DD249037A1

DD249037A1 - Verfahren zur synthese von streptokinase durch heterologe produzenten

Info

Publication number: DD249037A1
Application number: DD25552383A
Authority: DD
Inventors: Horst Malke; Joseph J Ferretti
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1983-10-10
Filing date: 1983-10-10
Publication date: 1987-08-26
Also published as: ZA847873B; GR80577B; JPS60237995A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Streptokinase durch heterologe Produzenten. Ihr Ziel besteht in der Isolierung eines Streptokinasegens (skc) und in der Bereitstellung von heterologen Wirten, die nach Aufnahme dieses skc-Gens Streptokinase zu produzieren vermoegen. Diese Aufgaben sind in der Weise geloest, dass im ersten Schritt eine Genbibliothek der genomischen DNA von Streptococcus equisimilis H46A mit Hilfe eines in-vitro-Systems zur DNA-Verpackung im Bakteriophagenvektor Lambda L47 angelegt wird. Die rekombinanten Phagenpartikeln werden dann unter Verwendung eines Plasminogen und Casein/Fibrin enthaltenden Assaysystems einem auf Streptokinasesynthese gerichteten Screening unterworfen. Die DNA der solcherart durch Primaerklonierung erhaltenen skc -rekombinanten Phagenstaemme wird mit Restriktionsenzymen analysiert, und Teile der Target-DNA-Inserts mit funktionellem skc-Gen werden in Plasmidvektoren subkloniert. Mit den skc -rekombinanten Plasmiden werden heterologe Bakterienarten, vorzugsweise Escherichia coli, Streptococcus sanguis und Bacillus subtilis, transformiert und die solcherart gentechnisch manipulierten Bakterien zur Streptokinaseproduktion durch submerse Fermentation eingesetzt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Klonierung eines Gens für Streptokinase (skc) und den Einsatz von heterologen Produzenten für die bakterielle Produktion des Genprodukts durch submerse Fermentation. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Forschung und Industrie.

Streptokinase ist ein Protein, das von beta-hämolytischen Streptokokken gebildet und als potentieller Virulenzfaktor ins Medium exportiert wird. Heterolog nennen wir erfindungsgemäß solche Streptokinase-produzierenden Bakterien, die anderen taxonomischen Einheiten als die bisher bekannten Produzenten angehören, normalerweise nicht Streptokinase produzieren, aber durch gezielte genetische Manipulation diese Fähigkeit erworben haben.

Streptokinase katalysiert die Konversion des enzymatisch inerten Plasminogen des Blutplasmas zum enzymatisch aktiven Plasmin, das durch begrenzte Proteolyse das Fibrinnetzwerk von Blutgerinnseln solubilisiert. Auf dieser fibrinolytischen Reaktion basiert der Einsatz von Streptokinase in der klinischen Medizin als bedeutsames Therapeutikum zur Behandlung thromboembolischer Gefäßverschlüsse (venöse und arterielle Thrombosen, Thrombophlebitiden, Lungenembolien, Gehimembolien etc.).

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bisher konnte Streptokinase nur durch submerse Fermentation von geeigneten Stämmen des Genus Streptococcus gewonnen werden. Solche Streptokinaseproduzenten sind unter den pathogenen Streptokokken der serologischen Gruppen A, B, C, G und F weit verbreitet. Zur industriellen Streptokinaseherstellung sind bevorzugt Stämme der Species S. equisimilis (serologische Gruppe C) eingesetzt worden. Ihre Streptokinasen werden z. B. unter den Handelsnamen Kabikinase (Kabi, Schweden), Streptase (Behringwerke AG, BRD) und Awelysin (AWD, DDR; vgl. Patentschrift DD 111096) vertrieben. Verfahren zur Optimierung der Streptokinaseproduktion in der industriellen Mikrobiologie haben sich praktisch nur auf die Verbesserung der Milieubedingungen während der Fermentation und der Reinigungsschritte bei der Streptokinasegewinnung aus den Kulturmedien beschränkt (s. Patentschrift DD 126342). Eine Optimierung der Produktionsstämme selbst mit konventionellen genetischen Methoden konnte dabei nicht erfolgen, da nichts über die Genetik der Produzenten im allgemeinen und die genetischen Grundlagen der Streptokinasesynthese im besonderen bekannt ist.

Seit einigen Jahren werden im zunehmenden Maße von der Grundlagenforschung entwickelte Methoden zur in-vitro-Rekombination von DNA ausgenutzt, um Gene zu isolieren, die für industriell und medizinisch wichtige Proteine kodieren. Diese Gene können in vitro in Vektor-DNA-Moleküle gespleißt und im Verbund mit diesen in geeignete homologe oder heterologe Wirte überführt werden. Dort können sie sich im Verein mit dem Vektor replizieren und unter bestimmten Bedingungen auch zur Expression gelangen. Organismen, die solche klonierten Gene tragen, sind viel besser einer genetischen Manipulation" zugänglich als die Wildtypen, die als Genspender dienten. Freie Wahl der Wirtsorganismen, Kontrolle des Gen-Dosiseffekts und Manipulation von Regulationsdeterminanten sind nur einige Faktoren, die dann zur Optimierung der Genproduktsynthese ausgenutzt werden können. Da das Streptokinasegen vorher nicht kloniert worden ist, ist auch die Streptokinasesynthese durch heterologe Organismen bisher nicht möglich gewesen.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der Isolierung eines Streptokinasegens (skc) und in der Bereitstellung von heterologen Wirten, die nach Aufnahme dieses skc-Gens Streptokinase zu produzieren vermögen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung basiert auf der Aufgabe, ein gentechnisches Verfahren zur Klonierung des Streptokinasegens zu entwickeln und heterologe Mikroorganismen zur Produktion des Genproduktes bereitzustellen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in einer Reihe von experimentellen Schritten wie folgt gelöst:

1. Auswahl des Genspenders

Als Gendonor wird ein Streptococcus der serologischen Gruppe C, vorzugsweise ein S. equisimilis und insbesondere Stamm H46A, verwendet. Letztgenannter Stamm, der als guter Streptokinaseproduzent bekannt ist, wird bereits zur technischen Herstellung des Proteins eingesetzt (Awelysin).

2. Isolierung der Total-DNA von H46A

Der bevorzugt eingesetzte Gendonor H46A ist plasmidfrei, so daß das Streptokinasegen in der genomischen DNA gesucht werden muß. Die DNA wird nach Zeliyse mittels Mutanolysin, Pronase und Natriumdodecylsulfat durch Extraktion mit Phenol/ Chloroform vorgereinigt, mit Äthanol präzipitiert und anschließend weiter durch Zentrifugation im Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid-Dichtegradienten gereinigt. Die so gewonnene DNA hat eine durchschnittliche Fragmentgröße von 50 Kilobasenpaaren (kb).

3. Anlage einer Genbibliothek für H46A

Die DNA des bevorzugt herangezogenen Gendonors H46A wird partiell mit einem kleinschneidenden Restriktionsenzym, das mit den Insertionsorten im verfahrensgemäß verwendeten Bakteriophagenvektor kompatibel ist, vorzugsweise mit M6ol oder Sau3AI, verdaut und nach Zentrifugation durch einen Sucrosegradienten größenfraktioniert. Gradientfraktionen, die Verdauungsfragmente im Größenbereich zwischen 4 und 15kb enthalten, werden vereinigt, und diese DNA wird mit einem an sich bekannten Bakteriophagen-Vektor, vorzugsweise mit Lambda L47, der zuvor komplett mit einer das zentrale stuffer-Fragment entfernenden und kompatible Enden liefernden Endonuclease, vorzugsweise mit BamH1, gespalten wurde, ligiert. Die Ligation wird in an sjch bekannter Weise mit DNA-Ligase, vorzugsweise T4-DNA-Ligase, durchgeführt. Das Ligationsgemisch wird mittels eines an sich bekannten Lambda-DNA-Verpackungssystems in vitro in Lambda-Partikeln verpackt und durch Differenitalplattierung auf Wirtsstämmen, vorzugsweise auf E. coli-Wirtsstämmen, insbesondere auf WL87 oderWL95(P2), auf den Gehaltan rekombinanten Lambdaphagenpartikeln geprüft, in denen das zentrale Bam H1-stuff erFragment des Vektors durch H46A-DNA-Segmente ersetzt ist. Dabei ist die Ausbeute an rekombinanten Phagen mindestens 20fach größer als die Zahl rekombinanter Phagen, die auf Grund theoretischer Berechnungen zur Repräsentation des gesamten H46A-Genoms im Labdapräparat notwendig ist, das aus Ligation und in-vitro-Verpackung resultiert.

