DD216253A1 - Selektionsverfahren fuer effektoren mittels gasumsatz- und wachstumsanalysen heterotropher zellsuspensionen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung "Selektionsverfahren fuer Effektoren mittels Gasumsatz- und Wachstumsanalysen heterotropher Zellsuspensionen" dient der Suche nach Pflanzenschutzmitteln und nach Effektoren biologischer Prozesse. Sie verfolgt das Ziel, moeglichst in einem Arbeitsgang die Ergebnisse von Tests mit heterotrophen Zellsuspensionen auszuwerten und dabei primaere Atmungshemmer, primaer nichtrespiratorische Effektoren und unspezifische Atmungseffektoren besonders hinsichtlich der Beeinflussung sowohl der optischen Eigenschaften als auch der respiratorischen Gaswechselumsaetze zu charakterisieren und zu differenzieren. Die Erfindung basiert auf einem Auswertungsverfahren, das die entwicklungsbedingten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften bei verschiedenen Wellenlaengen sowie der respiratorischen Gaswechselumsaetze - Kohlendioxidproduktion und Sauerstoffverbrauch - substanzbehandelter Zellsuspensionen nutzt. Die Fig. 1 illustriert anhand von Wirkbildern fuer die Beeinflussung der optischen Eigenschaften bei 680 und 750 nm und der Kohlendioxidproduktion durch einen Effektor A, dass das Auswertungsverfahren darueber hinaus Informationen ueber Einsetzen, Verlauf und Bestaendigkeit der Wirkungsauspraegung in Abhaengigkeit von der Dosis und von der Einwirkungsdauer der Effektoren sowie ueber Art und Weise der Wirkungsausloesung liefert.
Description
Selektionsverfahren für Effektoren mittels Gasumsatz- und Wachstumsanalysen hoterotropher Zellsuspensionen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Pflanzenschutzmittelforschung, Suche nach Regulatoren . biologischer Prozesse, Haturstoffchemie, Umweltschutz
Es ist bekannt, daß für die Indikation der biologischen Aktivität von Effektoren Zellsuspensionen einzelliger Grünalgen genutzt werden können. Nach dem Patent "Verfahren zur Selektion biochemisch wirksamer Substanzen", DD WP C 12 K 1/00 ITr. 94 234, lassen sich mittels heterotroph kultivierter < Zellsuspensionen diejenigen Chemikalien aus einer Stichprobe selektieren, die den fundamentalen Prozeß des heterotrophen Zellwachstums, die Atmung, unmittelbar oder mittelbar beeinträchtigen oder fördern. Substanzen, die die Atmung nicht beeinflussen, aber dennoch, biochemisch wirksam sind, werden nach diesem Verfahren als biochemisch unwirksam eingestuft. Solche Substanzen müssen dann in einer Kette nachfolgender Tests spezifischer Zielstellung auf entsprechenden spezifischen Effekt geprüft werden, z.B. potentielle Photosynthesehemmer in einem Autotrophtest, Effektoren des Wukleinsäurehaushaltes in einem lukleinsäure-Test. ' '
Auch die als "biochemisch wirksam" eingestuften Substanzen bilden hinsichtlich ihrer Wirkungsweise keine einheitliche Gruppe. Sie können die Atmung unmittelbar beeinflussen, also als primäre Atmungs effekt oren wirken. Aber es besteht auch die Möglichkeit, daß sie nur mittelbar bzw. im Ergebnis ihrer Metabplisie-
rung den Atmungsprozeß tangieren, während sie ihre Hauptwirkung in anderen Stoffwechselbereichen, manifestieren. Informationen hierüber sowie die Selektion von vorrangigen Photosynthese- bzw. Atmungseffektoren, von nicht primären Photosynthese- oder Atmungshemmern, die Aufdeckung von Permeationseffekten und die Selektion von Hemmern der Licht- und Dunkelreaktion ermöglichen Selektionsverfahren, die auf Auswertungsmodi basieren, die entweder die entwicklungsbedingten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften oder der photosynthetischen bzw. respiratorischen Gaswechselumsätze substanzbehandelter autotropher bzw. heterotropher Zellsuspensionen nutzen.
