DD237326A1 - Stabilisierung von enzymen und so stabilisiertes medium - Google Patents
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Es wird ein Verfahren zur Stabilisierung von verschiedenartigen Enzymen beschrieben, die fuer analytische Zwecke, und zwar als Kontroll- bzw. Vergleichsloesungen oder als Reagenzien verwendet werden. Die Stabilisierung erfolgt durch Zusatz von Polyalkoholen zu dem das Enzym und Proteine und/oder Aminosaeuren oder Derivate dieser Stoffe sowie gegebenenfalls Substrate und/oder Coenzyme enthaltenden Medium.
Description
Bei verschiedenen analytischen Laboruntersuchungen, vor allem in der klinischen Labordiagnostik, werden Enzyme benötigt. Sie werden kommerziell in Form von Kontroll- und Standardlösungen angeboten, um die routinemäßigen Bestimmungen von Enzymen in Körperflüssigkeiten zu kontrollieren oder zu eichen. Zum anderen werden sie auch in'zahlreichen Formen als Hilfsmittel eingesetzt, um andere Parameter zu bestimmen. In jedem Falle müssen die Reagenzien möglichst stabil sein, weil davon zu einem großen Teil die Sicherheit der Ergebnisse abhängt.
Da viele Enzyme gegenüber verschiedenen Einflüssen sehr empfindlich sind, muß bei der Herstellung enzymhaltiger Reagenzien stets darauf geachtet werden, daß ihre Haltbarkeit so sicher wie möglich gestaltet wird.
Die bisher veröffentlichten, sehr zahlreichen Vorschläge für die Stabilisierung von Enzymen zur Anwendung in der Analytik verwenden die verschiedenartigsten Zusätze, die im allgemeinen nur ein Enzym oder Gruppen ähnlich wirkender Enzyme betreffen. Aus verschiedenen Gründen wäre es aber wünschenswert, eine einheitliche Art von Stabilisierungsmedium für verschiedenartige Enzyme zu haben.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung war es daher, einen zwar unspezifischen, aber für unterschiedliche Enzyme anwendbaren Typ von Stabilisierungsmedium zu finden.
Wesen der Erfindung
Bei der Erprobung diverser Varianten wurde überraschenderweise gefunden, daß die Stabilität zahlreicher Enzyme in Lösungen von Proteinen, Proteinderivaten, Aminosäuren oder Aminosäurederivaten in Gegenwart oder Abwesenheit ihrer Substrate oder Coenzyme beträchtlich zunimmt, wenn man dem Medium Polyalkohole zufügt. Dies betrifft im Prinzip alle in der Analytik verwendeten Enzyme, z. B. solche aus der Klasse der Hydrolasen, z. B. Phosphatasen, derTransferasen, z. 8. Aminotransferasen, der Oxidoreduktasen, z. B. Peroxidasen, der Lyasen, z. B. Aldolasen, der Isomerasen und der Ligasen. Der gegebenenfalls erfolgende Zusatz von Substraten oder Coenzymen trägt in verschiedenen Fällen zur Verbesserung der Stabilität bei, ist aber keineswegs immer wirksam und bei einer vorhandenen Wirksamkeit auch nicht immer voll befriedigend. Bei den Proteinen kommen solche tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs in Frage, ebenso aber auch ihre Derivate. Von den löslichen Proteinen eignen sich vor allem Serumeiweiße von Mensch und Tier. Das Serum kann nativ oder in bearbeitetem Zustand zugegeben werden. Die teilweise oder vollständige Entfernung der Fettbestandteile in an sich bekannter Weise, z. B. über die Adsorption an AerosilR, ist eine häufig günstige Vorbehandlung. Andererseits können auch mit Erfolg Serumfraktionen eingesetzt werden, z.B. solche, bei denen die Eiweiße mit niedrigerem Molekulargewicht, vor allem Albumin, entfernt worden sind, überraschenderweise eignete sich reines Albumin unterschiedlicher Herkunft bei dem hier beschriebenen Verfahren, z. B. für die Peroxidasestabiiisierung, in verschiedenen Fällen nicht gut; für andere Enzyme eignete es sich dagegen ausgezeichnet. —Zur Zurückdrängung von eventuell möglichen ungünstigen Einflüssen der Serumenzyme, der Transportproteine oder anderer Substanzen erweist es sich im Bedarfsfall als vorteilhaft, diese Aktivitäten durch Erhitzen teilweise oder vollständig zu zerstören. Ebenso kann man im Bedarfsfall niedermolekulare Substanzen in an sich bekannter Weise entfernen, z. B. durch Adsorption an Aktivkohle, durch Dialyse oder durch andere Verfahren.