Die Primärklonierung der Gendonor-DNA, so daß der H46A-DNA, in dem vorzugsweise eingesetzten Vektor Lambda L47, der Plaques bildet, hat den Vorteil, daß die Etablierung der Genbank nicht lebensfähige Wirtszellen erfordert, wie dies bei der Verwendung von Cosmid- oder Plasmidvektoren notwendig wäre. Lange DNA-Segmente von H46A können so kloniert werden, selbst wenn sie sich schädlich auf die Lebensfähigkeit von E. coli-Zellen auswirken.

4. Nachweis von rekombinanten Vektorphagen, die skc enthalten

Die Lambdaphagenpartikeln der Genbank werden unter Standardbedingungen vorzugsweise auf einem Rasen von WL95(P2), der selektiv rekombinante Partikeln anzeigt, zur Plaquebildung gebracht und anschließend mit einem Indikatormedium überschichtet, das Agar oder Agarose, Casein (Magermilch) oder Fibrin und humanes Plasminogen enthält. Phagen, die skc enthalten, bilden Plaques, die von einer klaren Verdauungszone, hervorgerufen durch streptokinasevermittelte Plasminogenaktivierung, umgeben sind. Solche caseinolytischen/fibrinolytischen Plaques lassen sich nicht nachweisen, wenn dem Assaysystem Plasminogen entzogen wird — ein vorläufiger, guter Beweis für die Identität des in E. coli-Zellen durch Phageninstruktion gebildeten Genprodukts. Das Assaysystem produziert ferner keinen background, d. h. WL95(P2)- und WL87-Zellen sowie Wildtypvektorphagen sind unter den verwendeten Assaybedingungen nicht im geringsten caseinolytisch/ fibrinolytisch.

5. Subklonierung von skc in Plasmidvektoren von E. coli

Die rekombinanten Vektorphagen, die skc enthalten, darunter die als AL47Askc bis AL47Kskc bezeichneten rekombinanten Phagenklone, insbesondere Klon \L47Eskc, werden durch wiederholte Einzelplaqueisolierung gereinigt und vorzugsweise auf WL87 vermehrt, so daß hochtitrige Lysate zur DNA-Extraktion entstehen.

Die DNA von so erhaltenen skc⁺-rekombinanten Phagenstämmen, darunter insbesondere von Phagenklon A47Eskc, wird anschließend mit den Restriktionsenzymen Hindill, EcoRI und BamH1 sowie Agarose-Gelelektrophorese analysiert.

Die Insert-DNA-Fragmente werden dann durch Verdauung mit Hindi 11 oder EcoRI, die mit je 2 Orten die BamH1-Orte des jeweiligen Primärklons flankieren, herausgeschnitten und in Plasmidvektoren, vorzugsweise in E. coli-Vektoren und insbesondere in pBR322 oder pACYC184, subkloniert. Partielle Hindlll-Verdauung der DNA eines Primärklons (AL47Eskc) liefert nach Insertion der partiell verdauten Fragmente in den singulären Hindlll-Ort von pBR322, nach Transformation von E. coli HB101 und nach screening auf caseinolytischeTransformantenkolonien unter Verwendung der Casein-Plasminogen-Überschichtungstechnikdas Streptokinaseproduktion determinierende Plasmid pMF1 (11.8kb). pMF1 trägt im Hindlll-Ort ein 7.4kb langes Insert, das selbst aus 4 Hindlll-Subfragmenten von der Größe 2.65, 2.60,1.90 und 0.2 kb besteht, die durch partielle Hindlll-Verdauung von pMF1 kartiert werden können.

Nach Erhalt von Plasmid pMF1 wird das Verfahren in der Weise fortgeführt, daß aus diesem Plasmid durch Enzym EcoRI oder durch Enzym Pstl jeweils ein skc⁺-Fragment herausgetrennt und erneut in E.coli-Plasmidvektoren mit singulären Orten für EcoRI und/oder für Pstl, vorzugsweise in pACYC184, pBR322 oder pPLa2311, subkloniert wird.

Durch EcoRI-Verdauung von pMF1 entsteht eine 6.4kb langes Fragment, das u.a. 29 Basenpaare des Vektors pBR322 und als wesentliche H46A-DNA-Segmente die kompletten 2.65kb plus 1.90kb langen Hindlll-Fragmente von pMF1 enthält. Aus der Insertion dieses Fragments in den singulären EcoRI-Ort des E.coli-Vektors pACYC184 resultieren die neuen Plasmide pMF2l und pMF2ll (jeweils 10.4kb), die ebenfalls Streptokinaseproduktion in HB101 determinieren.

Durch komplette Pstl-Verdauung von pMF1 entsteht u.a. ein 2.5kb langes Fragment, das Teile der 2.65 und 1.90kb langen Hindlll-Fragmente von pMF1 enthält. Insertion dieses Fragments in den singulären Pstl-Ort von pBR322 liefert die Plasmide pMF5l und pMF5ll (jeweils 6.9kb), die ebenfalls Streptokinaseproduktion durch HB101 spezifizieren.

6. Identifizierung des skc-Genprodukts in E.coli

Die folgenden Beweise zeigen eindeutig, daß die Klonierungsprozedur zur Isolierung des Streptokinasegens (und nicht eines Proteasegens) geführt hat, das in E.coli so exprimiert wird, daß ein Protein mit einer für Streptokinase charakteristischen Substrat- und Immunospezifität synthetisiert wird:

— Diecaseinolytische/fibrinolytische Reaktion aller Primär- und Subklone ist abhängig von der Anwesenheit von humanem Plasminogen;

— Ersatz von humanem Plasminogen durch bovines Plasminogen im Assasystem,das bovines Fibrin als Substrat enthält, führt zu Fibrinolyse nur dann, wenn entsprechende Präparate von E.coli-Klonen, die skc enthalten, vor der Testung mit humanem Plasminogen vermischt werden (H46A-Streptokinase aktiviert nicht Rinderplasminogen);

— Diisopropylfluorophosphat, ein Inhibitor von Serienproteasen, hemmt nicht die Plasminogenaktivierung durch entsprechende Präparate der E.coli-Klone oder Subkione unter Bedingungen, die zu einer kompletten Inhibition der Caseinolyse durch Trypsin führen;

— Im Immunodiffusionstest liefern E.coli-Streptokinase und authentische Streptokinase aus H46A eine Identitätslinie aus der Präzipitationsreaktion mit einem gegen authentische Streptokinase produzierten Antikörper. Ferner neutralisiert dieser Antikörper die caseinolytische/fibrinolytische Aktivität von geeigneten Präparaten, die aus E.coli-Klonen gewonnen wurden, die skc tragen. Diese spezifischen serologischen Reaktionen erfolgen nicht mit ähnlichen E.coli-Präparaten, die sich von Stämmen mit den insertfreien Vektoren ableiten.

7. Synthese von Streptokinase in E.coli

Als Ergebnis der Subklonierungsprozeduren, die zu den Plasmiden pMF2 sowie pMF5 führten, wurden HB101-Klone erhalten, die das EcoRI- bzw. Pstl-Insert in beiden möglichen Orientierungen (I und II) im Vektortragen. Für beide Plasmide liegt dabei der Befund vor, daß sie Streptokinasesynthese unabhängig von der Orientierung von skc determinieren. Hieraus folgt, daß in beiden Plasmiden der eigene Promoter des skc-Gens anwesend ist und vom Transkriptionssystem der Wirtszellen auch benutzt wird.

Interessanterweise wurde in diesem Zusammenhang gefunden, daß der Expressionsgrad von skc in pMF5 in einer Orientierung (II) größer ist als in der anderen (I). Dies legt nahe, daß sich die Transkription von einem oder beiden Promotern des Beta-Lactamasegens (bla) von pBR322 in Orientierung Il in die skc-Genregion hinein erstreckt und damit zu dessen erhöhter Expression führt. Aus diesem Befund läßt sich auch das skc-Gen in beiden Plasmiden bezüglich der Richtung seiner Transkription (Lage des Promoters) orientieren.

Bezüglich der Lokalisation von Streptokinase in E.coli skc-Kulturen wurde gefunden, daß auf festem Nährboden der Nachweis der Streptokinaseproduktion mittels der Casein-Plasminogen-Überschichtungstechnik nicht die vorherige Lysierung der Kolonien erfordert, d.h. die E.coli-Zellen sind in der Lage, signifikante Streptokinasemengen in das umgebende Medium zu sekretieren und somit Caseinolysehöfe zu produzieren. Die Größe dieser Höfe ist mit denen vergleichbar, die Kolonien von S.equisimilis H46A unter ähnlichen Bedingungen produzieren. Streptokinaseausschüttung ins Medium erfolgtauch bei Kultivierung von skc⁺-E.coli-Klonen in Flüssigkeitskultur, wie sich aus Aktivitätsbestimmungen von zeHfreien Kulturüberständen oder -filtraten ergibt. Da E.coli-Zellen normalerweise nicht zur Sekretion von klonierten Fremdproteinen ins Medium befähigt sind, verdient ihre Befähigung zu Streptokinasesekretion besondere Beachtung. Da sie durch pMF2- und pMF5-tragende Klone erfolgt, die skc in beliebiger Orientierung enthalten, ist anzunehmen, daß die Streptokinase-Spezifische Signalsequenz für den Proteinexport eine entscheidende Rolle spielt und dieser nicht durch die entsprechenden Signalsequenzen der bla bzw. cat-Gene der beiden Vektoren vermittelt wird, in die kloniert wurde.

