DD237325B1

DD237325B1 - Verfahren zur stabilisierung von haemenzymen und so stabilisiertes haemenzymen

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Publication number: DD237325B1
Authority: DD
Publication date: 1991-03-28

Description

Anwendung der Erfindung

Hämenzyme, speziell einige Isoenzyme der Peroxidase aus Meerrettich, aber auch Katalase, werden für verschiedene Zwecke in der klinischen Labordiagnostik verwendet. Zum Beispiel werden sie in einer häufig angewendeten Methodik, den Immunoassays, zur Markierung von Antigenen oder Antikörpern eingesetzt, um als sog. Tracer den Verlauf von immunchemischen Reaktionen meßbar zu machen.

In den für diagnostische Zwecke benötigten sehr geringen Konzentrationen sind Hämenzyme häufig sehr unbeständig. Wenn sie in freier oder gebundener Form als Reagenzien kommerziell vertrieben werden, müssen sie aber sehr stabil sein, weil der Gebrauchswert solcher Reagenzien wesentlich von der Haltbarkeit abhängt. Jede Verbesserung der Stabilität ist also für den Hersteller und den Nutzer von Vorteil.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Zur Zeit werden zur Stabilisierung von Hämenzymen verschiedenartige Medien mit unterschiedlichen Zusätzen von Salzen, Komplexbildnern, Saccharides Proteinen, synthetischen Polymeren und anderen Substanzen verwendet. Allerdings gibt es keine ideale Lösung, d. h. die Aktivität der Enzyme nimmt bei der Lagerung, insbesondere mit der Erhöhung der Lagertemperatur, in jedem Fall ab, wenn auch in sehr unterschiedlichem Maße. Es wird daher immer nach Möglichkeiten gesucht, die Stabilität der Enzyme noch zu verbessern.

Ziel der Erfindung

Das Ziel war es also, eine weitere Steigerung der Haltbarkeit von Hämenzymen zu erreichen.

Wesen der Erfindung

Bei den erforderlichen Untersuchungen wurde überraschenderweise gefunden, daß die Stabilität von Hämenzymen in Lösungen von Proteinen, Proteinderivaten, Aminosäuren oder Aminosäurederivaten, die gegebenenfalls einen Zusatz von Polyalkoholen enthalten, zum Teil beträchtlich zunimmt, wenn man dem Medium Imidazol oder Imidazolderivate zufügt. Für die Stabilisierung kommen Proteine tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs sowie ihre Derivate in Frage. Von den löslichen Proteinen eignen sich vor allem Serum oder Serumeiweiße von Mensch und Tier. Während reines Albumin verschiedenen Ursprungs sehr häufig und mit gutem Erfolg bei den unterschiedlichsten Lyophilisationen eingesetzt wird, zeigte es hier aus unbekannten Gründen eine mäßige bis schlechte Wirkung. In verschiedenen Fällen wurde die Enzymstabilität sogar mit steigender Albuminkonzentration herabgesetzt, also eine negative Wirkung verursacht. Um so überraschender war die

Feststellung, daß Vollserum oder Serumfraktionen, besonders solche, in denen das Albumin weitgehend entfernt worden war, eine sehr gute Wirkung auf die Enzymstabilität ausübten. — Das Serum kann nativ oder in bearbeitetem Zustand zugegeben werden. Die teilweise oder vollständige Entfernung der Lipide in an sich bekannter Weise, z. B. über die Adsorption an Aerosil", ist eine häufig günstige Vorbehandlung. Zur Zurückdrängung von eventuell möglichen ungünstigen Einflüssen der Serumenzyme, der Transportproteine oder anderer Substanzen erweist es sich als vorteilhaft, diese Aktivitäten durch Erhitzen teilweise oder vollständig zu zerstören. Schließlich ist es für die Verwendung der stabilisierten Enzyme bei Enzymimmunoassays im allgemeinen erforderlich, daß das Serum die anschließende Bestimmung nicht durch das Einbringen der zu bestimmenden Substanz, also eines Antigens oder Antikörpers, stört.