Obwohl diese Selektionsverfahren darüber hinaus in der lage sind, die Wirkungsverlaufe näher zu charakterisieren, gestatten sie keine Aussägen über die Zeitabfolge der substanzinitiierten Beeinflussung der optischen Eigenschaften im Vergleich zur Beeinflussung der Gaswechselumsätze· >
Da auch eine vergleichende Betrachtung der Auswertungsergeb-
". y " . . .
nisse aus mehreren dieser Verfahren keine gesicherten Aussagen zulassen, ergibt sich der Wunsch nach einem Verfahren, das zwar ebenfalls auf Suspensionskulturen einzelliger Grünalgenoder anderer Organismensuspensionen beruht, dessen Auswerijungsmodus jedoch durci^ gleichzeitige bzw. simultane Analyse der optischen Eigenschaften und der entsprechenden Gaswechselumsätze eine genauere Charakterisierung der Effektoren hinsichtlich ihrer Wirkspezifik auf die Atmungsprozesse und optischen Eigenschaften der Zeilsuspensionen gestattet.
Die Erfindung verfolgt das Ziel, für die Testuhg der biologischen
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Aktivität von Effektoren mittels paralleler oder simultaner Analyse der substanzinitiierten Beeinflussung der optischen Eigenschaften sowie der respiratorischen Kohlendioxidproduktion und/oder des respiratorischen Saüerstoffverbrauchs heterotropher Zeil- oder Organismensuspensionen einen Auswertungsmodus vorzuschlagen, der neben einer Selektion primärer Atmungshemmer, einer Selektion von Effektoren, die die Atmung nicht primär tangieren,, aber biologisch wirksam sind, auch die Wirkspezifik besonders.der gleichzeitigen Beeinflussung der optischen Eigenschaften und der respiratorischen Gaswechselumsätze zu charakterisieren und zu vergleichen erlaubt.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mittels eines speziellen Auswertungsverfahrens auf der Grundlage von Vergleichen der Analysenergebnisse der optischen Eigenschaften als Wachstumsparameter und der respiratorischen Gaswechselumsätze substanzbehandelter, heterotroph kultivierter einzelliger Grünalgensuspensionen primäre Atmungshemmer, Effektoren, die nicht primär die Atmung tangieren und unspezifische Atmungseffektoren zu charakterisieren und zu differenzieren. Darüber hinaus werden Informationen über Einsetzen, Verlauf und Beständigkeit der Wirkungsausprägung in Abhängigkeit von der Dosis und von der Einwirkungsdauer der Effektoren, über Art /und'8We is e der Wi r,-kungsauslösung wie Soforthemmung der Atmung, Über Permeations- und Transportprobleme sowie über den Wirkungsmechanismus des Effektors erhalten, insbesondere gestattet das Verfahren, die Effekte für die Beeinflussung der optischen Eigenschaften mit denen der Beeinflussung der respiratorischen Gaswechselumsätze zu vergleichen und damit die Wirkspezifik und das Wechselverhältnis zwischen Gaswechselumsatz- und Wachstumsbeeinflussung zu charakterisieren und für die gezielte Wirkstofforschung zu nutzen.