Zellfraktionierung nach Standardmethoden ergibt für Streptokinase-prodzierende E.coli-Kulturen ferner, daß das Protein in jungen stationären (gesättigten) Kulturen zusätzlich im periplasmatischen Raum und im Cytoplasma anwesend ist. In solchen Kulturen ist die Gesamtstreptokinaseaktivität im typischen Fall wie folgt verteilt: 17% im zellfreien Kulturmedium, 30% im Periplasma und 52% im Cytoplasma. Kulturen, die S=8 Stunden nach Erreichen der stationären Phase weiter unter Schüttelbedingungen bebrütet werden, lassen gewöhnlich peripläsmatische Streptokinaseaktivität vermissen, besitzen aber noch cytoplasmatische Aktivität. Offenbar wird bei verlängerter Kultivierung periplasmatisch lokalisierte Streptokinase komplett ins Medium sezemiert.

S. Klonierung von skc in anderen E.coli-Stämmen und anderen Bakterienspecies Die Verfügbarkeit der rekombinanten Plasmide pMF1, pMF2 und pMF5 sowie definierter H46A-DNA-Segmente, die skc enthalten, erlaubt die Einführung des Gens in zusätzliche E.coli-Stämme sowie in andere geeignete Vektoren und Klonierungswirte, darunter vorzugsweise in die folgenden:

— Andere E.coli-Stämme:

Die E.coli-Stämme 294 und CP78 lassen sich, wie in der weiteren Ausgestaltung des Verfahrens gefunden wurde, unter Standardbedingungen direkt mit pMF1, pMF2 und pMF5 transformieren, wobei für Ap^r bzw. Tc^r zu selektieren ist. Solche Stämme sind ähnlich wie HB101 zur Streptokinaseproduktion befähigt, und für sie gelten hinsichtlich der Lokalisation des Proteins qualitativ die gleichen Verhältnisse wie für HB101.

Da im E.coli-Wirtssystem offenbar die Hauptmenge der Streptokinase zellgebunden im Peri — oder Cytoplasma verbleibt, ist für die praktische Gewinnung des Proteins ein Produktionsstamm von Interesse, der effektiv ohne den Einsatz aufwendiger Fraktionierungsprozeduren und kostspieliger Chemikalien lysiert werden kann. Hierfür eignet sich HB101 (Lambda cl857), ein Lambda-Iysogener Abkömmling von HB101, dessen Prophage dank der Anwesenheit eines thermolabilen Repressors durch Hitzeschock induzierbar ist.

Dieser Stamm wird bei 30⁰C mit obigen Plasmiden transformiert. Flüssigkeitskulturen der Transformanten werden in der späten logarithmischen Wachstumsphase dann zur Inaktivierung des Lambdareprozessorfür 15 Minuten unter kräftigem Schütteln einer Temperatur von 42⁰C bis 43⁰C ausgesetzt und anschließend 2 Stunden bis 3 Stunden bei 37⁰C bis 38⁰C weiter bebrütet. In dieser Nachbebrütungszeit erfolgt Zellyse und damit die Ausschüttung der Streptokinase ins Medium. Die Möglichkeit LambdavermittelterZellyse wird vorteilhaft mit der Reklonierung des 6.4kb-EcoRI-Fragments aus pMF1 bzw. aus pMF2 (I oder II) sowie des 2.5kb-Pstl-Fragments wahlweise aus pMF1, pMF2 (I oder II) bzw. aus pMF5 (I oder II) in den jeweils singulären EcoRI- bzw. Pstl-Ort des E.coli-Expressionsvektors pPLa2311 verbunden, so daß die neuen, mit pSM22311 bzw. pSM52311 bezeichneten Plasmide entstehen. Die genannten Klonierungsorte liegen bei pPLa2311 stromabwärts vom starken p_L-Promoter des Phagen Lambda. Nach Temperaturinduktion von Lambda tritt p_Lin Funktion und vermittelt außerordentlich hohe Transkriptionsraten, wenn die skc-tragenden Inserts in der richtigen Orientierung in den jeweiligen Klonierungsort gespleißt sind.

— Streptococcus sanguis (Challis):

Bei S.sanguis (Challis) handelt es sich um den klassischen transformierbaren Streptokokkenstamm der serologischen Gruppe H, der als Wildtyp Streptokinase-negativ ist. Aus der für ihn existierenden Plasmidvektorfamilie mit singulärem EcoRI-Ort, in den Fremd-DNA kloniert werden kann, wird für den verfahrensgemäßen Zweck pSM7 (6.4kb) ausgewählt, ein Vektor, für den auf Erythromycin-haltigen Medien selektiert werden kann. Das6.4kb-EcoRI-Fragmentvon pMF1 bzw. von pMF2 (I oder II) wird in den EcoRI-Ort von pSM7 inseriert und das resultierende neue Plasmid, bezeichnet als pSM720, unter Standardbedingungen zur Transformation von Challis, vorzugsweise von Challis 6, benutzt.

Eine weitere Variante zur Einführung von skc in Challis besteht darin, daß pMF5 (I oder II) mit EcoRI linearisiert, EcoRI-gespaltene pSM7-DNA mit pMF5 (I oder II) ligiert und zur Transformation von Challis oder E.coli HB101 eingesetzt wird. Das reultierende neue Plasmid, bezeichnet als pSM752, erweist sich als eine bifunktionelle Chimäre zwischen pBR322 und pSM7, die skc weiterhin im Pstl-Ort von pBR322 enthält, aber die zusätzliche wichtige Eigenschaft der Replikation in E.coli plus S.sanguis besitzt (shuttle-Plasmid). pSM752 spezifiziert Streptokinasesynthese durch E.coli HB101 und durch S.sanguis Challis 6.

— Bacillus subtilis:

Für diesen Organismus, der neben E.coli bekanntlich die größte Rolle als alternativer prokaryotischer Klonierungswirt spielt, existiert eine große Zahl von Plasmidvektoren, von denen sich einige, die singuläre EcoRI-, Pstl- oder Hindlll-Orte besitzen, unmittelbar für die Reklonierung von skc und die nachfolgende Einführung in B.subtilis, vorzugsweise in Stamm 168, durch Transformation eignen.

Vorteilhaft wird insbesondere in pGR71 oder in pC194, die über singuläre Hindlll-Orte verfügen, nach partieller Verdauung von pMF1-DNAein Segment, bestehend aus den 2,65 + 1,90kb Hindlll-Fragmenten, gespleißt, so daß die neuen, mit pSM171 bzw. pSM1194 bezeichneten Plasmide entstehen;

in pUB110 mitsingulärem EcoRI-Ortwird nach EcoRI-Verdauung von pMF2 das 6,4kb-EcoRI-Fragment gespleißt, so daß das neue, mit pSM2110 bezeichnete Plasmid entsteht;

in pE 194 oder in pPL603 mit singulären Pstl-Orten wird das 2,5 kb-Pstl-Frag ment von pMF5 gespleißt, sodaßdieneuen,mit pSM5194 bzw. pSM5603 bezeichneten Plasmide entstehen.

Vorteile der Erfindung

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die Gewinnung einer Streptokinase durch submerse Fermentation von Bakterien möglich, die nicht zur Spezies Streptococcus equisimilis gehören und nicht wie diese pathogen sind.

Das Klonierungsverfahren ermöglicht weiterhin die Produktion einer mit Sicherheit unikalen Streptokinase, d. h. die Gewinnung eines Gemisches von Isostreptokinasen, bedingt durch das Vorliegen multipler Streptokinase-Gene, ist ausgeschlossen.

An Bakterienproteine, die wie Streptokinase parenteral verabreicht werden, müssen Anforderungen höchster Reinheit gestellt" werden, die sich insbesondere auf Toxinfreiheit und die Abwesenheit von Pyrogenen beziehen. Die bisherigen Streptokinaseproduzenten bilden Hämolysine, Streptodornase, Hyaluronidase, Diphosphopyridinnucleotidase etc., die im Zuge der Reinigungsschritte ebenso wie die schlecht definierten pyrogenen Substanzen abgetrennt werden müssen.

Diese störenden Substanzen fallen nicht bei der Fermentation mit den verfahrensgemäß eingesetzten heterologen Produzenten an. Ihre Verwendung eröffnet weiterhin diverse Möglichkeiten zur genetischen Manipulation der technischen Streptokinaseproduzenten.

