DD249920A1 - Verfahren zur herstellung von pektinasepraeparaten - Google Patents
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Abstract
Das erfindungsgemaesse Verfahren zur Herstellung von Pektinasepraeparaten mit unterschiedlichen Anteilen an Polygalakturonase (PG) und Pektinesterase (PE) mittels traegerfixierter Schimmelpilze, vorzugsweise Aspergillus niger, besteht im wesentlichen darin, dass die Kultivierung bei Vorgabe bestimmter Parameter (Sporentiter, Kultivierungstemperatur und -dauer, Luftzufuhr, Umwaelzgeschwindigkeit des Mediums, Verhaeltnis der Traegeroberflaeche zum Naehrmedienvolumen) in Naehrmedien erfolgt, die unterschiedliche N-Quellen (anorganische Salze, komplexe Substanzen) bzw. Kombinationen von komplexen C- und N-Quellen enthalten. In Abhaengigkeit von der eingesetzten N- bzw. C-Quelle entstehen Enzymgemische, die in ihren PG- und PE-Anteilen deutlich unterschiedlich sind und je nach Bedarf in der Obst- und Gemueseverarbeitung zur Mazeration, zur Maischeherstellung bzw. zur Totalverfluessigung eingesetzt werden koennen.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pektinasepräparaten mit unterschiedlichen Anteilen an Polygalakturonase (PG) und Pektinestrase (PE) mittels Schimmelpilzen, vorzugsweise Aspergillus niger, die der Obst- und Gemüseverarbeitung zur Mazeration, im Maischprozeß zur Vorbereitung der Saftgewinnung bzw. zur Totalverflüssigung zum Einsatz kommen.
Es ist bekannt, daß die Herstellung pektinolytischer Enzyme mittels kompaktem Schimmelpilzmycel im Vergleich zu diffusem Mycel Vorteile aufweist. So werden von WARDSACK, CH., SCHIWECK, E., LEUCHTENBERGER, A., KÖRNER, D., HERMERSDÖRFER, H., RUTTLOFF, H. und PARDEMANN, B. (DD-PS 245175) mit trägerfixierter Biomasse des Stammes Aspergillus niger Aktivitäten pektinolytischer Enzyme erreicht, die über denen bei diffusem Mycelwachstum liegen. In der Patentschrift DD-PS 219504 beschreiben SCHIWECK, E., KÖRNER, D., PARDEMANN, B., WARDSACK, CH., LEUCHTENBERGER, A., RUTTLOFF, H. und HERMERSDÖRFER, H. eine Verfahrensverbesserung, in dem durch erhöhte Trägerdichte, gleichmäßige Verteilung des Trägers im Fermentor sowie geringen Trägerabstand eine kompakte, feste Mycelstruktur erreicht wird, welche Voraussetzung füor die erhöhte Enzymausschüttung ins Medium ist. Von FRIESE, E., MAREK, E., LEUCHTENBERGER, A., und von LUPIN, I. wird gefunden, daß die unterschiedliche Pufferkapazität des Nährmediums die Ausschüttung der pektinolytischen Enzyme in Abhängigkeit von der Kulturdauer beeinflußt und die Anteile an Polygalakturonase (PG) und Pektinesterase (PE) am Gesamtenzymkomplex verändert werden können. Dies ist hinsichtlich der unterschiedlichen Anwendung in der obst- und gemüseverarbeitenden Industrie von großer Bedeutung.
Weiterhin wird vorgeschlagen (FRIESE, E. u.a. 1986), daß durch Einsatz verschiedener Kohlenstoff-Quellen (Zucker, komplexe C-Quellen) die Synthese der pektinolytischen Enzyme in unterschiedlichem Maße in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer ^ gesteigert wird, wodurch gleichzeitig das PG/PE-Verhältnis in der Kulturlösung beeinflußt wird. Um einen möglichst ökonomischen Einsatz der Enzympräparate in der Obst- und Gemüseverarbeitung zu gewährleisten, ist es notwendig, die Anteile der Einzelenzyme (vor allem PG und PE) am Gesamtenzymkomplex noch stärker zu variieren.
Ziel der Erfindung ist es daher, eine möglichst hohe PG-Syntheserate mittels Kultivierung von trägerfixiertem Mycel von Aspergillus niger zu erreichen und das PG/PE-Verhältnis des Enzymgemisches so zu variieren, daß je nach Anwendungszweck ein Mazerase- bzw. Maischeenzympräparat hergestellt werden kann.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde Verfahrensbedingungen aufzuzeigen, die es ermöglichen, das obige Ziel in möglichst einfacher Weise zu erreichen.
