NO844039L - Streptokinase kodende rekombinant vektorer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører streptokinase-kodende rekombinantvektorer.

Et betydelig medisinsk problem, nemlig tromboembolisme, gir seg til kjenne ved okklusjon av blodkar p.g.a. tilstedeværelsen av tromber (blodpropper). Slik tromboembolisme er potensielt dødelig, idet den ofte påvirker organer slik som hjerte eller lunger. Denne blokkering av normal blodsirkulasjon kan lede til irreversibel vevskade etter hvert som metaboliserende celler fratas oksygen, næringsstoffer og en bane for utføring av avfalls-produkter. Et tromboembolittisk tilfelle, som beskrevet ovenfor, kan f.eks. resultere fra dannelsen av en blod-propp i en arteriosklerotisk endret arterie. En slik propp kan løsne og sirkulere til mindre arterier inntil den når en arterie eller arteriole som er for liten til å tillate passasje av proppen. Proppen blokkerer derved denne lille arterien og hindrer eller inhiberer gjennomstrømning av blod.

Gjenopprettelsen av normal blodstrømning gjennom de propp-blokkerte blodkarene, spesielt i tide for å hindre vevs-skade, er et viktig helbredende mål for moderne medisinsk praksis. En annen medisinsk metode for å takle det trombo-embolittiske problemet er å hindre dannelsen av vaskulære blodpropper når man har kjennskap eller mistanke til fore-komsten av betingelser som er kjent for å resultere i slike proppdannelser.

Visse trombolytiske midler letter in vivo lysis eller opp-løsning av blodpropper. Et av disse midler er bakterie-proteinet streptokinase.

Streptokinase, et protein som produseres og utskilles av hemolytisk Streptococci, ble oppdaget og vist å forsake lysis av propper inneholdende humant fibrinogen av Tillett og Garner ( J. Exp. Med. 58: 485 <1933>). Mens mekanismen for slik fibrinolyse ikke er "helt forstått, antas streptokinase i seg selv å binde og aktivere humant plasminogen, den fibrinolytisk inaktive forløperen for plasmin. Akti-veringen av slikt plasminogen resulterer i tilsynekomsten av plasmin, et fibrinolytisk enzym som hydrolyserer propp-fibrinogen (Castellino TIBS, p.l <Jan. 1979>).

Streptokinase er et trombolytisk middel som i dag anvendes for lysis av intravaskulære tromber i de pulmonale eller perifere blodkar (Marder, Ann. Intern. Med. 90: 802

<1979> ). Nylige studier av intrakoronar administrasjon av streptokinase ved behandling av akutt myokardialt infarkt hos pasienter indikerer en nyttevirkning i det tidlige forløp av akutt myokardialt infarkt (Khaja et al. N.E. J. Med. 308, s. 1305 <1983> og Anderson et al. N.E. J. Med. 308, s. 1312 <1983>). Streptokinase fra serologisk gruppe C Streptococci har blitt renset for klinisk anvend-delse og studert av flere forskere. Hovedkilden for denne streptokinase har vært dyrkningsvæsken som resulterer fra veksten av beta-hemolytisk gruppe C organisme Streptococcus equisimilis. Denne dyrkningvæsken inneholder i til-legg til streptokinase (et enkeltkjedet protein med en molekylvekt på 45.000-50.000) en rekke andre ekstra-cellulært utskilte stoffer. Siden mange av disse andre stoffer er toksiske eller potensielt toksiske overfor mennesker, innebærer fremstillingen av streptokinase fra dyrkningsvæske for klinisk anvendelse flere trinn som må utføres med stor nøyaktighet for å sikre et klinisk aksepterbart produkt. c-DNA-sekvensene i pattedyr-urokinase og vevstype plas-minogenaktivator har tidligere blitt klonet (Pennica et al., Proe. Nat. Acad. Sei. 7B, s. 1313 <1981>).

En publikasjon av Sako et al. (Mol. Gen. Genet. 190, s. 271) <1983>) beskriver kloningen av en stafylokinase-produserende Escherichia coli-transformant. Polydeoksy- nukleotidsekvensen sak som koder for stafilokinase, som er et plasminogenaktiverende protein med en størrelse på ca. 15 kd, ble fjernet fra en nativ stafylokokk-residerende bakteriofag (P (j>-2) og ligativt innført i plasmid pBR322. Dette sak-modifiserte plasmid ble benyttet for å transformere Escherichia coli K12 og den resulterende stafylokinase-produserende Escherichia coli-transformant, ble funnet å utskille mengder av stafylokinase i et dyrknings-medium.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en rekombinant vektor tilpasset for transformasjon av en egnet vert til fremstilling av streptokinase. Rekombinantvektoren innbefatter en vektor i hvilken det er innført et polydeoksyribonukleotidfragment som koder for syntesen og utskillelsen av streptokinase. Den transformante mikroorganisme som innbefatter denne rekombinantvektor, syntetiserer og ut-skiller streptokinase. Den transformante mikroorganismen kan dyrkes i et egnet næringsmedium for fremstilling av en streptokinaserik kultur hvorfra streptokinase kan isoleres .

