DD246566A1 - Selektionsverfahren fuer phytoeffektoren mit wirkung auf die chlorophyllsynthese - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung "Selektionsverfahren fuer Phytoeffektoren mit Wirkung auf die Chlorophyllsynthese" dient in erster Linie der Suche nach Pflanzenschutzmitteln. Zusaetzlich bestehen Moeglichkeiten des Einsatzes des Verfahrens zur Umweltueberwachung. Sie verfolgt das Ziel, ein Verfahren vorzuschlagen, das durch photometrische Messung der Extinktionen zweier definierter Wellenlaengen vermittels speziell hergerichteter Photometer und opalisierten Kuevetten, auf der Basis von diffus gestreutem Licht mit Wellenlaengen des Absorptionsmaximums des jeweiligen Pigmentes bei nur geringer Ueberlagerung des Absorptionsspektrums durch andere Pigmente und des absorptionsfreien Bereiches zur Korrektur der Reststreuung, an intakten Algensuspensionen, die dem Einfluss abgestufter Konzentrationen verschiedener Noxen oder anderer Umweltfaktoren ausgesetzt werden, unter Ausschaltung des zellzahl- und volumenproportionalen Streuungseinflusses, weitgehend pigmentkonzentrationsproportionale Messwerte zulaesst, wodurch diese im Vergleich mit denen unbehandelter Proben exakt quantifizierbare Aussagen zur Beeinflussung der wachstums- und entwicklungsabhaengigen Neusynthese des Chlorophyll a von Pflanzen zulassen. Das Verfahren ermoeglicht auch eine Testung von Verbindungen, die eine Truebung des Kulturmediums der Algen hervorrufen.
Description
Hierzu 3 Seiten Zeichnungen
Pflanzenschutzmittelforschung, Umweltschutz, Mikroalgen
Detaillierte in vitro-Untersuchungen des Pigmentgehaltes von Pflanzen sind zeit-, material- und personalaufwendig. Sie erfordern neben der Zerkleinerung der Pflanzen den Aufschluß der Zellen sowie die Extraktion, die Trennung und Quantifizierung der verschiedenen Pigmentanteile. Zur gravimetrischen Bestimmung braucht man zusätzlich nicht nur sehr viel Phytomasse, sondern unterliegt auch der Gefahr eines oxydativen Abbaus oder Zerfalls der Farbstoffe. Daher wird in den meisten Fällen der Pigmentgehalt nach Aufschluß- und Extraktionsverfahren ohne Auftrennung photometrisch bestimmt und nach Ausgleichsformeln verschiedener Autoren (MCKINNEY, 1941; ARNON, 1949; BÖGER, 1964) berechnet. Bei diesem Vorgehen muß mit Fehlern um 15% gerechnet werden (KUNERT und BÖGER, 1979).
Photometrische in vivo-Pigmentbestimmungsverfahren an Algen sind durch die von den Zellen verursachte Scheinextinktion mit einem großen Fehler behaftet. DOUCHA und KUBIN (1976) eliminieren die Meßwertverfälschung durch Streuung dadurch, daß jede Probe intakter Zellen von Algen gegen ihre eigene Ffeferenzprobe mit ausgebleichten Zellen vermessen wird. Dieses · Vorgehen erfordert einen erhöhten Zeit-und Materialaufwand und setzt voraus, daß beim Ausbleichen der Zellen die chlorophyllfreien intrazellulären Strukturen nicht angegriffen werden.
Nach den Patenten „Verfahren zur Selektion biochemisch wirksamer Substanzen ",DD-WP 94 234 „Verfahren zur differenzierten Selektion von Effektoren mittels autotropher Zellsuspensionen", DD-WP 200472 und „Verfahren zur Selektion von Effektoren mittels Wachstumsanalyse von Zellsuspensionen", DD-WP 214146 können diejenigen Chemikalien aus einer Stichprobe selektiert werden, die den außerordentlich komplexen Lebensprozeß des Zellwachstums oder die ihm zu Grunde liegenden Metabolismen beeinträchtigen. Derartige Verfahren erheben keinen Anspruch auf eine Zuordnung der Wirkung der eingesetzten Chemikalien zu einem Teilprozeß des komplexen Lebensprozesses des Zellwachstums. Aussagen zum Einfluß auf die Chlorophyllsynthese sind nicht verifizierbar.
