DD230882B1

DD230882B1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper fuer ein monozyten-antigen

Info

Publication number: DD230882B1
Application number: DD25465183A
Authority: DD
Inventors: Helmut Fiebig; Ingrid Behn; Hartmut Kupper; Herwart Ambrosius
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-09-08
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1987-06-17
Also published as: DD230882A1

Description

Zellen mittels FITC-markiertem Ziege-anti-Mausimmunglobulin-Serum bestimmt. Mit der Methode der indirekten Immunfluoreszenz wird ausgeschlossen, daß u.U. Hybridome ausgewählt werden, deren Antikörper mit B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und Erythrozyten reagieren.

Das durch diese Selektionen erhaltene Hybridom H-BL-M/G wird rekloniert und ein Subklon wird selektioniert, die Antikörper, die zur Bestimmung humaner Monozyten, Granulozyten und Nullzellen geeignet sind, produziert. Diese überraschende und vorteilhafte Eigenschaft eröffnet sehr günstige diagnostische Möglichkeiten.

Die Herstellung des Antikörpers erfolgt erfindungsgemäß dergestalt, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen H-BL-M/G in einem Kulturmedium mitSerumzuskatzin Massenkultur aufgezogen werden. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haitiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographieo.dgl. möglich. Der derart erzeugte monoklonaIe Antikörper BL-M/G ist potentiell in der Lage, Komplement zu binden und die Zielzellen zytotoxisch zu zerstören.

Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 · 10"⁵M Mercaptoethanol, lOOmg/l Gentamysin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Käiberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35⁰C und 38°C. Vorteilhaft ist es, bei 37°C zu arbeiten.

Der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann.

Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen. Danach ist ein teilweiser Mediumwechsel notwendig. Dabei ist erneut die optimale Zelldichte einzustellen.

Der monoklonal Antikörper weist das in Tabelle 1 dokumentierte Reaktionsmuster mit humanen Biutzellen auf. Die Bindung wurde mittels indirekter Radiobindungstechnik (RBT) und indikreter Immunfluoreszenz (UF) bestimmt.

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird das Hybridom H-BL-M/G in histokompatible A χ BALBZo-F₁-MaUSe i. p.

injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinum subliquidum. Pristan o.dgl., vorbehandelt worden sind. Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-M/G enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z. B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z.B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil ausZellen des Hybridoms H-BL-M/G. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-M/G enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-lonenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die den Isotyp des BL-M/G spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-M/G antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10 mg BL-M/G pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20mg/mI.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch ais Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCGyLösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4⁰C haltbar ist.

Tabelle 1

Bindungsmuster des monoklonalen Antikörpers BL-M/G mit verschiedenen Blutzellen

Testzellen MarkierteZellen (%) Rl¹'

PMZ²¹	<5
Monozyten	>90
Granulozyten	>80
T-Lymphozyten	<2
B-Lymphozyten	<2
O-Zellen	>70
Erythrozyten	0

1) Rl bedeutet die relative Fluoreszenzintensität der Membrananfärbung

2) Periphere mononukleäre Zellen

1. Ausführungsbeispiel:

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridzellen (H-BL-M/G) werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 χ 10⁵ Zeilen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewerbekulturflaschen kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol (5 x 10"⁵M), Gentamycin (100mg/l) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird. Dieses Medium wird mit

a) fetalem Kälberserum oder

b) Pferdenormalserum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenden Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-IWG. Die Konzentration des Antikörpers BL-M/G ist ausreichend fürdie üblichen diagnostischen Nachweisverfahren für Monozyten, Granulozyten undNullzellen(wiez.B. indirekte Immunfluoreszenz, enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik (z. B. indirekte Immunfluoreszenz) bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration. Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobuiinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3M KSCN oder Glycin/HCI-Puffer pH2,8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.