Verwendbar sind Zusätze von Serum oder Serumfraktionen in flüssiger oder fester Form, die einen Eiweißgehalt des Mediums von mehr als 0,1 % ergeben. Sehr gute Effekte werden häufig mit mehr als 2% erreicht.
Eine weitere Quelle für lösliches Eiweiß ist z. B. tierische Milch. Für ihren Einsatz gilt im Prinzip das bei Serum gesagte.
Unter Proteinderivaten werden hier solche Verbindungen verstanden, die durch Abbau der Proteine über Bruchstücke bis hin zu den Aminosäuren reichen sowie Aggregate, die aus Proteinen oder ihren Abbauprodukten entstehen.
Der Proteinabbau kann in verschiedenen Arten erfolgen, z.B. schon rein thermisch, wobei teilweise Oxydationsmittel (Wasserstoffperoxid) zugegeben werden, vor allem aber durch Hydrolyse mit Säuren, Basen oder Enzymen. Solche Abbauprodukte sind in an sich bekannter Weise von allen Eiweißen herzustellen. Für den technischen Gebrauch bieten sich vor allem solche Produkte an, die billig im Handel erhältlich sind, z.B. Gelatine, hydrolysierte Gelatine und Peptone.
Gelatine wird aus Gerüsteiweißen von Tieren durch saure Hydrolyse gewonnen, die Peptone werden durch enzymatischen Abbau, z. B. von Gasein, Fleisch, Gluthen oder Sojabohneneiweiß hergestellt. Die Molmassen solcher Eiweißabbauprodukte sind sehr unterschiedlich, je nach Herstellungsart, und sie sind im allgemeinen auch sehr inhomogen. Die Zahl der Peptidbindungen pro Molekül kann von einigen 1000 bis zu Null reichen. Beiden Handelsprodukten sind die Molekülgrößen etwas besser definiert.
Während bei Gelatine die Zahl der Peptidbindungen in der Größenordnung von Tausend liegt, treten bei der sog. hydrolysierten (bzw. partiell hydrolysierten) Gelatine, die für Infusionszwecke verwendet wird, Molmassen von etwa 20000 bis 40000 auf, die kleineren Moleküle'werden vorher durch Dialyse entfernt.
Bei den verschiedenen handelsüblichen Peptonen treten meist Molmassen von weniger als 5000, teilweise auch von weniger als 2000 auf, und es liegen immer auch freie Aminosäuren vor.
Wenn solche Abbauprodukte im allgemeinen auch relativ inhomogen sind, so haben sie doch gegenüber Serum den Vorteil, daß sie nicht die Eigenschaften von Antikörpern, spezifischen Transportproteinen, Hormonen oder Enzymen besitzen und häufig auch keine Lipide enthalten. Sie sind daher in dieser Beziehung besser definiert als Serum, was für manche Zwecke von Bedeutung sein kann.
Aggregate von Eiweißen entstehen allmählich bei Lagerungen von flüssigen, tiefgefrorenen oder auch lyophilisierten Lösungen, besonders schnell aber beim Erhitzen. Solche Aggregate können aus zwei bis zwanzig oder mehr Molekülen zusammengesetzt sein, Ihre Bindungsform ist nicht genau bekannt, aber relativ fest. Man kann sie daher teilweise säu lenchromatographisch trennen. Die Eigenschaften der Aggregate können sich deutlich von denen der Einzelmoleküle unterscheiden. Proteinaggregate entstehen unter anderem zwangsläufig immer dann, wenn zur Stabilisierung Serum eingesetzt und ein großer Teil der potentiellen Störsubstanzen durch sog. Inaktivieren (Erhitzen, z. B. auf 50 bis 6O0C über 60 Minuten) unwirksam gemacht werden
Als Endprodukte der Proteinhydrolyse treten Aminosäuren auf, z. B. Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Phenylalanin, Tyrosin, Serin, Cystein, Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Prolin und andere. Neben den natürlich vorkommenden Aminosäuren kann man auch synthetische, nicht in der Natur vorkommende verwenden, und zwar neben α-Aminosäuren auch solche, in denen die Carboxyl- und die Aminogruppe durch einen Zwischenraum getrennt sind, z.B. ε-Aminocapronsäure, oder in denen zwei Aminogruppen nebeneinanderstehend. 8. Diaminobersteinsäure. Als Hauptderivate der Aminosäuren kommen hier die Peptide in Frage, die neben dem Abbau der Proteine auch durch Synthese gewonnen werden, aber auch N-Acylaminosäuren.
Als Polyalkohole werden hier vor allem einfache und zusammengesetzte Saccharide bis zu Polysacchariden verstanden, z.B.
Arabinose, Glukose, Fruktose, Saccharose, Maltose und andere bis zum Dextran, daneben auch Glykoside, Zuckeralkohole, -amine und -säuren, z. B. Methylglukosid, Sorbit, Glukosamin und Glukonsäure, sowie Kondensations- und Polymerisationsprodukte von Alkoholen, z. B. Polyethylenglykol und Polyvinylalkohol.
