DD246314A1

DD246314A1 - Verfahren zur virusfreien vegetativen vermehrung und erhaltung von foeniculum vulgare - hochleistungspflanzen

Info

Publication number: DD246314A1
Application number: DD28440685A
Authority: DD
Inventors: Heidelore Mertinat; Beate Dittrich; Martin Luckner; Hans-Juergen Hannig; Manfred Herold
Original assignee: Halle Pharma Veb
Priority date: 1985-12-16
Filing date: 1985-12-16
Publication date: 1987-06-03

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur pathogenfreien Vermehrung und Erhaltung von Foeniculum vulgare-Hochleistungspflanzen in vitro, das ueber eine lange Zeit einen innerhalb der Population gleichmaessig hohen und in seiner Zusammensetzung konstanten Gehalt an etherischem Oel bewirkt. Weiterhin wird ermoeglicht, ausgelesene einjaehrige Foeniculum vulgare-Pflanzen schnell zu vermehren und einjaehrige Sorten zu erhalten. Dazu werden aus Meristemen, Meristemanlagen bzw. Sprossspitzen, Stengelstuecken, Seitenknospen oder Blueten mit Meristemen oder Meristemanlagen unter sterilen Bedingungen auf ueblichen Naehrmedien, die Cytokinine und/oder Auxine enthalten koennen, Sprosse und Meristemgewebe angezogen, diese von den Ausgangsexplantaten abgetrennt, weiter vermehrt und vereinzelt und auf Naehrloesung ohne Phytohormone zur Bewurzelung gebracht. Die so erhaltenen Pflanzen werden isoliert, in Gesteinsmehl pikiert und unter Folietunnel an Gewaechshaus- bzw. Freilandbedingungen adaptiert. Die Pflanzen dienen der weiteren vegetativen Vermehrung oder der Saatgutgewinnung. Zur Erhaltung des genetisch hochwertigen Ausgangsmaterials werden sterile Pflanzen bei minimalen Entwicklungsbedingungen oder sterile Meristeme bei Ultratieftemperaturen konserviert und bei Bedarf rekultiviert.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Das zur Gewinnung von etherischen Ölen benutzte Pflanzenmaterial von Foeniculum vulgäre wird unter Feldbedingungen in verschiedenen Ländern angebaut, die Erfindung ermöglicht die Gewinnung von gesundem und einheitlichem Pflanzenmaterial aus ausgelesenen Hochleistungspflanzen. Foeniculum vulgäre ist eine vorwiegend zweijährige Pflanze. Vorkommende einjährige Pflanzen können durch Anwendung der Erfindung erhalten und vermehrt werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Durch aufwendige Screeningverfahren ausgelesene Exemplare von Foeniculum vulgäre mit hohem Gehalt an etherischen Ölen, gutem Wachstum, Resistenz gegenüber Schädlingen, Krankheiten und ungünstigen Umweltbedingungen werden gegenwärtig durch Saatgut generativ vermehrt. Das Verfahren begünstigt jedoch die Übertragung von Krankheiten, insbesondere Virosen, von der Mutter-auf die Tochterpflanzen und ist hinsichtlich der erzielbaren Vermehrungsraten nur wenig produktiv. Auch die Regeneration von Foeniculum vulgare-Pflanzen aus Zellkulturen hat sich nicht bewährt, da das Verfahren zu aufwendig ist und ein heterogenes Pflanzenmaterial erhalten wird.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die effektive Nutzung von Foeniculum vulgare-Hochleistungspflanzen, insbesondere einjähriger, für die Pflanzenvermehrung bei gleichzeitiger qualitativer Verbesserung der hergestellten Tochterpflanzen und einer beträchtlichen Senkung des für die Vermehrung notwenigen Aufwandes.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, die Mängel der bisher bekannten Verfahren zur Erhaltung und Vermehrung von hochwertigem Pflanzenmaterial von Foeniculum vulgäre zu überwinden und ein Verfahren zu entwickeln, welches

— die Erhaltung des genetischen Materials einmal ausgelesener insbesondere einjähriger Foeniculum vulgare-Hochleistungspflanzen für einen langen Zeitraum über das natürliche Lebensälter hinaus ermöglicht,

— die vegetative Vermehrung dieser Pflanzen in einer sehr hohen Zahl und mit praktischer Eignung für den Feldanbau erlaubt, wobei die erhaltenen Tochterpflanzen einen Klon mit gleichmäßig hohen und in seiner Zusammensetzung einheitlichen Gehalt an etherischen Ölen bilden.