Für die Bestimmung niedermolekularer Substanzen, z. B. von Steroiden, in einem Patientenserum entfernt man diese Substanzen aus dem für die Stabilisierung des Enzyms vorgesehenen Zusatzserum in an sich bekannter Weise durch Adsorptionsmittel wie Aktivkohle, durch Dialyse oder durch andere Verfahren. Soll in einem anderen Fall, z. B. im Schwangerenserum humanes Placentalactogen (HPL) bestimmt werden, so kann man als HPL-freies Serum entweder das von männlichen Spendern oder von Tieren benutzen. Ganz allgemein kann man bei der Bestimmung menschlicher Proteine das Serum von Tieren als Stabilisator verwenden und bei der Bestimmung tierischer Proteine das Serum einer anderen Tierart oder vom Menschen. Dabei ist vorher zu prüfen, ob nicht durch kreuzreagierende Antigene die spätere Bestimmung gestört wird. — Ein gewisses Problem könnte beim Einsatz im Enzymimmunoassay auch die Anwesenheit peroxidatisch wirkender Enzyme im

Zusatzserum sein. Dieser Einfluß auf die spätere Bestimmung ist aber im allgemeinen gering, da diese Enzyme nicht an der Immunreaktion teilnehmen und bei der Trennung von freiem und gebundenem Tracer fast vollständig entfernt werden. Ein geringer Rest stört nicht, weil er in allen Bestimmungsansätzen in gleicher Menge vorhanden ist und über die sogenannte unspezifische Bindung, von der er wiederum nur einen Bruchteil ausmacht, kontrolliert werden kann.

Verwendbar sind Zusätze von Serum oder Serumfraktionen in flüssiger oder fester Form, die einen Eiweißgehalt des Mediums von mehr als 0,1 % ergeben. Sehr gute Effekte werden mit mehr als 2% erreicht.

Eine weitere Quelle für lösliches Eiweiß ist z.B. tierische Milch, die man zweckmäßigerweise vorher entrahmt. Für den Einsatz von Milcheiweißen gilt im Prinzip das beim Serum Gesagte.

Unter Proteinderivaten werden hier solche Verbindungen verstanden, die durch Abbau der Proteine über Bruchstücke bis hin zu den Aminosäuren reichen, sowie Aggregate, die aus Proteinen oder ihren Abbauprodukten entstehen.

Der Proteinabbau kann in verschiedenen Arten erfolgen, z.B. schon rein thermisch, wobei teilweise Oxydationsmittel (Wasserstoffperoxid) zugesetzt werden, vor allem aber durch Hydrolyse mit Säuren, Basen oder Enzymen.

Solche Abbauprodukte sind in an sich bekannter Weise von allen Eiweißen herzustellen. Für den technischen Gebrauch bieten sich vor allem solche Produkte an, die billig im Handel erhältlich sind, z. B. Gelatine, hydrolysierte Gelatine und Peptone.

Gelatine wird aus Gerüsteiweißen von Tieren durch saure Hydrolyse gewonnen, die Peptone werden durch enzymatischem Abbau, z. B. von Casein, Fleisch, Gluthen oder Sojabohneneiweiß hergestellt. Die Molmassen solcher Eiweißabbauprodukte sind sehr unterschiedlich, je nach Herstellungsart, und sie sind im allgemeinen auch sehr inhomogen. Die Zahl der Peptidbindungen pro Molekül kann von einigen 1000 bis zu Null reichen. Bei den Handelsprodukten sind die Molekülgrößen etwas definierter.

Während bei Gelatine die Zahl der Peptidbindungen in der Größenordnung von Tausend liegt, treten bei der sog. hydroylsierten (= partiell hydrolysierten) Gelatine, die für die Infusionszwecke verwendet wird, Molmassen von etwa 20000 bis 40000 auf, die kleineren Moleküle werden vorher durch Dialyse entfernt. Bei den verschiedenen handelsüblichen Peptonen treten meist Molmassen von weniger als 5000, zum Teil auch weniger als 2000, auf, und es liegen stets neben Oligopeptiden auch freie Aminosäuren vor.

Wenn solche Abbauprodukte im allgemeinen auch relativ inhomogen sind, so haben sie doch gegenüber Serum den Vorteil, daß sie nicht die Eigenschaften von Antikörpern, spezifischen Transportproteinen, Hormonen oder Enzymen besitzen und häufig auch keine Lipide enthalten. Sie sind in dieser Beziehung also wesentlich besser definiert als Serum, was für manche Zwecke von Bedeutung sein kann.

Aggregate von Eiweißen entstehen allmählich bei Lagerungen in flüssigen, tiefgefrorenen oder auch lyophilisierten Lösungen, besonders schnell aber beim Erhitzen. Solche Aggregate können aus zwei bis zwanzig oder mehr Molekülen zusammengesetzt sein. Ihre Bindungsform ist nicht genau bekannt, aber relativ fest Man kann sie daher teilweise säulenchromatographisch trennen. Die Eigenschaften der Aggregate können sich deutlich von denen der Einzelmoleküle unterscheiden. Proteinaggregate entstehen unter anderem zwangsläufig dann, wenn zur Stabilisierung Serum eingesetzt und ein großer Teil der potentiellen Störsubstanzen durch sog. Inaktivieren (Erhitzen z. B. auf 50 bis 60⁰C über 60 Minuten) unwirksam gemacht werden soll.

