DD242240A1

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Info

Publication number: DD242240A1
Authority: DD
Publication date: 1987-01-21

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Immobilisierung bioaktiver Verbindungen zum Zwecke der chemischen Stoffwandlung, der enzymatischen Katalyse und zur analytischen und praeparativen Trennungstechnik. Ziel und Aufgabe der Erfindung sind die Herstellung immobilisierter biologisch aktiver Verbindungen (Enzyme, Inhibitoren, immunaktive Proteine), die mit hoher Aktivitaetsausbeute kovalent an makroporoese synthetische polymere Traeger gebunden sind, die eine rigide Struktur und sphaerische Form besitzen. Wesen der Erfindung ist ein zweistufiger Prozess, bei dem an der polymeren, reaktive Gruppen tragenden Matrix aus waessriger Loesung biologisch aktive Verbindungen unter Bildung stabiler kovalenter Bindungen fixiert werden. Der Prozess der Immobilisierung ist in der ersten Stufe durch hydrophobe Adsorption charakterisiert, die durch Zugabe anorganischer Salze in einem bestimmten Konzentrationsbereich optimal erfolgt. In der zweiten Stufe reagieren die adsorbierten biologisch wirksamen Verbindungen mit den reaktiven funktionellen Gruppen des Traegers unter Ausbildung hydrolysestabiler kovalenter Bindungen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Immobilisierung von Enzymen, Proteinen, Hormonen und andere biologisch aktiven Wirkstoffen zum Zwecke des Einsatzes in der Biotechnologie, bei der Isolierung von Proteinen und Enzymen, in der Immunologie, in der Affinitätschromatographie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Forschung mit und die Nutzung von immobilisierten biologisch wirksamen Verbindungen stellt gegenwärtig einen bedeutenden Faktor bei Entwicklungs- und Anwendungsprojekten der Biotechnologie und verwandter Disziplinen dar, wobei der praktische Nutzen bedeutend ist. Die Herstellung und Anwendung unlöslicher Enzyme durch die Bindung löslicher Enzyme an einen Träger erlaubt die wiederholte Nutzung des katalytischen Systems im batch-Verfahren oder bei anderer Gestaltung des Enzym reaktors. Dabei hat das unlösliche Enzym die Funktion eines spezifischen heterogenen Katalysators. Diese Ausführung der enzymatisch katalysierten Reaktion erleichtert die nachfolgende Abtrennung des Enzyms vom Substrat und den Reaktionsprodukten. Bei mehrfacher oder kontinuierlicher Reaktionsführung werden die Kosten gesenkt und die Automatisierung des Prozesses wird kostengünstiger.

Bei Wechselwirkungen des Substrats mit kovalent immobilisierten Enzymen ist die Geschwindigkeit der enzymatisch katalysierten Reaktion nicht nur vom Typ und der Aktivität des Enzyms abhängig, sondern auch vom Charakter der Bindung des Enzyms zum Träger und von den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Trägers (Größe und Verteilung der Poren, Hydrophilie der Oberfläche usw.). Die hydrodynamischen Eigenschaften des Systems sowie die Durchflußgeschwindigkeit des Substrats, die Temperatur usw. beeinflussen gleichfalls den Gesamtablauf der Reaktion.

Detaillierte Beschreibungen der Faktoren, die die enzymatisch katalysierten Reaktionen bei Anwendung immobilisierter Enzyme beeinflussen, wurden auch beim Studium der Prozesse im präparativen Maßstab gewonnen. (I.Chibata, Immobilized Enzymes, J.Wiley and Sons, New York, 1980).

