DD219504A1 - Gewinnung pektinolytischer enzyme unter einsatz traegerfixierter schimmelpilze - Google Patents

Abstract

Das erfindungsgemaesse Verfahren zur Gewinnung pektinolytischer Enzyme unter Einsatz traegerfixierter Schimmelpilze, vorzugsweise vom Stamm Aspergillus niger, hinterlegt in der zentralen Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut fuer Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter ZIMET 43 692, wobei der Mikroorganismus auf Traeger innerhalb eines Fermentors zum Aufwachsen gebracht und die Enzymsynthese mit dem gleichen oder einem in der Zusammensetzung geaenderten Naehrmedium durchgefuehrt wird, besteht im wesentlichen darin, dass bei Vorgabe der Sporenkonzentration fuer die Anzucht des Myzelrasens, Kultivationstemperatur, Luftzufuhr, Umwaelzungsgeschwindigkeit des Naehrmediums und Kultivationsdauer eine solche Traegerdichte im Naehrmedium vorgesehen wird, dass das Verhaeltnis der effektiven Traegerflaeche zum Naehrmedienvolumen ueber 160 m2/m3, vorzugsweise 180 bis 550 m2/m3, bei einem mittleren Traegerabstand von 4 bis 25 mm innerhalb des Naehrmediums, betraegt.

Description

Erfinder: Erhard Schiweck Dr. Andreas Leuchtenberger

Dieter Körner Prof. Dr. Heinz Ruttloff

Bernhard Pardemann Dr. Heino Hermersdörfer Christine Wardsack

Gewinnung pektinolytischer Enzyme unter Einsatz träger-· fixierter Schimmelpilze - . '

Anwendungsgebiet.der Erfindung . ^:

Die 'Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Gewinnung pektinolytischer Enzyme mit dem Schimmelpilz Aspergillus niger. Das gewonnene Enzym wird vorrangig zur Mazeration von Obst und Gemüse eingesetzt. · . ,

Charakteristik der bekannten technischen' Lösungen

Die inikrobielle Gewinnung pektinolytischer Enzyme nach den bekannten Verfahren erfolgt in den letzten Jahren mehr und mehr vorvriLegend durch submerse !Cultivation von Schimmelpilzen bei diffusem Myzelwachstuin. Diese Kultivationsform ist zwar in herkömmlichen Permentoren durchführ-. bar,.liefert aber nur relativ geringe Aktivitätsausbeuten. ." . ·

Einige Literatur- und Patentschriftenangaben beziehen sich auch auf die Erreichung höherer Enzymsyntheseleistungen durch Anwendung kompakter morphologischer Strukturen der Biomasse. So erzielen JiIARTAKOV A.A. und Dianova, 0.P. (IZV.Akad. Uauk Kaz. SSR, Ser. Biol. 5 (1967) 6, .54-59) im Labormaßstab durch submerse Kultivation von schwammartigen Myzel eine Aktivitätssteigerung gegenüber dem

Einsatz von diffusem Myzel.'. Rir die technische Realisierung wirkt sich nachteilig aus, daß das Kompaktmyzel in eine Drehbewegung, versetzt 'werden muß.

Auch Baum, F./Leuchtenberger, A./Ruttloff, H../Schiweck, £../ Wardsack, Gh. (DWP 145 027) arbeiten vorteilhaft mit kompaktem Myzel. Eine in Oberflächenkultur angezüchtete Myzeldecke wird durch eine Lochplatte unter der Flüssigkeitsoberfläche gehalten:und weiterkultiviert. Nachteilig ist hierbei die geringe Biomassekonzentration ausgedrückt als kompakte Biomassemenge pro Medienvolumen. Wardsack, Ch./Leuchtenberger, A./Baum, F./Ruttloff, H. . CDYiTP 235 310) schlagen nach einer anderen Verfahrensweise vor, diffuses (breiförmiges) Myzel von Aspergillus niger in durchlässigen Behältnissen zu verdichten und zwangsweise in eine kompakte Wüchsform,zu überführen. Diese •Verfahrensweise liefert im Labormaߧtab 'hohe Enzym-Ausbeuten, führt aber bei einer technischen Hutzung wegen der umständlichen Manipulationen zu RealisierungsSchwierigkeiten. ' ....' _ς .· ,'"'.,

