DE3787155T2 - Enzymatische Herstellung von L-Aspartyl-L-Phenylalanin-Alkylester. - Google Patents
Enzymatische Herstellung von L-Aspartyl-L-Phenylalanin-Alkylester.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Aspartyl-L-phenylalanin-Alkylester (in der Folge mit APM abgekürzt).
- APM ist ein Peptid, das in den letzten Jahren als Süßstoff bekannt geworden ist. Es ist wohlbekannt, daß die Verfahren zur Herstellung von APM oder L-Aspartyl-L-phenylalanin (AP) ein chemisches Synthetisierungsverfahren und ein enzymatisches Synthetisierungsverfahren umfassen.
- Das chemische Synthetisierungsverfahren zur Herstellung von APM umfaßt das Kondensieren von N-geschütztem L-Asparaginsaureanhydrid und L-Phenylalaninmethylester (PM), um N-geschützten APM zu erhalten. Die Schutzgruppe wird danach entfernt. Das enzymatische Synthetisierungsverfahren umfaßt das Einwirken eines proteinabbauenden Enzyms auf N-geschützte L-Asparaginsäure und PM, um N-geschützten APM oder das PM-Addukt von N-geschütztem APM zu erhalten, und dann das Entfernen der Schutzgruppe, um APM zu bilden. Jedoch erfordern beide Verfahren komplizierte Schritte des Einbringens der Schutzgruppen und deren Entfernung (Siehe GB-2,092,161A).
- Der Stand der Technik lehrt auch ein Verfahren zur Herstellung von APM ohne die Verwendung von Schutzgruppen (JP 83/126,796), das ein mikrobiologisches Syntheseverfahren unter Verwendung von Pseudomonas, Torulopsis, Rhodotoryla oder Sporobolomyces, aber dieses ist aufgrund extrem geringer Ausbeuten nicht immer für industrielle Produktion geeignet.
- Es wird auch ein direkterer Weg ohne Schutzgruppen angewendet, bei dem ein Mikroorganismus oder ein Enzym davon die direkte Bildung von APM aus L-Asparaginsäure und PM bewirken kann. (Japanische Patentanmeldung Nr. 75559/1983). Jedoch besteht eine Schwierigkeit dieses Verfahrens zur Herstellung von APM unter Verwendung von L-Asparaginsäure ohne eine Schutzgruppe darin, daß die Umsetzung von L-Asparaginsäure mit PM zur Bildung von APM eine Gleichgewichtsreaktion ist, und das Gleichgewicht verhindert, daß die Substrate wirksam in APM umgewandelt werden, was geringe Ausbeuten ergibt. Obwohl gemäß späteren Publikationen unter Verwendung des L-Phenylalaninesterrestes eines Alkohols eine gewisse Verbesserung der Ausbeute erzielt wurde (EP-A 154,472), bleibt die Reaktion gleichgewichtsgesteuert, und es werden daher relativ geringe Ausbeuten erzielt.
- Die vorliegende Erfindung verbessert die Herstellungsausbeuten ohne die Gleichgewichtsprobleme des/der unblockierten Wegs oder Wege unter Verwendung von nicht-derivatisierter Asparaginsäure.
- Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Aspartyl-L-phenylalanin-Alkylestern, welches das Umsetzen von nicht-N-geschütztem L-Asparaginsäure-Alphaester (LAE) oder L-Asparaginsäure-Alphaamid (LAA) mit L-Phenylalaninalkylester (LPAE) in einem ein organisches Lösungsmittel enthaltenden, wahlweise wässerigen Medium in Gegenwart eines Enzyms, eines das Enzym enthaltenden Mikroorganismus oder einer enzymhältigen Fraktion des Mikroorganismus oder eines auf festen Trägern immobilisierten Enzyms, wobei das genannte Enzym fähig ist, L-Aspartyl-L-phenylalanin-Alkylester durch Kondensation von nicht-N-geschütztem L-Asparaginsäure-Alphaester oder L-Asparaginsäure-Alphaamid mit dem L-Phenylalanin-Alkylester zu bilden.