Zunächst wird in an sich bekannter Weise ein Schimmelpilz, vorzugsweise der Stamm Aspefilius niger R1/214 — hinterlegt in der Zentralen Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter ZIMET 43692 — auf einem vom Nährmedium umgebenen inerten Träger zum Aufwachsen gebracht. Bei einer Sporenkonzentration von 102 bis 104 Sporen ml"1 kommt es unter Einhaltung bestimmter Parameter (Kultivationstemperatur 26 bis 32°C, Luftzufuhr 0,01 bis 1,0 vvm, Umwälzungsgeschwindigkeit des Mediums 1 bis 50cm · see"1, Kultivationsdauer4 bis 8 Tage, Verhältnis der effektiven Trägerfläche zum Nährmedienvolumen 160 bis 550m2 m~3) zur Ausbildung einer kompakten Mycelstruktur durch den entsprechenden Stamm. Die Enzymausschüttung erfolgt in das Nährmedium, welches Salze, Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in bestimmten Relationen enthält. Die auf dem Träger angezüchtete Mycelmase ist für mehrere Fermentationsansätze nutzbar, indem nach 3 bis 8 Tagen Fermentationsdauer die enzymhaltige Kulturlösung abgelassen und diese nach einerTrocknungsphase des Mycels durch frisches Nährmedium ersetzt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Pektinasepräparaten mit unterschiedlichen Anteilen von Polygalakturonase (PG) und Pektinesterase (PE) mittels trägerfixierter Schimmelpilze, vorzugsweise Aspergillus niger, durch submerse Kultivierung in Schüttelgefäßen, gebräuchliche Rühr- oder Spezialfermentoren unter Anwendung bekannter Kulturbedingungen besteht darin, daß als N-Quellen 0,5 bis 2% löslicher Nitrate oder Ammoniumsalze im Nährmedium oder 0,5 bis 10% komplexer N-Quellen, vorzugsweise Hefeextrakt, Futterhefe, Fleischextrakt, Maisquellwasser und/oder Pepton, zusammen mit Zuckern, vorzugsweise Glukose, Fruktose, Lactose, Galactose, Rohrzucker und/oder Saccharose als C-Quellen oder mit komplexen C-Quellen, vorzugsweise mit Melasse, Apfeltrub, Apfeltrester-, Möhrentrester- und/oder Zuckerrübenschnitzelextrakt, eingesetzt werden und die Fermentation nach 96 bis 168 h beendet wird.
Beim Einsatz von anorganischen N-Quellen und Zuckern und einer Ferm.entationszeit von 96 bis 168h werden Pektinasepräparate mit 150 bis 400PG-E · ml"1 und 1 bis 2 PE-E · ml"1 erreicht, wobei das PG/PE-Verhältnis 200 bis 300:1 beträgt.
Werden komplexe N-Quellen und Zucker eingesetzt und 96 bis 168 h fermentiert, erhält man Pektinasepräparate mit 200 bis 400 PG-E · ml"1 und 3 bis7 PE-E · ml"1 und einem PG/PE-Verhältnis von 60 bis 100:1.
Eine weitere Ausführungsform ist der Einsatz von komplexen N-Quellen und komplexen C-Quellen 200 bis 500PE-E · ml"1, und 15 bis 30 PE-E · ml"1, mit einem PG/PE-Verhältnis <20:1, bezogen auf diese Fermentationszeit.
