DD242240A1

DD242240A1 - OPTICAL FILTER MATERIALS FOR THE NEAR IR-RANGE

Info

Publication number: DD242240A1
Authority: DD
Publication date: 1987-01-21

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Immobilisierung bioaktiver Verbindungen zum Zwecke der chemischen Stoffwandlung, der enzymatischen Katalyse und zur analytischen und praeparativen Trennungstechnik. Ziel und Aufgabe der Erfindung sind die Herstellung immobilisierter biologisch aktiver Verbindungen (Enzyme, Inhibitoren, immunaktive Proteine), die mit hoher Aktivitaetsausbeute kovalent an makroporoese synthetische polymere Traeger gebunden sind, die eine rigide Struktur und sphaerische Form besitzen. Wesen der Erfindung ist ein zweistufiger Prozess, bei dem an der polymeren, reaktive Gruppen tragenden Matrix aus waessriger Loesung biologisch aktive Verbindungen unter Bildung stabiler kovalenter Bindungen fixiert werden. Der Prozess der Immobilisierung ist in der ersten Stufe durch hydrophobe Adsorption charakterisiert, die durch Zugabe anorganischer Salze in einem bestimmten Konzentrationsbereich optimal erfolgt. In der zweiten Stufe reagieren die adsorbierten biologisch wirksamen Verbindungen mit den reaktiven funktionellen Gruppen des Traegers unter Ausbildung hydrolysestabiler kovalenter Bindungen.The invention relates to the immobilization of bioactive compounds for the purpose of chemical conversion, enzymatic catalysis and analytical and preparative separation technique. The aim and object of the invention are the preparation of immobilized biologically active compounds (enzymes, inhibitors, immunoactive proteins) which are covalently bound with high activity yield to macroporous synthetic polymeric carriers which have a rigid structure and spherical form. Essence of the invention is a two-stage process in which biologically active compounds are immobilized on the polymeric, reactive group-bearing matrix of aqueous solution to form stable covalent bonds. The process of immobilization is characterized in the first stage by hydrophobic adsorption, which takes place optimally by adding inorganic salts in a certain concentration range. In the second step, the adsorbed biologically active compounds react with the reactive functional groups of the carrier to form hydrolysis-stable covalent bonds.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Immobilisierung von Enzymen, Proteinen, Hormonen und andere biologisch aktiven Wirkstoffen zum Zwecke des Einsatzes in der Biotechnologie, bei der Isolierung von Proteinen und Enzymen, in der Immunologie, in der Affinitätschromatographie.The invention relates to the field of immobilization of enzymes, proteins, hormones and other biologically active agents for use in biotechnology, in the isolation of proteins and enzymes, in immunology, in affinity chromatography.

Characteristic of the known technical solutions

Die Forschung mit und die Nutzung von immobilisierten biologisch wirksamen Verbindungen stellt gegenwärtig einen bedeutenden Faktor bei Entwicklungs- und Anwendungsprojekten der Biotechnologie und verwandter Disziplinen dar, wobei der praktische Nutzen bedeutend ist. Die Herstellung und Anwendung unlöslicher Enzyme durch die Bindung löslicher Enzyme an einen Träger erlaubt die wiederholte Nutzung des katalytischen Systems im batch-Verfahren oder bei anderer Gestaltung des Enzym reaktors. Dabei hat das unlösliche Enzym die Funktion eines spezifischen heterogenen Katalysators. Diese Ausführung der enzymatisch katalysierten Reaktion erleichtert die nachfolgende Abtrennung des Enzyms vom Substrat und den Reaktionsprodukten. Bei mehrfacher oder kontinuierlicher Reaktionsführung werden die Kosten gesenkt und die Automatisierung des Prozesses wird kostengünstiger.Research on and use of immobilized biologically active compounds is currently a significant factor in development and application projects in biotechnology and related disciplines, the practical benefits of which are significant. The preparation and application of insoluble enzymes by the binding of soluble enzymes to a carrier allows the repeated use of the catalytic system in the batch process or in other design of the enzyme reactor. The insoluble enzyme has the function of a specific heterogeneous catalyst. This embodiment of the enzymatically catalyzed reaction facilitates subsequent separation of the enzyme from the substrate and the reaction products. With multiple or continuous reaction control, costs are reduced and automation of the process becomes more cost effective.

Bei Wechselwirkungen des Substrats mit kovalent immobilisierten Enzymen ist die Geschwindigkeit der enzymatisch katalysierten Reaktion nicht nur vom Typ und der Aktivität des Enzyms abhängig, sondern auch vom Charakter der Bindung des Enzyms zum Träger und von den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Trägers (Größe und Verteilung der Poren, Hydrophilie der Oberfläche usw.). Die hydrodynamischen Eigenschaften des Systems sowie die Durchflußgeschwindigkeit des Substrats, die Temperatur usw. beeinflussen gleichfalls den Gesamtablauf der Reaktion.In interactions of the substrate with covalently immobilized enzymes, the rate of the enzymatically catalyzed reaction is not only dependent on the type and activity of the enzyme, but also on the nature of the binding of the enzyme to the carrier and on the physicochemical properties of the carrier (size and distribution of the carrier) Pores, hydrophilicity of the surface, etc.). The hydrodynamic properties of the system as well as the flow rate of the substrate, the temperature, etc., also affect the overall reaction process.