Fig. 1 er en restriksjonsendonuklease-illustrasjon av plasmid pMFl; Fig. 2 illustrerer nukleotidsekvensen for det 2,5 kb Pstl-produserte pMFl-fragment.

Ifølge foreliggende oppfinnelse blir en første vektor spaltet med en restriksjonsendonuklease for dannelse av en lineær første vektor-DNA. Den første vektoren er fortrinnsvis et plasmid, som fortrinnsvis oppnås fra slektene Escherichia, Sacharomyces, Streptococcus, Bacillus, Neurospora eller Streptomyces. Mer spesielt er den første vektoren et plasmid oppnådd fra en mikrobiell kilde av arten Escherichia coli. Andre egnede kilder for den første vektoren innbefatter Saccharomyces cereviciae, Bacillus subtilus, Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans og Neurospora crassa. Mer foretrukket er plasmidet plasmid pBR322 som kan oppnås fra Escherichia coli RR1, NRRL B-1204, og som har blitt beskrevet av Bolivar et al.

(Gene, 2, s. 95, <1977>). Restriksjonsendonukleasen .for spalting av den første vektoren er fortrinnsvis enten Pst I eller Hind III.

Den lineære første vektor-DNA ligateres med et første polydeoksyribonukleotidfragment som koder for syntesen og utskillelsen av streptokinase, for dannelse av en første rekombinantvektor omfattende en første vektor hvori det har blitt innført et polydeoksyribonukleotidfragment som koder for syntesen og utskillelsen av streptokinase.

Det første polydeoksyribonukleotidfragment som koder for syntesen og utskillelsen av streptokinase blir fortrinnsvis oppnådd ved spalting av det kromosonale DNA til en streptokinaseproduserende mikroorganisme med en restriks jonsendonuklease, for dannelse av i det minste et lineært DNA-fragment som koder for syntesen og utskillelsen av streptokinasee. Mens streptokinase synes å eks-porteres fra Streptococcus equisimilis og fra pMFI-transformert Escherichia coli HB101, har mekanismen for en slik ekstracellulær eksport ikke blitt fullstendig defi-nert. De her benyttede betegnelser "sekret" og "sekresjon" eller "utskillelse" skal generelt indikere en ekstracellulær eksport av streptokinase. Den streptokinaseproduserende mikroorganismen som er en kilde for det første poly-deoksynukleotidfragmentet, er fortrinnsvis en hemolytisk mikrobe, og er mer foretrukket av slekten Streptococcus, og er helst av arten Streptococcus equisimilis. Mest foretrukket er Streptococcus equisimilisstammen H46A, serologisk gruppe C. Restriksjonsendonukleasen med hvilken DNA i den streptokinaseproduserende mikroorganismen spaltes, er fortrinnsvis Sau 3A eller Pst I. Polydeoksyribonukleotidfragmentet som koder for syntesen og sekresjonen av streptokinase ligateres med lineært DNA fra en annen vektor, som fortrinnsvis innbefatter en bakteriofag, og mest foretrukket omfatter lambda L47 bakteriofag. Den lineære andre vektor-DNA dannes fortrinnsvis ved spalting av den andre vektor-DNA med minst en restriksjonsendonuklease, fortrinnsvis Bam Hl. Ligering av det lineære polydeoksyribonukleotidfragmentet som koder for syntese og sekresjon av streptokinase med lineær annen vektor-DNA, resulterer i dannelse av en annen rekombinantvektor. Den andre rekombinantvektoren blir fortrinnsvis infektivt tilsatt til en egnet annen vert som fortrinnsvis omfatter en mikroorganisme, og mer foretrukket omfatter en bakterie. Bakterien er fortrinnsvis av slekten Escherichia, og mer foretrukket av arten Escherichia coli, Bakterien omfatter helst Escherichia coli-stamme WL95 (P2). De infiserte andre vertene som produserer streptokinase, velges og klones.

