DD241789A1 - Selektives adsorbens zur bindung von immunkomplexen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung beschreibt ein Adsorbens für die Entfernung von zirkulierenden Immunkomplexen aus Körperflüssigkeiten durch biospezifische Bindung derselben an das Protein C1q das an zellulosehaltige feste Phasen über eine Brückenverbindung immpbilisiert ist, wobei die so gebundenen Immunkomplexe durch Abtrennung der festen Phase separiert werden und die feste Phase durch Behandlung mit nicht denaturierenden Medien regeneriert wird.
Description
Selektives Adsorbens zur Bindung von Immunkomplexen
Die Erfindung betrifft ein Adsorbens für die selektive Entfernung von zirkulierenden Immunkomplexen aus Körperflüssigkeiten unter wiederholtem und reproduzierbarem Einsatz eines beschichteten Trägers. Das Adsorbens ist anwendbar in der pharmazeutischen Industrie sowie der Medizin.
Es gilt als gesichert, daß den in Körperflüssigkeiten, z. B. im Blut, zirkulierenden Antigen-Antikörper-Komplexen (Immunkomplexen) eine wesentliche pathogenetische Bedeutung bei einer Vielzahl von Erkrankungen (u. a. Autoimmunerkrankungen wie Lupus erythematodesl/isceralis und Rheumatoid-Arthritis, Transplantatabstoßung, Infektionen, möglicherweise auch bei Neoplasien) zukommt. Zirkulierende Immunkomplexe können sich an den Gefäßwänden ablagern und über verschiedene Wirkungsmechanismen entzündliche Reaktionen in den jeweils disponierten Organen mit den entsprechenden Symptomen (u. a. Vasculitis, Arthritis, Nephritis, Serositis, Karditis, Cerebritis, Anämie, Leukopenie, Thrombopenie) induzieren. Insbesondere bei Autoimmunerkrankungen korreliert die Immunkomplexkonzentration im Serum/Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten mit der Aktivität der Erkrankung. Deshalb erscheint es sinnvoll, den Pathomechanismus dieser Erkrankungen durch Entfernung zirkulierender Immun-
komplexe aus den Körperflüssigkeiten zu beeinflussen, um dadurch das Fortschreiten der oben erwähnten Erkrankungen und unerwünschte Immunreaktionen zu verhindern, die Krankheitsaktivität zu mindern, die damit verbundenen Symptome zu lindern bzw. zu beseitigen. Die Erfolge der Plasmapharesebehandlung werden u. a,auf die Beseitigung bzw. Reduzierung der pathogenetisch bedeutsamen Immunkomplexe zurückgeführt /""vgl. E. Apostoloff et al., Dt. Gesundheitsw. 34, 64 (1979); H. F. Parry et al., Ann. Rheum. Dis. 40, 224 - 228 (1981); T. Sharon et al., Plasma Ther. Transfus. Technol. 25, 163 - 169 (1982); M. Valbonesi~et al.. Int. O. Art. Organs 4, 234 - 236 (1981); 3. V. 3ones et al., Arthritis Rheum. 24, 1113 1120 (198I)J7.
Nachteile dieser Methode sind das nicht selektive Entfernen aller Plasmabestandteile und die dadurch erforderliche Zuführung größerer Mengen Fremdplasma oder Humanalbumin, die auch aus Kapazitätsund ökonomischen Gründen limitierend sein können. Aus den genannten Gründen existieren seit einigen fahren Bemühungen um die Entwicklung von Adsorbentien, die eine selektive Entfernung zirkulierender Immunkomplexe aus Körperflüssigkeiten erlauben. Hierbei wurden im wesentlichen folgende Wege beschritten.