Durch Anbau geeigneter pathogenfreier Klone in Mischung kann-ih der Folge ein Hybridsaatgut erhalten werden, aus dem sich Pflanzen entwickeln, die durch Heterosiseffekt dem verklonten Ausgangsmaterial in den genannten Merkmalen noch überlegen

sind. ' .

Es wurde ein Verfahren zur virusfreien vegetativen Vermehrung und Erhaltung genetisch hochwertiger Individuen von Foeniculum vulgare-Hochleistungspflanzen gefunden, wonach meristematische Gewebe unter sterilen Bedingungen auf ein cytokininhaltiges Medium übertragen und bis zur Bildung von Sprossen oder neuem Meristemgewebe kultiviert werden. Diese Neubildungen werden von den Ausgangsexplantaten abgetrennt, vereinzelt und in an sich bekannter Weise vermehrt, wobei der Vermehrungszyklus sich nach Bedarf wiederholen kann. Die Bewurzeluhg der Sprosse erfolgt unter ebenfalls sterilen Bedingungen durch Kultivierung auf Bewurzelungsmedium. Die so erhaltenen Pflanzen werden isoliert, aus dem sterilen Milieu in Gesteinsmehl überführt und unter Folietunneln an Gwächshaus- bzw. Freilandbedingungen adaptiert.

Die pathogenfreien Pflanzen können wiederum wie oben beschrieben vegetativ vermehrt oder zur Saatgutgewinnung herangezogen werden. Die Erhaltung des Materials erfolgt durch Konservierung entweder in Form von sterilen Pflanzen als Arbeitskonserven oder in Form von sterilen Meristemen als Langzeitdepot. Als Ausgangsmaterial für die Sterilkultur dienen erfindungsgemäß Meristeme oder Meristemanlagen bzw.-Sproßspitzen, Stengelstücke, Seitenknospen oder Blüten mit Meristemen oder Meristemanlagen. Zur Bildung bzw. Vermehrung von Sprossen oder Meristemen wird für das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt das Kulturmedium nach Murashige und SkoogfMS-Medium, Tabelle 1) in modifizierter Zusammensetzung verwendet.

Zur Bewurzelung werden die angezogenen Sprosse erfindungsgemäß auf hormonfreies MS-Medium überführt. Die sich anschließende Adaptation an Gewächshaus- und Freiiandbedingungen erfolgt auf Gesteinsmehl aus Aluminiumsilikaten einer Korngröße von 0,5-3mm, das mit einer 1%igen handelsüblichen Wopil^(R'-Nährsalzmischung durchfeuchtet werd.

Zur Konservierung des Materials werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder die sterilen Pflanzen auf einem wuchsstoffreien Substrat bei 0 bis 4°C und 500-1 000 Lux aufbewahrt oder die sterilen Meristeme nach Vorbehandlung mit Kryopr otektoren, insbesondere Mischungen von Dimethylsulfoxid und Wasser oder Dimethylsulfoxid, mehrwertigen Alkoholen, vorzugsweise Glyzerol, sowie Syccharose mit Wasser langsam oder sehr schnell Temperaturen von unter—100°C ausgesetzt, in diesen Bereich gelagert und zur Rekultivierung schnell aufgetaut.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit die Erhaltung von genetisch wertvollem Zuchtmaterial von Foeniculum vulgare-Arten über einen langen Zeitraum, führt zu pathogenfreien, genetisch einheitlichen Pflanzen (Klonen) mit hoher Vitalität und qualitativ sowie quantitativ einheitlichem Gehalt an etherischen Ölen und gewährleistet die reproduzierbare Vermehrung dieses Pflanzenmaterials über lange Zeiträume, in beliebiger Menge und unabhängig von den natürlichen Vegetationsbedingungen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können hierbei unter produktionsmäßigen Bedingungen ausgehend von einer Foeniculum vulgare-Hochleistungspflanze mehrere zehntausend virusfreie Tochterpflanzen mit untereinander gleichen Eigenschaften erhalten werden.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele näher erläutert:

