DD243184A3

DD243184A3 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für L-Ketten

Info

Publication number: DD243184A3
Authority: DD
Publication date: 1987-02-25

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer L-Ketten der humanen Immunglobuline. Es ist das Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen spezifischer Antikoerper ermoeglicht, die in der Lage sind, mit Determinanten von L-Ketten aller humanen Immunglobulinklassen sowohl im isolierten als auch im H-kettengebundenen Zustand sowie mit membrangebundenem Immunglobulin der B-Lymphozyten zu reagieren. Die Aufgabe wird darin gesehen, zunaechst Hybridome zu erzeugen, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und oekonomisch vorteilhafter Weise moeglich ist. In folgenden Verfahrensschritten sollen dann monoklonale Antikoerper der gewuenschten Art hergestellt werden. Die Aufgabe wird geloest durch die Herstellung der Hybridome H-BL-Ig-L/1 und H-BL-Ig-L/2 und deren Kultivierung in vitro und in vivo.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, mit den leichten Ketten humaner Immunglobuline zu reagieren.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, spezifische Antiseren für die L-Ketten humaner Immunglobuline herzustellen und diese für die qualitative und quantitative Bestimmung von Immunglobulin in Seren oder anderen biologischen Flüssigkeiten sowie für den Nachweis und die Quantifizierung von immunglobulinpositiven B-Lymphozyten zu verwenden. Die konventionellen Methoden der Herstellung von Anti-L-Ketten-Antikörpem haben die Nachteile, daß die Antikörper von Tier zu Tier, ja sogar von Blutentnahme zu Blutentnahme unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, daß sie dadurch nicht reproduziert und standardisiert werden können, daß eine Absorption mit Lebertrockenpulver und verschiedenen Zellarten notwendig ist, um unspezifische Begleitantikörper zu entfernen und daß trotzdem bei ihrem Einsatz zum Nachweis von Membranimmunglobulin noch unspezifische Bindungen an die F_c-Rezeptoren von Lymphozyten und Monozyten vorkommen. Der letzte Nachteil kann durch die aufwendige und kostspielige Präparation von (Fab)2-Fragmenten zwar elimiert werden, jedoch ist für eine Routineanwendung dieses Verfahren insgesamt zu teuer. j

Es sind aber monoklonale Antikörper bekannt geworden, die mit verschiedenen Differenzierungsantigenen von humanen Lymphozyten reagieren. Zur Bestimmung der immunglobulinpositiven B-Lymphozyten werden jedoch weiterhin konventionelle Antiseren genutzt. Das hat seine Ursache mit hoher Wahrscheinlichkeit darin, daß keine hinreichend produktiven Hybridome bekannt sind, die monoklonale Antikörper mit Spezifität für die L-Ketten der humanen Immunglobuline sezemieren.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper ermöglicht, die in der Lage sind, mit Determinanten von L-Ketten humaner Immunglobulinklassen im isolierten und im H-kettengebundenen Zustand zu reagieren.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren zur Verfügung zu stellen, in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt wird, das leicht und unaufwendig handhabbar ist und dessen Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafterweise möglich ist. Unter Verwendung dieses Hybridoms sollen im folgenden Verfahrensschritt monoklonale Antikörper hergestellt werden, die spezifisch für die L-Ketten aller humaner Immunglobulinklassen sind. Dabei soll gleichbleibende Qualität der Antikörper gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zunächst eine Immunglobulinfraktion nach den an sictr bekannten Verfahren der Aussalzung und der Ionenaustauscher!romatographie aus dem Serum gesunder Blutspender präpariert wird. Mit derart gereinigtem humanen IgG werden erfindungsgemäß Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens, wobei die erste Immunisierung als Emulsion des Antigens mit komplettem Freundschen Adjuvans vorgenommen wird. 4 Tage vor der Entnahme der Milzlymphozyten für die Ausführung der Zellfusion erhalten die Mäuse eine i. v. Injektion von jeweils 200 μg humanem IgG.

Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-BN-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3-X-63Ag 8.-653 (KEARNEY et al., J. Immunol, 123 [1979], 1548) werden im RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin undThymidin enthält (Littlefield, Science, 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zellklon selektioniert, der Antikörper der gewünschten Art sezerniert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-pl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit humanem IgG reagieren. Anschließend werden die Hybridzellkulturen ausgewählt, die äußer mit IgG auch mit IgM, IgA, IgE, IgD sowie isolierten kappa- und lambda-Ketten reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik, wobei die einzelnen Antigene an Plastoberflächen adsorbiert werden und die gebundenen Hybridomantikörper durch ¹²⁵J-markierte Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper nachgewiesen werden.