Detaillierte Beschreibungen der Faktoren, die die enzymatisch katalysierten Reaktionen bei Anwendung immobilisierter Enzyme beeinflussen, wurden auch beim Studium der Prozesse im präparativen Maßstab gewonnen. (I.Chibata, Immobilized Enzymes, J.Wiley and Sons, New York, 1980).Detailed descriptions of the factors that influence enzymatically catalyzed reactions using immobilized enzymes have also been gained in the study of preparative scale processes. (I.Chibata, Immobilized Enzymes, J. Wiley and Sons, New York, 1980).

Eine umfassende Anwendung finden die immobilisierten biologisch aktiven Stoffein der Affinitätschromatographie. Diese Methode nutzt die Fähigkeit einer ganzen Reihe von biologisch wirksamen Verbindungen, Sorptionskomplexe mit anderen Verbindungen zu bilden. Dabei ist der Charakter der Wechselwirkungen sehr spezifisch und die Wechselwirkungen selbst reversibel. Ist einer der Bestandteile eines Sorptionskomplexes an einen festen Träger gebunden, dann kommt es unter bestimmten Bedingungen zur selektiven Sorption lediglich der Verbindung (aus einem Gemisch von Verbindungen in Lösung), die sich durch eine spezifische Affinität zur gebundenen Substanz auszeichnet. Mit Hilfe des Trägers des Sorptionskomplexes ist es leicht, diesen von den anderen Komponenten der Lösung zu trennen. Durch Änderung der Bedingungen (pH, lonenstärke, Temperatur, Zugabe eines kompetitiven Sorbats usw.) kommt es zur Dissoziation des Sorptionskomplexes und zur Abtrennung der löslichen Komponente von dem Bestandteil, der am Träger chemisch gebunden ist. Dieses Verfahren findet Anwendung bei der Isolierung und Reinigung von Enzymen, Inhibitoren von Enzymen, von Antikörpern, Antigenen, löslichen Proteinen usw. Die Immobilisierung bioaktiver Verbindungen wird mit Vorzug in der biochemischen Analyse unter Anwendung radioaktiver Markierung oder Verwendung von Markierung mit Chromophoren genutzt.The immobilized biologically active substances in affinity chromatography are widely used. This method utilizes the ability of a range of biologically active compounds to form sorbent complexes with other compounds. The character of the interactions is very specific and the interactions themselves are reversible. If one of the constituents of a sorption complex is bound to a solid carrier, then under certain conditions, only the compound (from a mixture of compounds in solution) which has a specific affinity for the bound substance is selectively sorbed. With the help of the support of the sorption complex, it is easy to separate it from the other components of the solution. By changing the conditions (pH, ionic strength, temperature, addition of a competitive sorbate, etc.), dissociation of the sorbent complex and separation of the soluble component from the component which is chemically bound to the carrier occurs. This method finds application in the isolation and purification of enzymes, inhibitors of enzymes, antibodies, antigens, soluble proteins, etc. Immobilization of bioactive compounds is preferably used in biochemical analysis using radioactive labeling or using labeling with chromophores.