DNA fra de andre rekombinantvektorene av de streptokinase-produserende andre vertene, blir fortrinnsvis delvis spaltet med en restriksjonsendonuklease, som fortrinnsvis er den samme restriksjonsendonukleasen med hvilken den første vektoren spaltes som beskrevet ovenfor, og som fortrinnsvis omfatter Hind III eller Pst I. De lineære polydeoksy-ribonukleotidf ragmentene som dannes ved spalting av DNA fra de streptokinaseproduserende andre rekombinantvektorene omfatter en foretrukken kilde av første poly-deoksyribonukleotidf ragmenter som koder for syntesen og sekresjonen av streptokinase. Som beskrevet ovenfor blir et første polydeoksyribonukleotidfragment som koder for syntese og utskillelse av streptokinase, ligert med lineær første vektor-DNA for dannelse av en første rekombinantvektor.

Fig. 1 viser en restriksjonsendonuklease-opptegning av plasmidet pMFl. Dette plasmid omfatter en første rekombinantvektor som har blitt fremstilt ifølge den nettopp beskrevne fremgangsmåte, når den første vektoren er pBR322 og spaltes av Hind III, når den streptokinase-produserende mikroorganismen er Streptococcus equisimilis stamme H46A, serologisk gruppe C og spaltes med Sau 3A når den andre vektoren er lambda L47-bakteriofag og spaltes med Barn Hl, når den andre verten er Escherichia coli WL95 (P21) og når den andre rekombinantvektoren spaltes med Hind III.

Den første rekombinantvektoren blir infektivt tilsatt til en egnet første vert som fortrinnsvis omfatter en mikroorganisme, og mer foretrukket omfatter en bakterie. Bakterien er fortrinnsvis av slekten Escherichia, og mer foretrukket av arten Escherichia coli. Mest foretrukket er Escherichia coli stamme HB101. Denne infektive tilsetning resulterer i en streptokinase-produserende transformert første vert innbefattende en rekombinant første vektor som omfatter en første vektor i hvilken et første polydeoksy-ribonukleotidf ragment som koder for streptokinasesyntese og -utskillelse har blitt innført.

Infeksjon av Escherichia coli HB101 stamme med det rekombinante plasmid pMFl som beskrevet ovenfor, resulterer i den transformerte Escherichia coli stamme HB101 (pMFl). Kulturer av Escherichia coli HBlOi (pMFl) har blitt deponert hos American Type Culture Colletion, Rockville, Marryland, hvilken deponering har blitt gitt aksesjonsnum-mer 39613, deponert 16. februar 1984.

Den transformerte første verten, produsert som beskrevet ovenfor, dyrkes i et egnet næringsmedium for dannelse av en streptokinaserik kultur. Streptokinase kan deretter isoleres fra denne kulturen. Etter rensing er denne streptokinasen egnet for klinisk fibrinolytisk bruk.

Eksempel I

Isolering av Streptococcus equisimilis

H46A kromosomalt DNA

Streptococcus equisimilis stamme H46A (serologisk gruppe C) ble dyrket natten over som en stående kultur ved 37°C i 500 ml hjerne-hjerte-infusjonsbuljong ("Difco"). Streptococccus equisimilis-cellene ble høstet ved sentrifugering og vasket med kald TES-buffer (0,03 M tris, pH 8,0; 0,005 M EDTA; og 0,05 M NaCl). Cellene ble resuspen-dert i 15 ml 25 vekt-% glukose inneholdende 0,03 M EDTA og deretter ble mutanolysin oppløst i TES-buffer tilsatt til en konsentrasjon på ca. 2 mg/ml, og denne cellesuspensjon ble inkubert ved 37°C i 30 min. Ved dette punkt ble 12,5 mg av det proteolytiske enzym Pronase, som hadde blitt prefermentert i 30 min. ved 37°C som en TES-oppløs-ning av ca. 5 mg pronase pr. ml., tilsatt til celle-suspens jonen, og denne resulterende blanding ble underkastet en inkubasjon ved 37°C i 30 min. Etter inkubasjon ble cellene i blandingen deretter utsatt for ytterligere lysis ved tilsetning av 10 ml 2 vekt-% natriumdodecylsulfat i TES og 8,5 ml 5 M natriumperklorat i TES for dannelse av et lysat.

Lysatet ble deretter gjentatte ganger ekstrahert med en fenol-kloroform (2:1)-oppløsning inntil intet ytterligere protein viste seg ved den vandige/organiske-grenseflaten. DNA ble deretter utfelt fra den vandige fasen ved tilsetning av 2 volumdeler av etanol dertil. DNA-bunnfallet ble vasket med kald 70% etanol, oppløst i TES-buffer og renset ytterligere ved sentrifugering i en flytende densitetsgradient av cesiumklorid-etidiumbromid. Etter dialyse mot 10 mM tris, pH 7,6 med 1 nM EDTA for å fjerne cesiumklorid og etidiumbromid, ble H46A DNA-materialet som hadde en gjennomsnittlig størrele på ca. 50kb, lagret ved 4°C.