2. Ausführungsbeispiel:

Eingesetzt werden Zellen des Hybridoms H-BL-M/G, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10⁵ bis 5 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitorieal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden F^-Hybride der Stämme A und BALB/c eingesetzt, die mit eirem Tumorstimulator, hiermit0,5mlParaffinumsubliquidum,i.p. 2 Wochen vor der Hybridom injektion behandelt worden sind.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BL-M/G enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.

Der zelluläre Anteil besteht überwiegend aus Zellen des Hybridoms H-BL-M/G. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p.

injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NHa)₂SO präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dislysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Der Antikörper BL-M/G ist lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Immunfluoreszenz unter Verwendung frischer humaner Blutmonozyten und einem geeigneten FITC-markierten Anti-Mausimmunglobulinserum bestimmt. Als Titer wird diejenige größte Verdünnung angegeben, bei der noch deutlich alle Monozyten markiert werden.

3. Ausführungsbeispiel:

Zellen des Hybridoms H-BL-M/G werden wie in Beispiel 1 kultiviert und vermehrt. Nach Erreichen einer hinreichenden Zeilanzahl werden die Hybridomzellen geerntet und mehrmals mit serumfreiem Zellzuchtmedium gewaschen.

Anschließend werden die Hybridomzellen in einer Dichte von 2-5 · TO⁶ Zellen pro 1 ml in einem serumfreien Zellzuchtmedium wie z. B. RPMI-1640, das mit NaHCO₃ (2g/l), Mercaptoethanol (5 · 10""⁵M), Gentamycin (lOOmg/l) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird, kultiviert. Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei 37⁰C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden. Die Inkubation dauert 12-24 Stunden. Der zellfreie Kulturüberstand enthält den monoklonalen Antikörper des jeweiligen Hybridoms H-BL-M/G ohne Serumproteine, die sonst als Mediumzusatz verwendet werden. Der monoklonale Antikörper kann durch DEAE-Ionenaustauschchromatographie oder Protein-A-Adsorption o.dgl. weiter konzentriert werden, wenn das gewünscht wird.

Mit den erfindungsgemäß hergestellten Antikörpern BL-M/G gelingt es besser und genauer als bisher, Monozyten, Granulozyten und Nullzellen zu bestimmen. Ein weiterer wesentlicher Vorteil der geschilderten Verfahrensweise ist die Möglichkeit, das Hybridom H-BL-M/G über längere Zeit aufzubewahren und auch nach Ruhezeiten wieder zur Anti körper produktion einzusetzen. In diesem Sinne wird durch die zur Verfügung gestellte Lehre der Stand der Technik wesentlich bereichert. Das Hybridom H-BL-M/G ist an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig zugänglich. Der monoklonale Antikörper BL-M/G ist im Zentralinstitut für Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der DDR unter der Nummer DDR 0044 registriert.