Als Endprodukte der Proteinhydrolyse treten Aminosäuren auf, z. B. Glycin, Alanin, Phenylalanin, Tyrosin, Serin, Cystein, Glutaminsäure, Lysin und andere. Neben den natürlich vorkommenden Aminosäuren kann man auch synthetische, nicht in der Natur vorkommende verwenden, und zwar neben α-Aminosäuren auch solche, in denen die Carboxyl- und die Aminogruppe durch einen Zwischenraum getrennt sind, z. B. ε-Aminocapronsäure, oder in denen zwei Aminogruppen nebeneinander stehen,

z. B. Diaminobernsteinsäure. Als Hauptderivate der Aminosäuren kommen hier die Peptide in Frage, die neben dem Abbau der Proteine auch durch Synthese hergestellt werden, sowie N-Acylaminosäuren.

Als Polyalkohole werden hier vor allem einfache und zusammengesetzte Saccharide bis zur Polysacchariden verstanden, z.B.

Arabinose, Glukose, Fruktose, Saccharose, Maltose und andere bis zum Dextran, daneben auch Glykoside, Zuckeralkohole, -amine und -säuren, z.B. Methylglukosid, Sorbid, Glukosamin und Glukonsäure sowie Kondensations- und Polymerisationsprodukte von Alkoholen, z. B. Polyethylenglykol und Polyvinylalkohol.

Sehr günstig ist z. B. Rohrzucker, da er billig und in großer Reinheit überall zur Verfügung steht. Eine Wirkung tritt bei einer Konzentration im Medium von mehr als 1 % auf, für die Stabilisierung und Lyophilisierung sind 5 bis 15% besonders günstig.

Anstelle von reinem Imidazol können auch Derivate eingesetzt werden, bei denen die 3-Stellung unbesetzt und nicht sterisch behindert ist, z.B. Benzimidazol, 2- oder 4(5)-Methylimidazol oder 4(5)-lmidazolcarbonsäure. Der Zusatz des Imidazole ist variabel, er soll oberhalb von 0,001 % liegen und ist am günstigsten zwischen 0,01 und 0,1 %. In Abhängigkeit von den übrigen Bedingungen kann oberhalb des Optimums mitzunehmender Imidazolzugabe eine ungünstige Beeinflussung auftreten, so daß der günstigste Zusatz für die betreffenden Bedingungen jeweils ermittelt werden muß.

Für die Einstellung und Beibehaltung des gewünschten pH-Wertes ist ein Zusatz von Puffer günstig. Die Art der Pufferionen sowie ihre Konzentration hängt von dem zu stabilisierenden Enzym ab. Phosphatpuffer und die sog. Good-Puffer in Konzentrationen von 0,005 bis 0,25mol/l haben sich in verschiedenen Fällen als günstig erwiesen. Man kann aber auch Citrat, Tartrat, Succinat und andere Anionen verwenden. Als Kationen kommen neben Natrium, Kalium und Ammonium auch Trispuffer und Amine in Frage. pH-Werte zwischen 4,0 und 9,0 sind im Prinzip verwendbar, für die meisten Fälle ist aber ein Wert von 6,0 bis 7,5 am günstigsten.

Die Lyophilisation der zu stabilisierenden Enzymlösungen erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man z. B. Portionen von 0,1 bis 1,0ml in Flaschen abfüllt, diese auf eine Temperatur von unter -30⁰C abkühlt und das Eis unter vermindertem Druck sublimiert. Danach werden die Flaschen mit einem Schutzgas versehen oder im Vakuum luft- und feuchtigkeitsdicht verschlossen.

Der stabilisierende Effekt durch das Medium tritt im allgemeinen am günstigsten in der lyophilisierten Form auf, gelegentlich aber auch in der flüssigen Form.

Ausführungsbeispiel 1

Humanserum wurde in an sich bekannter Weise vorbehandelt (eine Stunde auf 56⁰C erhitzt, delipidiert und mit Aktivkohle behandelt) und dann mit Ammoniumsulfatlösung gefällt (final 2,0mol/l an Ammoniumsulfat). Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand verworfen, und der Niederschlag wurde zweimal mit 2,0mol/l Ammoniumsulfatlösung gewaschen. Der so vorgereinigte Niederschlag wurde in 0,05mol/l Phosphatpuffer, pH- 6,5 aufgenommen, membranfiltriert und in einer Ultrafiltrationsanlage mit 0,05mol/l Phosphatpuffer gewaschen. Zum Schluß wurde der Eiweißgehalt auf 50g/l eingestellt. Dieses Ultrafiltrat wurde in den folgenden Versuchen eingesetzt.