Eksempel II

Kloning av Streptococcus equisimilis H46A

DNA i bakteriofag lambda L47

Fremgangsmåten ifølge Cameron et al. (Nul. Acids Res. 4, s. 1429 <1977>) ble benyttet for fremstilling av DNA fra Amersham-tilveiebragt bakteriofag lambda L47 (Loehnen et al., Gene 20, s. 249 <1980>) oppnådd fra bakterielle lysa-ter med høy titer (dvs. inneholdende minst IO1*"1 pFU/ml) etter utfelling av protein ved hjelp av tilsetninger av natriumdodecylsulfat-kaliumsulfat. Bakteriofag lambda L47 DNA ble spaltet fullstendig med restriksjonsendonukleasen Barn Hl for dannelse av bakteriofag lambda L47 DNA-spaltningsfragmenter.

Streptococcus equisimilis H46A DNA, fremstilt som beskrevet ovenfor i eksempel I ble spaltet med restriksjonsendonukleasen Sau 3A ifølge metoden til Maniatas et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY <1982>) for dannelse av en blanding av H46A DNA-fragmenter. Blandingen av H46A DNA-fragmenter ble anbragt lagvis på en 37 ml, 10%-40% lineær sukrose-densitetsgradient inneholdende 1 nM NaCl, 20 mM tris (pH 8,0) og 5 mM EDTA og deretter underkastet sentrifugering ved 25.000 omdr./min. i 21 timer i en SW27 Beckman ultrasentrifugerotor. Fraksjoner med volumer på 1 ml ble oppsamlet fra den sentrifugerte gradienten og størrelsesfordelingen for DNA-fragmentene i hver fraksjon ble bestemt ved elektroforese derav i en 0,5%% agarose ("Sigma")-gel, og sammenligninger av fragmentmigreringene ble foretatt med de for baktertiofag lambda DNAS- referansefragmentene med kjente størrelser. Fraksjonene som hadde streptococcus equisilimis H46A DNA-fragmenter i størrelse fra ca. 4 kb til ca. 15 kb, ble oppsamlet, dia-lysert mot 10 mM tris, pH 7,4 med 1 mM EDTA og deretter utfelt med kald etanol. De utfelte DNA-fragmentene ble oppløst i 10 mM tris, pH 4,7 med 1 mM EDTA ved en konsentrasjon på 1 mg DNA pr. ml.

Ligering av Streptococcus equisimilis H46A DNA-fragmentene med spaltet bakteriofag lambda L47 DNA ble oppnådd ved kombinasjon, i et 10 my 1 volum, av 1 my g av de oppsam-lede H46A DNA-fragmentene med bestemt størrelse; 1 my g av spaltet lambda L47 DNA, T4 DNA-ligase og ligase-buffer, ifølge retningslinjene som medfølger Amersham lambda DNA in vitro pakningsutstyret. Etter en 12 timers inkubering ved 12°C ble 4 my 1 av den nå-ligerte DNA-blandingen pak-ket i lambda-faghodene i ovverensstemmelse med de betingelser som er foreskrevet i Amersham-instruksjonene som det er referert til ovenfor.

En porsjon av den således fremstilte ligerte fag ble infektivt tilsatt til hver av to Escherichia coli puter. En pute inneholdt stamme WL95 (P2), som tillater formering bare av rekombinante kloner inneholdende DNA-innskudd og er ikke mottagelige for fag P2-mediert interferens (Loenen et al. Gene 20, s. 249 <1980>). Den andre puten inneholdt stamme WL87 som tillater formering av rekombinante kloner samt av rekonstituert villtype lambda L47 fag.

Den totale pakningseffektivitet beregnet fra WL487-puten var 105 PFU pr. p.4' my g av lambda L47 DNA, og disse rekombinante kloner (oppnådd fra WL95 (P2)-puten) repre-senterte et forråd av Streptokokkus equisimilis-stamme H46A kromosom.

Eksempel III

Deteksjon av rekombinante fager som produserer streptokinase .

Aktivert plasminogen utvikler en kaseinolytisk samt en fibrinolytisk aktivitet. Escherichia coli-materialet som ble behandlet med rekombinant fag som beskrevet i eksempel II, ble dyrket som plaque på plater av næringsagar. Disse plater ble deretter overlagt med en oppløsning inneholdende 50 mM tris, pH 8,1, 150 mM NaCl, 10 my g/ml humant plasminogen, 10 mg agar/ml og 10 volum-% skummet melk og ble deretter inkubert ved 37°C i minst to timer. Tilstedeværelsen av streptokinase som en plaque resulterte i dannelsen av en omgivende klar sone i den overliggende geldannede oppløsning, hvilket indikerer kaseinhydrolyse av aktivert plasminogen. Av de således studerte mer enn 8.000 plaque-elementene, ble det funnet 10 som produserte omgivende klare soner av kaseinolyse. Disse 10 rekombinante streptokinase-produserende kloner ble betegnet lambda L47 (A til K) ske, isolert og lagret for ytterligere studium.