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

(Anzucht pathogenfreier Sprosse)

Sproßspitzen (Meristeme und nächstliegende Blattprimordien), Größe 0,3-0,5imm, werden am Sproßende oder aus den Blattachseln sterilisierter Knospen von Pflanzen entnommen. Die Sproßspitzen werden auf einem Nährboden zur Entwicklung gebracht, der neben den Salzen derTabelle 1, 0,5mg Thiamin, 100mg Inositol, 30mg Saccharose, 3mg Benzyladenin und 8g Agar sowie 2,25pankreatisches Pepton, 0,1 g Glukose, 0,610g Kaliumdihydrogenphosphatund 0,3g Natriumchlorid pro Liter enthält. Die Kultivation erfolgt bei 25°C bei einer 16stündigen Belichtung, die durch 8stündige Dunkelperioden unterbrochen wird. Nach 4 Wochen bilden sich virusfreie Sprosse und es entwickeln sich an den Blattachseln neue Sproßspitzen.

Beispiel 2

(Vermehrung steriler Sprosse)

Nach Beispiel 1 erhaltene Sprosse werden in einem Nährmedium, das neben den Salzen derTabelle 1, 0,5mg Thiamin, 100mg Inositol, 30g Saccharose, 0,610g Kaliumdihydrogenphosphat, 1-3 mg Benzyladenin und 8g Agar pro Liter enthält, im HeI!- Dunkel-Wechsel, wie in Beispeil 1 beschrieben, kultiviert (1 Sproß auf 50 ml Medium in 100 ml Becherglas), Innerhalb von vier Wochen bilden sich 10 Tochtersprosse, die vereinzelt werden und entweder zur weiteren Vermehrung benutzt werden.

Beispiel 3

(Bewurzelung steriler Sprosse)

Nach Beispiel 2 erhaltene Sprosse werden auf einem Medium kultiviert, das 8g Agar, 30g Saccharose sowie die Salze des modifizierten MS-Mediums (Tabelle 1) enthält, wobei die Stickstoffkonzentration zur Förderung des Wurzelwachstums auf die Hälfte verringert ist. Innerhalb von etwa 6 Wochen hat sich eine für die Überführung aus dem sterilen Milieu ausreichende Wurzelmasse gebildet.

Beispiel 4

(Anpassung der steril vermehrten Pflanzen an Freilandbedingungen)

Die nach Beispiel 3 hergestellten sterilen Pflanzen werden in Gesteinsmehl, das aus Aluminiumsilikaten einer Korngröße von 0,5-3mm entspricht, pikiert und unter Folietunneln kultiviert. Durch sich ständig verlängernde Lüftungszeiten wird die

Beispiel 5

(Konservierung von virusfreien sterilen Mutterpflanzen) Nach Beispiel 4 hergestellte sterile Pflanzen werden auf einem hormonfreien, zur Verfestigung mit Agar oder Gesteinsmehl aus Aluminiumsilikaten mit einer Korngröße von 1—2 mm (z.B. Perlit) versetzten Medium bei 0 bis 4°C und einer Beleuchtung von ca. 500 Lux aufbewahrt. Die Sprosse dieser Pflanzen können für einen Zeitraum bis zu 12 Monatenzur erneuten Vermehrung nach Beispiel 3 herangezogen werden.

Beispiel 6

(Konservierung von Meristemen)

Sterile Meristeme, die nach Beispiel 2 oder 3 erhalten wurden, werden mit Kryoprotektoren in Form von Mischungen aus 5-10% Dimethylsulfoxid und 90-95% Wasser oder aus 5-10% Dimethylsülfoxid, 5-10% Glycerol sowie 5-10% Saccharose und 70-85%Wasser versetzt und nach 12stündiger Einwirkung dieser Kryoprotektoren entweder sofort in flüssigen.Stickstoff überführt oder langsam (0,5 bis 1°C/min) auf etwa -100°C abgekühlt und danach in flüssigen Stickstoff überführt. Die Meristeme werden in oder über flüssigem Stickstoff beliebig lange gelagert. Bei Bedarf werden die Meristeme im Wasserbad bei +40⁰C schnell aufgetaut und wie in Beispiel 2 beschrieben kultiviert. Die sich entwickelnden Sprosse können nach Beispiel 3 zur weiteren Vermehrung benutzt werden.