- Staphylokokken-Protein A, an einen unlöslichen Träger fixiert (fixierte Staphylokokken, Protein A-Sepharose) /""vgl. D. S. Torman et al., D. Immunol. 124, 798 (1980); New England D. Med. 305, 1195); E. Behm u. H. Klinkmann, in Plasma Separation and Plasma Fractionation, S. 254 - 265 (Karger, Basel 1983)_J7
- Poröses Harz vom Akrylsäureester-Typ /~z. B. XAD-7, geliefert von Rohm und Hass Co., USA; vgl. T. Agishi, Zinko Zoki, 9_, 264 (1980)_7
- Kationenaustauschglied wie Carboxymethylcellulose /"vgl. L. D, Oohnson et al., Can. 3. Biochem. 42, 795 (1964)__7
Z4 I /
- Adsorbens, enthaltend eine Oberfläche und mit der Oberfläche verbunden wenigstens ein hydrophobes Glied mit 6 - 700 Kohlenstoff-Atomen und wenigstens eine negative Ladung erzeugendes Glied /~T. Kuroda et al., japanisches Patent 0. P. P58-59199, P58-59197J7
Diese Adsorbentien haben jedoch verschiedene Nachteile, Protein A ist in der Lage, Immunkomplexe zu binden; jedoch nicht ausreichend selektiv, denn es bindet ebenfalls nicht immunkomplexgebundenes IgG. Außerdem ist Protein A ein Fremdprotein mit den ihm anhaftenden Nachteilen beim Einsatz des Adsorbens, wenn es in Berührung mit den Körperflüssigkeiten gehalten wird. Die Herstellungskosten für Protein A sind sehr hoch. Die Verwendung inaktivierter Staphylokokken als "natürlichen" Trager des Protein A ermöglicht den Einsatz des Protein A ohne seine weitere Reinigung, bringt aber zusätzlich Probleme bei Berührung der Körperflüssigkeit mit den inaktivierten Bakterien (z. B. Freisetzen von Pyrogenen) mit sich. Weiterhin sollen Protein-A-Träger das Komplementsystem aktivieren. Das poröse Harz vom Acrylsäureester-Typ und Carboxymethylcellulose besitzen nur ungenügendes Adsorptionsvermögen und unzureichende Adsorptionsspezifität (u. a. wird Albumin aus Körperflüssigkeit absorbiert). Das aus einem hydrophoben und einem eine negative Ladung enthaltenden Glied bestehende Adsorbens ist ebenfalls für die Adsorption von Immunkomplexen nicht ausreichend spezifisch.
Es ist Ziel der Erfindung, zirkulierende Immunkomplexe selektiv, einfach und schonend aus Körperflüssigkeiten unter Nutzung sterilisierbarer Träger zu entfernen. Die Träger sollen sich einfach, schnell und reproduzierbar zwecks Wiederverwendung regenerieren lassen.
Die Erfindung hat die Aufgabe, zirkulierende Immunkomplexe aus Körperflüssigkeiten ah eine feste Phase (Träger) biospezifisch
zu binden, wobei die feste Phase wiederverwendbar sein soll. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß das Protein CIq - eine Untereinheit der ersten Komplementkomponente - an zellulosehaltige Materialien, vorzugsweise Perlzellulose oder flächenförmige Zelluloseträger, über eine BrückenveYbindung kovalent gebunden wird und dieses trägergebundene CIq zur Bindung und Entfernung der zirkulierenden Immunkomplexe eingesetzt wird, wobei die an das CIq gebundenen Immunkomplexe aus den Körperflüssigkeiten durch Abtrennung der festen Phase separiert werden und die feste Phase durch Behandlung mit nicht denaturierenden Medien funktionell regeneriert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das im menschlichen und tierischen Blut vorkommende und für die Bindung von Immunkomplexen und deren physiologische Eliminierung verantwortliche Protein CIq an einen geeigneten zellulosehaltigen Träger mit hinreichend großer Oberfläche und Porosität auf an sich bekannte vorherige chemische Oberflächenmodifizierung des Trägers, vorzugsweise durch Chlorameisensäureester, CNBr, Cyanurchlorid, Carbodiimiden (Obersicht: M. D. Lilly: Methods in Enzymology 44, (1976), 46) gebunden wird und dieses trägergebundene CIq für die in vivo- und in vitro-Entfernung der zirkulierenden Immunkomplexe aus Körperflüssigkeiten eingesetzt wird und danach die so gebundenen Immunkomplexe durch nicht denaturierende Medien wieder abgespalten werden, so daß der mit CIq beladene Träger erneut eingesetzt werden kann.
Der als feste Phase dienende Träger hat eine unterschiedliche geometrische Form, wobei kugelförmige oder flächenförmige vernetzte Träger mit oder ohne Zusätzen besonders geeignet sind. Das zellulosehaltige Material ist im wesentlichen Perlzellulose, wobei deren Partikelgröße, Zusammensetzung, Struktur und Porosität unterschiedlich sein kann. Besonders vorteilhaft sind Partikelgrößen zwischen 100 - 400 ,um und Porenweiten >500 A. Die maximale Porenweite beträgt ca. 100 ,um, wobei mit zunehmender Porenweite die zur Verfügung stehende Fläche und damit die Kapazität des Trägers immer kleiner wird.