Eine umfassende Anwendung finden die immobilisierten biologisch aktiven Stoffein der Affinitätschromatographie. Diese Methode nutzt die Fähigkeit einer ganzen Reihe von biologisch wirksamen Verbindungen, Sorptionskomplexe mit anderen Verbindungen zu bilden. Dabei ist der Charakter der Wechselwirkungen sehr spezifisch und die Wechselwirkungen selbst reversibel. Ist einer der Bestandteile eines Sorptionskomplexes an einen festen Träger gebunden, dann kommt es unter bestimmten Bedingungen zur selektiven Sorption lediglich der Verbindung (aus einem Gemisch von Verbindungen in Lösung), die sich durch eine spezifische Affinität zur gebundenen Substanz auszeichnet. Mit Hilfe des Trägers des Sorptionskomplexes ist es leicht, diesen von den anderen Komponenten der Lösung zu trennen. Durch Änderung der Bedingungen (pH, lonenstärke, Temperatur, Zugabe eines kompetitiven Sorbats usw.) kommt es zur Dissoziation des Sorptionskomplexes und zur Abtrennung der löslichen Komponente von dem Bestandteil, der am Träger chemisch gebunden ist. Dieses Verfahren findet Anwendung bei der Isolierung und Reinigung von Enzymen, Inhibitoren von Enzymen, von Antikörpern, Antigenen, löslichen Proteinen usw. Die Immobilisierung bioaktiver Verbindungen wird mit Vorzug in der biochemischen Analyse unter Anwendung radioaktiver Markierung oder Verwendung von Markierung mit Chromophoren genutzt.

Als Träger bioaktiver Verbindungen finden eine ganze Reihe von Materialien wie z. B. poröses Glas, Kieselgele, Aktivkohle, Cellulose und deren Derivate Anwendung. Weiterhin gehören dazu Stärke, Agarose, vernetzte Polydextrane, synthetische Polymere und Copolymere (Polyacrylamid, Polystyren, Polyamid, Polymaleinsäureanhydrid, Polyacrylat, Polymethacrylat usw.). Einige Träger haben Nachteile, da sie ionogene Gruppen enthalten, andere zeichnen sich durch eine starke unspezifische Sorptionseigenschaft für Proteine aus. Andere wiederum haben eine ungenügende mechanische, hydrolytische, mikrobielle oder thermische Stabilität bzw. eine unzureichende Verteilung der Porengröße. Dadurch verengt sich der Awendungsbereich • bedeutend. Homogene hydrophile Träger vom Polysaccharid-Typ dürfen in der Mehrzahl nicht austrocknen. Damit sind Lagerung und Transport erschwert.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Herstellung hochaktiver, biologisch wirksamer Verbindungen, die an Träger immobilisiert sind, nach einem wirtschaftlichen Verfahren, welches den ökonomischen Einsatz dieser trägergebundenen Verbindungen in der Biotechnologie (z. B. chemische Stoffwandlung durch enzymatische Katalyse), der analytischen und präperativen Affinitätschromatographie und ähnlichen Verfahren garantiert. Dabei werden an die Eigenschaften der Träger und das Immobilisierungsverfahren Anforderungen gestellt, die die Mängel bisher erprobter Materialien und Methoden beseitigt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Träger, die die genannten Mängel nicht besitzen, mit biologisch wirksamen Verbindungen aus der Gruppe der Enzyme, Proteine, immunaktiven Verbindungen (z. B. Antikörpern, Antigenen), Hormone, Substrate und Inhibitoren usw. zu einem kovalent gebundenen Träger-Konjugat zu vereinigen, das die Aktivität der biologisch (biochemisch) wirksamem Verbindungen in hohem Maße enthält.

Zu den Trägern, die die Mehrzahl der genannten Mängel nicht besitzen, gehören Kopolymerisate von 2-Hydroxyalkylmethacrylaten mit Alkylendimethacrylaten, diefürdie kovalente Immobilisierung durch Substitutionsreaktionen an den Hydroxylgruppen aktiviert werden (J.Coupek, J.Turkova, O.Hubälkovä und M.Kfiväkovä, CS A.O. Nr.167530). Eine weitere detaillierte Studie der Mechanismen der Immobilisierung biologisch wirksamer Verbindungen zeigte, daß die kovalente Bindung möglichst stabil sein soll. Eine hohe Stabilität der Bindung kann allerdings nicht durch Aktivierung mit Bromcyan oder durch Nutzung von Amid-, Sulfid-, Ester- und einigen weiteren Bindungsgruppen erreicht werden. Am geeignetsten zeigte sich die Immobilisierung durch Anwendung reaktiver Epoxidgrupperi nach folgendem Schema:

- CH₀ - CH - CH₀ + H₀N-PrOt.-*-CH₀-CH-CH₀-NH-PrOt.