Als Träger bioaktiver Verbindungen finden eine ganze Reihe von Materialien wie z. B. poröses Glas, Kieselgele, Aktivkohle, Cellulose und deren Derivate Anwendung. Weiterhin gehören dazu Stärke, Agarose, vernetzte Polydextrane, synthetische Polymere und Copolymere (Polyacrylamid, Polystyren, Polyamid, Polymaleinsäureanhydrid, Polyacrylat, Polymethacrylat usw.). Einige Träger haben Nachteile, da sie ionogene Gruppen enthalten, andere zeichnen sich durch eine starke unspezifische Sorptionseigenschaft für Proteine aus. Andere wiederum haben eine ungenügende mechanische, hydrolytische, mikrobielle oder thermische Stabilität bzw. eine unzureichende Verteilung der Porengröße. Dadurch verengt sich der Awendungsbereich • bedeutend. Homogene hydrophile Träger vom Polysaccharid-Typ dürfen in der Mehrzahl nicht austrocknen. Damit sind Lagerung und Transport erschwert.As carriers of bioactive compounds find a whole range of materials such. As porous glass, silica gels, activated carbon, cellulose and derivatives thereof application. It also includes starch, agarose, cross-linked polydextranes, synthetic polymers and copolymers (polyacrylamide, polystyrene, polyamide, polymaleic anhydride, polyacrylate, polymethacrylate, etc.). Some carriers have disadvantages because they contain ionogenic groups, others are characterized by a strong unspecific sorption property for proteins. Others have inadequate mechanical, hydrolytic, microbial or thermal stability or insufficient pore size distribution. This narrows the area of application significantly. Homogeneous polysaccharide-type hydrophilic carriers must not dry out in the majority. This makes storage and transport difficult.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist die Herstellung hochaktiver, biologisch wirksamer Verbindungen, die an Träger immobilisiert sind, nach einem wirtschaftlichen Verfahren, welches den ökonomischen Einsatz dieser trägergebundenen Verbindungen in der Biotechnologie (z. B. chemische Stoffwandlung durch enzymatische Katalyse), der analytischen und präperativen Affinitätschromatographie und ähnlichen Verfahren garantiert. Dabei werden an die Eigenschaften der Träger und das Immobilisierungsverfahren Anforderungen gestellt, die die Mängel bisher erprobter Materialien und Methoden beseitigt.The aim of the invention is the production of highly active, biologically active compounds immobilized on carriers, according to an economic process which permits the economical use of these carrier-bound compounds in biotechnology (eg chemical conversion by enzymatic catalysis), analytical and preparative affinity chromatography and similar procedures. Requirements are made of the properties of the carrier and the immobilization process, which eliminates the deficiencies of previously proven materials and methods.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Träger, die die genannten Mängel nicht besitzen, mit biologisch wirksamen Verbindungen aus der Gruppe der Enzyme, Proteine, immunaktiven Verbindungen (z. B. Antikörpern, Antigenen), Hormone, Substrate und Inhibitoren usw. zu einem kovalent gebundenen Träger-Konjugat zu vereinigen, das die Aktivität der biologisch (biochemisch) wirksamem Verbindungen in hohem Maße enthält.It is an object of the present invention to provide a covalent carrier which does not possess the deficiencies mentioned above with biologically active compounds from the group of enzymes, proteins, immunoactive compounds (eg antibodies, antigens), hormones, substrates and inhibitors, etc. bound carrier conjugate containing the activity of the biologically (biochemically) active compounds to a high degree.

Zu den Trägern, die die Mehrzahl der genannten Mängel nicht besitzen, gehören Kopolymerisate von 2-Hydroxyalkylmethacrylaten mit Alkylendimethacrylaten, diefürdie kovalente Immobilisierung durch Substitutionsreaktionen an den Hydroxylgruppen aktiviert werden (J.Coupek, J.Turkova, O.Hubälkovä und M.Kfiväkovä, CS A.O. Nr.167530). Eine weitere detaillierte Studie der Mechanismen der Immobilisierung biologisch wirksamer Verbindungen zeigte, daß die kovalente Bindung möglichst stabil sein soll. Eine hohe Stabilität der Bindung kann allerdings nicht durch Aktivierung mit Bromcyan oder durch Nutzung von Amid-, Sulfid-, Ester- und einigen weiteren Bindungsgruppen erreicht werden. Am geeignetsten zeigte sich die Immobilisierung durch Anwendung reaktiver Epoxidgrupperi nach folgendem Schema:Carriers lacking the majority of the deficiencies include copolymers of 2-hydroxyalkyl methacrylates with alkylenedimethacrylates, which are activated for covalent immobilization by substitution reactions on the hydroxyl groups (J.Coupek, J.Turkova, O.Hubälkovä and M.Kfiväkovä, CS AO No. 167530). Another detailed study of the mechanisms of immobilization of biologically active compounds showed that the covalent bond should be as stable as possible. However, a high stability of the binding can not be achieved by activation with cyanogen bromide or by using amide, sulfide, ester and some other bonding groups. Immobilization was most suitably achieved by the use of reactive epoxide groups according to the following scheme:

- CH₀ - CH - CH₀ + H₀N-PrOt.-*-CH₀-CH-CH₀-NH-PrOt.- CH ₀ - CH - CH ₀ + H ₀ N-PrOt .- * - CH ₀ -CH-CH ₀ -NH-PrOt.

O OHOH

wobei Prot. einen Eiweißrest kennzeichnet.where Prot. denotes a protein residue.

Die Versuche mit der Immobilisierung an das Kopolymere von Glycidylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat (J.Turkova,The experiments with the immobilization to the copolymer of glycidyl methacrylate with ethylene dimethacrylate (J.Turkova,

K. Blaha, M. Malanikovä, D. Vajcnerova, G.Svec und J. Kälal, Biochim. Biophys. Acta 524,162 [1978]) zeigten, daß die reaktiven Epoxidgruppen, welche in einer dicht vernetzten Matrix des Kopolymeren eingeschlossen sind, nicht voll für die Immobilisierung genutzt werden können und daß ihre nachfolgende Desaktivierung schwierig ist. Deshalb war es vorteilhaft, als Träger die mit Epichlorhydrin aktivierten Kopolymeren von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat zu nutzen. Diese besitzen die Epoxypropylfunktion lediglich auf der inneren Oberfläche der Poren und auf der Oberfläche der Teilchen (J.Turkova, K. Blaha, J.Horäcek, J.Vajcner, A.Frydrychova und J.Coupek, J.Chromatogr. 215,165 [1981]).K. Blaha, M. Malanikova, D. Vajcnerova, G. Svec and J. Kaelal, Biochim. Biophys. Acta 524, 162 [1978]) showed that the reactive epoxide groups trapped in a densely crosslinked matrix of the copolymer can not be fully utilized for immobilization and that their subsequent deactivation is difficult. Therefore, it was advantageous to use as the carrier the epichlorohydrin-activated copolymers of 2-hydroxyethyl methacrylate with ethylene dimethacrylate. These have the epoxypropyl function only on the inner surface of the pores and on the surface of the particles (J.Turkova, K. Blaha, J. Horacek, J. Vajcner, A.Frydrychova, and J. Coupek, J. Chromatogr. 215, 165 [1981] ).