Das von SHIBATA und Mitarbeitern (1954) im Rahmen von Grundlagenuntersuchungen zur Pigmentbestimmung an Algen vorgeschlagene Verfahren, die durch die Algenzellen verursachte Scheinextinktion in ihrem Einfluß auf die Messung der Lichtabsorption durch Pigmente dadurch zu minimieren, daß mit durch geeignete Opalglasfilter maximal gestreutem, d.h. diffusem Licht bei einer das jeweilige Pigment charakterisierenden Wellenlänge photometriert wird, bildet die Grundlage für das nachfolgend vorgeschlagene Selektionsverfahren für Phytoeffektoren mit Wirkung auf die Chlorophyilsynthese.
Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein einfaches, schnelles und hinreichend sicheres Verfahren für den photometrischen in vivo-Test vermittels diffusem Licht zur Selektion von Phytoeffektoren bzw. anderweitiger Umwelteinflüsse mit Wirkung auf die Chlorophyllsynthese von höheren Pflanzen auf der Basis einzelliger Mikroalgenkulturen vorzuschlagen, das nicht nur große Versuchsserien zuläßt, arbeits-, material-, zeit- und personalökonomisch sowie automatisierbar ist und sowohl bei Kultivierungsverfahren mit periodischer oder kontinuierlicher Verdünnung Verwendung finden kann, sondern auch erlaubt, Aussagen zur Substanzwirkung in den Fällen vorzunehmen, die bisher infolge von Trübung der Meßprobe einer Analyse meßtechnisch nicht zugänglich waren.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde,durch photometrische Messung der Extinktion zweier definierter Wellenlängen vermittels speziell hergerichteter Photometer und Küvetten, auf der Basis yon diffus gestreutem Licht mit Wellenlängen des Absorptionsmaximums des jeweiligen Pigmentes bei nur geringer Überlagerung des Absorptionsspektrums durch andere Pigmente und des absorptionsfreien Bereiches zur Korrektur der Reststreuung, an intakten Algensuspensionen, die dem Einfluß abgestufter Konzentrationen verschiedener Noxen oder anderer Umweltfaktoren ausgesetzt werden, unter Ausschaltung des zeilzahl- und volumenproportionalen Streuungseinflusses, weitgehend pigmentkonzentrationsproportionale Meßwerte zu erhalten, die im Vergleich mit denen unbehandelter Proben exakt quantifizierbare Aussagen zur Beeinflussung derwachstums- und entwicklungsabhängigen Neusynthese des Chlorophyll a von Pflanzen zulassen.
Daneben sollen Aussagen zur biologischen Aktivität solcher Verbindungen, die infolge schlechter Löslichkeit und Trübung des Kulturmediums einer in vivo-Testung an Algen bisher unzugänglich waren, auf der Basis der Pigmentsynthese nach Eliminierung der durch die Zellen selbst und die Wirkstoffe verursachten Streuungen des Meßlichtes, vermittels des Verfahrens möglich werden.
1. Ausführungsbeispiel
Man suspendiert eine Synchronkultur von Chlorella vulgaris in ein mineralisches Nährmedium und zieht die Zellen in einer geeigneten Anzuchtapparatur autotroph bei einer Temperatur von 37 0C unter Zufuhr von 51 Luft pro Stunde, die 2Vol.-% CO2 enthält, an. Es werden vor Belichtungsbeginn die Kontrollsuspensionen mit einem minimalen Volumen Wasser sowie die weiteren Chargen der Algensuspensionen mit den gleichen Volumena, die abgestuften Konzentrationen des gelösten Phytoeffektors Dodine enthalten, beimpft. Die Chlorophyllsynthese der Algen soll bei einer Lichtintensität von 2 χ 90 Watt/m2 PhAR über den Zeitraum von 6,5 Stunden untersucht werden. Dazu erfolgen innerhalb dieses Zeitintervalls distiηkte Messungen der optischen Dichte der einzelnen Chargen bei 680nm und750nm mit opalisierten Küvetten (0,5cm Schichtdicke) am Photometer (Spekol 10). Für jedes gemessene Wertepaar wird nun die chlorophyll a-konzentrationsproportionale Extinktionsdifferenz ΔΕ(ΔΕ = E680-E750) errechnet. Sie wird in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit t für die einzelnen Chargen zeichnerisch aufgetragen (Fig. 1).