O OH

wobei Prot. einen Eiweißrest kennzeichnet.

Die Versuche mit der Immobilisierung an das Kopolymere von Glycidylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat (J.Turkova,

K. Blaha, M. Malanikovä, D. Vajcnerova, G.Svec und J. Kälal, Biochim. Biophys. Acta 524,162 [1978]) zeigten, daß die reaktiven Epoxidgruppen, welche in einer dicht vernetzten Matrix des Kopolymeren eingeschlossen sind, nicht voll für die Immobilisierung genutzt werden können und daß ihre nachfolgende Desaktivierung schwierig ist. Deshalb war es vorteilhaft, als Träger die mit Epichlorhydrin aktivierten Kopolymeren von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat zu nutzen. Diese besitzen die Epoxypropylfunktion lediglich auf der inneren Oberfläche der Poren und auf der Oberfläche der Teilchen (J.Turkova, K. Blaha, J.Horäcek, J.Vajcner, A.Frydrychova und J.Coupek, J.Chromatogr. 215,165 [1981]).

Bei direkter Bindung des Proteins an das Epoxypropyl-Derivat von 2-Hydroxyethylmethacrylat-Kopolymeren ist allerdings die Ausbeute an immobilisierter Aktivität in einigen Fällen viel zu niedrig. Diesen Mangel, der sich auch bei anderen bekannten aktivierten synthetischen polymeren Trägern äußert, beseitigt der Gegenstand dieser Erfindung.

Erfindungsgemäß werden die biologisch (biochemisch) wirksamen Verbindungen an den aktivierten makroporösen, polymeren Träger in Gegenwart anorganischer Salze (Konzentration: 0,5 bis 3mol/l) gebunden. Die genannte Konzentration der anorganischen Salze ruft bei der Bindungsreaktion eine Begrenzung oder sogar Ablösung der Solvatationshülle der Eiweißmoleküle hervor. In der ersten Stufe kommt es zur hydrophoben Adsorption biologisch (biochemisch) wirksamer Verbindungen an den Träger. In der zweiten Stufe reagieren dann die biologisch aktiven Verbindungen mitden funktioneilen Gruppen des Trägers unter Ausbildung kovalenter Bindungen.

Die makroporösen polymeren Träger wurden aus der Gruppe der synthetischen Kopolymeren von Hydroxyalkylmethacrylaten (Alkyl C₂ bis C₆) mit Alkylendimethacrylaten (Alkylen C₂ bis C₄), von Kopolymeren von Styren mit Divinylbenzen oder mit Alkylendimethacrylaten (Alkylen C₂ bis C₄), von Kopolymeren von Glyzidylmethacrylaten mit Ethylendimethacrylat, von porösem Glas oder Silicagel ausgewählt.

Die polymeren Träger müssen vorder Immobilisierungsreaktion aktiviert werden. Die reaktiven funktionellen Gruppen wurden aus den Gruppen der Epoxide, Aldehyde, der primären oder sekundären Amine, Carboxyle und Thiole ausgewählt. Vorteilhaft besitzt der makroporöse Träger eine rigide Struktur und eine sphärische Form. Zur Prüfung der Wirksamkeit der Erfindung wurden Verbindungen aus der Gruppe der Enzyme, Inhibitoren der Enzyme und immunoaktive Proteine ausgewählt. Salze, deren Gegenwart bei der Bindung bioaktiver Verbindungen die Ausbeute von gebundenen Proteinen und gebundener Aktivität wesentlich erhöhen, wurden aus der Gruppe der Natrium- und Ammoniumsulfate und -phosphate ausgewählt.

Die Temperatur der Reaktion wird durch die Reaktivität der funktionellen Gruppen der Träger bzw. der bioaktiven Verbindungen bestimmt. Sie liegt im Bereich von 268-303 K. Die Reaktion verläuft im pH-Bereich zwischen 3 und 10 für eine Zeit von 0,5-40 Stunden.

Die Methode der Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen in Gegenwart von höheren Konzentrationen anorganischer Salze auf der Basis dieser Erfindung hat einen universellen Charakter.