Ausführungsbeispiele I. Primärklonierung des Streptokinasegens (skc)

II. Isolierung derTotal-DNA von Streptococcus equisimilis H46A

H46Awird über Nacht bei 37⁰C in 100 ml brain heart infusion broth als Standkultur bebrütet. Die Zellen werden auf der Zentrifuge zweimal mit eiskaltem TES-Puffer (0,05 M NaCI, 0,03 M Tris-HCI, pH 8,0,0,005 M EDTA) gewaschen und in 3 ml einerTES-Lösung, die 25% (w/v) Glucose enthält, resuspendiert. Die Zellsuspension erhält 0,5ml einerTES-Lösung mit 0,25M EDTA, 1 ml einer TES-Lösung mit 10 mg Mutanolysin und wird 30 Minuten bei 37°C bebrütet. Danach wird 0,5 ml einer Pronaselösung zugegeben, die aus der 30 Minuten langen Selbstverdauung des Enzyms (5mg/mlTES) bei 37°C resultiert. Nach weiteren 30 Minuten werden die Zellen durch Zugabe von 2ml einer 2"%igen Natriumdodecylsulfatlösung in TES komplett lysiert, das Lysat erhält 1,75ml einer 5M NaCIO₄-Lösung in TES, und die resultierende Mischung wird so oft mit Phenol/Chloroform (2:1) extrahiert, bis die Interphase kein Protein zeigt. Die DNA wird dann aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von 2 Volumen Äthanol gefällt, mit 70%igem Äthanol gewaschen und in 5 ml TES-Puffer gelöst. Zu dieser DNA-Lösung werden 5,4g CaCI und 1 ml einer Ethidiumbromidlösung (4mg/ml TES) gegeben (Brechungsindex = 1,3910), bevor sie 60 Stunden bei 37000rpm in einem Festwinkel rotor bei 15⁰C zentrifugiert wird. Die DNA sammelt sich in einer Bande, wird durch Punktur des Röhrchens geerntet, mit Isopropanol zur Entfernung des Ethidiumbromids extrahiert, gegen TE-PufferO 0 mM Tris-HCI, pH 7,4,1mM EDTA) dia lysiert und in einer Konzentration von ca. 1 mg/ml bei 4°C aufbewahrt. Elektrophorese durch ein 0,4%iges Agarosegel mit nativer Lambda-DNA als Standard zeigt, daß die so präparierte H46A-DNA eine durchschnittliche Fragmentgröße von 50kb besitzt.

12. Sau3A-Verdauung der H46A-DNA

In jedem von 20 parallel laufenden Ansätzen werden ΙΟμ-g H46A-DNA mit 0,4 U Sau3Afür20 Minuten bei Raumtemperatur in einem Reaktionsvolumen von 30μΙ partiell verdaut. Die Verdauungsgemische werden vereinigt und mit Phenol extrahiert. Die DNA wird mit Äthanol präzipitiert, in 300μΙ TE gelöst und 21 Stunden bei 25000 rpm und 18°C durch einen linearen 10- bis 40%igenSucrosegradienten (37ml in 1 M NaCI, 2OmN Tris-HCI, pH8,0, 5mM EDTA) zentrifugiert. Gradientfraktionen von 1ml werden gesammelt und Aliquote durch Agarose (0,5%)-Gelelektrophorese mit ungespaltener, Sail- und Hindlll-vertrauter Lambda-DNA als Größenstandards analysiert. Gradientenfunktionen, die DNA-Fragmente im Größenbereich von 4 bis 15kb enthalten, werden vereinigt, gegen TE dialysiert und durch wiederholte Extraktion mit Butanol konzentriert. Die DNA wird mit Äthanol präzipitiert und schließlich zu einer Konzentration von 1 mg/ml in TE gelöst.

13. Ligation

Die 4 bis 15kb langen Sau3A-Fragmente der H46A-DNA werden in den Bakteriophagen-replacement-Vektor Lambda L47 gespleißt, dessen DNA nach Standardmethoden präpariert oder kommerziell erworben werden kann. Dazu wird 1 ^g Lambda L47-DNA komplett mit BamH1 gespalten und nach Phenolextraktion in einem Reaktionsvolumen von 10μΙ mit 1 μg H46A/Sau3A-DNAund2UT4-DNA-Ligasefür 16 Stunden bei 12⁰C ligiert.

14. In-vitro-Verpackung der ligierten DNA

Das Ligationsgemisch wird in vitro durch Anwendung eines Verpackungssystems für Lambda-DNA, das nach Standardmethoden präpariert oder kommerziell erworben werden kann, in Lambdaphagenpartikeln verpackt. Der Größenbereich der H46A-DNA/Sau3A-Fragmente (4 bis 15kb) entspricht dabei der Verpackungskapazität des Vektors für die BamH1-Orte. Der Einsatz von 4μ.Ι Ligationsgemisch für die Verpackung liefert 10⁵ Plaque-bildende Lambdaphagen (PFU) auf einem Wirtsrasen von E.coliWL87, der die Gesamtphagenausbeute anzeigt (Verpackungseffizienz: 10⁵ Total-PFU/0,4^g Vektor-DNA). Plattierung eines aliquoten Volumens auf E.coli WL95(P2), der bekanntlich ein selektiver Wirt für rekombinante Phagen ist, zeigt, daß 20% der durch in-vitro-Ligation und Verpackung erhaltenen Gesamtphagenanzahl rekombinante Genome trägt, in denen das zentrale BamH1 -Fragment des Vektors durch H46A-DNA ersetzt ist. Werden 10 zufallsgemäß ausgewählte rekombinante Phagenstocks nach Hindlll-Verdauung ihrer DNA durch Gelelektrophorese analysiert, ergibt sich für sie eine durchschnittliche H46A-DNA-Insertgröße von ca. 10 kb. (Im Vektor flankieren 2Hindlll-Orte die beiden BamH1-Orte, so daß Insert-DNA mit Hindlll herausgeschnitten werden kann.) Unter der Voraussetzung, daß das H46A-Genom eine Größe von etwa 2000kb hat, läßt sich aus der Kenntnis der Insertgröße nach der Beziehung

(P = Wahrscheinlichkeit für die Anwesenheit einer beliebigen Sequenz; f = Fraktioneller Anteil des Gesamtgenoms in einer rekombinanten Phagenpartikel)

die Zahl N der rekombinanten Lambda L47-Partikeln berechnen, die zur vollständigen Repräsentation des H46A-Genoms in der Phagenbank notwendig ist. Für P = 99% und f = 10kb/2000kb ergibt sich N « 900. Diese theoretische Betrachtung zeigt, daß die Zahl der aus Ligation und in-vitro-Verpackung resultierenden rekombinanten Phagen mehr als 20mal größer als N ist (nämlich ca. 20000).

15. Nachweis von Streptokinase-bildenden Plaques

Phagen aus der H46A-Genbibliothek werden mit WL95(P2) als Indikatorstamm so nach der Doppelschichtmethode auf Standardmedien ausgeplattet, daß sich innerhalb von 6 Stunden bis 8 Stunden bei 37°C maximal 300 Plaques pro Platte ausbilden. Die Platten werden mit 9 ml einer 5OmMTHs-HCI (pH 8,1) — 15OmM NaCI-Lösung überschichtet, die 90 mg Agar oder Agarose, 100/u.g Hu ma η plasminogen und 1 ml Magermilch enthält. Nach einerminimalen Bebrütungszeit von 2 Stunden bei 37°C entwickeln solche Frequenzen Caseinolysehöfe, die von Phagenpartikeln mit dem Streptokinasegen herrühren (Abb. 1). Unter insgesamt 8360 ausgeplatteten rekombinanten Phagen wurden 10 gefunden, die caseinolytische Plaques bilden. Die Häufigkeit solcher Phagen in der Genbank (1/836) ist mit der theoretischen Erwartung für die Häufigkeit des Streptokinasegens auf der Grundlage der unter I4. angestellten Betrachtungen konsistent.

Die caseinolytische Reaktion erfolgt nicht, wenn die Überschichtung mit einem Medium erfolgt, dem Humanplasminogen fehlt — ein Beweis dafür, daß sie auf Plasminogenaktivierung zurückzuführen ist.