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind der Figur 1 zu entnehmen. Die mit K gekennzeichnete Kurve zeigt den Extinktionsdifferenzverlauf der unbehandelten Kontrolle. Der zeitliche Verlauf der chlorophyll a-proportionalen Extinktionsdifferenz nach Zugabe von 3 x 10"4M, 1 x 1O-4M, 3 x 10"5M, 2 x 10"5M und 1 x 10"5M Dodine wird durch die Kurven I bis V dargestellt. Die Kurve I zeigt, daß die Chlorophyllsynthese durch die Behandlung mit 3 χ 10"4M Dodine bis etwa zur Hälfte des Untersuchungszeitraumes besonders stark gehemmt ist und danach eine sehr geringe Syntheseaktivität erreicht wird. Auch mit der niedrigsten Konzentration (Kurve V) werden die Kontrollwerte nicht erreicht.
Die Umrechung der chlorophyllkonzentrationsproportionalen Extinktionsdifferenz in Milligramm Chlorophyll a pro Liter Suspension wird durch die gewählte Auftragung von in Vorversuchen ermittelten Werten in Figur 2 verdeutlicht. Es ergeben sich bei doppeltlogarithmischer Darstellung der Extinktionsdifferenz in Abhängigkeit vom Chlorphyll a-Gehalt zwei lineare Bereiche a und b mit unterschiedlichen Anstiegen. °'
Der mathematische Zusammenhang zwischen dem Chlorphyll a-Gehalt und der Extinktionsdifferenz wird durch die folgenden ermittelten Gleichungen beschrieben: Bereich a:cchia= 4,6866 χ ΔΕ0·3376mg/l
fürAE< 0,144 Bereich b: cchia = 32,7292 x AEu1S6mg/l
fürAE> 0,144
Verfährt man wie im Ausführungsbeispiel 1 und versetzt einzelne Chargen von Algensuspensionen frisch angesetzter Synchronkulturen von Chlorella vulgaris mit abgestuften Konzentrationen von Amitrol, so erhält man die in Figur 3 dargestellten Änderungen des Chlorophyll a-Gehaltes durch die mehr oder weniger stark gehemmte Chlorophyll a-Synthese der Algen. Die mit K gekennzeichnete Kurve zeigt den Verlauf der Extinktionsdifferenz der unbehandelten Kontrollsuspension. Das Verhalten der Extinktionsdifferenz bei Einwirkung von 5 x 10"2%,1 χ 10"2%,3 χ 10"3%und 1 χ 10"3% Amitrol auf die Algensuspensionen ist durch die Kurven I bis IV dargestellt. 5 χ 10~2% Amitrol unterbindet fast über den gesamten Untersuchungszeitraum die Chlorophyllsynthese. Eine äußerst geringe Chlorophyllsynthese setzt erst nach der fünften Stunde ein. ,
Claims (4)
- Erfindungsanspruch:1. Selektionsverfahren für Phytoeffektoren mit Wirkung auf die Chlorophyllsynthese, dadurch gekennzeichnet, daß durch photometrische Messung der Extinktionen zweier definierter Wellenlängen vermittels speziell hergerichteter Photometer undopalisierten Küvetten, auf der Basis von diffus gestreutem Licht mit Wellenlängen des Absorptionsmaximums des Chlorophyll a bei nur geringer Überlagerung des Absorptionsspektrums durch andere Pigmente und des absorptionsfreien Bereiches zur Korrektur der Reststreuung, an intakten Algensuspensionen, die dem Einfluß abgestufter Konzentrationen verschiedener Noxen oder anderer Umweltfaktoren ausgesetzt werden, unter Ausschaltung deszellzahl- und volumenproportionalen Streuungseinflusses, weitgehend pigmentkonzentrationsproportionale Meßwerte erhalten werden, die im Vergleich mit denen unbehandelter Proben exakt quantifizierbare Aussagen zur Beeinflussung der Wachstums- und entwicklungsabhängigen Neusynthese des Chlorophyll a von Pflanzen zulassen.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Bildung der Differenzen der Meßwerte des absorbierenden Wellenlängenbereiches minus derer des absorptionsfreien Bereiches pigmentkonzentrationsproportionale Extinktionswerte erhalten werden.
- 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit verschiedensten Spezies von Mikroalgen sowie Homogenaten von pigmenthaltigen Organen niederer und höherer Pflanzen und auch mit suspendierten Chloroplasten und Chloroplastenfragmenten durchführbar ist.
- 4. Verfahren nach Punkt 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die durch das beschriebene Vorgehen erhaltenen Extinktionswerte einer unterschiedlichen mathematischen Bearbeitung zugeführt werden können und Vergleiche mit dem Verhalten von anderen Wachstums- und Entwicklungsparametern durchführbar sind.
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