DD149874A3 - Verfahren zur herstellung von 3-hydroxybutyratdehydrogenase - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxybutyratdehydrogenase. Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein kostenguenstiges Verfahren anzugeben, das ein Enzym hoher spezifischer Aktivitaet liefert. Die Aufgabe wird darin gesehen, durch Zuechtung eines neuen Stammes auf bisher nicht verwendeten Kultursubstraten das gewuenschte Enzym herzustellen. Das Wesen der Erfindung besteht darin, den Stamm Pseudomonas putida entweder auf Kultursubstraten zu zuechten, bei deren Abbau Acetoacetat oder Hydroxybutyrat entsteht oder auf Substraten, die aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen C&ind6! bis C&ind10! bestehen.
Description
Verfahren zur Herstellung von 3~Hydroxybutyratdehydrogenase
jftnweiidungsgebieit der_ Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxybutyratdehydrogenase, die in der klinisch-chemischen Diagnostik zur quantitativen Bestimmung von Ketonkörpern eingesetzt wird* · .
^PPfoi iscnen !lösungen
Eb ist bereits bekannt, 3-Hydroxybutyratdehydrogenase herzu-Btelleno Zu diesem Zweck ist es üblich, den Bakterienstamm Rhodopseudomonas spheroides auf 3-Hydroxybutyrat als Kohlenetoffquelle zu züchten, die Bakterien durch Zentrifugieren zu separieren* aufzuschließen und den zellfreien Proteinextrakt, der eine Ausgangsaktivität von ca« 0,1 /umol/min/mg Protein besitzt, einer ProtaminsuIfatfällung zwecks Entfernung der Nucleinsäuren zu unterwerfen«. Nach fraktionierter Ammonsulfatfällung wird die entsprechende Fraktion abgetrennt, gewaschen, in Puffer gelöst und mehrfach chromatografisch bis zu einer Aktivität von ca» 17 y$&raol/rnin/mg Protein gereinigt bzw.» angereichert (Literatur zc Bc H„ U* Bergmeyer et al., Biochenu J· ^96?)? l£2s 423)o Das geschilderte Verfahren hat den lachteil, daß das Endprodukt sehr teuer ist» insbesondere wenn es sich um etark angereicherte 3-Hydroxybutyratdehydrogenase handelt«, Die Ursache liegt nicht nur in den aufwendigen Reinigungsoperationen begründet, sondern auch im hohen Preis des Kultursubstrats. Ein weiterer Nachteil ist darin zu sehen, daß die Aktivität des her-
- 2 - 2 2 0 0 6 0
gestellten Enzyms einen Wert von 17-20 /umol/min/mg Protein nicht übersteigt. Die Ursache liegt darin begründet, daß der verwendete Stamm Rhodopseudomonas spheroides nicht in der Lage ist, ein Enzym mit höherer Ausgangsaktivität als oben beschrieben zu produzieren.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Enzymproduktion anzugeben, das wesentlich kostengünstiger ist als bisher bekannte und das.darüberhinaus gestattet, ein Enzym mit wesentlich höherer spezifischer Aktivität herzustellen«
Darlegung des Wesens ,der,, Erfindung
Die Erfindung hat die Aufgabe, wesentliche Merkmale der bisher bekannten Verfahrensweise zu verändern und durch den Einsatz eines anderen Stammes sowie anderer Kultursubstrate im Zusam-' menwirken mit einer neuen Technologie das gewünschte Enzym günstig und mit hoher spezifischer Aktivität zur Verfugung zu stellen«,
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Enzym 3-Hydroxybutyratdehydrogenase aus dem Stamm Pseudomonas putida hergestellt wird· Die Stammhaltung geschieht bevorzugt auf 2 %igem Bouillon-Agar bei 4 C im Dunkeln« Die Kultivierung von Pseudomonas putida erfolgt nach Beimpfen aus einer Vorkultur bei Temperaturen von 20 ~ 40 0C, vorzugsweise bei 30 0C, in Submerskultur in einem flüssigen Minimalmedium«
Die Züchtung wird erfindungsgemäß auf C-Quellen durchgeführt, bei deren Abbau Acetoacetat oder Hydroxybutyrat gebildet wird« Solche C-Quellen sind z« B. D,L-Lysin} D,L-Leucin, D,!»Carnitin Ue a., darüberhinaus geradkettige Kohlenwasserstoffe mit einer Kettenlänge Cg bis C.q oder Fettsäuren von C, bis C1ge Als IT-Quelle wird in den Fällen KH4Cl, (HH^)2SO4 Oc dgl* verwendet, in denen die C-Quelle' nicht gleichzeitig als C- und N-Quelle verwertet werden kanne Wach einer Wachstumszeit von 5 - 40 Stunden - je nach physiologischem Zustand und Menge des Impf»
. .- 3 - 220060
materials - werden die Bakterien geerntet (ζ. B. durch Zentrifugation), mit Phosphatpuffer gewaschen und anschließend in zellfreien Rohextrakt verwandelt, was z, B. durch Ultraschallbehandlung bei Temperaturen nahe dem Gefrierpunkt mit nachfolgendem Zentrifugieren erfolgen kann· Das im zellfreien Rohextrakt enthaltene Enzym wesist in Abhängigkeit von der C-Quel-Ie die in Tabelle 1 dargestellten spezifischen Aktivitäten auf.