16. Restriktionsanalyse derskc-tragenden Lambda L47-Rekombination

Die lOcaseinolytischen Plaques wurden isoliert, durch je 2 weitere Einzelplaqueisolierungen gereinigt und in flüssigem Standardmedium auf WL87 propagiert, so daß 10 hochtitrige stock-Lysate (^ 10¹⁰ PFU/ml) mit den Klonbezeichnungen Lambda L47A-Kskc resultierten. Aus je 10ml dieser Lysate werden die Phagen durch Zentrifugation sedimentiert und nach Standardmethoden zur Extraktion ihrer DNA benutzt. Die DNA der Klone wird durch Hindlll-Verdauung und anschließende Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Abb. 2 zeigt das Hindlll-Verdauungsmuster der 10 Klone einschl. des insertfreien Vektors. Es ergibt sich, daß die Insertgrößen der Klone zwischen 7 und 15kb liegen und die Klone E und G identisch sind. (Dies wird bestätigt durch Analyse ihrer EcoRI- und BamH1-Verdauungsmuster). Das hervorragende Merkmal der Hindlll-Muster ist ein 1,90kb-Fragment, das allen Klonen gemeinsam ist. Ein zweites Hindlll-Fragment von 2,65kb ist 5 Klonen (incl. E und G) gemeinsam. Wie sich im weiteren zeigte, enthalten diese DNA-Segmente Sequenzen, die die Streptokinasebildung determinieren

ll.Subklonierung von skc

DieSubklonierungvonskcwirdinden Plasmidvektoren pBR322 oder pACYCI 84 von E.coli vorgenommen. Als Donor-DNA wird die DNA des Primärklons Lambda L47Eskc verwendet. Die Subklonierung erfolgt in 3 Stufen, die sukzessive zu einer Verkürzung des H46A-DNA-Fragments führen, welches skc enthält

111. Konstruktion von pMF1

In getrennten Reaktionsansätzen mit einem Gesamtvolumen von je 1O₁LtI werden 1^ig Lambda L47Eskc-DNA partiell und 0,5^g pBR322-DNA komplett mit Hindill gespalten. Die beiden Verdauungsgemische werden vereinigt, mit Phenol extrahiert, mit Äthanol präzipitiert und in einem Volumen von 10μ.Ι 8 Stunden bei 12⁰C ligiert. Zellen des durch Hitzeschock (42⁰C) induzierten E.coli-StammesHBIOI (Xcl857) werden nach der Standard-Ca-C^-Methode zur Transformation kompetent gemacht, und 3 χ 10⁹ kompetente Zellen werden in einem Reaktionsvolumen von 100μ,Ι mit 10μΙ des Ligationsgemisches transformiert. Die transformierten Zellen werden in 5 ml Luria-Bertani (LB)-Medium 1 Stunde bei 30⁰C zur Expression der Ampicillin-Resistenz(Ap^r) bebrütet und dann in geeigneten Verdünnungen auf LB-Agar + 50/.ig/ml Ap ausgeplattet. Nach Übemachtbebrütung bei 30°C wurden 260Ap^r-Transformantenkolonien durch Abimpfung auf LB-Agar -f 12,.5μg/ml Tetracyclin (Tc) auf Tc-Sensitiyität (Tc^s) geprüft, und 37 erwiesen sich alsTc^s. Von diesen ist anzunehmen, daß sie Target-DNA im Hindlll-Ort enthalten, der im Promoter desTc^r-Gens liegt, der durch DNA-Insertion inaktiviert wird. Die ApTc^s-Klone werden zur Koloniebildung auf LB-Agar ausgeplattet und mit der Casein-Plasminogen-Überschichtungsmethode auf Streptokinaseproduktion getestet. Es wurde ein caseinolytischer Klon gefunden. (Wird ein ähnliches Experiment mit Lambda L47Eskc-DNA ausgeführt, die komplett mit Hindlll gespalten wurde, werden unter mehr als 500 Klonen mit dem Phänotyp ApTc^s keine gefunden, die caseinolytisch sind. Dies deutet darauf hin, daß das skc-Gen mindestens einen Hindlll-Ort besitzt).

Aus einer LB-Kultur des caseinolytischen Klons wird nach der Standard-Klarlysatmethode Plasmid-DNA präpariert und der Restriktionsanlage mit folgenden Enzymen unterworfen: Hindlll, Aval, BamH1, EcoRI, Pstl und Sail. Die Daten, die die partielle Hindlll-Verdauung, die komplette Verdauung mit den übrigen Enzymen und die Doppelverdauung mit Enzymkombinationen, wie Hindlll + BamH1, Hindlll + EcoRI, Hindlll + Pstl und EcoRI + Sail lieferten, wurden zur Konstruktion der Restriktionskarte

des Plasmids benutzt, die in Abb. 3 dargestellt ist. Das Plasmid, das die Bezeichnung pMF1 erhielt, hat eine Größe von 11,8kbund besteht aus pBR322 mit einem 7,4kb-lnsert im Hindlll-Ort. (Ein Fragment derselben Größe läßt sich in partiellen Hindlll-Verdauungsgemischen von Lambda L47Eskc-DNA identifizieren, was anzeigt, daß das pBR322-lnsert keine vermischten Hindlll-Fragmente der H46A-DNA enthält.) Wichtig ist der Befund, daß pMF1 die kompletten 2,65 und 1,90kb-Hindlll-Fragmente des Primärklons benachbart enthält. Im Vergleich zum DNA-Gehalt des letzteren fehlen pMF1 die beiden Vektor-Arme und das 2,0kb-Hindlll-Fragmentdes Primärklons (s. Abb. 2).

Der E.coli-Klon, der pMF1 enthält, wurde in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie (ZIMET), Beutenbergstr. 11, Jena, 6900 unter der Bezeichnung HB101 (Acl857,pMF1) und der Registriernummer ZIMET 10953 hinterlegt.

112. Konstruktion von pMF2

Die Restriktionskarte von pMF1 (Abb.3) erlaubte die Formulierung einer klaren Strategie für die weitere Subklonierung von skc. Sie richtete sich im nächsten Schritt auf die Klonierung des großen EcoRl-Fragments (6,4kb) von pMF1, das die 2,65 und 1,90kb Hindlll-Fragmente komplett enthält (s. Abb.3).

Zu diesem Zweck werden in getrennten ΙΟμΙ-Ansätzen 1 μg pMF1-DNA und Ο,δμρ pACYC184-DNA komplett mit EcoRI gespalten. Die Verdauungsgemische werden vereinigt, zur Inaktivierung von EcoR115 Minuten bei 65°C gehalten und 12 Stunden bei 12°C in einem Gasvolumen von 40μΙ ligiert. Mit dem Ligationsgemisch wird E.coli HB101 transformiert, auf LB-Agar + 12,5/xg/mlTc ausgeplattet, und Tc^r-Transformantenkolonien werden weiter auf Sensitivität gegenüber Chloramphenicol (Cm^s) geprüft. (Insertion in den EcoRI-Ortvon pACYC184 inaktiviert das Cm^r-Gen cat).

Es wurden viele Transform ante η mit dem Phänotyp Tc^rCm^sskc⁺ gefunden, die alle caseinolytisch sind. Sechs dieser Klone wurden zur Isolierung von Plasmid-DNA benutzt, die mit EcoRI und Aval analysiert wird. EcoR?-Verdauung zeigte an, daß die 6 Klone ein 10,4kb Plasmid besitzen, das aus dem linearisierten Vektor (4,0kb) und dem erwarteten 6,4kb-lnsert besteht. Aval-Verdauung wird benutzt, um das Insert im Vektor zu orientierten (Vektor und 6,4kb-Fragment tragen je einen asymmetrisch zu den EcoRI-Orten liegenden Aval-Ort). Vier der 6 Klone trugen ein Plasmid, das Aal-Junktionsfragmente von 5,3 und 5,1 kb liefert; dieses Plasmid wird als pMF2l bezeichnet. Zwei Klone trugen ein Plasmid, das Aval-Junktionsfragmente von 6,9 und 3,5kb liefert; dieses Plasmid erhält die Bezeichnugn pMF2ll. Beide Plasmide determinierten Streptokinaseproduktion ohne feststellbare quantitativen Differenzen. Ihre Restriktionskarten mit relevanten Spaltorten sind in Abb.4 dargestellt. Ein E.coli-Klon, der pMF2l enthält, wurde in der o.g. Hinterlegungsstelle (ZIMET) unter der Bezeichnung BH101(pMF2l) und der Registriernummer ZIMET 10951 hinterlegt.

113. Konstruktion von PMF5

Pstl-Verdauung von PmF1 liefert 4 Fragmente von der Größe 6,0, 2,5, 2,2 und 1,1 kb (s. Abb. 3). Von diesen enthält das 2,5 kb-Fragment Teile der 2,65 kb und 1,90kb-Hindlll-Fragmente. Das 2,5kb-Pstl-Fragment wird in den singulären Pstl-Ort von pBR322 ligiert und mit dem Ligationsgemisch wird E.coli HB101 zu Tc^r transformiert. Zirka 30% derTc^r-Transformanten waren Ap^sskc⁺. Aus 4 Klonen mit dem Phänotyp Tc^rA^sskc⁺ wird die Plasmid-DNA isoliert und mit Pstl, Hindill und EcoRI analysiert. EcoRI lieferte erwartungsgemäß ein Fragment von der Größe 6,9 kb. Pstl-Verdauung liefert 2 Fragmente, von denen das4,4kb-Fragment den inearisierten Vektor und das 2,5kb-Fragment das Insert repräsentiert. Hindlll-Verdauung wird zur Orientierung des Inserts benutzt. Drei der 4 Klonejragen ein Plasmid, das Hindlll-Junktionsfragmente von 5,3 und 1,6kb liefert; dieses Plasmid wird als pMF5l bezeichnet. Der verbleibende Klon trägt ein Plasmid, das Hindlll-Junktionsfragmente von 4,4 und 2,5 kb liefert; dieses Plasmid erhält die Bezeichnung pMF5ll. Beide Plasmide determinieren Streptokinaseproduktion, doch ist sie, wie unter IV1. gezeigt werden wird, in den Klonen, die pMF5ll enthalten, stärker ausgeprägt. Die Restriktionskarten von pMF5ll mit relevanten Spaltorten sind in Abb.4 dargestellt.