Eksempel IV

Fysikalsk kartlegging av rekombinant lambda L47 skc- kloner

De ti rekombinante streptokinase-produserende lambda-kloner som beskrevet ovenfor, ble isolert fra høytiter-lysater (lO<1>^ PFU/ml) ifølge metodene beskrevet av Davies et al. (A Manual for Genetic Engineering: Advanced Bacte-rial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY <1980>). Restriksjonsendonuklease-spalting av DNA fra disse kloner ble foretatt ved bruk av restriks jonsendonukleasene Barn Hl, Eco Ri og Hind III, igjen ifølge metodene beskrevet i Davies et al. De således oppnådde DNA-spaltningsprodukter sammen med DNA-markører av kjente molekylstørrelser, ble underkastet elektroforese i 1% agarosegeler. Den resulterende gelfordeling for DNA-fragmenter fra de streptokinase-produserende lambda-klonene indikerte at størrelsen på Streptococcus equisimilis H46A DNA-fragmentene innskutt i disse klonene, vari-erte fra 7 kb til 15 kb. Et 1,9 kb Hind III fragment var felles for alle ti klonene, hvilket antydet at dette 1,9 kb fragment spesifiserte i det minste en del av ske (streptokinase)-genet. Mønstrene fra lambda L47E ske og lambda L47G ske var identiske.

Eksempel V

Subkloning av skc- geenet i Escherichia coli plasmid-vektorer

DNA fra lambda L47E ske ble delvis spaltet med restriksjonsendonukleasen Hind III og deretter kombinert med DNA i plasmid pBR322 som hadde blitt fullstendig spaltet med den samme restriksjonsendonukleasen. En ligerings-blanding omfattende de ovenfor beskrevne spaltede DNA-fragmentene, T4 DNA-ligase og ligasebuffer, ble inkubert ved 12°C i 12 timer for å ligere det spaltede plasmid pBR322 DNA med det delvis spaltede DNA fra lambda L47E ske. Ligeringsproduktene ble benyttet for å transformere Escherichia coli stamme HB101 (en vanlig benyttet stamme K-12 underart) ved å følge metoden beskrevet av Dagert et al. (Gene 6, s. 23 <1979>), for dannelse av den transformerte mikroorganismen Escherichia coli HB101 (pMFl).

Fremstillingen av transformerte Escherichia coli stamme HBlOl-celler ble belagt på LB agarplater (Lennox, Viro-logy 1, s. 190 <1955>) som inneholdt 50 my g ampicillin/ml, og 260 ampicillin-hemmende (Ap<r>) kloner ble oppnådd. Når disse Ap<r->klonene ble testet for vekst på LB-agarplater inneholdende 12,5 my g tetracyklin/ml, ble 37 Tc<s->kolonier funnet. Når Tc<s->koloniene ble testet .for kaseinolytisk aktivitet (som beskrevet i eksempel III), ble det funnet at en koloni ga den omgivende klare sone som er karakteristisk for streptokinase-produksjon.

Plasmidet oppnådd fra denne streptokinaseproduserende transformant ble isolert ved ultrasentrifugering av flytende densitetsgradient og betegnet plasmid pMFl. Seks restriksjonsendonukleaser (Hind III, Pst I, Sal I, Bam Hl, Ava I og Eo RI) ble benyttet for å spalte plamid pMF ved den spaltningsmetode som er beskrevet i eksempel IV. Med de data som resulterte fra disse spaltinger ble en over-sikt over restriksjonssetene bestemt og er vist på fig. 1. Plasmid pMFl ble funnet å ha en molekylstørrelse på ca. 11,8 kb og inneholdt et 7,4 kb-innskudd i dets Hind III-sete som innbefattet skc-genet. Partielle Hind III-spaltningsprrodukter av det opprinnelige lambda L47E ske DNA inneholdt også 7,4 kb-fragmenter. Plasmid pMFl og DNA i lambda L47E skc-klonen inneholdt begge også fire Hind III-fragmenter av størrelse 2,65, 2,60, 1,9 og 0,2 kb. Disse identiske fragmentene bekreftet at de skc-beslektede sekvensene i lambda L47E ske DNA og plasmid pMFl DNA var identiske, og at de skc-beslektede sekvensene i plasmid pMFl var avledet fra de skc-beslektede sekvensene i lambda L47E.