Sehr günstig ist z. B. Rohrzucker, da er billig und in großer Reinheit überall zur Verfügung steht. Eine Wirkung tritt bei einer Konzentration im Medium von mehr als 1 % auf, für die Stabilisierung und Lyophilisierung sind 5 bis 15% besonders günstig.
Für die Einstellung und Beibehaltung des gewünschten pH-Wertes ist ein Zusatz von Puffer wichtig. Die Art der Pufferionen sowie ihre Konzentration hängt von dem zu stabilisierenden Enzym ab. Phosphatpuffer und die sog. Good-Puffer in Konzentrationen von 0,005 bis 0,25 mol/l haben sich in verschiedenen Fällen als günstig erwiesen. Man kann aber auch Zitrat,Tartrat, Sukzinat und andere Anionen verwenden. Als Kationen kommen neben Natrium, Kalium und Ammonium auch Tris-Puffer und Amine in Frage. pH-Werte zwischen 4,0 und 9,0 sind im Prinzip verwendbar, für die meisten Fälle ist aber ein Wert von 6,0 bis 7,8 am
günstigsten. ·
Die Lyophilisation der zu stabilisierenden Enzymlösungen erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man z. B. Portionen von 0,1 bis 5,0 ml in Flaschen abfüllt, diese auf eine Temperatur von unter -300C abkühlt und das Eis unter vermindertem Druck sublimiert. Danach werden die Flaschen mit einem Schutzgas versehen oder im Vakuum luft- und feuchtigkeitsdicht verschlossen.
Die Stabilisierung tritt z.T. auch in der flüssigen Lösung auf,
Ausführungsbeispiel 1
A. Alaninaminotransferase (aus Schweineherz) wurde in Rinderserum (deiipidiert, 1 Stunde auf 560C erhitzt), gepuffert mit Morpholinethansulfonsäure auf pH 7,2, unter Zusatz von 10% Rohrzucker lyophilisiert. Aktivität 1,24,umol/l · s
B. Wie Ansatz A, aber ohne Rohrzucker.
Nach 21 Tagen Lagerung bei 370C wurden bei A 98%, bei B 86% der nach der Lyophilisation erhaltenen Aktivität wiedergefunden.
Ausführungsbeispiel 2 '
A. Aspartataminotransferase (aus Schweineherz) wurde in Humanserum (deiipidiert, 1 Stunde auf 56°C erhitzt), gepuffert mit Morpholinethansulfonsäure auf pH 7,2, unter Zusatz von 10% Rohrzucker lyophilisiert. Aktivität 1,28,umoi/ · s
B. Wie Ansatz A, aber ohne. Rohrzucker.
Nach 21 Tagen Lagerung bei 37°C wurden bei A 99%, bei B 83% der nach der Lyophilisierung erhaltenen Aktivität wiedergefunden.
A. Laktatdehydrogenase (aus Hefe) wurde in Humanserum, gepuffert mit Morpholinpropansulfonsäure auf pH 7,0, unter Zusatz von 10% Glukose lyophilisiert. Aktivität 4,66,u.mol/l · s
B. Wie Ansatz A, aber ohne Glukose.
Nach 21 Tagen Lagerung bei 37°C wurden bei A 99%, bei B 95% der nach der Lyophilisation erhaltenen Aktivität wiedergefunden.
Ausführungsbeispiel 4
A. Wie in Beispiel 3 A, aber anstelle von Laktatdehydrogenase wurde alkalische Phosphatase (aus Kälberdarm) eingesetzt. Aktivität 3,80/imol/l · s
B. Wie Ansatz A, aber ohne Glukose.
Nach 21 Tagen Lagerung bei 37°C wurden bei A 93%, bei B 86% der nach der Lyophilisation erhaltenen Aktivität wiedergefunden.
A. Peroxidase (aus Meerrettich) wurde in folgender Lösung lyophilisiert: 2% Caseinpepton, 4% Dextran, 0,01 mol/l Phosphatpuffer, ph 6,5. Der Peroxidasegehalt betrug 800ng/ml.
B. Wie Ansatz A, aber ohne Dextran.
Nach 6 Tagen Lagerung bei 37 0C wurden bei A 59%, bei B 6% der nach der Lyophilisation erhaltenen Aktivität wiedergefunden.
Ausführungsbeispiei 6
A. Wie in Beispiel 5, Ansatz A, aber anstelle von Dextran wurden 10% Rohrzucker eingesetzt.
3. Wie Ansatz A, aber ohne Rohrzucker.
Nach 14 Tagen Lagerung bei 37°C wurden bei A 92%, bei B 6% der nach der Lyophilisation erhaltenen Aktivität wiedergefunden.