Ein E.coli-Stamm, der pMF5ll enthält, wurde in o.g. Hinterlegungsstelle (ZIMET) unter der Bezeichnung HB101(pMF5ll)undder Registriernummer ZIMET 10952 hinterlegt.

114. Transformation der E.coli-Stämme HB101, 294 und CP78 mit skc-tragenden nativen Plasmiden

Nach Standardmethoden werden 3 χ 10⁹ kompetente Zellen von HB101, 294 und CP78, die in je 100μΙ Medium enthalten sind, mit ca. 0,5μg nativer Plasmid-DNA von pMF1 und pmF5ll transformiert. Transformanten werden auf LB-Agar + 50μ9/ηιΙ Ap bzw. 12,5μg/mI Tc selektiert und entwickelte sich mit einer Frequenz von der Größenordnung 10⁵(StämmeHB101 und 294) bzw. 10³ (Stamm CP78) pro μg Plasmid-DNA. Test auf Streptokinasebildung mittels der Casein-Plasminogen-Überschichtungsmethode zeigt an, daß alle Transformantenkolonien zur Streptokinseproduktion befähigt sind. Ein Stamm, der pMF5ll enthält, wurde in o.g. Hinterlegungsstelle (ZlMET) unter der Bezeichnung CP78 und der Registriernummer ZIMET 10954 hinterlegt.

III. Reklonierung von skc in Streptococcus sanguis

In getrennten ΙΟμΙ-Ansätzen werden 0,5μg pMF5ll-DNA und 1 μ-g pSM7-DNA komplett mit EcoRI gespalten. Die Verdauungsgemische werden vereinigt, zur Inaktivierung von EcoRI 15 Minuten bei 65⁰C gehalten und 12 Stunden bei 12⁰C in einem Gesamtvolumen von 40 μΙ mit1 Einheit T4-DNA-Ligase behandelt. Mit dem Ligationsgemisch werden 3 χ 10⁹ kompetente Zellen von E.coli HB101 in einem Reaktionsvolumen von 100μΙ transformiert. Die transformierten Zellen werden in 5ml LB-Medium 1 Stunde bei 37⁰C zur Expression der Antibiotikum-Resistenz (Tc^r) bebrütet und dann auf LB-Agar + 12,5μg/mlTC ausgeplattet. Nach Übernachtbebrütung bei 37⁰C wurde gefunden, daß 1,5% derTc^r-Transformanten gleichzeitig pSM7-determinierte Erythromycin-Resistenz (Em') (Wachstum auf ^^100μg/mlEm) tragen und zur pMF5ll-determinierten Streptokinaseproduktion befähigt sind. Die Plasmid-DNA eines Klons mit dem Phänotyp Tc^rEm^rskc⁺ wurde unverdaut und nach Spaltung mit EcoRI und Pstl durch Elektrophorese im Agarosegel analysiert. Es lag eine einzige Plasmidspecies, bezeichnet als pSM752, vor. pSM752 (13.3kb) ist ein Kointegrat zwischen pMF5ll und pSM7, und liefert erwartungsgemäß nach Pstl-Verdauung zwei Fragmente mit Größen von 10.8kb und 2.5kb (pSM7 hat keinen Pst-Ort) und nach EcoRI-Verdauung zwei Fragmente mit Größen von 6.9kb (pMF5ll) und 6.4kb (pSM7).—

Zur Übertragung von pSM752 in den Challis-Stamm von S.sanguis werden 1,8 ml einer nach Standardmethoden kompetent gemachten Kultur (ca. 8 χ 10⁷ Koloniebildner/ml) mit 0,1 ^g pSM752-DNA (in 10μΙ TE-Puffer) versetzt und 3 Stunden bei 37⁰C in Transformationsmedium bebrütet. Die transformierte Kultur wird auf brain-heart-infusion(BHI)-Agar + 10μg/ml Em zur Selektion von Plasmidtransformanten und auf antibiotikumfreiem BHI-Agar zur Bestimmung der Gesamtzellzahl ausgeplattet. Nach Übernachtbebrütung bei 37°C wurde eine Transformationsfrequenz von ca. 10~⁵ gefunden. Die Transformantenkolonien wurden mit der Casein-Plasminogen-Überschichtungstechnik auf Streptokinasebildung getestet, und alle erwiesen sich als Streptokinase-positiv. Von ei ne rTransformantenkolon ie wurde nach wiederhol te r Su bkultivieru ng auf BHI-Agar + 10μg/ml Em

und Einzelkolonieisolierung der Stamm S.sanguis Challis (pSM752) etabliert. Ein Vergleich der Durchmesser der durch Challis (pSM752)- und H46A-Kolonien auf BHI-Agar im Streptokinasetest gebildeten Caseinolysehöfe ergab, daß die Streptokinseaktivität der Challis-Kolonien der der H46A-Kolonien vergleichbar war. Dies zeigt erstens, daß das skc-Gen von S.equisimilis in S.sanguis unter Kontrolle seines eigenen Promotors exprimiert wird (der Beta-Lactamase-Promotor wird von Challis nicht erkannt). Zweitens unterliegt das Expressionsniveau einem Gen-Dosiseffekt (das Replikationsvermögen von pSM752 in Challis ist auf die pSM7-Komponente zurückzuführen, und pSM7 ist ein Multikopie-Plasmid). Der charakterisierte Challis-Klon wurde in o.g. Hinterlegungsstelle (Zl Μ ET) unter der Bezeichnung Challis (pSM752) und der Registriernummer ZIMET 10959 hinterlegt.

IV. Bestimmung der Streptokinaseproduktion durch skc-tragende E.coli-Stämme

IV1. Demonstration, daß pMF5ll ein höheres Expressionsniveau von skc spezifiziert als pMF5l LB-Agar-Platten werden so mit verdünnten Kulturen von HB101(pMF5l) und HB101(pMF5ll) beimpft, daß sie nach 18stündiger Bebrütung bei 37°C bis 100 Kolonien pro Platte entwickeln. Die Platten werden mit Streptokinase-Assaymedium überschichtet, und nach 8stündiger Bebrütung bei 37°C wird an je 100 Kolonien'der Durchmesser der von ihnen produzierten Caseinolysezonen gemessen. Ein repräsentatives Experiment ergab für HB101 (pMF5l)-Kolonien eine Verdauungshofgröße von 6,51 ± 0,28 mm und für HB101 (pMF5ll)-Kolonien eine Hofgröße von 7,35 + 0,30 mm. Statistische Analyse auf der Grundlage des t-Tests zeigt an, daß die Differenz im Expressionsniveau des skc-Gens hochsignifikant ist (P>0.99). Zwei Wiederholungen dieses Experiments lieferten ähnliche Resultate.