Tabelle 1

Modifiziertes Nährmedium nach MURASHIGE und SKOOG (Physiol. Plant. 15 [1962] 479-497)

mg/1

CaCl₂ x 6 H₂O 661,0

KH₂PO₄ 170,0

Na₂EDTA x 2 H₂O 37,3

H₃BO₃ .6,2

MnSO₄ · · 15,1

ZnSO₄ x 7 H₂O 8,6

KJ 0,83

Na₂MoO₄ χ 2 H₂O 0,25

NH₄NO₃ 1650,0

KNO₃ 1900,0

MgSO₄ x 7 H₂O 370,0

FeSO₄ x 7 H₂O 50,0 . .

Thiamin 0,5

Pyridoxin 0,5

Nicotinsäureamid 1,0

m-lnosit 100,0

Saccharose . 30000,0

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur virusfreien vegetativen Vermehrung und Erhaltung von Foeniculum vulgare-Hochleistungspflanzen durch Verklonung meristematischer Gewebe in vitro in einem für Gewebekulturen üblichen Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man aus den Pflanzen Meristeme oder Meristemanlagen bzw. Sproßspitzen, Stengelstücke, Seitenknospen oder Blüten mit Meristemen oder Meristemanlagen gewinnt, diese sterilisiert und auf einem Cytokinine enthaltenden Nährmedium bis zur Neubildung von Sprossen und Meristemgewebe kultiviert, diese von den Ausgangsexplantaten abtrennt, vereinzelt und in an sich bekannter Weise auf einem Cytokinine enthaltenden Nährmedium vermehrt, anschließend auf hormonfreiem modifizierten MS-Medium mit der halben Stickstoffkonzentration oder fehlendem Cytokinin-Gehalt, bis zur Bewurzelung kultiviert, die so erhaltenen Pflanzen isoliert, durch Pikieren in Gesteinsmehl unter Folietunneln an Gewächshaus- bzw. Freilandbedingungen adaptiert und sterile Pflanzen bei minimalen Entwicklungsbedingungen oder sterile Meristeme in Anwesenheit von Kryoprotektoren bei Temperaturen von unter -100°C konserviert.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Adaptationsphase Gesteinsmehl aus Aluminiumsilikaten mit einer Korngröße von 0,5-3 mm, vorzugsweise 1-2 mm, wie z. B. das Aluminiumsilikatmehl Perlit, anwendet.
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß in vitro angezogene Pflanzen im sterilen Zustand bei 0 bis 4⁰C und 500-1000 Lux auf einem hormonfreien mit Agar oder Gesteinsmehl aus Aluminiumsilikaten, vorzugsweise Perlit, verfestigtem Nährmedium verschlossen, d.h. bei einer relativen Luftfeuchtigkeit nahe 100% aufbewahrt werden.
4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß in vitro angezogene Meristeme nach Kryoprotektorbehandlung entweder sehr langsam (ca. 0,5 bis 5°C/Min) auf -100⁰C oder sehr schnell durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff eingefroren und dann in oder überflüssigen Stickstoff gelagert, bei Bedarf möglichst schnell wieder aufgetaut und auf einem geeigneten Nährboden weiter kultiviert werden. "
5. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanzen vor Entnahme der Meristeme für Zeiten bis zu 4. Wochen bei Temperaturen von 4°C aufbewahrt werden.
6. Verfahren nach Punkt 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Kryoprotektoren Mischungen von 5-10% Dimethylsulfoxid und 90-95% Wasser oder von 5-10% Dimethylsulfoxid, 1-10% Glyzerol sowie 5-10% Saccharose und 70-85% Wasser eingesetzt werden.
7. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Einleitung der Konservierung die Kryoprotektoren bis zu 48 Stunden auf die Meristeme einwirken.
8. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Auftauen durch Erwärmen mit Wasser von etwa 40⁰C erfolgt.
9. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Kryoprotektor nach dem Auftauen aus den Meristemen langsam in das umgebende Medium diffundiert und durch Austausch des Mediums entfernt wird.