Die nicht denaturierenden Medien für die Abspaltung der gebundenen Immunkomplexe setzen sich aus gepufferten Lösungen hoher Ionenstärke zusammen, wobei insbesondere 0,5 - 3 m NaCl-Lösungen geeignet sind.
Die Oberflächenmodifizierung der Zellulose zum Zwecke der Schaffung von Bedingungen für das Eingehen kovalenter Bindungen mit dem Protein CIq erfolgt auf an sich bekannte Art und Weise vorzugsweise durch Chlorameisensäureester, kann aber auch durch andere bekannte Modifizierungsverfahren wie CNBr, Cyanurchlorid, Carbodiimide, Glutaraldehyd erfolgen. Der erfindungsgemäße CIq-Träger ist chemisch stabil, mikrobiell schwer angreifbar und sterilisierbar. Dadurch ist die Wiederverwendbarkeit gewährleistet. Der so mit dem Protein CIq beladene Zelluloseträger wird dann zur Bindung und Entfernung der zirkulierenden Immunkomplexe eingesetzt, wobei der Träger sowohl im Durchflußverfahren in üblicher Weise (Hämoperfusion, Plasmaperfusion) als auch im Batch-Verfahren (bei der Isolierung von Immunkomplexen für in vitro-Untersuchungen) genutzt werden kann. Nach Ablauf der Reaktion und Entfernung des Trägers von den zu behandelnden Körperflüssigkeiten werden die gebundenen Immunkomplexe durch nicht denaturierende Medien wie 1 M NaCl-Lösung abgespalten, so daß das kovalent gebundene CIq für einen erneuten Einsatz zur Verfugung steht.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die physiologische Funktion des Proteins CIq für die selektive und schonende Bindung und damit Entfernung von zirkulierenden Immunkomplexen aus Körperflüssigkeiten.
Im folgenden wird die Erfindung durch 2 Beispiele näher erläutert
Die mit Chlorameisensäureestern aktivierte Perlzellulose (Aktivierungsgrad 63 .umol/ml) wird zunächst stufenweise in das wäßrige Milieu überführt, da die Perlzellulose mit Dioxan ver-
1 /Ö7
setzt ist. Hierzu wird der Träger mit einem hinreichend großen Überschuß (50 ml Waschlösung/ml Träger) Dioxan-Wasser-Gemischen folgender Abstufungen unter Rühren gewaschen: 90/10; 70/30; 10/90; 0/100. Die Gesamtdauer des Waschprozesses sollte nicht länger als 10 - 15 Minuten betragen, um Hydrolyseverluste an aktiven Gruppen zu vermeiden. Danach wird der Träger mit CIq (1 mg/ml) in PBS-Puffer, pH 7,4, 10 mM EDTA enthaltend, versetzt und 4 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Bestimmung des gebundenen CIq erfolgt durch Differenzmessung der Ausgangslösung bzw. des Oberstands nach vorheri-
280 ger Dialyse bei 280 nm (E1S = 6,8) oder mit Hilfe der einfachen radialen Immundiffusion. Abschließend wird der Träger mit 1 m Äthanolaminlösung in PBS-Puffer, pH 7,4, versetzt, um eventuell noch freie reaktive Gruppen abzublocken. Schließlich wird der Träger mit einem 0,01 m Phosphat-Puffer, pH 7,4, der 0,05 m NaCl enthält, gewaschen.
Dieses trägergebundene CIq wird nunmehr zur Bindung der Immunkomplexe eingesetzt. Hierzu wird die mit CIq beladene Perlzellulose mit einem Patientenserum, das erhöhte Konzentrationen zirkulierender Immunkomplexe enthält (Patient mit Lupus erythematodes visceralis), im Batch-Verfahren versetzt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernung des Trägers durch Dekantieren oder Zentrifugieren wird dieser im folgenden mit 0,01 M Phosphat-Puffer, pH 7,4, 0,05 M NaCl, gewaschen und anschließend mit 2 M NaCl in PBS-Puffer, pH 7,4, regeneriert. Die Bestimmung der Immunkomplexe erfolgte mit einem Clq-Festphasen-Enzymimmunoassay. Zur Ermittlung der unspezifischen Bindungen an den Träger wurde die Eiweißkonzentration im spezifischen Eluat nach Lowry bestimmt sowie eine Immunelektrophorese durchgeführt.
Eine mögliche Aktivierung des Komplementsystems wurde durch quantitative Bestimmung der Komplementkomponenten CIq und C3 verfolgt.
Tabelle 1 zeigt ein charakteristisches Ergebnis einer derartigen Behandlung.