IV2. Lokalisation der Streptokinase von skc-tragenden E.coli-Stämmen

Wie bereits oben (111.—4., IVI.) wiederholt implizit festgestellt, scheiden E.coli-Kolonien, deren Zellen das skc-Gen tragen. Streptokinase ins Medium aus. Der Streptokinasenachweis auf festem Medium erfordert also nicht die vorherige Lysierung der Kolonien. Dieses Phänomen ist für Kulturen des nicht-lysogenen Stammes HB101(pMF1) in Abb. 5 illustriert. Sekretion der Streptokinase erfolgt nicht nur durch lebende Zellen ins feste Medium, sondern auch bei Kultivierung im flüssigen LB-Medium. Unabhängige 5 ml-HB1 OKpMFI (-Kulturen, die mit je einer Einzelkolonie beimpft und bis zur Sättigung (3 χ 10⁹ Zellen/ml) unter Schüttelbedingungen bei 37T bebrütet worden sind, enthalten 8 bis 100 Streptokinaseeinheiten/ml zellfreies Medium, wie sich ergibt, wenn das Protein im Lochtest im Casein-Plasminogen-Agarmedium durch Vergleich mit den bekannten Aktivitäten von Verdünnungen einer authentischen Streptokinase-Stammlösung bestimmt wurde. Unter der Annahme, daß authentische Streptokinase (spezifischer Aktivitäten des verwendeten Präparats: 55000 U/mg Protein) und E.coli-Streptokinase dieselbe spezifische Aktivität haben, entspricht diese sezernierte Streptokinasemenge 0,15 bis 1,82 mg/l Kulturmedium oder 600 bis 7000 Streptokinasemolekülen, die von einer Zelle sezerniert werden (M, der authentischen Streptokinase: 47,4K). Streptokinase ist in E.coli-Kulturen nicht nur extrazellulär lokalisierbar, sondern auch im Periplasma und Cytoplasma der Zellen, wie sich aus Aktivitätsmessungen an entsprechenden Zellfraktionen ergibt. Das periplasmatische Protein wird nach der „Mini' shock"-Prozedur erhalten, indem 3 x 10⁹ Zellen 2mal in 1 ml 1OmM T.ris-HCI (pH7,3)-30mM NaCI gewaschen, in 0,2ml 3OmM Tris-HCI (pH3,7)-20% (w/v) Sucrose-0,1 mM EDTA resuspendiert, in dieser Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur gehalten und dann durch Zentrifugation sedimentiert werden. Das Zellsediment wird in 0,6ml eiskalter 0,5mM MgCI₂-Lösung resuspendiert und 10 Minuten bei 0⁰C geschüttelt (osmotischer Schock). Die Zellsuspension wird zentrifugiert, und der Überstand enthält als osmotisphe Schockflüssigkeit die Proteine des periplasmatischen Raumes. Das Zellsediment wird in 1 ml 0,5mM MgCI₂-Lösung resuspendiert und bei 0⁰C mit 4 intermittierenden 20sec-Pulsen von Ultraschall behandelt. Nach Abtrennung unlöslicher Rückstände durch Zentrifugation enthält der Überstand die cytoplasmatischen Proteine. Wird eine junge stationäre Kultur (3 x 10⁹ Zellen/ml) von HB101(pMF5ll) dieser Fraktionierung unterworfen und werden die Streptokinaseaktivitäten der oben definierten Kulturfraktionen bestimmt, so ergeben sich folgende Aktivitäten pro ml Kultur: Zellfreier Überstand: 8U (17%), periplasmatische Fraktion: 14U (30%), cytoplasmatische Fraktion: 24,5U (52%). Alte stationäre Kulturen, die mehr als 8 Stunden nach Erreichen der Zellsättigung weiter bebrütet werden, lassen gewöhnlich die periplasmatische Aktivität vermissen, zugunsten des Ansteigens der extrazellulären Aktivität, besitzen aber noch cytoplasmatische Aktivität.

IV 3. Ausschüttung der Streptokinase ins Medium durch Hitzeinduktion von HB101(Acl857, pMF1 (-Kulturen Wird eine von zwei Parallelkulturen von HB101 (Acl857,pMF1) in LB-Medium nachdem Erreichen einer Zellzahl von ca. 5 χ 10⁸/ml durch 15 Minuten lange Bebrütung bei 42 °C hitzeinaktiviert und da rauf 2 Stunden bei 37 ⁰C zur ZeI lysierung nachbebrütet, so hat der durch Zentrifugation gewonnene zellfreie Kulturüberstand eine mindestens 15fach höhere Streptokinaseaktivität als der entsprechende Überstand der nicht durch Hitzeschock lysierten Parallelkultur.

V. Serologische Identifizierung von E.coli-Streptokinase

Die Verfügbarkeit eines von Dr. Dieter Gerlach (ZIMET) hergestellten und durch Affinitätschromatographie gereinigten monospezifischen Antikörpers gegen authentische Streptokinase von H46A ermöglichte die Ausführung von serologischen Tests, die die Identität von E-coli-Streptokinase und H46A-Streptokinase anzeigen. Im Doppeldiffusionstest nach Ouchterlony, ausgeführt auf 1%igen Agaroseplatten in Barbitalpuffer, entwickeln beide eine fusionierende Präzipitationsbande mit dem Antikörper. Im Lochplatten-Diffusionstest auf einem Casein-Plasminogen-Agarmedium wurde ferner gefunden, daß der Antikörper die Plasminogen-aktivierende Wirkung von E.coli-Streptokinase ebenso neutralisiert wie diejenige der authentischen Streptokinase (Abb. 6).

Abbildungslegenden

Abb. 1. Nachweis von rekombinanten Lambda L47-Phagen, die das Streptokinasegen tragen. Die Photographie zeigt

caseinolytische Plaques des Klons Lambda L47Kskc nach Plattierung auf E.coli WL87 als Indikator. Abb.2. Analyse der DNA der Primärklone Lambda L47A-Kskc durch Hindlll-Verdauung. 1: AL47; 2. AL47Askc; 3: AL47Bskc; 4:

AL47Cskc; 5: AL47Dskc; 6: AL47Eskc; 7: AL47Fskc; 8: AL47Gskc; 9. AL47Hskc; 10: AL47fe1ccAL47Kskc; 12: A-Wildtyp; 13: pBR322 verdaut mit Avail

Abb.3. Restriktionskarte von pMF1. Die dicke Linie repräsentiert die pBR322-Vektor-DNA. Abb.4. Restriktionskarten von pMF2 und pMF5. Die Orientierungen der Inserts sind durch Angabe einiger Restriktionsorte definiert. Dicke Linien repräsentieren Vektor-DNA. Die Pfeile zeigen die Transkriptionsrichtung des cat-Gens in

pACYC184 und des bla-Gens in pBR322 an

Abb.5. Caseinolysehöfe produziert durch HB101(pMF1 !-Kolonien nach Überschichtung mit Casein-Plasminogen-Agar.

6. Neutralisierung der caseinolytischen Aktivität von E.coli-Streptokinase durch einen monospezifischen Antikörper gegen authentische Streptokinase von H46A.

Obere Reihe von links nach rechts: 2.5, 5,10, 2OU gereinigte H46A-Streptokinase; mittlere Reihe von links nach rechts: H46A-Streptokinase (5U) + Streptokinase-Antikörper, H46A-Streptokinase (5U) + Nicht-Immunserum, H46A-Streptokinase (5U); untere Reihe von links nach rechts: Kulturüberstand von HB101(pBR322), Kulturüberstand von HB101(pMF1) + Streptokinase-Antikörper, Kulturüberstand von HB101(pMF1) + Nicht-Immunserum, Kulturübertand von HB101(pMF1).

Claims

1. Verfahren zur Synthese von Streptokinase durch heterologe Produzenten unter Anwendung von Teilen gentechnischer Standardmethoden der DNA-Rekombination, gekennzeichnet dadurch, daß

— das Gen für Streptokinase (skc) von einem Streptococcus der serologischen Gruppe C primär auf einem Bakteriophagenvektor kloniert wird, indem genomische DNA eines Gruppe C-Streptokokkenstammes und der Phagenvektor mit Restriktionsenzymen, die kompatible Enden liefern, gespalten werden, die so erhaltenen DNA-Fragmente ligiert werden, die ligierte DNA auf an sich bekannte Weise mittels eines Verpackungssystems in vitro in Partikeln des jeweils herangezogenen Phagenvektors verpackt wird und die resultierenden Phagenpartikeln nach Plaquebildung einem screening auf skc⁺-rekombinante Phagenstämme unterworfen werden,

— die DNA von so erhaltenen skc⁺-rekombinanten Phagenstämmen mit Restriktionsenzymen analysiert wird sowieTeile derTarget-DNA-lnserts mitfunktionellem skc-Gen aus einem durch die Primär-Klonierung erhaltenen rekombinanten Phagenstamm in an sich bekannte Plasmidvektoren, vorzugsweise für Escherichia coli, Streptococcus sanguis oder Bacillus subtilis, subkloniert werden,

— die erhaltenen skc⁺-rekombinanten Plasmidvektoren mit an sich bekannten Methoden in Stämme aus o. g. Bakterienarten transformiert werden und solcherart gentechnisch manipulierte Bakterienstämme zurfermentativen Produktion von Streptokinase eingesetzt werden, wobei die gebildete Streptokinase mit gängigen biochemischen Assays nachgewiesen oder gegebenenfalls quantitativ bestimmt wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß

— S. equisimilis, vorzugsweise Stamm H46A, als skc-Gendonor herangezogen wird,

die chromosomale DNA des eingesetzten Stammes mit Restriktionsenzymen, die mit den Insertionsorten im Bakteriophagenvektor kompatibel sind, vorzugsweise mit Sau3AI oder Mbol, partiell gespalten und durch Sucrosegradientenzentrifugation fraktioniert wird, wobei Donor-DNA-Fragmente mit einer Größe, die mit der Verpackungskapazität der Bakteriophagenvektor-DNA harmoniert, vorzugsweise von 4kb bis 15kb, gesammelt und zur Ligation eingesetzt werden,

— ein E. coIi-Bakteriophagenvektor, vorzugsweise Lambda L47, zur Primärklonierung des skc-Gens herangezogen und durch komplette Verdauung mit einem das zentrale stuffer-Fragment entfernenden Enzym, vorzugsweise BamH1,für die Ligation voirbereitet wird

— und die so präparierten Donor-DNA- und Bakteriophagen-DNA-Fragmente mit DNA-Ligase, vorzugsweise T4-DNA-Ligase, in an sich bekannter Weise ligiert und in vitro in Lambdaphagenpartikeln verpackt werden.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß im Ergebis der Primärklonierung erhaltenen rekombinanten Phagenpartikeln auf Wirtsstämmen, vorzugsweise auf E. coli-Wirtsstämmen, insbesondere auf WL87 oder WL95(P2), ausgeplattet und nach erfolgter Plaquebildung mit einem im Diffusionsbereich der Plaques Streptokinasesynthese anzeigenden Assaymedium, vorzugsweise ein Agar- oder Agarosemedium, bestehend aus Casein (Magermilch) oder Fibrin und humanem Plasminogen, überschichtet werden.

