DD249712A1 - Verfahren zur herstellung von lipase - Google Patents
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Abstract
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren anzugeben, das ein Enzym hoher spezifischer Aktivitaet und Anreicherung liefert. Die Aufgabe wird darin gesehen, durch Zuechtung eines Bakterienstammes auf einem bisher nicht verwendeten Kultursubstrat das gewuenschte Enzym herzustellen. Das Wesen der Erfindung besteht darin, den Stamm Acinetobacter calcoaceticus auf wasserloeslichen Fettsaeureestern als einziger C-Quelle zu zuechten, bei deren Abbau Fettsaeuren entstehen.
Description
Ausführungsbeispiel
Acinetobacter calcoaceticus (69V) wird bei 3O0C in Submerskultur in einem flüssigen Minimalmedium gezüchtet. Das Medium enthält pro Liter: 6,97K2HPO4,1,5g NaH2PO4, 0,2g MgSO4- 7H2O, 7,5mg FeSO4 · 7H2O, 0,75mg MnSO4 · 4H2O, 0,75mg ZnSO4- 7H2O, 0,15mg CuSO4- 5H2O, 0,15mg CoCI2 · 6H2O und 0,15mg Borsäure. Als Impfsuspension dient eine Abschwemmung von Bouillon-Agar. Als C-Quelle wie Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat in einer Konzentration von 10 ml/l als einziger Kohlenstoffquelle und NH4Cl (3g/l) als N-Quelle verwendet.
Nach einer Wachstumszeit von 12h werden die Bakterien durch Zentrifugation (2000 x g, 20min) separiert und derzellfreie Kulturüberstand gewonnen. Zu diesem Kulturüberstand wird NaCI zu einer Konzentration von 1 mol/l zugegeben und die Lösung bei 4°C auf eine Octyl-Sepharose-Säule aufgetragen. Die Lipaseaktivität verbleibt am Trägermaterial. Nacheinander wird der Träger mit 1 mol/l Natriumchloridlösung (in 50mmol/l Phosphatpuffer, pH7,5)xl gewaschen, bis kein Protein im Eluat nachweisbar ist. Das Enzym wird anschließend mit Triton X-100 (5g/l in 50mmol/l Phosphatpuffer, pH7,5) vom Träger gelöst. Das gewonnene Enzym ist diskelektrophor'etisch rein. Die Isolierung der Lipase ist in Tabelle 2 dargestellt, x) und Phosphatpuffer, pH7,5
Volumenaktivität, Proteinkonzentration und spezifische Aktivität der Lipse im Kulturüberstand von Acinetobacter calcoaceticus nach Wachstum auf verschiedenen Kultursubstraten
Kultursubstrat
Volumenaktivität (μιηοΙ/Γηίη/ΓηΙ)
Protein (mg/1)
spezifische Aktivität (^mol/min/mg Protein)
Bouillon
Polyoxyethylen-
sobitan-mono-
laurat
Polyoxyethylen-
sorbitan-mono-
palmitat
Polyoxyethylen-
sorbitan-mono-
0,3
6,5
6,0
26,6
9,5
0,25
0,25
0,34
0,03
Reinigung der Lipase (Kultursubstrat: Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat) von Acinetobacter calcoaceticus
| Reinigungsstufe | • Volumen | Protein | Gesamtakt. | spez. | Reinig. | Ausbeute |
| Aktivität | ||||||
| (ml) | (mg/ml) | (jumol/min) | (μΐτιοΙ/min/ | (-fach) | (%) | |
| mg Protein) | ||||||
| Kulturüberstand | 190 | 0,34 | 5 054 | 78,2 | ||
| Triton X-100 | ||||||
| Fraktion | 30 | 0,13 | 3 040 | 779,2 | 9,96 | 60 |
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung von Lipase, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Acinetobacter calcoaceticus gezüchtet wird und dabei als einzige C-Quelle wasserlösliche Fettsäureester eingesetzt werden.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Acinetobacter calcoaceticus bei Temperaturen von 20—400C in Submerskultur in einem flüssigen Minimalmedium gezüchtet wird, nach einer Wachstumszeit von 5-4Oh die Bakterien separiert werden und das Enzym aus dem Kulurüberstand abgetrennt wird.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als einzige C-Quelle, bei deren Abbau Fettsäuren entstehen, wasserlösliche Fettsäureester wie z. B. Polyoxyethylensorbitan-monooleat, -laurat,-palmiat oder-oleat verwendet werden.
4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem zellfreien Kulturüberstand durch Chromatographie an einem hydrophoben Träger wie z. B. Octyl-Sepharose eine Isolierung des Enzyms bis zur diskelektrophoretischen Reinheit erfolgt.