Die Erfindung wird durch folgende Ausführungsbeispiele näher erläutert:
In 300-ml-Kulturflaschen werden 70 ml Nährmedium, welches als N-Quelle z. B. 0,5 bis 2% anorganische Salze ((NH4J2SO4, KNO3, NaNÜ3, NH4NO3) oderO,5 bis 10% komplexe Substanzen (Hefeextrakt, Futterhefe, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Pepton) enhält, mit einer solchen Sporenmenge des Stammes Aspergillus niger beimpft, daß ein Titer von 103 bis 104 Sporen pro ml Kulturlösung vorliegt. In dem Nährmedium ist ein sterilisierter textiler Träger enthalten, auf dem das Sporenmaterial zum Auskeimen gebracht wird. Die Kulturansätze werden bei einer Temperatur von 280C bis 300C auf einer Rotationsschüttelmaschine (FANAL, 220rpm) 96 bis 144h inkubiert. Bei Einsaztvon N-haltigen Salzen wird eine PG-Aktivität von 150 bis 400 PG-E ml"1 und eine PE-Aktivität von 1 bis 2 PE-E · ml"1 erreicht, woraus sich.ein PG/PE-Verhältnis von etwa 200-300:1 ergibt. Unter den gleichen Bedingungen wird mit komplexen N-Quellen in Abhängigkeit von der eingesetzten Menge bei gleichbleibender PG-Aktivität eine höhere PE-Aktivität von 3 bis 7 PE-E · ml"1 erzielt, wodurch ein PG/PE-Verhältnis von 100:1 erreicht wird und sich das PG/PE-Verhältnis zugunsten eines Maischeenzyms verschiebt. Werden neben den komplexen N-Quellen ebensolche C-Quellen eingesetzt, sinkt das PG/PE-Verhältnis auf 20:1 und esensteht ein Enzymgemisch, welches für den Maischprozeß sehr gut geeignet ist.
Ein Spezialfermentor (Glasrohr: Durchmesser 70mm, Höhe 700 mm, mit 2 parallel zueinander im Abstand von 30 mm fest installierten Trägerplatten aus nichtrostendem Stahlgewebe, Gesamtträgerfläche 800cm2) wird mit 21 Kulturmedium, welches unterschiedliche N-Quellenm und Zucker als C-Quellen enthält, gefüllt und mit einer Sporenmenge des Stammes Aspergillus niger beimpft, daß eine Endkonzentration von 103bis 104 Sporen pro ml vorliegt. Die Kultivierung verläuft bei einer Temperatur von 280C bis 300C und einer Luftzufuhr von 1 bis 21 Luft · min"1; Belüftung und Durch mischung der Kulturlösung erfolgen nach dem Mammutpumpenprinzip. Nach 48h hat sich am Träger eine starke Myceldecke ausgebildet.
Die Variation des PG/PE-Verhältnisses entspricht im wesentlichen den in Beispiel 1 erzielten Ergebnissen, doch die Höhe der absoluten Ausbeuten an PG- und PE-Aktivität liegt etwas darunter (150 bis 200 PG-E · ml"1, bis 2 PE-E · ml"1). Werden neben den komplexen N-Quellen gleichzeitig komplexe C-Quellen eingesetzt, verschiebt sich das PG/PE-Verhältnis noch weiter zugunsten eines Maischeenzyms (PG/PE20-30:1).
Claims (1)
1. Verfahren zur Herstellung von Pektinasepräparaten mit unterschiedlichen Anteilen von Polygalakturonase (PG) und Pektinesterase (PE) mittelsträgerfixierterSchimmelpilze, vorzugsweise Aspergillus niger, durch submerse Kultivierung in Schüttelgefäßen, gebräuchlichen Rühr- oder Spezialfermentoren unter Anwendung bekannter Kulturbedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß als N-Quellen 0,5 bis 2% löslicher anorganischer Nitrate oder Ammoniumsalze im Nährmedium oder 0,5 bis 10% komplexer N-Quellen, vorzugsweise Hefeextrakt, Futterhefe, Fleischextrakt, Maisquellwasser und/oder Pepton, zusammen mit Zuckern, vorzugsweise Glukose, Fruktose, Lactose, Galactose, Rohrzucker und/oder Saccharose als C-Quellen oder mit komplexen C-Quellen, vorzugsweise mit Melasse, Apfeltrub, Apfeltrester-, Möhrentrester- und/oder Zuckerrübenschnitzelextrakt, eingesetzt werden und die Fermentation nach 96 bis 168 h beendet wird, wobei
— bei Einsatz von anorganischen N-Quellen und Zuckern 150 bis 400PG-E · ml"1 und 1 bis 2PE-E · ml"1, mit einem PG/PE-Verhältnis von 200 bis 300:1,
— bei Einsatz von komplexen N-Quellen und Zuckern 200 bis 400 PG-E · ml~1 und 3 bis 7 PE-E · ml"1, mit einem PG/PE-Verhältnis von 60 bis 100:1 und
— bei Einsatz von komplexen N-Quellen und komplexen C-Quellen 200 bis 500 PG-E · ιτιΓ1, und 15 bis30PE-E· ~\ mit einem PG/PE-Verhältnis 20:1,
bezogen auf diese Fermentationszeit resultieren.
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