Bei direkter Bindung des Proteins an das Epoxypropyl-Derivat von 2-Hydroxyethylmethacrylat-Kopolymeren ist allerdings die Ausbeute an immobilisierter Aktivität in einigen Fällen viel zu niedrig. Diesen Mangel, der sich auch bei anderen bekannten aktivierten synthetischen polymeren Trägern äußert, beseitigt der Gegenstand dieser Erfindung.However, upon direct binding of the protein to the epoxypropyl derivative of 2-hydroxyethyl methacrylate copolymers, the yield of immobilized activity is in many cases far too low. This deficiency, which also manifests itself in other known activated synthetic polymeric carriers, is eliminated by the subject of this invention.

Erfindungsgemäß werden die biologisch (biochemisch) wirksamen Verbindungen an den aktivierten makroporösen, polymeren Träger in Gegenwart anorganischer Salze (Konzentration: 0,5 bis 3mol/l) gebunden. Die genannte Konzentration der anorganischen Salze ruft bei der Bindungsreaktion eine Begrenzung oder sogar Ablösung der Solvatationshülle der Eiweißmoleküle hervor. In der ersten Stufe kommt es zur hydrophoben Adsorption biologisch (biochemisch) wirksamer Verbindungen an den Träger. In der zweiten Stufe reagieren dann die biologisch aktiven Verbindungen mitden funktioneilen Gruppen des Trägers unter Ausbildung kovalenter Bindungen.According to the invention, the biologically (biochemically) active compounds are bound to the activated macroporous, polymeric carrier in the presence of inorganic salts (concentration: 0.5 to 3 mol / l). The stated concentration of the inorganic salts in the binding reaction causes a limitation or even detachment of the solvation shell of the protein molecules. In the first stage, hydrophobic adsorption of biologically (biochemically) active compounds to the carrier occurs. In the second stage, the biologically active compounds then react with the functional groups of the carrier to form covalent bonds.

Die makroporösen polymeren Träger wurden aus der Gruppe der synthetischen Kopolymeren von Hydroxyalkylmethacrylaten (Alkyl C₂ bis C₆) mit Alkylendimethacrylaten (Alkylen C₂ bis C₄), von Kopolymeren von Styren mit Divinylbenzen oder mit Alkylendimethacrylaten (Alkylen C₂ bis C₄), von Kopolymeren von Glyzidylmethacrylaten mit Ethylendimethacrylat, von porösem Glas oder Silicagel ausgewählt.The macroporous polymeric supports were selected from the group of synthetic copolymers of hydroxyalkyl methacrylates (alkyl C ₂ to C ₆ ) with alkylenedimethacrylates (alkylene C ₂ to C ₄ ), copolymers of styrene with divinylbenzene or with alkylenedimethacrylates (alkylene C ₂ to C ₄ ), of copolymers of glycidyl methacrylates with ethylene dimethacrylate, of porous glass or silica gel.

Die polymeren Träger müssen vorder Immobilisierungsreaktion aktiviert werden. Die reaktiven funktionellen Gruppen wurden aus den Gruppen der Epoxide, Aldehyde, der primären oder sekundären Amine, Carboxyle und Thiole ausgewählt. Vorteilhaft besitzt der makroporöse Träger eine rigide Struktur und eine sphärische Form. Zur Prüfung der Wirksamkeit der Erfindung wurden Verbindungen aus der Gruppe der Enzyme, Inhibitoren der Enzyme und immunoaktive Proteine ausgewählt. Salze, deren Gegenwart bei der Bindung bioaktiver Verbindungen die Ausbeute von gebundenen Proteinen und gebundener Aktivität wesentlich erhöhen, wurden aus der Gruppe der Natrium- und Ammoniumsulfate und -phosphate ausgewählt.The polymeric supports must be activated prior to immobilization reaction. The reactive functional groups were selected from the groups of epoxides, aldehydes, primary or secondary amines, carboxyls and thiols. Advantageously, the macroporous support has a rigid structure and a spherical shape. To test the effectiveness of the invention, compounds from the group of enzymes, inhibitors of enzymes and immunoactive proteins were selected. Salts whose presence in the binding of bioactive compounds substantially increase the yield of bound proteins and bound activity were selected from the group of sodium and ammonium sulfates and phosphates.