Der Mechanismus der Bindung wurde im einzelnen studiert und an einer Reihe unterschiedlicher biologisch (biochemisch) aktiver Verbindungen erprobt.

Der Gegenstand der Erfindung wird an einer Reihe von Ausführungsbeispielen belegt, die allerdings ihren Umfang keineswegs begrenzen.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1:

10mg von Aminoacylase (EC 3.5.1.14) wurden in 5ml 0,2mol/l Phosphatpuffer pH 7,0 aufgelöst. Ammoniumsulfat wurde in fester Form zugegeben bis die Endkonzentration 1,75mol/l betrug. Danach wurden 100mg Kopolymer von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat (SEPARON HEMA1000 Emax mit einer Ausschlußgrenze von 2 · 10^e Dalton, einer Teilchengröße von 40-80 pm und einer Kapazität der an der Oberfläche gebundenen Epoxidgruppen von 1,77mmol/g) zugegeben. Zur Beschleunigung der Durchtränkung der makroporösen Struktur mit der Lösung wurde die Suspension 5Minuten im Vakuum einer Wasserstrahlpumpe (15mmHg) gehalten. Die Immobilisierung der Aminoacylase verlief für eine Zeit von 30 Stunden bei mildem Schütteln der Suspension bei einer Temperatur von 277 K. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Träger-Konjugat mit der Phosphatpufferlösung (pH 0,7) und mit Lösungen von NaCI in Wasser (1-0,1 mol/l) gewaschen. Nachfolgend wurde der Gehalt an gebundenem Protein und an gebundener Enzymaktivität festgestellt. Die Ausbeute der gebundenen Aktivität betrug 10%, bezogen auf vorgelegte Aktivität und 20%, bezogen auf das gebundene Protein.

Beispiel 2:

Die Reaktion wurde analog zum Beispiel 1 nur mit dem Unterschied durchgeführt, daß sie in Gegenwart einer optimalen Menge von Ammoniumhydrogenphosphat (1,5mol/l) erfolgte. Die Ausbeuten waren ähnlich wie im Beispiel 1.

Beispiel 3:

1 mgThermitase (EC 3.4.21.14) wurde in 5 ml 0,2 mol/l Phosphatpuffer pH 8,0 gelöst. Dann wurde eine Lösung von Ammoniumsulfat zugegeben bis die Endkonzentration des Salzes 2,0mol/l betrug. Ähnlich wie im Beispiel 1 wurden 100mg Kopolymeres von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat (modifiziert mit einem Epoxidgruppengehalt von 1,77 mmol/g) zugegeben und die Suspenion für 5 Minuten evakuiert. Die Reaktion dauerte 40 Stunden bei einer Temperatur von 293 K unter mildem Schütteln. Die Aktivitätsausbeute betrug 10%.

Beispiel 4:

Die Reaktion wurde analog zum Beispiel 3 ausgeführt nur mit dem Unterschied, daß als Salz Natriumsulfat bis zur Endkonzentration von 1,25mol/l zugesetzt wurde. Die anderen Reaktionsbedingungen und die Ausbeute ähneln denen des Beispiels 3.

Beispiel 5:

Zu 1 mg Penicillinamidohydrolase (EC 3.5.1.11) in 5 ml 0,2 mol/l Phosphatpuffer pH 8,0 wurden 100 mg aktivierter Träger (SEPARON HEMAIOOOEmax) der Partikelgröße 110-200μιη zugegeben und die Suspension kurz evakuiert. Nach und nach wurde eine gesättigte Lösung von Ammoniumsulfat zugefügt bis die Endkonzentration des Salzes 2,5 mol/l betrug. Die Reaktion dauerte 40 Stunden bei 277 K unter mildem Schütteln. Die Bearbeitung des Reaktionsgemisches wurde ähnlich wie im Beispiel 1 durchgeführt. Die Aktivitätsausbeute betrug 45%.