Sin weiteres Verfahren zur Gewinnung eines pektinolytischeil Enzymgemisches beschreiben Wardsack, Gh./Schiweck,S./ Leuchtenberger, A./Körner, D./Hermersdörfer,. H../Ruttloff, H./3?ardemann, B. unter DD-PS 245 175. Ss wird dabei mit trägerfirrierten Schimmelpilzen, vorzugsweise mit einem Stamm von Aspergillus niger, gearbeitet. Wesentlich .für dieses Verfahren ist,- daß die Sporen des Mikroorganismus auf einem freischwebenden oder stationären Träger aus inertem Material zum Auswachsen gebracht werden und die Kultivierung mit dem gleichen oder mit einem veränderten Hahrmedium fortgesetzt wird. Für die Anzucht des Myzelrasens auf dem Träger sind bestimmte Bedingungen angeführt, zu denen insbesondere die Einhaltung eines bestimmten Verhältnisses der Menge des'Nährmediums zur Oberfläche des inerten Trägermaterials gehört. Dieses Verfahren läßt sich auch unter, industriellen Bedingungen durchführen. Die erreichbaren Aktivitätsausbeuten liegen ' über denen anderer bekannter submerser.Verfahren. Sie

sind jedoch in der genannten Höhe nicht ausreichend, um die Ökonomie des Verfahrens zu garantieren. J'erner fehlt die für einen Produktionsprozeß notwendige'.Stabilität und feste Myzelstruktur.._:

Ziel der Erfindung. . '

Ziel der Erfindung ist daher durch einfache !Cultivation eines Stammes von Aspergillus niger eine so hohe Syntheserate zu erreichen, daß eine ökonomische Produktion pektine-, lytischer Enzyme weiter verbessert wird. '

Darlegung des Wesens der Erfindung .

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde Verfahrensbedingungen aufzuzeigen, die es ermöglichen das obige Ziel in relativ einfacher Weise zu erreichen. .

Zunächst wird in -an, sich bekannter Weise auf der Ober-." fläche eines in einem speziellen Permentor installierten und vom Kulturmedium umgebenden fixierten inerten Trägers eine kompakte Myzelstruktur des einzusetzenden Stammes von Aspergillus niger angezogen. Der Schimmelpilz bewächst in 2 bis 4 Tagen die gesamte Trägerfläche. Sehr, entscheidend für eine wesentlich erhöhte Snzymausbeute ist nun das Einhalten eines möglichst hohen Verhältnisses der Myzeloberfläche zum Volumen der Kulturlösung, wobei das Trägermaterial gleichmäßig im Ferment or verteilt sein muß. iiach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung pektinolytischer Enzymgemische mittels eines trägerfixierten Mikroorganismus, vorzugsweise des Stammes Aspergillus niger E1/214, hinterlegt in der Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter ZIMET 43 692, wird also der Mikroorganismus auf dem Träger innerhalb des Permentors zum Aufwachsen gebracht und die Bnzymsynthese mit dem gleichen oder mit einem in der Zusammensetzung geänderten IJährmedium durchgeführt -wird. Dabei ist wesentlich, daß bei einer vorgege-

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bener ' Sporenkonzentratibi; für die Anzucht des Myzelrasens unter Einhaltung bestimmter Parameter,hinsichtlich, Kulti-. .vationstemperatur, Luftzufuhr, Umwälzgeschwindigkeit des JTährmediums und Kultivationsdauer eine solche Trägerdichte im Nährmedium vorgesehen wird, daß das Verhältnis der

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effektiven Trägerfläche zum ITährmedienvolumen über 160 m /

3 ' 2 3 '

ΐΐΓ, vorzugsv/eise 180 bis 550 m /m , bei einem mittleren Trägerabstand von 4 bis 25 mm innerhalb desÜährmediums beträgt.. " ^:. '.'.:' ^: . '

Zur Anzucht des Myzelrasens sind folgende Bedingungen vor-'

,teilhaft:

- das Verhältnis der effektiven Trägerfläche (m ) zur He-

•3 2 3

dienmenge (m^J) beträgt 160 -55Om /m^J

- Trägerabstand 4 - 25 mm . ·· \ /

2 4 ..- .. -· Sporenkonzentration 10 - ΙΟ"¹"- Sporen pro ml

- Luftzufuhr ,0,01, bis 1,0 vvm ; . '

-. Medienumv/älzung zur Erzielung einer Strömungsgeschwindigkeit des ITährmediums am. fixierten Myzel von 1 bis 50 cm/isec

- Kultivationstemperatur 26 - 32 ⁰C

- Kultivationsdauer 4 — 3 Tage .