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für ein Monozyten-Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß weibliche Α-Mäuse mit humanen Monozyten immunisiert werden, aus den Milzen derart behandelter Mäuse Lymphozyten separiert werden, diese mit Maus-B-Myelomzellen hybridisiert werden, Hybridomzellen der Art H-BL-M/G selektioniert, die selektionierten Hybridomzellen kultiviert oder in Mäuse injiziert, die Aszitesflüssigkeit entnommen und der Antikörper BL-M/G gewonnen wird.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom H-BL-M/G rekloniert wird und daß ein Subkion selektioniert wird, der zur Bestimmung von Monozyten, Granulozyten und Nullzelien geeignete Antikörper produziert.
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung 6 bis 8 Wochen aite weibliche A-Mäuse verwendet werden.
4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Myelomzeüen solche der Linie P3-X-63 Ag 8.653 eingesetzt werden.
5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung der Mäuse durch eine Reihe von Injektionen mit humanen Monozyten er^fo!gt.
6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die letzte Immunisie rung 4 Ta ge vor der Isolierung der für dia Hybridisierung bestimmten B-Lymphozyten vorgenommen wird.
7. Verfahren nach Punkt 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß aas Verhältnis von Myelomzellen und B-Lymphoblasten, die zur Fusion bestimmt sind, etwa 1:1 beträgt.
8. Verfahren nach Punkt 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt der Abtrennung der nicht hybridisierten Myelomzellen von den Hybridzeilen das verwendete Kulturmedium Milzzellen von nicht immunisierten A χ BALBZc-F₁-Hybridmäusen enthält.
9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf ihre Reaktion mit humanen Monozyten, Granulozyten, Nullzeilen durch indirekte Immunfluoreszenz mittels FITC-markiertem Ziege-anti-Mausimmunglobuiinserum erfolgt.
10. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf das Nichtreagie,ren mit B- und T-Lymphozyten mittels indirekter Immunfluoreszenz erfolgt.
11. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen H-BL-M/G in einem Kulturmedium in Massenkultur aufgezogen werden, wobei dem Kulturmedium ein Serum zugesetzt wird, nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre das nunmehr antikörperhaltige Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NHj)₂SO₁J versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten wird, aus der nach weiterer Aufarbeitung in an sich bekannter Weise der monoklonale Antikörper isoliert wird.
12. Verfahren nach Punkt 1 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium MEMN Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI oder dgl. eingesetzt wird.
13. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium RPM 1-1640 verwendet wird.
14. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium 1OmM HEPES, 5 10"⁵M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin zugesetzt werden.
15. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Serum fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum eingesetzt werden.
16. Verfahren nach Punkt 15.. dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des fetalen Kälberserums am Kulturmedium ca. 10%, der des Pferdenormalserums ebenfalls ca. 10% beträgt.
17. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierungstemperatur 35³C bis 38⁰C beträgt.
18. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß bei 37'C kultiviert wird.
19. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der CO₂-Geha!t der Atmosphäre über dem Kulturmedium 2 bis 10% beträgt.
20. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der CO₂-Gehalt über dem Kulturmedium 5% beträgt.
21. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß über dem Kulturmedium hohe Luftfeuchtigkeit herrscht, die bis zur Sättigung der Aimosphäre mit Wasserdampf reichen kann.
22. Verfahren nach Punkt 1 und 11 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß 3 bis 4 Tage kultiviert wird.
23. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom H-BL-M/G in histokompatible A χ BALB/c-FrMäuse i. p. injiziert wird, nach der Aszitesbildung die Aszitesflüssigkeit entnommen wird, die zellulären Bestandteile abgetrennt werden, der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-M/G enthält, entweder direkt weiter verwendet wird oder Reinigung s- und Anreicherungsoperationen unterzogen wird oder durch Ausfällen der !mmunglobulinfraktion der zeilfreien Aszitesflüssigkeit z. B. mit 50% gesättigter (NH₄I₂SCVLOSUHg, Aufnehmen des Präzipitats in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, dialysieren gegen verdünnte NH₄HCO3-Lösung und anschließende Lyophilisierung in eine dauerhafte Aufbewahrungsform überführt wird.
24. Verfahren nach Punkt 1 und 23, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennten zellulären Bestandteile, die hauptsächlich aus Zellen des Hybridoms H-BL-M/G bestehen, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und erneut histokompatiblen Mäusen injiziert werden können.
25. Verfahren nach Punkt 1 und 23, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinumsubliquidum,Pristano.dgl. vorbehandelt werden.