Beispiel 6:

Zu 5 mg Elastase (EC 3.4.21.36) in 5 ml 0,2 mol/l Phosphatpuffer wurden 100 mg Kopolymer von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Butylendimethacrylat (Ausschlußgrenze 8 · 10⁵DaItOn, Partikelgröße 80-100Mm) aktiviert mit Epoxidgruppen (Kapazität 1,25mmol/g) zugegeben. Es wurde wie in den anderen Beispielen evakuiert und eine Lösung von Dinatriumhydrogenphosphat bis zur Endkonzentration von 1,5 mol/l zugeführt. Bei 277 K dauerte die Reaktion bei mildem Schütteln 20 Stunden. Die Aktivitätsausbeute lag bei 17%.

Beispiel 7:

10mg Cystathiomin-ß-synthese (EC 4.2.1.22) wurden in 5ml 0,2 mol/l TRIS/HCI-Puffer pH 8,7 gelöst. Dazu wurden 100mg Träger (wie im Beispiel 1) und eine Lösung von Ammoniumsulfat bis zur Salzkonzentration 2,5 mol/l zugefügt. Die Reaktion dauerte 40 Stunden bei 269 K. Die Aufarbeitung erfolgte wie im Beispiel 1. Die Aktivitätsausbeute betrug 35%.

Beispiel 8:

1 mg CarboxypeptidaseA(EC 3.4.17.1) wurde in 5 ml 0,2 mol/l Phosphatpuffer pH7,6 gelöst und mit 100 mg eines kopolymeren Trägers (Glyzidylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat 1:2, Ausschlußgrenze 1 10⁶DaItOn, Partikelgröße 100-200 pm) versetzt, wie üblich evakuiert und die Kupplungsreaktion in Gegenwart von 2 mol/l Ammoniumsulfat bei 277 K innerhalb von 20 Stunden bei mildem Schütteln ausgeführt. Die Aufarbeitung nach Beispiel 1 ergab ein Konjugat mit einer Aktivitätsausbeute von 11,5%.

Beispiel 9:

3 mg Anti-cathepsion D-IgG wurden in 5 ml 0,2 Phosphatpuffer pH 8,0 aufgelöst und an den selben Träger wie im Beispiel 1 gebunden, wobei die Ammoniumsulfatkonzentration 1,5mol/l, die Temperatur 298 K und die Reaktionsdauer 24 Stunden betrugen. Danach wurde das Trägerkonjugat abgesaugt, mit Ausgangspuffer gewaschen, in eine Säule gefüllt und zur affinitätschromatographischen Gewinnung von Cathepsin D eingesetzt.

Beispiel 10:

250mg einesTrägers nach Beispie! 1 wurden bei 323K mit 1 g Hexamethylendiamin in 5ml Wasserfür die Zeit von 3 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser gewaschen. Der feuchte Träger wurde nach dem Durchwaschen in 2 ml einer 5%igen Lösung von Glutaraldehyd für 20 Stunden geschüttelt, mit Wasser gewaschen, bis die negative Reaktion mit Dinitropheny!hydrazin erreicht war. Der feuchte, aktivierte Träger wurde mit der Lösung von Trypsin-Inhibitor (isoliert aus Kartoffeln) (1 mg/ml) vermischt. Weiterhin wurden 2 ml 1 · 25mol/l Natriumsulfat zugegeben, und nach 5 Stunden milden Schütteins bei 298 K wurde das Gemisch abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Der immobilisierte Inhibitor wurde für die affinitätschromatographische Reinigung von Trypsin eingesetzt.

Beispiel 11:

10mg Chymotrypsin (EC 3.4.21.1) wurden in 5ml 0,2mol/l Phosphatpuffer pH8,0 gelöst und dazu 100mg einesTrägers auf der Basis von epoxypropyliertem Derivat von Silicagel (Ausschlußgrenze 5 · 10⁵DaItOn, Kapazität 0,5 mmol/g) gegeben. Nach Zufügung von Ammoniumsulfat (Endkonzentration 2,5mol/l) wurde die Kupplung über 20 Stunden bei 303K durchgeführt. Nach dem Waschen des Konjugats wie im Beispiel 1 wurde die Aktivitätsausbeute ermittelt. Sie betrug 8,5%.

Beispiel 12:

Der Versuch wurde analog zum Beispiel 11 ausgeführt nur mit dem Unterschied, daß sich für die Anwendung a Is Träger poröses Glas mit einem mittleren Porendurchmesser von 50nm als günstig erwies. Der Träger wurde durch Reaktion mit Triethoxyepoxypropylsilan aktiviert. Die Ausbeute der Aktivität des immobilisierten Chymotrypsins betrug 9,7%.