Durch fraktionierte Salzfällung bzw. -extraktion, ζ. Β. mit Ammoniumsulfat, wird das Enzym auf das 10 - 15fache angereichert« Dazu wird zweckmäßigerweise der Proteinrohextrakt verdünnt und mit 70 % gesättigtem Ammoniumsulfat der überwiegende Teil des Proteins gefällt. Die gesamte Aktivität verbleibt dabei im Sediment. Zur weiteren Anreicherung der 3~Hydroxybutyratdehydrogenase wird der Rückstand nacheinander mit Ammoniumsulfatlösung, die jeweils 0,05 mol/l Tris enthält, bei 4 0C und sinkender Konzentration an (UEL ^SO, für jeweils 5 min gerührt. Das Enzym wird dabei in zunehmendem Maße gelöst. Die Hauptmenge löst sich im Konzentrationsbereich zwischen 35 % und 20 % gesättigter Ammoniumsulfatlösung· Das Enzym wird durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis auf eine Endkonzentration von 50 $ wieder ausgefällt.
Eine weitere Anreicherung des Enzyms ist an einem hydrophoben Trägermaterial wie z. B. lO-Carboxydecyl-Sepharose wie folgt möglich. Auf eine mit 10-Oarboxydecyl-Sepharose gefüllte Säule wird Enzym in 20 % gesättigter Ammoniumsulfatlösung gegeben. Wach Waschen mit Ammoniumsulfatlösung dieser Konzentration wird mit 17 % gesättigtem Ammoniumsulfat fraktioniert eluiert» In der ersten Fraktion ist die spezifische Aktivität auf das 4fache, in der zweiten auf das 7fache gestiegen« Die Adsorption wird durch strukturformierende Ionen wie Phosphat, Citrat, Sulfat begünstigt«
Das erfindungsgemäß hergestellte Enzym ist gut lagerfähig. Bei spezifischen Aktivitäten von 10 - 20 yumol/min/mg Protein sind maximal folgende Fremdaktivitäten nachweisbar:
| ' - 4 - · | έ | < 1 | 12 | 0 | 0 | 6 | 0 |
| Alkoholdehydrogenase | < * | C . / | |||||
| Malatdehydrogenase | < o, | 02· | C t | ||||
| Lactatdehydrpgenase | 001 | L i | Vo |
Es ist vorteilhaft, im Verfahrensschritt der Bakterienzüchtung mit einem abgestuften Sauerstoffdefizit zu arbeiten·
Die Erfindung soll nachstehend an 1 Ausflihrungsbeispiel näher erläutert werden»
Ausführungsbeispiel
Pseudomonas putida (PpG 6) wird bei 30 0C in Submerskultur in einem flüssigen Minimalrnedium gezüchtet α Das Medium enthält pro Liter: 6,97 g K2HPO4, 1,5 g UaH2PO4, 0,2 g MgSO4 β 7 H2O, 7,5 mg PeSO4 . 7 K2O, 0,75 mg ROiSO4 β 4 H2O, 0,75 mg ZnSO4 . 7 H2O, 0,15 mg CuSO4 β 5 H2O, 0,15 mg CoCl2 . 6 H3O und 0,15 mg Borsäure« Als Impfsuspensionen dienen Vorkulturen, bei denen "dem flüssigen Minimalmedium Hefeextrakt (0,4 g/l) und Glucose (10 g/l) zugesetzt wurden. Bei Kultivierung auf D,L-Car~ nitin wird dieses in einer Konzentration von 2 g/l als einzige C- und IT-Quelle eingesetzt« Bei Kultivierung auf anderen C-Quellen (10 g/l) wird NH4Cl (3 g/l) als N-Quelle verwendet. Nach einer Wachstumszeit von 15 Stunden werden die Bakterien durch Zentrifugieren geerntet, mehrfach mit Phosphatpuffer (0,067 mol/1, pH 7$5) gewaschen und anschließend durch Ultraschallbehandlung bei 4 0C zerstört· Der zellfreie Rohextrakt wird durch Zentrifugieren gewonnen.