Beim "Selektionsverfahren für Effektoren mittels Gasumsätz- und Wachstumsanalysen heterotropher Zellsuspensionen" verfährt man zunächst grundsätzlich so, wie es das "Verfahren zur Selektion biochemisch" wirksamer Substanzen" empfielt, also definierte " Mengen chemischer Verbindungen parallel oder simultan mit hetero-
• .· .- = ; ; -, ;:;λ—^;·;,/ ^,, . v;:f ' ." 4
troph kultivierten Zellsuspensionen einzelliger Grünalgen in unmittelbaren Kontakt bringt und diese Proben parallel mit unbehandelten Vergleichskulturen bei einheitlicher Temperatur zwischen 2O0C und 380C im Dunkeln belüftet, so daß sie auf der Grundlage des sieh vollziehenden Atmungsprozesses wachsen und sich entwickeln. Kontinuierlich oder zu festgelegten Zeitpunkten werden dann Proben und Vergleichskulturen oder Anteile von beiden parallel oder in definierter Folge mittels spektralanalytischer Verfahren bei einem, zwei oder mehreren Wellenlängenbereichen des infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Spektrums analysiert sowie die respiratorische Kohlendioxidproduktion mittels Infrarot-Gasanalysatoren, '^C-Methode, photometrischer Methoden und weiterer Verfahren und/oder der respiratorische Sauerstoff verbrauch mittels Paramagnet-Gasanalysatoren, sauerstoffsensitiver Elektroden, polarographischer und anderer elektrochemischer Meßketten, manometrischer Verfahren oder der Winkler-Methode analysiert und die dabei gewonnenen Ergebnisse beider Analysenmethoden - Analyse der optischen Eigenschaften und Analyse der,respiratorischen Gaswechselumsätze - vergleichenden Betrachtungen unterzogen·
Von der zu prüfenden Substanz A werden in einem Heterotrophtest die Beeinflussungen der optischen Eigenschaften bei 680 und 750 nm und der respiratorischen Kohlendioxidproduktion untersucht· Hierzu werden heterotroph kultivierte Zellsuspensionen einzelliger Grünalgen der Species Chlorella vulgaris var. vulgaris, Stamm BÖHM und BORKS 1972/1 mit einer Suspensionsdichte von 12·10 Zellen/cm mit verschieden konzentrierten wäßrigen lösungen der zu prüfenden Substanz A,beimpft und zusammen mit unbehandelten Kontrollen bei 37,50C im Dunkeln belüftet, wobei Glucose als organische Kohlenstoffquelle eingesetzt wird, so daß alle erforderlichen Voraussetzungen für die Atmung gegeben sind. Die Analysen der .optischen Eigenschaften und der respiratorischen Kohlendioxidproduktion erfolgten nach einer spezifisch entwickelten Meßanordnung, die durch Kopplung von kommerziell erhältlichen Infrarot- und Paramagnet-Gasanalysatoren eine gleichzeitige Bestimmung der Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentratio-
nen der entwicklungsbedingten Gaswechselumsätze an 6 Meßplätzen im offenen Gasstrom mit hoher Genauigkeit sowie eine äußere Messung der optischen Eigenschaften bei 680 und 750 mn ermöglichte» Während das Wachstum und der respiratorische Gaswechselumsatz der in Nährlösung suspendierten Zellen in den unbehandelten Vergleichskulturen einer normalen heterotrophen , Wachstumsentwicklung entsprechen, werden die optischen Eigenschaften bei 680 und 750 nm sowie die Kohlendioxid- und Sauerstoff Umsätze in den mit Chemikalien versetzten Chlorella-Sus-Pensionen während des Wachstums und der Entwicklung mehr oder weniger beeinflußt, wenn verschiedene Substanzkonzentrationen \„. den Atmungsprozeß mehr oder weniger stören.