Die Temperatur der Reaktion wird durch die Reaktivität der funktionellen Gruppen der Träger bzw. der bioaktiven Verbindungen bestimmt. Sie liegt im Bereich von 268-303 K. Die Reaktion verläuft im pH-Bereich zwischen 3 und 10 für eine Zeit von 0,5-40 Stunden.The temperature of the reaction is determined by the reactivity of the functional groups of the carriers or of the bioactive compounds. It is in the range of 268-303 K. The reaction proceeds in the pH range between 3 and 10 for a period of 0.5-40 hours.

Die Methode der Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen in Gegenwart von höheren Konzentrationen anorganischer Salze auf der Basis dieser Erfindung hat einen universellen Charakter.The method of immobilizing biologically active compounds in the presence of higher concentrations of inorganic salts based on this invention has a universal character.

Der Mechanismus der Bindung wurde im einzelnen studiert und an einer Reihe unterschiedlicher biologisch (biochemisch) aktiver Verbindungen erprobt.The mechanism of binding has been studied in detail and tested on a variety of different biologically (biochemically) active compounds.

Der Gegenstand der Erfindung wird an einer Reihe von Ausführungsbeispielen belegt, die allerdings ihren Umfang keineswegs begrenzen.The object of the invention will be evidenced by a number of embodiments which, however, by no means limit their scope.

embodiments Example 1:

10mg von Aminoacylase (EC 3.5.1.14) wurden in 5ml 0,2mol/l Phosphatpuffer pH 7,0 aufgelöst. Ammoniumsulfat wurde in fester Form zugegeben bis die Endkonzentration 1,75mol/l betrug. Danach wurden 100mg Kopolymer von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat (SEPARON HEMA1000 Emax mit einer Ausschlußgrenze von 2 · 10^e Dalton, einer Teilchengröße von 40-80 pm und einer Kapazität der an der Oberfläche gebundenen Epoxidgruppen von 1,77mmol/g) zugegeben. Zur Beschleunigung der Durchtränkung der makroporösen Struktur mit der Lösung wurde die Suspension 5Minuten im Vakuum einer Wasserstrahlpumpe (15mmHg) gehalten. Die Immobilisierung der Aminoacylase verlief für eine Zeit von 30 Stunden bei mildem Schütteln der Suspension bei einer Temperatur von 277 K. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Träger-Konjugat mit der Phosphatpufferlösung (pH 0,7) und mit Lösungen von NaCI in Wasser (1-0,1 mol/l) gewaschen. Nachfolgend wurde der Gehalt an gebundenem Protein und an gebundener Enzymaktivität festgestellt. Die Ausbeute der gebundenen Aktivität betrug 10%, bezogen auf vorgelegte Aktivität und 20%, bezogen auf das gebundene Protein.10 mg of aminoacylase (EC 3.5.1.14) were dissolved in 5 ml of 0.2 mol / l phosphate buffer pH 7.0. Ammonium sulfate was added in solid form until the final concentration was 1.75 mol / l. Thereafter, 100mg copolymer of 2-hydroxyethyl methacrylate with ethylene dimethacrylate were (Separon HEMA1000 Emax having an exclusion limit of 2 x 10 ^e Dalton, a particle size of 40-80 pm and a capacity of the surface-bound epoxide groups of 1,77mmol / g) was added. To accelerate the saturation of the macroporous structure with the solution, the suspension was held for 5 minutes in the vacuum of a water jet pump (15 mmHg). The immobilization of the aminoacylase proceeded for a period of 30 hours with gentle shaking of the suspension at a temperature of 277 K. After completion of the reaction, the carrier conjugate was treated with the phosphate buffer solution (pH 0.7) and with solutions of NaCl in water (1 -0.1 mol / l). Subsequently, the content of bound protein and bound enzyme activity was determined. The yield of the bound activity was 10% based on the supplied activity and 20% on the bound protein.

Example 2:

Die Reaktion wurde analog zum Beispiel 1 nur mit dem Unterschied durchgeführt, daß sie in Gegenwart einer optimalen Menge von Ammoniumhydrogenphosphat (1,5mol/l) erfolgte. Die Ausbeuten waren ähnlich wie im Beispiel 1.The reaction was carried out analogously to Example 1 with the difference that it was carried out in the presence of an optimal amount of ammonium hydrogen phosphate (1.5 mol / l). The yields were similar to Example 1.

Example 3:

1 mgThermitase (EC 3.4.21.14) wurde in 5 ml 0,2 mol/l Phosphatpuffer pH 8,0 gelöst. Dann wurde eine Lösung von Ammoniumsulfat zugegeben bis die Endkonzentration des Salzes 2,0mol/l betrug. Ähnlich wie im Beispiel 1 wurden 100mg Kopolymeres von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat (modifiziert mit einem Epoxidgruppengehalt von 1,77 mmol/g) zugegeben und die Suspenion für 5 Minuten evakuiert. Die Reaktion dauerte 40 Stunden bei einer Temperatur von 293 K unter mildem Schütteln. Die Aktivitätsausbeute betrug 10%.1 mg of thermitase (EC 3.4.21.14) was dissolved in 5 ml of 0.2 M phosphate buffer pH 8.0. Then, a solution of ammonium sulfate was added until the final concentration of the salt was 2.0 mol / l. Similar to Example 1, 100 mg of 2-hydroxyethyl methacrylate copolymer with ethylene dimethacrylate (modified with an epoxide group content of 1.77 mmol / g) were added and the suspension was evacuated for 5 minutes. The reaction lasted 40 hours at a temperature of 293 K with gentle shaking. The activity yield was 10%.