Eksempel VI

Bekreftelse av at det klonede skc- gen hadde sin opprinnel-se i Streptococcus equisimilis stamme H46A

For å bekreftede at det klonede skc-gen var det til Streptococcus equisimilis stamme H46A, ble hybridiserings-metoden beskrevet av Southern (J. Mol. Biol. 98, s. 503

<1975>) benyttet.

Plasmid pMFl med et polydeoksynukleotid-innskudd som koder for streptokinase og med en størrelse på ca. 7,4 kb, ble underkastet spalting med restriksjonsendonukleasen Pst I og de fire resulterende pMFl-fragmentene med størrelser på 6,0, 2,5, 2,2 og 1,1 kb ble separert ved elektroforese i 0,8% lavtsmeltende agarose. Det 2,5 kb Pst I-produserete pMFl-fragmentet ble separert fra de andre fragmentene og fjernet fra agarosen ved elektroeluering. Dette rensede 2,5 kb-fragment ble utfelt fra oppløsning ved tilsetning av etanol og deretter oppløst i 10 mM tris, pH 7,4 inneholdende 1 mM EDTA. Det oppløste fragmentet ble "nick"-translatert ifølge metoden beskrevet av Maniatas et al.

(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY <1982>) for å danne en<32>p-merket 2,5 kb fragmentprobe. Kromosomalt DNA fra Streptococcus equisimilis H46A og fra Escherihia coli ble immobilisert på separate nitrocellulosefiltere. Den p-merkede fragmentproben ble radioautografisk funnet å hybridisere kun med immobilisert DNA fra Streptococcus equisimilis stamme H46A, hvilket således beskreftet at det 2,5 kb Pst I-produserte pMFl-fragmentet hadde sin opprin-nelse i Streptococcus equisimilis stamme H46A.

Eksempel VII

Identifisering av skc- genproduktet

Kaseinolyse-reaktiviteten benyttet i de ovenfor beskrevne metoder for å kontrollere skc-genproduktet var avhengig av tilstedeværelsen av humant plasminogen, hvilket indikerer at det proteolytiske skc-genproduktet var avhengig av det humane plasminogen, og at ingen uavhengig proteolytisk aktivitet var involvert. Denne skc-relaterte kaseinolyse-reaktivitet oppsto ikke når Bovin-plasminogen ble benyttet i stedet for humant plasminogen i den kaseionolytiske overlegningsanalysen. Streptococcus-streptokinase er in-aktiv for bovin-plasminogenaktivering.

Når de disopropylfluorfosfat, en irreversibel inhibitor i serin-holdige proteaser, ble inkludert i det kaseionolytiske reaksjonssystemet, var det ingen inhibering av kaseionolyse. Streptokinase, ikke en serinholdig protease, er likeledes upåvirket av diisopropylfluorfosfat.

I et Ouchterlony-immunodiffusjonssystem, ble antistoff som er spesifikt for streptokinase, anbragt i en senter-brønn, og renset streptokinase og supernatant fra en transformant Esherichia coli stamme HB101 (pMFl) kultur ble anbragt i separate omgivende brønner. Etter diffusjon gjennom gelen dannet det seg en immunobunnfall-identitetslinje hvilket indikerer at streptokinase og den immunologisk aktive kom-ponenten fra Escherichia coli stamme HB101 (pMFl) kulturen var identiske.

Eksempel VIII

Eksport av skc- genproduktet ved hjelp av Esherichia coli-trans formanter

Supernatant-kulturvæsker fra den pMFl-holdige tranformant av Escherichia coli stamme HB101 hadde nivåer for strepto-kinaseaktivitet i overensstemmelse med sekresjon av streptokinasen fra Escherichia coli-cellene. Likeledes resulterte kaseinolyse-overleggingsanalysene av transformerte bakteriekolonier i områder av kaseinhydrolyse som hadde store diametere i overensstemmelse med ekstracellulær streptokinaseproduksjon.