Ausführungsbeispiei 7
A. Progesteron-Peroxidase-Konjugat (hergestellt nach der Methode der gemischten Anhydride) wurde in folgender Lösung lyophilisiert: 0,5% partiell hydroiysierte Gelatine (GeiafusalR), 10% Sorbit, Phosphatpuffer 0,01 mol/l, pH 6,5. Der Peroxidasegehalt betrug etwa 80 ng/ml.
B. Wie Ansatz A, aber ohne Sorbit.
Nach 8 Tagen Lagerung bei 370C zeigte A 80%, B 12% der nach der Lyophilisation erhaltenen Aktivität.
A. 17-Hydroxyprogesteron-Peroxidase-Konjugat wurde in folgender Lösung lyophilisiert: 2% Glycin, 10% Rohrzucker, 0,01 mol/l Phosphatpuffer, pH 6,5. Der Peroxidasegehalt betrug etwa 30 ng/ml.
B. Wie Ansatz A, aber ohne Rohrzucker.
Nach 6 Tagen Lagerung bei 37 0C wurden bei A 64%, bei B 12% der bei der Lyophilisation erhaltenen Aktivität wiedergefunden.
Ausführungsbeispiel 9
A. Humanserum wurde in an sich bekannter Weise vorbehandelt (eine Stunde auf 560C erhitzt, delipidiert und mit Aktivkohle behandelt) und dann mit Ammoniumsulfatlösung gefällt (final 2,0mol/l an Ammoniumsulfat). Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand verworfen und der Niederschlag wurde zweimal mit 2,0 mol/l Ammoniumsulfatlösung gewaschen. Der so vorgereinigte Niederschlag wurde in 0,05mol/i Phosphatpuffer, pH 6,5, aufgenommen, membranfiltriert und in einer Ultrafiltrationsanlage mit 0,05 mol/l Phosphatpuffer gewaschen. Zum Schluß wurde der Eiweißgehalt auf 50 g/l eingestellt. Dieses Ultrafiltrat wurde in den folgenden Versuchen eingesetzt. -Progesteron-Peroxidase-Konjugat, hergestellt nach der Methode der gemischten Anhydride, wurde in einer Lösung folgender Zusammensetzung lyophilisiert: 80% des obigen Ultrafiltrates, 10% Rohrzucker, 0,05mol/l Phosphatpuffer, pH6,5. Der Peroxidasegehalt betrug etwa 60ng/ml.
B. Wie Ansatz A, aber ohne Rohrzucker.
Nach 10 Tagen Lagerung bei 370C wurden bei A 92%, bei B 63% der nach der Lyophilisierung erhaltenen Aktivität wiedergefunden.
Claims (8)
- Patentansprüche:1. Verfahren zur Stabilisierung von Enzymen aus den Klassen der Hydrolasen, Transferasen, Oxidoreduktasen, Lyasen, Isomerasen oder Lyasen in einem Proteine und/oder Aminosäuren oder Derivate dieser Stoffe sowie gegebenenfalls Substrate und/oder Coenzyme enthaltenden Medium, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Medium Polyalkohole zugibt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs sind.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteinderivate Abbauprodukte oder Aggregate von Proteinen sind.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Derivate von Aminosäuren Peptide oder N-Acylaminosäuren sind.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an Proteinen und/oder Aminosäuren bzw. den Derivaten dieser Stoffe im Medium mehr als 1 g/l, vorzugsweise 20 bis 60g/l beträgt.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyalkohole einfache, zusammengesetzte oder Polysaccharide, Zuckeralkohole, -amine oder -säuren, Glykoside, Kondensations- oder Polymerisationsprodukte von Alkoholen sind.
- 7. Verfahren nach Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Zusatz der Polyalkohole zwischen 10und400g/l, vorzugsweise zwischen 50 und 150g/l liegt.
- 8. Stabilisierte Enzyme in einem Proteine und/oder Aminosäuren oder Derivate dieser Stoffe sowie gegebenenfalls Substrate und/oder Coenzyme enthaltenden Medium, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium Polyalkohole enthält.
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| DD27636585A DD237326A1 (de) | 1985-05-15 | 1985-05-15 | Stabilisierung von enzymen und so stabilisiertes medium |
Applications Claiming Priority (1)
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Country Status (1)
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4861712A (en) * | 1986-05-16 | 1989-08-29 | Boehringer Manneheim Gmbh | Analysis element for determination of a coagulation parameter |
-
1985
- 1985-05-15 DD DD27636585A patent/DD237326A1/de active IP Right Grant
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4861712A (en) * | 1986-05-16 | 1989-08-29 | Boehringer Manneheim Gmbh | Analysis element for determination of a coagulation parameter |
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