Die Ergebnisse der Analysen für die Substanz A sind der Pig· 1 zu entnehmen. Zum besseren Vergleich wurden in allen Fällen vergleichbare Maßstäbe in Pig. 1 verwendet. Die Fig. 1, A1 enthält die dekadischen Lpgarithmen der Extinktionsmessungen bei 680 nm für die unbehandelte Kontrolle K und die mit abgestuft zunehmenden Konzentrationen der Substanz A versetzten Proben 1,2, 3 und 4 in Abhängigkeit von der Wachstums- bzw. Einwirkzeit, Fig. 1, Ap die entsprechenden. Ergebnisse solcher Extinktionsmessungen bei 750 nm. Obwohl beide Wirkbilder prinzipiell ähnliche Wirküngsverläufe zeigen, bestehen größere Unterschiede im Zeitpunkt des Einsetzens, im Verlauf und in der Beständigkeit der Wirkungsausprägung in Abhängigkeit von der Dosis des Effektors. Das verdeutlicht,' daß die Auswertung solcher Tests bei verschiedenen Wellenlängen, für die die Extinktionsmessungen bei 680 und 750 nm lediglich eine mögliche Kombination von vielen darstellen, in einem Arbeitsgang zu zum Teil sehr differenzierten Aussagen hinsichtlich der Wirkung auf die optischen Eigenschaften führen kann. Besonders deutlich zeigen sich diesbezügliche Unterschiede bei Korrelationen der> dekadischen Logarithmen der Extinktionswerte zueinander, -Fig. 1, Ag, bzw. bei Auftragungen der Q-Werte, Q = ^^qq^jcq* in Abhängigkeit von der Wirkdauer, Fig. 1, A^.
Die Fig. 1, A^ zeigt eine Auftragung der dekadischen Logarithmen der Konzentrationen der respiratorischen Kohlendioxidproduktion für die unbehandelte Kontrolle K und die mit^abgestuften Konzentrationen der Substanz A versetzten Proben 1 bis
in.Abhängigkeit von der Wachstums- bzw. Einwirkzeit. Im Vergleich zur Beeinflussung der optischen Eigenschaften in Fig. 1, A1 und Α« bestehen große Unterschiede im Zeitpunkt des Einsetzens, im Verlauf und in der Beständigkeit der Wirkungsausprägung der Wirkkurven in Abhängigkeit von der Dosis der Substanz A. So hemmen alle 4 Konzentrationsstufen in Abhängigkeit von der Dosis von Anfang an die Kohlendioxidproduktion. Die Dosis 2 führt zu einer Totalhemmung und die Dosen 3 und 4 scheinen den Kohlendioxidproduktionsprozeß in einen Kohlendioxidverbrauchsprozeß umzukehren.
Zusätzliche, weiterreichende Informationen zur Wirkspezifik der Substanz A auf den komplexen Atmungsprozeß heterotropher Zellsuspensionen sind über Vergleiche der Ergebnisse der optischen Analyse mit denen der Gaswechselumsatz-Analyse, in die beide respiratorischen Gaswechselumsätze - Kohlendioxidproduktion und Säuerstoffverbrauch - einbezogen werden können, zugänglich. Die Fig. 1, Ac zeigt als Beispiel in Form einer Aufträgung der dekadischen Logarithmen der Extinktionen bei 680 im und der dekadischen Logarithmen der Konzentrationen der respiratorischen Kohlendioxidproduktion einen solchen Vergleich. Der Fig. 1, Ac ist zu entnehmen, daß bereits die Dosis 1 die Köhlendioxid^- produktion stärker hemmt als das Wachstum bei 680 nm, wobei der Wirkungsverlauf für Dosis 1 dem der Kontrolle K ähnlich ist. Der Graph für Dosis 2 verdeutlicht, soweit eine Auswertung möglich war, daß diese Dosis das Wachstum vergleichsweise zur Dosis 1 und zur Kohiendioxidproduktion stärker hemmt, also ein anderer Wirkmechanismus vorliegt. Ahnliche Auswertungen für die Dosen 3 und 4 konnten in diesem Fall nicht durchgeführt werden, da die Umkehrung des respiratorischen Gaswechselumsatzes ,durch diese Dosen das nicht zuließen.