Dieser Proteinrohextrakt wird mit 0,067 mol/1 Phosphatpuffer (pH 8) verdünnt, bis ein Pr.oteingehalt von 5-20 mg/ml erreicht ist* Aus dieser Lösung wird bei 4 0C durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 70 % Sättigung der überwiegende Teil des Proteins gefällte Die gesamte Aktivität der 3-Hydroxybutyratdehydrogenase befindet sich im Präzipitat* Nach Zentrifugieren wird das Sediment in Ammoniumsulf at lösung (45 /3 Sättigung in 0,05 mol/1 Tris) bei 0 0C suspendiert und anschließend erneut zentrifugiert« Die gesarate
• - 5 -· 2 2 C
Aktivität verbleibt im Sedimente Der Rückstand wird zur wei-.teren Anreicherung .mit Ammoniumsulf at lösungen (jeweils 0,05 mol/1 Tris/HCl, pH 8, enthaltend) sinkender Konzentration bei 4 0C für jeweils 5 min gerührt. Das Enzym wird dabei in zunehmendem Maße gelöst, bevorzugt im Konzentrationsbereich zwischen 35 % und 20 % gesättigter Ammoniumsulfatlösung (siehe Tabelle 2). Das Enzym wird durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis auf eine Endkonzentration von 50 % Sättigung wieder ausgefällt. Nach Zentrifugieren wird das Enzym in 3,2 mol/1 Ammoniumsulfatlösung, pH 7» suspendiert und bei 4 C gelagert»
Zu weiterer Anreicherung vjerden auf eine 2 ml-Säule mit 10-Carboxydecyl-Sepharoee bei 25 0G 1 ml der Enzymlösung in 20 % gesättigter Ammoniumsulfatlösung aufgetragen. Die spezifische Aktivität beträgt 11 /umol/min/mg Protein; Gesamtprotein 1,5 mg· Die gesamte Aktivität verbleibt am Träger. Nach Waschen mit. 10 ml Ammoniumsulfatlösung (20 ^-Sättigung) werden nacheinander jeweils 2 ml Ammoniumsulfatlösung (17 % Sättigung) auf die Säule gegeben« In den erhaltenen 2 Fraktionen befindet sich die gesamte Aktivität, jedoch nur 25 % des Proteins. Die spezifische Aktivität beträgt in der 1. Fraktion 41 /umol/ min/mg Protein (0,3 mg Protein), in der 2« Fraktion 80 /Umol/ min/mg Protein (051 mg Protein).
Die Enzymsusρensionen sind in gesättigter Ammoniumsulfatlösung lagerfähig« Nach 6 Monaten ist bei Aufbewahrung nahe 4 0C kein Aktivitätsverlust an 3-Hydroxybutyratdehydrogenase feststellbar«
2 20 0
T ab. 1
Spezifische Aktivität der 3-Hydroxybutyratdehydrogenase im Rohextrakt aus Pseudomonas putida nach Wachstum auf Acetoacetat-bildenden Kultursubstanzen ·
C-Quelle 3-Hydroxybutyratdehydrogenase
(/umol/min/mg Protein)
DjL-Hydroxybutyrat 3,5
D,L-Carnitin ,2,0
i),L~Leucin 3,6
D,L-Lysin 0,8
laut
Reinigung der 3-Hydroxybutyratdehydrogenase (Kultursubstrat D,L-Garnitin) aus PseuGomonas putida
Zur Präparation -wurden 17 ml Rohextrakt (7,5 mg/ml Protein) eingesetzt· Das Sediment, das nach Behandlung mit 45 %iger Ammoniumsuifatiösung verblieb, wurde mit jeweils 5 ml Ammoniums u If at I'd sung sinkender Konzentration behandelte S = Sediment s U = Überstand
Gesamtprotein Gesamtaktivität Spezifische Aktivität Reinigung
(mg)
(/umol/min)
(/umo 1/min/mg )
(-fach)
Ausbeute (56)
| Rohextrakt | 70 | % | (1.) | 228 |
| S | 45 | % | (2.) | 202 |
| Ü | 45 | % | ||
| ü | 35 | % | ||
| Ü | 33 | % | ||
| Ü | 30 | % | ||
| Ü | 27 | % | ||
| ü | 25 | % | . 7 | |
| ü | 22 | % | 8 | |
| ü | 19 | % | 7, | |
| ü |
470
490 2,6 3,2 2,6 4,2 58
136
160
102 34
2,06 2,3
19
20 14
1,1
9,2
9,7 6,8
29
34 V 85 22 i
Claims (2)