- Die Erfindung betrifft die Herstellung von APM ausgehend von L-Asparaginsäure-Alphaester oder -Alphaamid und L-Phenylalaninalkylester Alphaester von L-Asparaginsäure sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und können beispielsweise nach den Verfahren von J. Kovacs et al., "J.Org.Chem." 26, 1084 (1961) hergestellt werden. Bevorzugte Alphaester umfassen einen Rest eines Alkohols, ein substituiertes oder unsubstituiertes Phenol, ein Thiol oder einen Alkylester; auch wird in Erwägung gezogen, daß andere Formen von L-Asparaginsäure-Alphaester oder -Alphaamid verwendet werden könnten. Eine bevorzugte andere Form wäre L-Asparaginsäuredialkylester. Derartige Verbindungen sind nach dem Stand der Technik bekannt. Derartige zusätzliche Gruppen könnten dann durch nach dem Stand der Technik bekannte Mittel entfernt werden. Alphaamide werden durch das Umsetzen des Asparaginsäurealphamethylesters mit Ammoniak in Methanol unter nach dem Stand der Technik bekannten Bedingungen hergestellt. Andere Verfahren sind nach dem Stand der Technik zur Herstellung von Amiden bekannt und können ebenfalls eingesetzt werden. Die Amidgruppe in der Alphaposition kann beispielsweise von NH&sub3; oder R-NH&sub2; oder R&sub2;NH oder R&sub3;N abgeleitet werden, worin R eine aromatische oder aliphatische Struktur enthält. Bevorzugtes Amid ist Asparaginsäureainid Bevorzugter Alkylester ist der Methylester. L-Phenylalaninalkylester sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt, insbesondere die Nieder(1-6)alkylester. Ein bevorzugter Niederalkylester von L-Phenylalanin ist der Methylester.
- Das Verfahren wird durchgeführt, indem L-Asparaginsäure-Alphaester oder -Alphaamid mit L-Phenylalaninalkylester in einem wässerigen organischen Medium in Gegenwart eines Enzyms umgesetzt wird, das fähig ist, den Alphaester oder das Alphaamid von L-Asparaginsäure zu kondensieren, um das Kondensationsprodukt APM zu bilden. Reaktionen werden bei geeigneten Temperaturen, vorzugsweise im Bereich von 25-45ºC, für einen Zeitraum von etwa 1 bis 10 Tage durchgeführt. Die Umsetzung wird bei einem pH-Wert von in etwa 4-9 durchgeführt. Ein bevorzugter pH-Wert ist etwa 8. Die tatsächlichen Mengen an Ausgangsreaktanden sind natürlich relativ, wobei in etwa stöchiometrische Mengen umgesetzt werden, um APM zu bilden, und vorzugsweise für optimale Ergebnisse derartige Mengen in jeder relativen Konzentration bevorzugt werden. Jedoch kann mehr oder weniger von einem oder dem anderen Reaktanden verwendet werden, ebenso wie mehr als ein L-Asparaginsäureester oder -amid oder mehr als ein L-Phenylalaninalkylester ausgewählt werden kann. Ausgewählte Enzyme weisen vorzugsweise eine Präferenz für die Alphaester- oder -amidbindungen von L-Asparaginsäure auf und hydrolysieren die Bindungen (insbesondere Ester) von L-Phenylalaninalkylester und andere L-Asparaginsäurebindungen oder das APM-Produkt vorzugsweise nicht. Ein bevorzugtes Enzym ist die extrazelluläre Protease (von Sigma Chemical Co. erhalten) von Staphylococcus aureus Stamm V8 und Mutantvarianten und genetisch veränderte Formen dieser Protease, die die gleiche Funktion beibehalten. Die Aminosäuresequenz des N-terminalen Bereichs des Enzyms war bekannt (G.R. Drapeau, (1978) "Canadian Journal of Biochemistry" 56 534-44). Dennoch wird die vollständige Aminosäure- und kodierende DNA-Sequenz des reifen Enzyms unten angegeben (siehe auch Carmona et al., "Nucleic Acids Research" 15, 16, (1987), 6757).