Neben den in der Fig. 1, A1 bis Ag für die Substanz A vorgestellten spezifischen Wirkbildern, die eine differenzierte Beurteilung der Wirkeigenschaften des Effektors und damit eine Selektion zulassen, sind η qualitativ und quantitativ unterscheidbare Wirkungsverläufe sowohl hinsichtlich der Beeinflussung der optischen Eigenschaften bei mehreren Wellenlängen als auch hinsichtlich beider respiratorischer Gaswechselumsätze denkbar« Die Fig. 2 zeigt als Beispiel 6 verschiedene Wirkbilder von η
möglichen in Form von Auftragungen der Respirationsgeschwindigkeit de™ /dt als Punktion der Wachstums- bzw. Einwirkzeiten
für die Beeinflussung des heterotrophen Atmungsprozesses einzelliger Grünalgen durch die Effektoren B, C, D, E, F und G; Im Gegensatz zu Pig· 1, A, erfolgte hier die Applikation nicht zur nullten Stunde, sondern erst im Bereich der dritten bis vierten Stunde. Der ApplikationsZeitpunkt ist in Mg. 2 durch Pfeile gekennzeichnet.
Durch Vergleiche entsprechender Wirkbilder, die aus parallelen oder simultanen Analysen der waehstumsbedingten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften und der respiratorischen Gaswechselumsätze resultieren, von neu untersuchten Substanzen, über deren herbizide Wirksamkeit bisher nichts oder wenig bekannt ist, mit einer Y/irkbildkartei oder mit Hilfe der elektronischen Datenverarbeitung der, Wirkdaten von gut untersuchten, auch kommerziell vertriebenen Herbiziden oder Standardherbiziden, erhält man konkrete Hinweise über ähnliche Wirkorte, Wirkmechanismen, Selektivität und Anwendungsmöglichkeiten solcher Effektoren.
Claims (6)
- Patentansprüche1. Verfahren zur Selektion von Effektoren mittels Gasumsatz- und Wachsturasanalysen heterotropher Zellsuspensionen, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Eigenschaften und der respiratorische Kohlendioxid- und/oder Sauerstoff-Umsatz substanzbehandelter heterotropher Zellsuspensionen oder Organismensuspensionen genutzt werden, um mittels substanzinitiierter Variation der optischen Eigenschaften und respiratorischen Kohlendioxid- und/oder Sauerstoff-Umsätze solcher Suspensionen die Effektoren nach ihrer Wirkspezifik in primäre und sekundäre'Atmungseffektoren.sowie' in atmungsneutrale Effektoren differenzieren zu können. <
- 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als heterotrophe Zellsuspensionen oder Organismensuspensionen alle suspendierbaren heterotrophen Bakterien, Blaualgen und Grünalgen verwendet werden können.
- 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Eigenschaften der Zeil- oder Organismensuspensionen mittels Spektralkolorimetrie, Spektralphotometrie oder Nephelometrie bei ein bzw· zwei bis η verschiedenen · Wellenlängenbereichen- oder ganzen Spektralbereichen im infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Spektralbereich analysiert werden.
- 4. Verfahren nach Punkt 1, 2 und 3» dadurch gekennzeichnet, daß der respiratorische Sauerstoffumsatz mittels Paramagnet-Gasanalysatoren, sauerstoffsensitiven Elektroden, Polarographie und anderen elektrochemischen Meßketten, manometrischen Verfahren, der Winklermethode oder durch Kombination mehrerer ,,dieser Methoden analysiert wird.
- 5. Verfahren nach Punkt 1, 2, 3 und 4» dadurch gekennzeichnet, daß der respiratorische Kohlendioxidumsatz mittels Infrarot-Gasanalysatoren, C-Methode, photometrischer Methoden oder durch Kombination dieser Methoden analysiert wird.
- 6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Eigenschaften und die respiratorische Kohlendioxidproduktion und/oder der respiratorische Sauerstoffverbrauch der heterotrophen Zeil- oder Organismensuspensionen parallel oder simultan analysiert werden.Hierzu .SLSeiten Zeichnungen
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