- Patentansprüche1. Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxybutyratdehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Pseudomonas putida gezüchtet wird und dabei C-Quellen eingesetzt werden, bei deren Abbau Acetoacetat oder Hydroxybutyrat gebildet wird.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Pseudomonas putida bei Temperaturen von 20 - 40 0C in Submerskultur in einem flüssigen Minimalmedium gezüchtet wird, nach einer Wachstumszeit von 5-40 Stunden die Bakterien separiert- werden, in zellfreien Proteinextrakt über-· führt werden, aus'dem das Enzym durch fraktionierte Ammonsulfatfällung abgetrennt wird und gegebenenfalls einer Reinigung und/oder Anreicherung unterzogen wird»3· Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als C-Quellen, bei deren Abbau Acetoacetat oder Hydroxybutyrat entstehen, D,L-Leucin, D,L~Lysin, D,L-Camitin, geradkettige Kohlenwasserstoffe der Kettenlänge Or bis C^q, Fettsäuren von C, bis C1g eingesetzt werden«4* Verfahren nach Punkt 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß aus zellfreiem Rohextrakt allein durch fraktionierte Ammoniumsulfatfällung ein Enzym der spezifischen Aktivität 10 20 /umol/min/mg Protein hergestellt wird·5· Verfahren nach Punkt 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Anreicherung des Enzyms chromatografisch an einem hydrophoben Trägermaterial wie "iO-Carboxydecyl-Sepharose ο« dgl« erfolgt«,6e Verfahren nach Punkt 5* dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym bei hohen Konzentrationen von Sulfat, Phosphat oder Citrat adsorbiert, bei abnehmender Konzentration dieser Ionen eluiert wird.7· Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß .im Verfahrensschritt der Bakterienzüchtung mit einem abgestuften Sauerstoffdefizit gearbeitet wird.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD22006080A DD149874A3 (de) | 1980-03-31 | 1980-03-31 | Verfahren zur herstellung von 3-hydroxybutyratdehydrogenase |
| SU807771547A SU1731813A1 (ru) | 1980-03-31 | 1980-12-31 | Способ получени 3-гидроксибутиратдегидрогеназы |
| BG5029081A BG41060A1 (en) | 1980-03-31 | 1981-01-03 | Method for preparing of 3- hydroxybutyratedehydrogenase |
| CS8981A CS233318B1 (en) | 1980-03-31 | 1981-01-05 | Method of 3-hydroxybutyratedehydrogenase preparation |
| DE19813109748 DE3109748A1 (de) | 1980-03-31 | 1981-03-13 | Verfahren zur herstellung von 3-hydroxybutyratdehydrogenase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD22006080A DD149874A3 (de) | 1980-03-31 | 1980-03-31 | Verfahren zur herstellung von 3-hydroxybutyratdehydrogenase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD149874A3 true DD149874A3 (de) | 1981-08-05 |
Family
ID=5523436
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD22006080A DD149874A3 (de) | 1980-03-31 | 1980-03-31 | Verfahren zur herstellung von 3-hydroxybutyratdehydrogenase |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| BG (1) | BG41060A1 (de) |
| CS (1) | CS233318B1 (de) |
| DD (1) | DD149874A3 (de) |
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-
1980
- 1980-03-31 DD DD22006080A patent/DD149874A3/de not_active IP Right Cessation
- 1980-12-31 SU SU807771547A patent/SU1731813A1/ru active
-
1981
- 1981-01-03 BG BG5029081A patent/BG41060A1/xx unknown
- 1981-01-05 CS CS8981A patent/CS233318B1/cs unknown
- 1981-03-13 DE DE19813109748 patent/DE3109748A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SU1731813A1 (ru) | 1992-05-07 |
| CS233318B1 (en) | 1985-02-14 |
| BG41060A1 (en) | 1987-04-15 |
| DE3109748A1 (de) | 1982-05-06 |
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