyloxycarbonyl-S-phenacetamidomethyl-L-cystein wurde bei pH 7,6 und 318 K in Gegenwart von 1 % Dimethylformamid durch eine immobilisierte Penicillinamidohydrolase (kovalent gebunden an Copolymerisat von 2-Hydroxyethylmethacrylat und Ethylendimethacrylat welches durch Epoxydgruppen modifiziert war) analog Beispiel 1 zu tert.-Butyloxycarbonyl-L-cystein umgesetzt.
4. S-Phenacetamidomethyl-ß-mercaptopropionsäure (10~13 mol/l) wurde bei pH 8 und 298 K durch Penicillinamidohydrolase aus Bakterien zu ß-Mercaptopropionsäure umgesetzt.

Claims (7)

  1. — I — /UvI U/
    Patentanspruch:
    1. Verfahren zur enzymatischen Abspaltung von Thiol-Schutzgruppen gekennzeichnet dadurch, daß als Thiol-Schutzgruppen solche verwendet werden, die als S-Acylamidomethyl-Gruppen zunächst enzymatisch an der Säureamidbindung der ^ Schutzgruppe gespalten werden und dann die verbleibende S-Aminomethylthioverbindung spontan unter Freisetzung der Thiol-Funktion hydrolysiert wird, wobei Enzyme vom Amidohydrolase-Typ eingesetzt werden, die besonders auf den an der S-Acylamidomethyl-Schutzgruppe beteiligten Acylrest eingestellt sind.
  2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Thiol-Schutzgruppen die S-Phenacetamidomethyl- und die S-Phenoxyacetamidomethyl-Gruppen und weitere S-Acylamidomethyl-Gruppen, die ebenfalls enzymatisch gespalten werden können, eingesetzt werden.
  3. 3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Enzyme solche vom Typ der Penicillinamidohydrolasen aus Mikroorganismen verwendet werden.
  4. 4. Verfahren nach Punkten 1-3, gekennzeichnet dadurch, daß dies Verfahren vorzugsweise zur Synthese von Peptiden, Peptidderivaten und Aminosäurederivaten eingesetzt wird, deren Thiol-haltigen Bausteine zeitweise durch Schutzgruppen blockiert sein müssen.
  5. 5. Verfahren nach Punkten 1-4, gekennzeichnet dadurch, daß die Abspaltung der Acylgruppe und die nachfolgende Freisetzung der Thiol-Funktion in Wasser oder in Mischungen mit Wasser und organischen Lösungsmitteln im pH-Bereich 6-10 erfolgt.
  6. 6. Verfahren nach Punkten 1—5, gekennzeichnet dadurch, daß die Enzyme auch in immobilisierter Form eingesetzt werden können.
  7. 7. Verfahren nach Punkten 1 -6, gekennzeichnet dadurch, daß die Enzymwirkung im Temperaturbereich 283-323 K zur Anwendung kommt.
DD27538785A 1985-04-22 1985-04-22 Verfahren zur enzymatischen abspaltung von thiolschutzgruppen DD236346A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DD27538785A DD236346A1 (de) 1985-04-22 1985-04-22 Verfahren zur enzymatischen abspaltung von thiolschutzgruppen

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DD27538785A DD236346A1 (de) 1985-04-22 1985-04-22 Verfahren zur enzymatischen abspaltung von thiolschutzgruppen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DD236346A1 true DD236346A1 (de) 1986-06-04

Family

ID=5567047

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DD27538785A DD236346A1 (de) 1985-04-22 1985-04-22 Verfahren zur enzymatischen abspaltung von thiolschutzgruppen

Country Status (1)

Country Link
DD (1) DD236346A1 (de)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0020290B1 (de) Verfahren zur spezifischen Abspaltung von Proteinsequenzen aus Proteinen
EP0477902B1 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Phosphinothricin durch eine gekoppelte enzymatische Reaktion
EP0180920B1 (de) Verfahren zur Spaltung von Peptiden und Proteinen an der Methionyl-Bindung
DE3012693A1 (de) Verfahren zur herstellung von dipeptiden
EP0003786B1 (de) Stereoselektive Spaltung von Phenylglycinderivaten und 4-Hydroxyphenylglycinderivaten mit Enzymharzen
DE2703703A1 (de) Traegergebundene acylasen
EP0521408B1 (de) Balhimycin-abgeleitete glykopeptidische Antibiotika
DD236346A1 (de) Verfahren zur enzymatischen abspaltung von thiolschutzgruppen
DE3203292C2 (de)
EP0157170A2 (de) Verfahren zur Immobilisierung von Zellen und Enzymen
DE69211340T2 (de) Verfahren zur enzymatischen herstellung von makrolakton
EP0377083B1 (de) Verfahren zur Herstellung von L-alpha-Aminosäuren
EP0456138B1 (de) Peptidamidase und deren Verwendung
Kuhl et al. On the use of carboxamidomethyl esters in the protease-catalyzed peptide synthesis
DE2509482A1 (de) Verfahren zur herstellung des kallikrein-trypsin-inhibitors aus rinderlunge
EP0321722B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden
Meister et al. [53] 5-Oxo-l-prolinase from rat kidney
DE3787155T2 (de) Enzymatische Herstellung von L-Aspartyl-L-Phenylalanin-Alkylester.
EP0832982A2 (de) Verfahren zur Herstellung von Z-L-Asparaginsäure-Dinatriumsalz aus Fumarsäure
US3882097A (en) {60 -Methyl glutathione, analogs thereof, intermediates therefore and processes for their preparation
JPS58209991A (ja) ペプチド又はペプチド誘導体の合成法
DE2647188C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Oligopeptiden
DE3803124C2 (de)
MXPA01012836A (es) Metodo para estabilizar proteinas en mezclas complejas durante su almacenamiento en solventes acuosos.
DE19942812A1 (de) Verfahren zur Herstellung von D-(3'-Pyridyl)-alanin

Legal Events

Date Code Title Description
ENJ Ceased due to non-payment of renewal fee