Example 4:

Die Reaktion wurde analog zum Beispiel 3 ausgeführt nur mit dem Unterschied, daß als Salz Natriumsulfat bis zur Endkonzentration von 1,25mol/l zugesetzt wurde. Die anderen Reaktionsbedingungen und die Ausbeute ähneln denen des Beispiels 3.The reaction was carried out analogously to Example 3, but with the difference that sodium sulfate was added as salt to the final concentration of 1.25 mol / l. The other reaction conditions and the yield are similar to those of Example 3.

Example 5:

Zu 1 mg Penicillinamidohydrolase (EC 3.5.1.11) in 5 ml 0,2 mol/l Phosphatpuffer pH 8,0 wurden 100 mg aktivierter Träger (SEPARON HEMAIOOOEmax) der Partikelgröße 110-200μιη zugegeben und die Suspension kurz evakuiert. Nach und nach wurde eine gesättigte Lösung von Ammoniumsulfat zugefügt bis die Endkonzentration des Salzes 2,5 mol/l betrug. Die Reaktion dauerte 40 Stunden bei 277 K unter mildem Schütteln. Die Bearbeitung des Reaktionsgemisches wurde ähnlich wie im Beispiel 1 durchgeführt. Die Aktivitätsausbeute betrug 45%.To 1 mg of penicillin amidohydrolase (EC 3.5.1.11) in 5 ml of 0.2 mol / l phosphate buffer pH 8.0 were added 100 mg of activated carrier (SEPARON HEMAIOOOEmax) of particle size 110-200μιη and briefly evacuated the suspension. Gradually, a saturated solution of ammonium sulfate was added until the final concentration of the salt was 2.5 mol / l. The reaction lasted 40 hours at 277 K with gentle shaking. The processing of the reaction mixture was carried out similarly as in Example 1. The activity yield was 45%.

Example 6:

Zu 5 mg Elastase (EC 3.4.21.36) in 5 ml 0,2 mol/l Phosphatpuffer wurden 100 mg Kopolymer von 2-Hydroxyethylmethacrylat mit Butylendimethacrylat (Ausschlußgrenze 8 · 10⁵DaItOn, Partikelgröße 80-100Mm) aktiviert mit Epoxidgruppen (Kapazität 1,25mmol/g) zugegeben. Es wurde wie in den anderen Beispielen evakuiert und eine Lösung von Dinatriumhydrogenphosphat bis zur Endkonzentration von 1,5 mol/l zugeführt. Bei 277 K dauerte die Reaktion bei mildem Schütteln 20 Stunden. Die Aktivitätsausbeute lag bei 17%.To 5 mg elastase (EC 3.4.21.36) in 5 ml 0.2 mol / l phosphate buffer, 100 mg copolymer of 2-hydroxyethyl methacrylate with butylene dimethacrylate (exclusion limit 8 · 10 ⁵ DaItOn, particle size 80-100 μm) were activated with epoxide groups (capacity 1, 25mmol / g) was added. It was evacuated as in the other examples and fed a solution of disodium hydrogen phosphate to the final concentration of 1.5 mol / l. At 277 K, the reaction lasted 20 hours with gentle shaking. The activity yield was 17%.

Example 7:

10mg Cystathiomin-ß-synthese (EC 4.2.1.22) wurden in 5ml 0,2 mol/l TRIS/HCI-Puffer pH 8,7 gelöst. Dazu wurden 100mg Träger (wie im Beispiel 1) und eine Lösung von Ammoniumsulfat bis zur Salzkonzentration 2,5 mol/l zugefügt. Die Reaktion dauerte 40 Stunden bei 269 K. Die Aufarbeitung erfolgte wie im Beispiel 1. Die Aktivitätsausbeute betrug 35%.10 mg of cystathioma-β synthesis (EC 4.2.1.22) were dissolved in 5 ml of 0.2 mol / l TRIS / HCl buffer pH 8.7. To this was added 100 mg of carrier (as in Example 1) and a solution of ammonium sulfate to a salt concentration of 2.5 mol / l. The reaction lasted for 40 hours at 269 K. The workup was carried out as in Example 1. The activity yield was 35%.