Kulturer av den pMFl-transformerte Escherichia coli stamme HB101 ble separert ved hjelp av sentrifuge i den tidlige stasjonære vekstfasen for dannelse av en supernatant-væske og cellepellet. De pelletiserte cellene ble vasket og behnandlet ved hjelp av den osmotiske sjokkmetoden ifølge Hazelbauer et al. (Cell. 16, s. 617 <1979>) for oppnåelse av periplasmisk væske og protein. Cytoplasmiske celle-proteiner ble oppnådd ved sonifisering av disse osmotisk sjokkpåvirkede cellene. Når streptokinase-aktivitet ble bestemt, ble det funnet at supernatant-væsken inneholdt 17%; periplasmaet 30%; og cytoplasmaet 52% av den totale aktivitet. Når dette forsøk ble gjentatt, men med pMFl-transformerte Escherichia coli HBlOl-celler som hadde blitt dyrket i den stasjonære fasen i minst 8 timer, inneholdt supernatantvæsken størstedelen av streptokinase-aktiviteten, mens periplasmaet inneholdt en ikke-detekter-bar liten mengde, og cytoplasmaet inneholdt resten.

Med Streptococcus equisimilis H46A synes streptokinase å være et utskilt protein. Dette kan ifølge signalhypotesen (Emr et al., J. Cell. Biol. <1980>, 86, s. 701; Talmadge et al., Proe. Nat'l. Acad. Sei. <1980>), 77, s. 3369; Gray et al., J. Bacteriol. <1981>, 145, s. <1981>, 78, s. 4466), indikere at en forløper omfattende streptokinase med et amino-terminalt signalpeptid syntetiseres av Streptococcus equisimilis H46A (Michaelis et al., Ann. Rev. Microbiol. <1982>, 36, s. 435; and Jackson et al., Bio-chem. <1982>, 21, s. 6620). Den pMFl-transformerte Escherichia coli HB101 synes også å utskille streptokinase, hvilket kan indikere et fellespreg for sekresjon i gram-negativ Streptococcus equisimilis H46A og gram-negativ (pMFl) Escherichia coli HB101. Polydeoksynukleotid-fragmentet fra Streptococcus equisimilis som inneholdes i pMFl-plasmidet, kan således kode for streptokinase samt for et amino-terminalt signalpeptid som er bundet til streptokinase, og som hydrolyseres når en streptokinase-sekresjon inntreffer.

2,5 kb Pst I-fragmentet produserte når det var subklonet i plasmid pBR 322, biologisk aktiv streptokinase og vil der-for inneholde alt skc-strukturelt gen. Fig. 2 viser nukleotidsekvensen for dette fragment bestemt ved konven-sjonelle sekvens-metoder, idet de deler som antas å kode for sekresjon ("A") og for streptokinase ("B") også er angitt.

Claims (45)

1. Rekombinant vektor tilpasset for transformasjon av en egnet vert for fremstilling av streptokinase, karakterisert ved at nevnte vektor omfatter en vektor i hvilken polydeoksyribonukleotid-fragment som koder for syntesen og sekresjonen av stepto-kinase har blitt innført.

2. Rekombinant vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at vektoren er et plasmid oppnådd fra en mikrobiell kilde av slekten Escherichia.

3. Rekombinant vektor ifølge krav 2, karakterisert ved at den mikrobielle kilden av slekten Escherichia er av arten Escherichia coli.

4. Rekombinant vektor ifølge krav 3, karakterisert ved at vektoren er plasmid pBR322.

5. Rekombinant vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at polydeoksyribonukleotid-fragmentet som koder for syntesen og sekresjonen av streptokinase er avledet fra en mikroorganisme av slekten Streptococcus.

6. Rekombinant vektor ifølge krav 5, karakterisert ved at mikroorganismen er av arten Streptococcus equisimilis.

7. Rekombinant vektor ifølge krav 6, karakterisert ved at mikroben er Streptococcus equisimilis stamme H46A.

8. Rekombinant plasmid pMFl, karakterisert ved at den er som vist ved restriksjonsendonuklease-opptegninngen på fig. 1.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av en rekombinant vektor omfattende en vektor hvori et polydeoksyribonukleotid-fragment som koder for syntesen og sekresjonen av streptokinase har blitt innført, karakterisert ved at man spalter en vektor med restriksjonsendonuklease for dannelse av lineær vektor-DNA; og ligerer den lineære vektor-DNA med et polydeoksyribonukleotid-fragment som koder for syntese og sekresjon av streptokinase, for dannelse av en rekombinant vektor omfattende en vektor hvori et polydeoksyribonukleotid-fragment som koder for syntesen og sekresjonen av streptokinase har blitt innført.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at polydeoksyribonukleotid-fragmentet fremstilles ved spalting av en streptokinase-produserende mikroorganisme med den samme restriksjonsendonukleasen som benyttes for å spalte vektoren, for dannelse av et polydeoksyribonukleotid-fragment som koder for syntesen og sekresjonen av streptokinase.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at restriksjonsendonukleasen er Pst I.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at restriks jonsendo-nukleasen er Pst I.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at vektoren er et plasmid oppnådd fra en mikrobiell kilde av slekten Escherichia .