Nur Hybridome, deren Antikörper mit allen genannten Immunoglobulinen reagieren, werden mittels indirekter Immunfluoreszenz geprüft, ob sie auch mit den L-Kettendeterminanten von membrangebundenem Immunglobulin der B-Lymphozyten reagieren.

Dazu werden mononukleare Blutzellen, separierte B-Lymphozyten und T-Lymphozyten sowie adhärierende Zellen (Monozyten) eingesetzt. Hierdurch wird abgesichert, daß die Antikörper zur spezifischen Erkennung von membrangebundenes Immunglobulin tragenden B-Lymphozyten geeignet sind und keine zufällige Kreuzreaktivität mit einer Determinante von T-Lymphozyten oder Monozyten besteht.

Durch diese Selektionsschritte werden Hybridome H-BL-lg-L/1 und 2 erhalten, die rekloniert werden und dadurch Subklone selektioniert werden, die stabil monoklonale Antikörper produzieren, die zur Erkennung von immunglobulintragenden humanen B-Lymphozyten geeignet sind.

Die auf die vorstehend geschilderte Weise erhaltenen Hybridome H-BL-IgL sind durch die überraschende, vorteilhafte Eigenschaft charakterisiert. Antikörper zu seziernieren, die humane immunglobulintragende B-Lymphozyten und die L-Ketten von Immunglobulin im isolierten Zustand, aber auch nach ihrer Bindung an schwere Ketten, erkennen. — Das Hybridom ist unaufwendig zu kultivieren und kann in üblicherweise, z.B. in flüssigem Stickstoff, aufbewahrt werden.

Zur Herstellung der Antikörper werden-frisch hergestellte oder aufgetaute Hybridome H-BL-Ig-L in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigem (NH₄J₂SO₄ versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten.

Weitere Reinigung der Antikörper ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie

o. dgl. möglich. Der derart erzeugte Antikörper BL-lg-L/1 gehört der IgGi Subklasse an. Der monoklonale Antikörper BL-lg-L/2 ist ein IgM und ist potentiell in der Lage, Komplement zu fixieren.

Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dubeccos MEM, RPMI o.dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5-10"⁵M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin versetzt ist.

Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil an Kulturmedium von 5 bis 20%.

Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35°C und 38°C.

Vorteilhaft ist es, bei 37°C zu arbeiten.

Der CGvGehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann.

Die Kultivierung der Hybridome erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen.

Die monoklonalen Antikörper BL-lg-L/1 und BL-lg-L/2 weisen das folgende, in Tabelle 1 zusammengestellte Reaktionsmuster mit humanen Immunglobulinen auf, wie es durch indirekte Radiobindungstechnik (RBT) bestimmt wurde. Mit Blutzellen reagieren die beiden monoklonalen Antikörper in der in Tabelle 2 gezeigten Art und Weise, wie durch indirekte Immunfluoreszenz (ilF) nachgewiesen wird. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Hybridom H-BL-lg-L/1 bzw. H-BL-lg-L/2 in histokompatible Ax Balb/c-Fi-Mäuse i.p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o.dgl. vorbehandelt worden sind. — Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-lg-L/1 bzw. L/2 enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen,

z. B. durch Funktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des Hybridoms H-BL-lg-L/1 bzw. L/2. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-lg-L/1 bzz. L/2 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die den Isotyp das BL-lg-L/1 bzw. L/2 spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-lg-L/1 bzw. L/2 antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10mg BL-lg-L/1 bzw. L/2 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCO3-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert

bei +4^CC haltbar ist. i

Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

1. Ausführungsbeispiel

Eingesetzt werden Zellen des Hybridoms H-BL-lg-L/1 bzw. H-BL-lg-L/2, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10^Bbis5 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden Fi-Hybride der Stämme A und Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5ml Paraffinum subliquidum i.p. 2 Wochen vorder Hybridominjektion behandelt worden sind.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BL-lg-L/1 bzw. L/2 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.

Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des Hybridoms H-BL-lg-L/1 bzw. L/2. Diese Hybridzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i.p. injiziert werden. Solche Passungen sind wiederholt möglich.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄I₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.

Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Die Antikörper BL-lg-L/1 bzw. L/2 sind lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik unter Verwendung von PVC-Mikrotiterplatten, die mit isolierten humanen L-Ketten oder IgG beschichtet sind, ermittelt. Als Titer wird diejenige größte Verdünnung des monoklonalen Antikörpers angegeben, bei der 50% der radiomarkierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper, die bei maximaler Sättigung mit beiden Antikörpern angelagert sind, gebunden werden.