- Nach dem Stand der Technik ist auch bekannt, daß stellenspezifische Veränderungen in Kodonen, d. h. andere als natürlich auftretende oder zufällige Mutationen oder Veränderungen an Enzymen vorgenommen werden können, die die spezifische Wirkung, Reaktionsrate, Reaktionsspezifität Kcat, Km-Stabilität gegenüber organischen Lösungsmitteln und Temperatur und ähnliche verändern können. Derartige Modifikationen für stellenspezifische Veränderungen an spezifischen Kodonen sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und sollen beim Auswählen von Enzymen Teil der vorliegenden Erfindung sein. Wichtige stellenspezifische Veränderungen würden an oder nahe an aktiven Stellen auftreten, beispielsweise in der Nähe der katalytischen Reste eines Enzyms oder der Vorderseite des Enzyms, oder an irgendeiner anderen Aminosäure oder in der Nähe des äußeren Abschnitts der Aminosäure. Außerdem können auch Disulfidbindungen eingefügt werden, um das Enzym zu stabilisieren. Alternativ dazu kann der das Enzym enthaltende Mikroorganismus oder eine Fraktion des das Enzym enthaltenden Mikroorganismus verwendet werden. Auch immobilisierte Enzyme können verwendet werden.
- Die Umsetzung des Enzyms von LAE oder LAA mit PAE in Gegenwart des geeigneten ausgewählten Enzyms ergibt das Kondensationsprodukt APM.
- Wenn Enzyme von Mikroorganismen oder von Fraktionen von Mikroorganismen verwendet werden, können derartige Mikroorganismen erhalten werden, indem herkömmliche Kulturmedien verwendet werden. Weiters können Reaktanden am Beginn oder während des Verfahrens zum Kultivieren der Zellen hinzugefügt werden.
- Die für die Mikroorganismen zu verwendenden Kulturmedien sind herkömmliche, die gewöhnliche Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Ionen enthalten. Darüberhinaus führt das Hinzufügen von Spurenmengen an organischen Nährstoffsubstanzen wie Vitaminen und Aminosäure häufig zu wünschenswerten Ergebnissen.
- Die zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung geeigneten Kohlenstoffquellen umfassen Kohlehydrate wie Glukose und Saccharose, organische Säuren wie Essigsäure, und Alkohole. Die zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung geeigneten Stickstoffquellen umfassen Ammoniakgas, wässerigen Ammoniak und Ammoniumsalze. Die anorganischen Ionen werden auf geeignete Weise wie erforderlich aus z. B. Magnesiumion, Phosphorsäureion, Kaliumionen und Eisenion ausgewählt.
- Die Kulturen werden auf geeignete Weise unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 4-9, vorzugsweise etwa pH 8, bei entsprechenden Temperaturen, die innerhalb des Bereichs von 25-45ºC gehalten werden, und für etwa 1-10 Tage gehalten.
- Die Mikroorganismen, die gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden können, umfassen die gesamten nach dem Abschluß der Kultivierung erhaltenen Kulturlösungen, von den Kulturlösungen abgetrennte Mikroorganismen oder gewaschene Mikroorganismen. Auch können die verwendbaren Mikroorganismen gefriergetrocknet, acetongetrocknet, mit Toluol, oberflächenaktiven Stoffen bzw. Tensiden usw. in Kontakt gebracht, mit Lysozym behandelt,
- Ultraschallwellen ausgesetzt oder mechanisch gemahlen und Enzymproteinfraktionen sein, die aus diesen zellbehandelnden Materialien mit enzymatischer Wirkung erhalten werden. Es können fixierte Zellen dieser Mikroorganismen, insolubilisierte Materialien behandelter Zellen usw. verwendet werden.