A. Progesteron-Peroxidase-Konjugat, hergestellt nach der Methode der gemischten Anhydride, wurde in einer Lösung folgender Zusammensetzungen aufgenommen: 80% des obigen Ultrafiltrates, 0,05% Imidazol, 0,05mol/l Phosphatpuffer, pH 6,5. Der Peroxidasegehalt betrug etwa 30 ng/ml. Die Lösung wurde in 1 ml-Portionen abgefüllt in 10 ml-Flaschen lyophilisiert, mit Gummistopfen und darüber mit Aluminiumkappen (Capsolutverschluß") verschlossen.

B. Wie Ansatz A, aber ohne Imidazol.

Nach 12 Monaten Lagerung bei 2 bis 8°C wurden im Ansatz A88%, im Ansatz B 56% der nach der Lyophilisation erhaltenen Enzymaktivität wiedergefunden.

Ausführungsbeispiel 2

A. Cortisol-Peroxidase-Konjugat wurde in einer Lösung folgender Zusammensetzung aufgenommen: 25% Humanserum (1 Stunde auf 56°C erhitzt, delipidiert, mit Aktivkohle behandelt), 0,05% Imidazol, 0,01 mol/l Phosphatpuffer, pH 6,5. Der Peroxidasegehalt betrug etwa 60ng/ml. Die Lösung wurde in 0,5 ml-Portionen lyophilisiert.

B. Wie Ansatz A, aber ohne Imidazol.

Nach einer Lagerung desLyophilisats von 10 Tagen bei 37°C wurden bei A 82%, bei B 52% der nach der Lyophilisation erhaltenen Enzymaktivität wiedergefunden.

Ausführungsbeispiel 3

A. Das Peroxidasekonjugat von humanem Placentalactogen, hergestellt nach der Perjodatmethode, wurde in einer Lösung der folgenden Zusammensetzung aufgenommen: 2% Casein-Pepton, 8% Dextran (durchschnittliches Molekulargewicht 60000), 0,05% Imidazol, Phosphatpuffer 0,02mol/l, pH6,2. Der Peroxidasegehalt betrug etwa 100ng/ml. Die Lösung wurde in 0,5ml-Portionen lyophilisiert.

B. Wie Ansatz A, aber ohne Imidazol.

Nach 6 Tagen Lagerung bei 37 °C wurden bei A 79%, bei B 60% der nach der Lyophilisation erhaltenen Aktivität wiedergefunden.

Ausführungsbeispiel 4

A. Progesteron-Peroxidase-Konjugat wurde in einer Lösung der folgenden Zusammensetzung aufgenommen: 3% hydrolysierte Gelatine (Gelafusal·), 10% Rohrzucker, 0,05% Imidazol, 0,6% Natriumchlorid, 0,01 mol/l Phosphatpuffer, pH 6,5.

B. Wie Ansatz A, aber anstelle von Imidazol 0,05% 4(5)-Methylimidazol.

C. Wie Ansatz A, aber anstelle von Imidazol 0,05 % 4(5)-Hydroxymethylimidazol.

D. Wie Ansatz A, aber ohne Imidazol.

Nach 8 Tagen Lagerung bei 37⁰C wurden bei Ansatz A 90%, bei Ansatz B 88%, bei Ansatz C 87% und bei Ansatz D 75% der nach der Lyophilisation erhaltenen Aktivität wiedergefunden.

Ausführungsbeispiel 5

A. Progesteron-Peroxidase-Konjugat wurde in einer Lösung der folgenden Zusammensetzung aufgenommen: 2% Glycin, 10% Sorbit, 0,05% Imidazol, Phosphatpuffer 0,01 mol/l, pH 6,5.

B. Wie Ansatz A, aber ohne Imidazol.

Nach 8 Tagen Lagerung bei 37°C wurde im Ansatz A 89%, im Ansatz B 56% der nach der Lyophilisation erhaltenen Aktivität wiedergefunden.

Claims

1. Verfahren zur Stabilisierung von Hämenzymen in einem Proteine und/oder Aminosäuren oder Derivate dieser Stoffe sowie gegebenenfalls zusätzlich Polyalkohole enthaltenden Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Medium Imidazol oder Imidazolderivate zugibt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Medium Imidazol oder Imidazolderivate in einer Konzentration von mehr als 0,01 g/l, vorzugsweise 0,1 bis 0,8g/l zusetzt.

3. Stabilisierte Hämenzyme in einem Proteine und/oder Aminosäuren oder Derivate dieser Stoffe sowie gegebenenfalls zusätzlich Polyalkohole enthaltenden Medium, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium Imidazol oder Imidazolderivate enthält.