2. Ausführungsbeispiel

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen H-BL-lg-L/1 bzw. H-BL-lg-L/2 werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 · 10⁵ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert.

Das Kulturmedium besteht aus RPMM 640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mecaptoethanol (5 x 10"⁵M), Gentamycin (100mg/l) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird.

Dieses Medium wird mit

a) fetalem Kälberserum oder

b) Pferdenormalserum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igenCC>2-Atmosphäre bebrütet werden.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten die monoklonalen Antikörper BL-lg-L/1 bzw. BL-lg-L/2. Die Konzentration der Antikörper BL-lg-L/1 bzw. BL-lg-L/2 ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von B-Lymphozyten (wie z.B. indirekte Immunfluoreszenz, enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik (z. B. indirekte Immunfluoreszenz oder Radiobindungstechnik bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Perdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oder Glycin/HCL-Puffer pH 2.8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.

Tabelle 1

Antigen RBT(I)¹¹

BL-lg-L/1 BL-lg-L/2

Isolierte L-Ketten

isolierte k-Kette

isolierte λ-Kette

IgG

IgM

IgA

IgD²¹

IgE³'

isolierte y-Kette - -

isolierte μ-Kette - -

¹ Bindungsindex I = lpm BL-lg-L/lpm BL-DNP(IgGD I > 10: +++, <10>4: ++, <4< 1,5: +, <1,5:

² Myelomprotein igOwh

³ Myelomprotein lgE_ND

Tabelle 2

Zellen	ilF	% markierte Zellen	BL-lg-L/2	% markierte Zellen
	BL-Ig-UI	12±4	Intensität¹¹	11 ±3
	Intensität¹¹	0	+	0
Lymphozyten	+ +	>90	-	>90
T-Zellen²¹	—	0	+	0
B-Zellen³	+ +	0	-	0
Thymozyten	-	0	-	0
Monozyten	-	0	-	0
Granulozyten	-		-
Erythrozyten	-

Subjektive Bewertung der Fluoreszenzintensität von +++ bis — ² MitSchaferythrozyten rosettenbildende Lymphozyten (E⁺-Zellen) ³E- negative Lymphozyten

Die Hybridome H-BL-lg-L/1 und H-BL-lg-L/2 sind an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig verfügbar.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für L-Ketten der humanen Immunglobuline, indem Mäuse mit IgG immunisiert werden und Milzlymphozyten hyperimmuner Mäuse mit Myelomzellen hybridisiert werden, entstandene Hybridome selektioniert und kultiviert werden und monoklonale Antikörper abgetrennt werden, dadurch gekennzeichnet, daß 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse mit humanem IgG immunisiert werden, als Myelomzellen solche der Linie P3-X-63Ag 8.653 eingesetzt werden, die Hybridome H-BL-lg-L/1 bzw. H-BL-lg-L/2 selektioniert werden, indem die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf ihre Reaktion mit isolierten humanen lambda- und kappa-Ketten sowie L-Ketten, die an die schweren Ketten der Isotypen IgG, IgM, IgA, IgD, IgE gebunden sind, durch indirekte Radiobindungstechnik erfolgt und der Nachweis der Bindung an Immunglobulin-tragende humane B-Lymphozyten sowie der Ausschluß der Bindung an T-Lymphozyten mittels indirekter Immunfluoreszenz erbracht wird, die selektionierten Hybridome in vitro kultiviert oder in Mäuse injiziert und aus dem Kulturmedium bzw. der Aszitesflüssigkeit der monoklonale Antikörper BL-lg-L/1 bzw. BL-lg-L/2 in an sich bekannter Weise separiert wird.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridome selektioniert, kloniert und rekloniert werden und die entsprechenden Subklone selektioniert werden, die zur Erkennung von immunglobulintragenden humanen B-Lymphozyten und isolierten sowie an Η-Ketten gebundenen L-Ketten der Immunglobuline geeignete Antikörper produzieren.
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der Überstände der die Hybridome enthaltenden Kulturen auf ihre Reaktion mit humanen B-Lymphozyten mittels FITC-markiertem Ziege-anti-Mausimmungiobulinserum erfolgt.
4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen H-BL-lg-L/1 oder H-BL-lg-L/2 in einem Kulturmedium in Massenkultur aufgezogen werden, wobei dem Kulturmedium ein Serum zugesetzt wird, nach entsprechender Kultivierung in CO2-haltiger Atmosphäre das nunmehr antikörperhaltige Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SCU versetzt und eineGammaglobulinfraktion erhalten wird, aus der nach weiterer Aufarbeitung in an sich bekannter Weise der monoklonale Antikörper isoliert wird.
5. Verfahren nach Punkt 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Serum fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum eingesetzt werden.