26. Verfahren nach Puniet 1,23 und 25, dadurch gekennzeichnet, daß ein entsprechender Tumorstimulator3 Tage bis 6 Wochen vor der Hybridominjektion gegeben wird.
27. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lyophilisierte Antikörper BL-M/G bei +4⁰C aufbewahrt wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die mit humanen Monozyten, Granulozyten sowie Nullzellen reagieren.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Monozyten und Makrophagen spielen eine bedeutende Rolle bei verschiedenen pathogenen Immunreaktionen. Die Analyse der Funktion dieser Zellen und deren diagnostische Verwertung sind an die Verfügbarkeit von Antikörpern gegen spezifische Monozyten/Makrophagen-Antigene gekoppelt. Es hat nicht an Versuchen gefehlt, Anti-Makrophagen-Seren durch Xeno- oder Alloimmunisierung und anschließende Gewebeabsorption zu erzeugen (UNANUE, E. R., Nature 218, [1968], 36; STINNETTJ. D. et al., J. Immunol. 116, [1976], 273; BREARD, J. et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 15, [1980], 438). Diese Antiseren sind jedoch nur in begrenztem Maße hersteilbar, nicht reproduzierbar und somit nicht standardisierbar. Eine Lösung dieser Probleme könnten die von Hybridomen sezernierten monoklonalen Antikörper darstellen. Es ist bereits bekannt, monoklonal Antikörper herzustellen. So haben KÖHLER und MILSTEIN (Nature, 256, [1975] 495) durch Fusion anti kör perbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanentwächst und stabil Antikörper sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridom linien, die Antikörper unterschiedlicher Spzezifität produzieren, hergestellt worden sind. So sind auch rnonokionale Ratten-anti-Mausmakrophagen-Antikörper beschrieben (SPRINGER, T. A. et al., Eur. J. Immuno!. 9, [1979], 301). Diese Antikörper kreuzreagieren auch mit Antigenen, die auf humanen Monozyten und Granulozyten vorhanden sind (AULT, K. A. und T. A. SPRINGER, J. Immunol. 126, [1980], 359). Es sind auch mono kl onale Anti körper, die mit humanen Monozyten reagieren, beschrieben worden (NUNEZ, G. et al., Scand. J. Immunol. 18, [1982], 515). Da zur Zeit nur 2 monoklonale Antikörper für Monozyten bekannt und erhältlich sind, scheint es sinnvoll, den Stand der Technik durch einen weiteren, leichtzugänglichen und preisgünstigen monoklonaien Antikörper zu bereichern.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers des Typs BL-M/G anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers für ein Zelloberflächenantigen humaner Monozyten, Granulozyten sowie Nullzellen gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einfachen und exakten Nachweistesten für humane Monozyten, Granulozyten sowie Nullzellen eignen, wobei Kreuzreaktionen mit Zelloberflächenantigenen anderer Zeilen nicht vorkommen sollen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Herstellungsverfahren für monoklonale Antikörper anzugeben, die spezifisch mit humanen Monozyten, Granulozyten sowie Nullzellen reagieren, wobei in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt werden soll, das unkompliziert zu handhaben ist und dessen Kultivierung technisch und ökonomisch vorteilhaft möglich ist. Die Kultivierung des Hybridoms soll zu monoklonalen Antikörpern führen, die die oben angegebenen Eigenschaften haben und in der klinischen Diagnostik eingesetzt werden können.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach dem an sich bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation mononükleare Zellen aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Durch Inkubation dieser Zellen in Plastepetrischalen werden die ad parierende η Zellen isoliert. Nach Ablösung dieser Zellen, z.B. mit einem Gummischaber, werden diese erfindungsgemäß zur Immunisie rung von Mäusen verwendet. Vorzugsweise werden 6 bis3 Wochen alte weibliche Α-Mäuse eingesetzt. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zeil gemisch es werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hygridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3-X-63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979] 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zellklon selektioniert, der Antikörper der gewünschten Art sezerniert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusioin in eine Vielzahl von separaten 200-дІ-КиИигеп aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit Zelloberflächenantigenen von Monozyten, Granulozyten und Nullzellen reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit adhärierenden Zellen (Monozyten) reagieren, mit Granulozyten, die durch an sich bekannte Verfahren mittels Dichtegradientenzentrifugation aus peripherem Blut gesunder Spender gewonnen werden, getestet. Die Testung der Überstände erfolgt mittels indirekter immunfloreszenz, wobei im Phasenkontrastverfahren zu kontrollieren ist, daß es sich um Zellen der jeweiligen Art handelt. Nur solche Kulturen werden weiter verwendet, die mit der Mehrheit der Monozyten und Granulozyten reagieren. Die Kulturüberstände werdendann mit den adhärenten Monozyten und mit den Granulozyten inkubiert und der Anteil der markierten