Example 8:

1 mg CarboxypeptidaseA(EC 3.4.17.1) wurde in 5 ml 0,2 mol/l Phosphatpuffer pH7,6 gelöst und mit 100 mg eines kopolymeren Trägers (Glyzidylmethacrylat mit Ethylendimethacrylat 1:2, Ausschlußgrenze 1 10⁶DaItOn, Partikelgröße 100-200 pm) versetzt, wie üblich evakuiert und die Kupplungsreaktion in Gegenwart von 2 mol/l Ammoniumsulfat bei 277 K innerhalb von 20 Stunden bei mildem Schütteln ausgeführt. Die Aufarbeitung nach Beispiel 1 ergab ein Konjugat mit einer Aktivitätsausbeute von 11,5%.1 mg of carboxypeptidase A (EC 3.4.17.1) was dissolved in 5 ml of 0.2 mol / l phosphate buffer pH 7.6 and mixed with 100 mg of a copolymeric carrier (glycidyl methacrylate with ethylene dimethacrylate 1: 2, exclusion limit 1 10 ⁶ DaItOn, particle size 100-200 μm ), evacuated as usual and the coupling reaction carried out in the presence of 2 mol / l ammonium sulfate at 277 K within 20 hours with gentle shaking. The workup of Example 1 gave a conjugate with an activity yield of 11.5%.

Example 9:

3 mg Anti-cathepsion D-IgG wurden in 5 ml 0,2 Phosphatpuffer pH 8,0 aufgelöst und an den selben Träger wie im Beispiel 1 gebunden, wobei die Ammoniumsulfatkonzentration 1,5mol/l, die Temperatur 298 K und die Reaktionsdauer 24 Stunden betrugen. Danach wurde das Trägerkonjugat abgesaugt, mit Ausgangspuffer gewaschen, in eine Säule gefüllt und zur affinitätschromatographischen Gewinnung von Cathepsin D eingesetzt.3 mg of anti-cathepsion D-IgG were dissolved in 5 ml of 0.2 phosphate buffer pH 8.0 and bound to the same support as in Example 1, the ammonium sulfate concentration 1.5 mol / l, the temperature 298 K and the reaction time 24 hours cheat. Thereafter, the carrier conjugate was aspirated, washed with starting buffer, filled in a column and used for affinity-chromatographic recovery of cathepsin D.

Example 10:

250mg einesTrägers nach Beispie! 1 wurden bei 323K mit 1 g Hexamethylendiamin in 5ml Wasserfür die Zeit von 3 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser gewaschen. Der feuchte Träger wurde nach dem Durchwaschen in 2 ml einer 5%igen Lösung von Glutaraldehyd für 20 Stunden geschüttelt, mit Wasser gewaschen, bis die negative Reaktion mit Dinitropheny!hydrazin erreicht war. Der feuchte, aktivierte Träger wurde mit der Lösung von Trypsin-Inhibitor (isoliert aus Kartoffeln) (1 mg/ml) vermischt. Weiterhin wurden 2 ml 1 · 25mol/l Natriumsulfat zugegeben, und nach 5 Stunden milden Schütteins bei 298 K wurde das Gemisch abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Der immobilisierte Inhibitor wurde für die affinitätschromatographische Reinigung von Trypsin eingesetzt.250mg of a carrier after example! 1 were reacted at 323K with 1 g of hexamethylenediamine in 5 ml of water for 3 hours. The reaction mixture was washed with water. The wet carrier was washed after washing in 2 ml of a 5% solution of glutaraldehyde for 20 hours, washed with water until the negative reaction with dinitropheny! Hydrazine was achieved. The wet, activated carrier was mixed with the solution of trypsin inhibitor (isolated from potatoes) (1 mg / ml). Furthermore, 2 ml of 1 x 25 mol / l sodium sulfate were added, and after 5 hours of mild Schütteins at 298 K, the mixture was filtered off with suction and washed with water. The immobilized inhibitor was used for the affinity chromatographic purification of trypsin.

Example 11:

10mg Chymotrypsin (EC 3.4.21.1) wurden in 5ml 0,2mol/l Phosphatpuffer pH8,0 gelöst und dazu 100mg einesTrägers auf der Basis von epoxypropyliertem Derivat von Silicagel (Ausschlußgrenze 5 · 10⁵DaItOn, Kapazität 0,5 mmol/g) gegeben. Nach Zufügung von Ammoniumsulfat (Endkonzentration 2,5mol/l) wurde die Kupplung über 20 Stunden bei 303K durchgeführt. Nach dem Waschen des Konjugats wie im Beispiel 1 wurde die Aktivitätsausbeute ermittelt. Sie betrug 8,5%.10 mg of chymotrypsin (EC 3.4.21.1) were dissolved in 5 ml of 0.2 mol / l phosphate buffer pH8.0 and 100 mg of a support based on epoxypropylated derivative of silica gel (exclusion limit 5 × 10 ⁵ DaItOn, capacity 0.5 mmol / g) were added , After addition of ammonium sulfate (final concentration 2.5 mol / l), the coupling was carried out at 303K for 20 hours. After washing the conjugate as in Example 1, the activity yield was determined. It was 8.5%.

Example 12:

Der Versuch wurde analog zum Beispiel 11 ausgeführt nur mit dem Unterschied, daß sich für die Anwendung a Is Träger poröses Glas mit einem mittleren Porendurchmesser von 50nm als günstig erwies. Der Träger wurde durch Reaktion mit Triethoxyepoxypropylsilan aktiviert. Die Ausbeute der Aktivität des immobilisierten Chymotrypsins betrug 9,7%.The experiment was carried out analogously to Example 11 only with the difference that proved for the application a Is carrier porous glass with a mean pore diameter of 50 nm as low. The support was activated by reaction with triethoxyepoxypropylsilane. The yield of the activity of the immobilized chymotrypsin was 9.7%.