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at den mikrobielle kilden av slekten Escherichia er av arten Escherichia coli.

15. Rekombinantvektor ifølge krav 14, karakterisert ved at vektoren er plasmid pBR322.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at polydeoksyribonukleotid-fragmentet som koder for syntesen og sekresjonen av streptokinase, er avledet fra en mikroorganisme av slekten Streptococcus.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at mikroorganismen er av arten Streptococcus equisimilis.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at mikroorganismen er Streptococcus equisimilis stamme H46A.

19. Transformant mikroorganisme som innbefatter en rekombinant vektor, karakterisert ved en vektor hvori et polydeoksyribonukleotid-fragment som koder for syntesen og sekresjonen av Streptokinase, har blitt innført.

20. Transformant mikroorganisme ifølge krav 19, karakterisert ved at den er av slekten Escherichia.

21. Transformant mikroorganisme ifølge krav 20, karakterisert ved at den er av arten Escherichia coli.

22. Transformant mikroorganisme ifølge krav 21, karakterisert ved at den er Escherichia coli stamme HB101.

23. Transformant mikroorganisme ifølge krav 19, karakterisert ved at vektoren er plasmid pBR322.

24. Transformant mikroorganisme ifølge krav 19, karakterisert ved at den rekombinante vektor er plasmid pMFl.

25. Mikroorganisme, karakterisert ved at den er Escherichia coli HB101 (pMFl).

26. Fremgangsmåte for fremstilling av et streptokinase-produserende mikroorganisme, karakterisert ved at transformasjon i en egnet mikroorganisk vert av en rekombinant vektor omfattende en vektor i hvilken det har blitt innført et polydeoksyribonukleotid-fragment som koder for syntesen og sekresjonen av streptokinase.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at mikroorganisme-verten er av slekten Escherichia.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27, karakterisert ved at mikroorganisme-verten er av arten Escherichia coli.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28, karakterisert ved at mikroorganisme-verten er Escherichia coli HB101.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 26, karakterisert ved at den rekombinante vektor er pMFl.

31. Polydeoksyribonukleotid-fragment, karakterisert ved at det koder for syntese og sekresjon av streptokinase.

32. Polydeoksyribonukleotid-fragment ifølge krav 31, karakterisert ved at det har restriks jonsendonuklease-spaltningsseter ved dens termina-ler .

33. Polydeoksyribonukleotid-fragment ifølge krav 32, karakterisert ved at det har ca.

7400 deoksyribonukleotid-par.

34. Polydeoksyribonukleotid-sekvens ifølge krav 32, karakterisert ved at spaltningssetene er for restriksjonsendonukleasen Hind III.

35. Polydeoksyribonukleotid-fragment ifølge krav 31, karakterisert ved at det er avledet fra en mikroorganisme av slekten Streptococcus.

36. Polydeoksyribonukleotid-fragment ifølge krav 35, karakterisert ved at mikroorganismen er Streptpococcus equisimilis stamme H46A.

37. Polydeoksyribonukleotid-fragment ifølge krav 31, karakterisert ved at det har en nukleotidsekvens vesentlig som illustrert på fig. 2.

38. Polydeoksyribonukleotid-fragment ifølge krav 31, karakterisert ved at det har en nukleotidsekvens vesentlig som illustrert i de deler på fig. 2 som er identifisert som A og B.

39. Polydeoksyribonukleotid-fragment, karakterisert ved at det koder for streptokinase.

40. Polydeoksyribonukleotid-fragment ifølgekrav 39, karakterisert ved at det har en nukleotidsekvens vesentlig som illustrert i den del på fig. 2 som er identifisert som B.

41. Polydeoksyribonukleotid-fragment, karakterisert ved at det koder for sekresjon av streptokinase.

42. Polydeoksyribonukleotid-fragment ifølge krav 1, karakterisert ved at det har en nukleotidsekvens vesentlig som illustrert i den del på fig. 2 som er identifisert som A.

43. Fremgangsmåte for fremstilling av streptokinase, karakterisert ved at man dyrker en transformant mikroorganisme som innbefatter en rekombinant vektor omfattende en vektor i hvilken et polydeoksyribonukleotid-fragment som koder for syntesen og sekresjonen av streptokinase har blitt inn-ført, i et egnet næringsmedium for dannelse av streptokinase; og isolerer streptokinase fra kulturen.

44. Fremgangsmåte ifølge krav 37, karakterisert ved at den transf ormante mikroorganisme er av arten Escherichia coli.

45. Fremgangsmåte ifølge krav 38, karakterisert ved at den transf ormante mikroorganisme er Escherichia coli HB101 (pMFl).