Durch die wesentlich erhöhte Trägerdichte (überraschender Weise wird trotz des Bewuchses mit dem Myzelrasen der ständige Wechsel des Eährmediums.an. der Oberfläche während der Umwälzung*nicht behindert), die gleichmäßige Verteilung des Trägers im Fermentor sowie den geringen Trägerabstand wird eine kompakte und feste MyzelStruktur erreicht, die eine wichtige Voraussetzung für eine wesentlich'erhöhte. Enzymausbeute darstellen. Bei dieser, Art der Fixierung ist· des weiteren eine einfache und vollständige Abtrennung der Kulturlösung von der Biomasse voll· gewährleistet. Die Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert:

Ausführungsbeispiele

Beispiel .1 · . ^: , · ' ·

In einem 2 1 Spezialfermentor^(Glasrohr mit den Abmessungen/ Durchmesser 70 mm, Hohe 700 mm) werden 9 Trägerplatten"

. .. '... . ' . . > "

aus'nichtrostendem Stahlgewebe mit einer den Durchmesser des Rohres angepaßter maximalen Breite im Abstand von 5 mm in Längsrichtung de^rs Rohres parallel zueinander fast instaliert. Die Träger besitzen eine Länge von 500 mir.. Daraus

2 ,ergibt sich insgesamt eine Trägeroberfläche von 0,475 in

und ein Verhältnis Trägerfläche zu Medienmenge von 240 m / Der Fermentor wird mit 2 1 Kulturmedium ( 5 % Glucose;

0,1 % Pektin; 0,75^ (NH₄)₂S0^; 0,5 # .KH₂PO₄; 0,03 % PeSO₄ . 7H₂O; MgSO^. 7H₂O.; CaCO ; .NaCl) gefüllt und mit., einer ._ solchen Sporenmenge beimpft, daß¹ ein Titer von 10 Sporen/ml Kulturlösung eingestellt ist. Die !Cultivation wird, "bei 23 bis 32 ⁰C und einer Luftzufuhr von 1 bis 2 1 Luft/min vorgenommen;..: Belüftung bzw. die Bewegung'· der Kulturlösung erfolgen nach dem Mammutpumpenprinzip. Nach 48 Stunden hat sich eine starke, stabile Myzeldecke am Gewebeträger ausgebildet. Danach wird die Kultivation zur Enzymsynthese fortgesetzt. Die Abtrennung der enzymhalt ig en -.KuI tür lösung erfolgt nach 5 bis 6 Tagen. Die Enzymaktivität liegt bei 250. bis 300 PG-E/ml. '.. . -

Beispiel 2 .·. .

In einem 50 1 Spezialfermentor (Durchmesser 250 mm; Höhe 1000 mm) wird ein Trägerplattenpaket aus nichtrostendem Stahlgewebe aus 23 Platten (Breite der Platten 14O bis

2 250 mm; Länge 700 mm; Trägeroberfläche 6,8 m. bei einem Plattenabstand von 10 mm; Trägerfläche : Medienvolumen =

2 3 ^: -

23O m /m ) fest in senkrechter Lage installiert. Der permentor wird mit 30 1- Medium (siehe Beispiel: 1.) gefüllt und. mit 3*10' Sporen.(10 Sporen/ml/Kulturlösung) beimpft. Z.ur Anzucht des Myzelrasens wird der Permentor zunächst über 2^-Stunden schonend nach dem aiammutpumpenprinzip betrieben und anschließend wird der notwendige intensive Medienumlauf durch das Zuschalten einer Kreiselpumpe in den . Kreislauf erreicht. .

Die Kultivation erfolgt bei 28 bis 32 ⁰G mit einer Luftzufuhr von 40 bis 90 1 Luft/h. Mach einer Kultivationsdauer von 6 Tagen kann die Kulturlösung mit einer pektinolytischen Aktivität von 200 bis 250 PG-S/ml abgelassen werden. . . . -

Claims (1)

1. Erfindungsanspruch

   Verfahren zur Gewinnung·pektinolytischer Enzyme unter Einsatz trägerfixierter Schimmelpilze, vorzugsweise des' Stammes Aspergillus niger, hinterlegt in der zentralen Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut für Büikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter ZILIET 43* 692, bei dem der Mikroorganismus auf einem formstabilen Träger, innerhalb eines herkömmlichen, oder Spezialfermentors, beweglich oder'fest installiert, zum Aufwachsen gebracht und die Enzymsynthese mit dem gleichen oder einem in der Zusammensetzung geänderten Uährmedium durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß bei Vorgabe der Sporenkonzentration für die Anzucht des Myzelrasens, !Cultivations- _ temperatur, Luftzufuhr, Umwälzungsgeschwindigkeit des Hährmediums und Kultivationsdauer eine solche Trägerdichte im l'Tährmedium erreicht wird, daß das Verhältnis der , effektiven Trägerfläche zum Uährmedienvolumen über , 160 m /m, vorzugsweise 180 bis 550 üi'/r, bei einem mittleren Trägerabstand von 4 bis 25 mm innerhalb des lährmediums, beträgt. .