Example 13:

10 mg Trypsin (EC 3.4.21.4) wurden in 5mlO,2mol/l Phosphatpuffer pH 8,0 gelöst und 100 mg de's Trägers von Beispiel 1 zugefügt. Bei der Konzentration von Ammoniumsulfat von 2,5mol/l dauerte die Reaktion bei 293 K 20 Stunden.10 mg of trypsin (EC 3.4.21.4) were dissolved in 5 ml of 2 mol / l phosphate buffer pH 8.0 and 100 mg of the support of Example 1 were added. At the ammonium sulfate concentration of 2.5 mol / l, the reaction took 20 hours at 293K.

Example 14:

10mg Pepsin (EC 3.4.23.1) wurden in 5 ml 0,1 mol/l Acetatpuffer pH 4,0 analog Beispiel 1 mit 100 mg Träger vermischt. Bei einer optimalen Konzentration von Ammoniumsulfat von 1,25 mol/l dauerte die Reaktion 24 Stunden bei 298 K. Nach dem Waschprozeß (siehe Beispiel 1) wurde eine Ausbeute der immobilisierten Pepsinaktivität von 15% ermittelt.10 mg of pepsin (EC 3.4.23.1) were mixed in 5 ml of 0.1 mol / l acetate buffer pH 4.0 analogously to Example 1 with 100 mg of carrier. At an optimum concentration of ammonium sulfate of 1.25 mol / L, the reaction lasted 24 hours at 298 K. After the washing process (see Example 1), a 15% immobilized pepsin activity was determined.

Example 15:

Zu 100 mg Insulin in 5 ml eines 0,05 mol/l Phosphatpuffers pH 8,0 wurden 100 mg eines epoxidaktivierten Trägers nach Beispiel 1 zugegeben. Die Kupplungsreaktion verlief in Gegenwart von 1,75 mol/l Dinatriumhydrogenphosphatbei298Küber50 Stunden. Das gebundene Insulin wurde in der Affinitätschromatographie von Antikörpern gegen Insulin aus AntiihsulinrSerum in 0,1 mol/l Natriumbarbiturat pH 8,8 mit einem Gehalt von 3% Albumin angewandt. Die Desorption wurde mit einer Lösung von 3 mol/l HCI durchgeführt.To 100 mg of insulin in 5 ml of a 0.05 mol / l phosphate buffer pH 8.0, 100 mg of an epoxide-activated carrier according to Example 1 were added. The coupling reaction proceeded in the presence of 1.75 mol / l disodium hydrogen phosphate at 298K for over 50 hours. The bound insulin was used in the affinity chromatography of antibodies to insulin from antihsulin serum in 0.1 mol / l sodium barbiturate pH 8.8 containing 3% albumin. The desorption was carried out with a solution of 3 mol / l HCl.

Claims

Invention claim:

1. A process for the preparation of highly active carrier-bound biologically active substances for chemical substance conversion, enzymatic catalysis and for the analytical and preparative separation technique by hydrolytically stable covalent bond biological (biochemical) active compounds to macroporous polymeric carriers _f characterized in that the biologically (biochemically ) are covalently bonded to activated macroporous polymeric supports in the presence of a solution of inorganic salts to be present in concentrations of from 0.5 to 3 mol / l, said concentrations of the inorganic salts effecting a two-stage bonding process, the first stage of which is a hydrophobic adsorption of biologically active compounds to the carrier and in the second stage then the biologically active compound reacts with the carrier to form covalent bonds. 2

2. The method according to claim 1, characterized in that the macroporous polymeric support from the group of copolymers of hydroxyalkyl methacrylates (alkyl C ₂ to Cs) with alkylenedimethacrylates (alkylene C ₂ to CJ, the copolymers of styrene with divinylbenzene or with alkylenedimethacrylates (alkylene C ₂ to C ₄₎ copolymers of glycidyl methacrylate with Alkylendimetharylat (alkylene are to C4) selected from porous glass or silica gel C. ₂

3. Process according to claims 1 and 2, characterized in that the macroporous polymeric carrier functionally contain groups selected from the group of epoxides, aldehydes, primary or secondary amines, carboxyls or thiols.

4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that the macroporous polymeric carriers have a rigid structure and a spherical shape.

5. The method according to claim 1, characterized in that the covalently bound biologically active compounds from the group of enzymes, the inhibitors of the enzymes and the immunoactive proteins are selected.

6 .. The method of claim 1, characterized in that the salts from the group of sodium phosphates,

Ammonium phosphates, sodium sulfates and ammonium sulfates are selected.

7. The method according to claim 1, characterized in that the coupling reaction in the temperature range 268 to 303 K and in the pH range of 3 to 10 in a time of 0.5 to 50 hours.