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lipase(die in der Praxis zur Hydrolyse von Fettsäureestern verwendet werden kann.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Es ist bereits bekannt, Lipase herzustellen. Zu diesem Zweck werden verschiedene Bakterien- und Hefestämme bzw. Pilze auf komplexen Medien (u.a. Bouillon, Molke, Maisquellwasser) kultiviert, die Bakterien durch Zentrifugation separiert und die Kulturüberstände zur Lipasegewinnung aufbereitet (Literatur z.B. Lipases, ed. B. Borgström und H.Brockman, Elsevier, Amsterdam, 1984). Die dargestellten Verfahren haben den Nachteil, daß durch die Züchtung auf komplexen Medien die Lipase stark verunreinigt und zu ihrer Isolierung mehrere aufwendige Reinigungsstufen notwendig sind.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, mit einem bisher nicht verwendeten Bakterienstamm ein Verfahren zur Enzymproduktion anzugeben, das es gestattet, ein Enzym mit wesentlich höherer Reinheit und spezifischer Aktivität zu gewinnen und so die Isolierung aus den Kulturüberstand zu vereinfachen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Die Erfindung hat die Aufgabe, wesentliche bekannte Merkmale der bisherigen Verfahrensweise zu verändern und durch den Einsatz eines bisher nicht verwendeten Stammes sowie spezieller Kultivierungssubstrate das gewünschte Enzym mit hoher spezifischer Aktivität zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Enzym Lipase aus dem Stamm Acinetobacter calcoaceticus hergestellt wird. Die Stammhaltung geschieht bevorzugt auf 3%igem Bouillon-Agar bei 4°C im Dunklen. Die Kultivierung von Acinetobacter calcoaceticus erfolgt nach Beimpfen bei einer Temperatur von 20—400C, vorzugsweise bei 300C, in Submerskultur in einem flüssigen Minimalmedium. Die Züchtung wird erfindungsgemäß auf wasserlöslichen Fettsäureestern als einziger C-Quelle durchgeführt, bei deren Abbau Fettsäuren gebildet werden. Solche C-Quellen sind z. B. Polyoxyethylen-sorbitan-laurat, -paImitat oder-oleat u.a. Als N-QuelIe wird NH4CI, (NH4I2 o.dgl. verwendet. Nach einer Wachstumszeit von 5-40 Stunden —je nach physioloiigischen Zustand und Menge des Impfmaterials — werden die Bakterien z. B. durch Zentrifugation separiert und der zellfreie Kulturüberstand gewonnen. Das im zellfreien Kulturüberstand bei erfindungsgemäßer Züchtung erhaltene Enzym ist im Gegensatz zu Kultivierungen auf komplexen Medien nur gering mit Fremdstoffen verunreinigt und besitzt eine hohe spezifische Aktivität (Tabelle 1). Die Isolierung des Enzyms aus dem Kulturüberstand erfolgt an einem hydrophoben Trägermaterial, wie z. B. Octyl-Sepharose, wie folgt: Der gewonnene zellfreie Kulturüberstand wird bei 4°C mit kristallinem NaCI zu einer Konzentration von 1 mmol/l versetzt. Die Lösung wird auf eine mit Octyl-Sepharose gefüllte Glassäule gegeben. Die Lipase adsorbiert dabei an dem hydrophoben Träger. Fremdproteine werden nur gering gebunden. Nach einander wird die Säule m it lmol/I NaCI in Phosphatpuffer (50mmol/l, pH7,5) und 50mmol/l Phosphatpuffer (pH7,5) gewaschen. Die Lipase wird durch eine 0,5%ige Lösung von Triton X-100 in 50 mmol/l Phosphatpuffer, pH 7,5, von der Octyl-Sepharose abgelöst. 60% der ursprünglichen Lipase werden dabei 10fach angereichert gefunden. Das so erhaltene Lipasepräparat ist diskelektrophoretisch rein. Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DD29106886A DD249712B1 (de) | 1986-06-06 | 1986-06-06 | Verfahren zur herstellung von lipase |
Applications Claiming Priority (1)
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| DD29106886A DD249712B1 (de) | 1986-06-06 | 1986-06-06 | Verfahren zur herstellung von lipase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD249712A1 true DD249712A1 (de) | 1987-09-16 |
| DD249712B1 DD249712B1 (de) | 1988-12-14 |
Family
ID=5579747
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| DD29106886A DD249712B1 (de) | 1986-06-06 | 1986-06-06 | Verfahren zur herstellung von lipase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD249712B1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4933287A (en) * | 1985-08-09 | 1990-06-12 | Gist-Brocades N.V. | Novel lipolytic enzymes and their use in detergent compositions |
| WO2009037488A3 (en) * | 2007-09-21 | 2009-08-06 | Statoilhydro Asa | Biodiesel |
-
1986
- 1986-06-06 DD DD29106886A patent/DD249712B1/de not_active IP Right Cessation
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| EA017338B1 (ru) * | 2007-09-21 | 2012-11-30 | Статоил Аса | Биодизельное топливо |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD249712B1 (de) | 1988-12-14 |
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