4. Verfahren nach Punkt 1, 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß die im Ergebnis der Primärklonierung erhaltenen skc⁺-rekombinanten Lambda L47-Phagenstämme, darunter die als AL47Askc bis AL47Kskc bezeichneten rekombinanten Phagenklone, insbesondere der Klon AL47Eskc, mit den Restriktionsenzymen Hindll!, EcoRI und BamH1 durch anschließende Agarose-Gelelektrophorese analysiert werden.

5. Verfahren nach Punkt 1,2 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß skc⁺-Fragmente der Target-DNA des jeweiligen Phagenklons, vorzugsweise eines von E. coli-Bakteriophagenvektoren hergeleiteten Klons, insbesondere des Klons Lambda L47Eskc, in Plasmidvektoren, vorzugsweise in E. Coli-Plasmidvektoren, insbesondere in Plasmid pBR322, subkloniert werden.

6. Verfahren nach Punkt 1 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß ein durch partielle Hindlll-Verdauung erhaltenes 7.4kb-skc⁺-Fragment der Target-DNA von Klon Lambda L47Eskc in den singulären Hindlll-Ort von pBR322 inseriert wird und das so erhaltene skc⁺-rekombinante Plasmid pMF1 (11.8kb) sowohl zur Transformation von E. coli-Stämmen als auch zur Konstruktion weiterer skc⁺- rekombinanter Plasmide eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Punkt 1 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß durch Enzym EcoRI oder durch Enzym Pstl aus dem Plasmid pmF1 jeweils ein skc⁺-Fragment herausgetrennt und erneut in E. coli-Plasmidvektoren mit singulären EcoRI- und/oder Pstl-Orten, vorzugsweise in pACYC184, pBR322 oder pPLa2311 subkloniert wird.

8. Verfahren nach Punkt 1,6 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß ein durch komplette EcoRI-Verdauungvon pMF1 erhaltenes 6.4kb-skc⁺-Fragment in den singulären EcoRI-Ortvon pACYC184 inseriert wid und die so erhaltenen skc⁺-rekombinanten Plasmide pMF2l und pMF2ll von jeweils 10.4kb sowohl zur Transformation von E. coli-Stämmen als auch zur Konstruktion weiterer skc⁺- rekombinanter Plasmide eingesetzt werden.

9. Verfahren nach Punkt 1, 6 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß ein durch komplette Pstl-Verdauung von pMF1 erhaltenes 2.5kb-skc⁺-Fragment in den singulären Pstl-Ortvon pBR322 inseriert wird und die so erhaltenen skc⁺-rekombinanten Plasmide pMF5l und pMF5ll von jeweils 6.9 kb sowohl zur Transformation von E. coli-Stämmen als auch zur Konstruktion weiterer skc⁺- rekombinanter Plasmide eingesetzt werden.

10. Verfahren nach Punkt 1, 6 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß das 6.4kb-skc⁺-Fragment mittels EcoRI aus pMF1 oder aus pMF2 herausgetrennt und in den singulären EcoRI-Ort von pPLa2311 inseriert wird, wobei das skc-Gen stromabwärts unter die Kontrolle des starken p_L-Promoters gerät, der nach Temperaturinduktion des Phagen λΟΙ857 eingeschaltet wird und das so erhaltene skc⁺-rekombinante Plasmid pSM22311 (10.2 kb) zur Transformation von ACI857-lysogenen E. coli-Stämmen, vorzugsweise HB101 (ACI857), eingesetzt wird.

11. Verfahren nach Punkt 1,6,8 und 9, gekennzeichnet dadurch, daß das 2.5 kb-skc⁺-Fragment mittels Pstl aus pMF1, pMF2 oder pMF5 herausgetrennt, in den singulären Pstl-Ortvon pPLa2311 inseriert wird, wobei das skc-Gen stromabwärts unter die Kontrolle des starken p_L-Promoters gerät, der nach Temperaturinduktion des Phagen ACI857 eingeschaltet wird und das so erhaltene skc⁺- rekombinante Plasmid pSM52311 (6.3 kb) zur Transformation von ACI857-lysogenen E. coli-f-Stämmen, vorzugsweise HB101 (ACI857), eingesetzt wird.

12. Verfahren nach Punkt 1, 6, 8 und 9, gekennzeichnet dadurch, daß jeweils eines der skc⁺- rekombinanten Plasmide pMF1, pMF2l und pMF2ll, pMF5l und pMF5ll in die E. coli-Stämme HB101, 294 oder CP78 transformiert wird, die so erhaltenen transformierten E. coli-Stämme zur Submersfermentation für die Produktion von Streptokinase eingesetzt werden und die dabei gebildete Streptokinase teils aus dem zellfreien Kulturmedium sowie teils aus dem Periplasma und dem Cytoplasma der E. coli-Zellen gewonnen wird.

13. Verfahren nach Punkt 1, 6,8, 9,10 und 11, gekennzeichnet dadurch, daß jeweils eines derskc⁺-

. rekombinanten Plasmide pMF1, pMF2l und pMF2ll, pMF5l und pMF5ll, pSM22311 und pSM52311 in den einen thermolabilen Phagenrepressor tragenden Lambda-lysogenen E. coli-Stamm HB101 (Acl857) transformiert wird, die so erhaltenen transformierten Stämme zur Submersfermentation für die Produktion von Streptokinase eingesetzt werden und die gesamte dabei gebildete Streptokinase nach Hitzeschock der jeweiligen Kultur aus dem zellfreien Medium geworden wird.

14. Verfahren nach Punkt 1 und 6 oder 8, gekennzeichnet dadurch, daß das 6.4kb-skc⁺-Fragment durch komplette Spaltung mit EcoRI aus pMF1 oder pMF2 herausgelöst, in den singulären EcoRI-Ort des Streptokokken-Vektorplasmids pSM7 inseriert, das so erhaltene skc⁺-rekombinante Plasmid pSM720 (12.8kb) in Stämme der Art Streptococcus sanguis, vorzugsweise in S. sanguis Challis 6, transformiert wird, die transformierten Stämme zur Submersfermentation für die Produktion von Streptokinase eingesetzt werden und die gesamte dabei gebildete Streptokinase aus dem zellfreien Medium gewonnen wird.

15. Verfahren nach Punkt 1,9 und 14, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA von pMF5 mit EcoRI linearisiert, anschließend mit EcoRl-gespaltener pSM7-DNA ligiert und die so erhaltene skc⁺- rekombinante bifunktionelle Plasmidchimäre (shuttle-Plasmid) pSM752 wahlweise in S. sanguis-Stämme, vorzugsweise in S. sanguis Challis 6, oder in E. coli-Stämme transformiert wird.

16. Verfahren nach Punkt 1 und 6 oder 8 und 14, gekennzeichnet dadurch, daß das durch komplette EcoRI-Spaltung aus pMF1 oder pMF2 herausgelöste 6.4 kb-skc⁺-Fragment in den singulären EcoRI-Ort von Plasmid pUB110 inseriert und das so erhaltene skc⁺-rekombinante Plasmid pSM2110 (11.0kb) in Bacillus subtilis-Stämme, vorzugsweise in B. subtilis 168, transformiert wird.

17. Verfahren nach Punkt 1, 6, 8 oder9 und 14, gekennzeichnet dadurch, daß das durch komplette Pstl-Spaltung aus pMF1, pMF2 oder pMF5 herausgelöste 2.5kb-skc⁺-Fragment in den singulären Pstl-Ort des Plasm ids pE194 oder des Plasmids pPL603 inseriert wird und die so erhaltenen skc⁺- rekombinanten Plasmide pSM5194 (6.2kb) bzw. pSM5603 (7.3kb) in B. subtilis-Stämme, vorzugsweise in B. subtilis 168, transformiert werden.

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