Beispiel 13:

10 mg Trypsin (EC 3.4.21.4) wurden in 5mlO,2mol/l Phosphatpuffer pH 8,0 gelöst und 100 mg de's Trägers von Beispiel 1 zugefügt. Bei der Konzentration von Ammoniumsulfat von 2,5mol/l dauerte die Reaktion bei 293 K 20 Stunden.

Beispiel 14:

10mg Pepsin (EC 3.4.23.1) wurden in 5 ml 0,1 mol/l Acetatpuffer pH 4,0 analog Beispiel 1 mit 100 mg Träger vermischt. Bei einer optimalen Konzentration von Ammoniumsulfat von 1,25 mol/l dauerte die Reaktion 24 Stunden bei 298 K. Nach dem Waschprozeß (siehe Beispiel 1) wurde eine Ausbeute der immobilisierten Pepsinaktivität von 15% ermittelt.

Beispiel 15:

Zu 100 mg Insulin in 5 ml eines 0,05 mol/l Phosphatpuffers pH 8,0 wurden 100 mg eines epoxidaktivierten Trägers nach Beispiel 1 zugegeben. Die Kupplungsreaktion verlief in Gegenwart von 1,75 mol/l Dinatriumhydrogenphosphatbei298Küber50 Stunden. Das gebundene Insulin wurde in der Affinitätschromatographie von Antikörpern gegen Insulin aus AntiihsulinrSerum in 0,1 mol/l Natriumbarbiturat pH 8,8 mit einem Gehalt von 3% Albumin angewandt. Die Desorption wurde mit einer Lösung von 3 mol/l HCI durchgeführt.

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung hochaktiverträgergebundener biologisch aktiver Substanzen für die chemische Stoffwandlung, die enzymatische Katalyse und für die analytische und präparative Trennungs-Technik durch hydrolytisch stabile kovalente Bindung biologisch (biochemisch) wirksamer Verbindungen an makroporöse polymere Träger_fgekennzeichnet dadurch, daß die biologisch (biochemisch) wirksamen Verbindungen an aktivierte makroporöse polymere Träger kovalent gebunden werden in Gegenwart einer Lösung anorganischer Salze, die in Konzentrationen von 0,5 bis 3 mol/l vorliegen soll, wobei die genannten Konzentrationen der anorganischen Salze einen zweistufigen Bindungsprozeß bewirken, dessen erste Stufe zu einer hydrophoben Adsorption biologisch wirksamer Verbindungen an den Träger führt und in der zweiten Stufe dann die biologisch wirksame Verbindung mit dem Träger unter Ausbildung kovalenter Bindungen reagiert.' 2

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die makroporösen polymeren Träger aus der Gruppe der Kopolymeren von Hydroxyalkylmethacrylaten (Alkyl C₂ bis Cs) mit Alkylendimethacrylaten (Alkylen C₂ bis CJ, der Kopolymeren von Styren mit Divinylbenzen oder mit Alkylendimethacrylaten (Alkylen C₂ bis C₄), der Kopolymeren von Glyzidylmethacrylat mit Alkylendimetharylat (Alkylen C₂ bis C4) von porösem Glas oder Silicagel ausgewählt werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die makroporösen polymeren Träger funktionell Gruppen enthalten, die aus der Gruppe der Epoxide, Aldehyde, primären oder sekundären Amine, Carboxyle oder Thiole ausgewählt werden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die makroporösen polymeren Träger eine rigide Struktur und eine sphärische Form haben.

5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die kovalent gebundenen biologisch wirksamen Verbindungen aus der Gruppe der Enzyme, der Inhibitoren der Enzyme und der immunaktiven Proteine ausgewählt werden.

6.. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Salze aus der Gruppe der Natriumphosphate,

Ammoniumphosphate, Natriumsulfate und Ammoniumsulfate ausgewählt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Kupplungsreaktion im Temperaturbereich 268 bis 303 K und im pH-Bereich von 3 bis 10 in einer Zeit von 0,5 bis 50 Stunden verläuft.