- Als wässerige Medien können diejenigen verwendet werden, die Wasser, Puffer, organische Lösungsmittel wie Äthanol enthalten. Darüberhinaus können den wässerigen Medien, wenn notwendig, für das Wachstum von Mikroorganismen notwendige Nährstoffelemente, Oxidationshemmer, oberflächenaktive Stoffe bzw. Tenside, Coenzyme, Hydroxylamin und Metallionen, organische Lösungsmittel wie DMSO usw. hinzugefügt werden.
- Wenn die gesamten Kulturlösungen, Kulturzellen oder behandelten Zellmaterialien der obengenannten Mikroorganismen direkt mit den Reaktanden in Kontakt gebracht werden, um darauf einzuwirken, wird ein wässeriges Medium hergestellt, indem Reaktanden und die Kulturlösung, Kulturzellen oder behandelte Zellmaterialien aufgelöst oder suspendiert werden, und es wird auf geeignete Weise bei einer Temperatur von 10-70ºC und pH 4-9 gehalten und einige Zeit stehengelassen oder gerührt.
- Der so hergestellte APM kann nach den bekannten Abtrennungsverfahren abgetrennt und gereinigt werden. Der erhaltene APM wird mit einem Aminosäureanalysator bestimmt.
- Wässerige Lösungen aus L-Phenylalanin-Methylester und L-Asparaginsäure-alphamethylester wurde hergestellt und auf pH 8,0 eingestellt.
- Diese Lösungen wurden dann mit Dimethylsulfoxid (DMSO) gemischt, so daß die Endkonzentration von L-Phenylalanin-Methylester, L-Asparaginsäurealphamethylester und DMSO 0,1M, 0,5M bzw. 50% betrug. Eine Lösung aus dem zuvor beschriebenen V-8-Enzym wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml hinzugefügt, und die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 24 Stunden lang stehengelassen. Analyse mittels HPLC des Produkts auf Basis von in APM umgewandeltem PM ergab etwa 33%.
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von L-Aspartyl-L-phenylalanin-Alkylestern,
umfassend:
a) das Umsetzen von nicht-N-geschütztem L-Asparaginsäure-Alphaester oder
L-Asparaginsäure-Alphaamid mit L-Phenylalaninalkylester in einem ein
organisches Lösungsmittel enthaltenden Medium in Gegenwart eines Enzyms,
eines das Enzym enthaltenden Mikroorganismus, einer enzymhältigen Fraktion
eines Mikroorganismus oder eines auf einem festen Träger immobilisierten
Enzyms, wobei das genannte Enzym fähig ist,
L-Aspartyl-L-phenylalanin-Alkylester durch Kondensation des
nicht-N-geschützten L-Asparaginsäure-Alphaesters oder
L-Asparaginsäure-Alphaamids mit dem L-Phenylalaninalkylester zu bilden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das ausgewählte Enzym die extrazelluläre
Protease von Staphylococcus aureus Stamm V8 oder eine Mutantvariante oder
genetisch veränderte Form davon ist, welche dieselbe Funktion bei behält.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das ausgewählte Enzym einen N-Terminus
aufweist, der jenem der folgenden Aminosäuresequenz entspricht:
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3, worin
L-Asparaginsäuremethylester eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin L-Phenylalaninmethylester
eingesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der/das
L-Asparaginsäure-Alphaester oder -Alphaamid auch ein Betaester oder -amid
ist, wobei das Verfahren weiters das Entfernen des Betaesters oder -amids
umfaßt, um L-Aspartyl-L-phenylalaninalkylester zu ergeben.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das ausgewählte
Enzym größere Spezifität für den/das L-Asparaginsäure-Alphaester oder
-Alphaamid als für den L-Phenylalaninalkylester aufweist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin gereinigtes Enzym
eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Umsetzung
bei einem pH-Wert von etwa 8 durchgeführt wird.
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