I /
zirkulierende Immunkomplexe
Äquivalente (%) aggr. IgG)
Patientenserum
vor der Behandlung 90 100
nach der Behandlung 62 69
Eine Aktivierung des Komplementsystems konnte nicht nachgewiesen werden.
An aktivierte Perlzellulose wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, humanes CIq gebunden. Diese Matrix wird in eine Chromatographiesäule (j3 4 mm) gefüllt und mit einem 0,01 M Phosphat-Puffer pH 7,4, 0,05 M NaCl, gespült. Anschließend wird 1 ml Serum eines Patienten mit erhöhtem Immunkomplexspiegel aufgetragen und mit o. g. Puffer eluiert (Durchfluß 10 ml/h). Die Abspaltung der spezifisch gebundenen Immunkomplexe und die hiermit verbundene Regenerierung der Matrix erfolgt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit 2 M NaCl-Lösung in PBS-Puffer, pH 7,4. Die Eiweißkonzentratxon wurde kontinuierlich mit einem UV-Durchflußphotometer verfolgt. Die Ergebnisse entsprachen den in Beispiel 1 dargestellten Resultaten.
Claims (6)
- Erfindungsanspruch1. Selektives Adsorbens zur Bindung von Immunkomplexen aus Körperflüssigkeiten auf der Grundlage biospezifischer Wechselwirkungen an feste Phasen, gekennzeichnet dadurch, daß als feste Phase zellulosehaltige Materialien verwendet werden, die über eine Brückenverbindung das Protein CIq kovalent gebunden enthalten und daß nach Bindung der Immunkomplexe an das CIq der festen Phase durch Behandlung mit der Körperflüssigkeit und Abtrennung der festen Phase eine Regenerierung der festen Phase durch Behandlung mit nicht denaturierenden Medien und Wiederverwendung derselben erfolgt.
- 2. Selektives Adsorbens zur Bindung von Immunkomplexen aus Körperflüssigkeiten nach Punkt. 1, gekennzeichnet dadurch, daß die eingesetzten zellulosehaltigen Materialien aus sphärischen oder faserförmigen Formkörpern bestehen.
- 3. Selektives Adsorbens zur Bindung von Immunkomplexen nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Formkörper durch Packung, Verweben oder durch Bindemittel zu vorzugsweise flächenförmigen Materialien oder Kolonnenpackungen zusammengestellt sind.
- 4. Selektives Adsorbens zur Bindung von Immunkomplexen aus Körperflüssigkeiten nach Punkt 1, 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß das eingesetzte zellulosehaltige Material Perlzellulose ist, deren Partikelgröße IO - 500 ,um beträgt und deren Porosität>100 A ist.
- 5. Selektives Adsorbens zur Bindung von Immunkomplexen aus Körperflüssigkeiten nach Punkt 1-4, gekennzeichnet dadurch, daß als Brückenverbindung Chlorameisensäureester, CNBr, Carbodiimide, Glutaraldehyd u. ä. eingesetzt werden.
- 6. Selektives Adsorbens zur Bindung und Entfernung von Immunkomplexen aus Körperflüssigkeiten nach Punkt 1-5, gekennzeichnet dadurch, daß die nicht denaturierenden Medien gepufferte Lösungen hoher lonenstärke sind.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD28179385A DD241789A1 (de) | 1985-10-16 | 1985-10-16 | Selektives adsorbens zur bindung von immunkomplexen |
| DE86113784T DE3689645D1 (de) | 1985-10-16 | 1986-10-04 | Selektives Adsorbens zur Bindung von Immunkomplexen. |
| EP86113784A EP0222146B1 (de) | 1985-10-16 | 1986-10-04 | Selektives Adsorbens zur Bindung von Immunkomplexen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD28179385A DD241789A1 (de) | 1985-10-16 | 1985-10-16 | Selektives adsorbens zur bindung von immunkomplexen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD241789A1 true DD241789A1 (de) | 1986-12-24 |
Family
ID=5572189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD28179385A DD241789A1 (de) | 1985-10-16 | 1985-10-16 | Selektives adsorbens zur bindung von immunkomplexen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD241789A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0453060A3 (en) * | 1990-04-19 | 1991-11-27 | Imtec Immundiagnostika Gmbh | Method for determination of antinuclear antibodies |
-
1985
- 1985-10-16 DD DD28179385A patent/DD241789A1/de unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0453060A3 (en) * | 1990-04-19 | 1991-11-27 | Imtec Immundiagnostika Gmbh | Method for determination of antinuclear antibodies |
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