DD250456A1

DD250456A1 - Herstellung mikrobieller antagonisten zur bekaempfung von phytopathogenen bodenpilzen

Info

Publication number: DD250456A1
Application number: DD28076185A
Authority: DD
Inventors: Johann Huber; Helmut Bochow; Peter Kanther; Birgit Krebs; Helmut Junge; Marthe Jacob; Karla Storek; Eberhard Juhr; Regine Vettermann
Original assignee: Ve Forschungszentrum Biotechno
Priority date: 1985-09-18
Filing date: 1985-09-18
Publication date: 1987-10-14
Also published as: DD250456B1

Abstract

Ziel der Erfindung ist es, mittels biotechnischer Verfahren zur massenweisen Herstellung von Applikationsformen definierter Mikroorganismen Antagonisten zur Bekaempfung phytopathogener Bodenpilze, bevorzugt fuer den Einsatz in der gaertnerischen Produktion, bereitzustellen. Erfindungsgemaess werden die Mikroorganismen Streptomyces spec. G 43, ZIMET 43 801, bzw. Bacillus subtilis T 99, ZIMET 11 095, submers oder auf Oberflaechen von Naehrboeden kultiviert. Die submers erzeugten Kulturloesungen mit hohen Keimzahlen oder die hochtitrigen Sporem-Zell-Suspensionen von Oberflaechenkulturen werden nach ihrer Verduennung fuer grossflaechige Applikationsmassnahmen bereitgestellt.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von mikrobiellen Antagonisten zur Bekämpfung von phytopathogenen Bodenpilzen in der gärtnerischen Pflanzenproduktion.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen .

Die Bekämpfung mikrobieller pilzlicher Erreger von Pflanzenkrankheiten in Gewächshäusern und Pflanzensubstraten erfolgt, neben den üblichen ausbautechnischen Maßnahmen, gegenwärtig durch den Einsatz synthetisch oder mikrobiell hergestellter Fungizide oder durch chemische und/oder thermische Behandlung der Substrate sowie neuerdings im Versuchsstadium auch mittels biologischer Bekämpfungsmaßnahmen.

Die Hersteilung synthetisch oder mikrobiell erzeugter Fungizide ist aufwendig und teuer. Die Anwendung der synthetischen Fungizide kann vielfach die Erden und Substrate durch nicht erwünschte Nebenwirkungen belasten; außerdem schränken jeweils notwendige Karenzzeiten den Einsatz dieser Syntheseprodukte ein. Fungizide mikrobiellen Ursprungs (DD-WP 218388) haben nach ihrer Applikation nur eine begrenzte Wirkungsdauer. Diese Nachteile sind beim direkten Einsatz fungistatisch wirksamer Mikroorganismen nicht gegeben, da die Bereitstellung der Mikroorganismen, sei es in Form von Kulturlösungen oder Zell-Sporen-Suspensionen, nur einen geringen Aufwand erfordert, das ökologische System des Bodens bzw. der Pflanzenerden in keinerWeise negativ beeinflußt wird und die applizierten Mikroorganismen im Boden oder den Erdsubstraten (aus denen sie isoliert wurden) ein natürliches Areal finden.

Ein Verfahren zur Verhütung pilzlicher Krankheiten bei verschiedenen Kulturpflanzen auf torfhaltigem Substrat durch Streptomyces-Stämme, die selbst aus Torf isoliert wurden, ist in der DE-OS 3311 071 beschrieben worden.

Es gibt ferner mehrere Literaturhinweise, die den Einsatz mikrobieller Antagonisten gegen pilzliche Welke- oder andere Krankheitserreger im Boden unter speziellen Applikationsbedingungen bei unterschiedlichen Wirtspflanzen und geographischen Besonderheiten beinhalten. Als antagonistisch wirksam werden bakterielle Mikroorganismen folgender Taxa genannt: Streptomyceten, Bacillen, Pseudomonaden, Arthrobacter sp„ Corynebacterium sp. und nicht näher beschriebene chitinolytische Bakterien. Die taxonomische Species-Zugehörigkeit o. g. Taxa wurde bis auf wenige Ausnahmen nicht angegeben.

Die zur Bekämpfung von bodenbürtigen pilzlichen Pflanzenkrankheiten verwendeten Mikroorganismen werden als Zell-Sporen- oder Mycelsuspensionen im Labormaßstab hergestellt und eingesetzt. Mitteilungen über die Herstellung und Verwendung von Applikationsformen, die im technischen Maßstab produziert werden, liegen nicht vor.

Schließlich sind die hier bekannt gewordenen bakteriellen Antagonisten nurgegeneine begrenzte Anzahl von phytopathogenen Pilzen getestet worden bzw. wirksam.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, biotechnische Verfahren zur massenweisen Herstellung von Applikationsformen definierter Mikroorganismen zu entwickeln und für den Einsatz, insbesondere in der gärtnerischen Produktion, bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit antagonistisch wirkenden Bakterienstämmen der Gattungen Streptomyces und Bacillus eine wirkungsvolle Bekämpfung bodenbürtiger phytopathogener Schadpilze durchzuführen.

Es wurde gefunden, daß Streptomyces spec. G 43 und Bacillus subtiiisT99 sehr wirkungsvolle Antagonisten gegen phytopathogene Bodenpilze sind. Sie besitzen sowohl antifungale als auch mycellvisierende Wirkung.

Die antifugale Wirkung wird üblicherweise im Plattentest, s.u., nachgewiesen. Die mycellisierende Wirkung kann in Kulturlösungen der Antagonisten nach Zusatz von lebendem Mycel der Schadpilze ermittelt werden. Nach einer Schütteldauer der mit Pilzmycel versetzten Bacillus- oder Streptomyceskulturen von drei Tagen wird die An- oder Abwesenheit des Pilzmycels mikroskopisch und durch Ausstreichen der Kulturlösung auf Czapek-Dox-Agar (nach 48 Stunden Bebrütung) erfaßt.

Die erfindungsgemäßen Stämme wurden aus Boden- und Erdsubstratproben eines Gartenbaubetriebes isoliert. Die Stämme Streptomyces spec. G43 und Bacillus subtilis T99 wurden in der zentralen Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter den Nummern ZlMET 43801 und ZIMET 11 095 hinterlegt.

Stammcharakterisierung

Streptomyces spec. G 43

Morphologie: Kurze, gerade bis leicht gewellte Sporenketten, die dem Typ Rectus-Flexibilis angehören, glatte

Sporenoberfläche

Zellwandzusammensetzung: Dietaxonospezifischen Zellwandaminosäuren sind LL-Diaminopimelinsäure und Glycin Phasensensibilität: Sensibel gegen Streptomycesphagen

Wachstum der Kolonien: Gutes Wachstum auf verschiedenen Medien, z.B. Waksman-Agar, Fleisch-Pepton-Agar, mit

rauher Oberfläche und unregelmäßigem Rand. Koloniedurchmesser 2 bis 5 mm.

Farben von Luft- und Substratmycel auf verschiedenen Medien:

Medium	Luftmycel	Substratmycel	Agarver- färbung
Hafermehlagar	hellgrau-gelb lich (reichlich)	gelbgrünlich bis oliv	keine
Glycerin-Aspa ragin-Agar	matt creme gelblich (reichlich)	helloliv	keine
Anorganischer Salz-Stärke- Agar	hellgrau bis hellbeige (weniger)	beige bis hell- oliv	keine
Hefeextrakt- Malzextra kt- Agar	graugelblich bis graugrün lich	dunkelbraun	keine

Physiologische Merkmale: Keine Melaninbildung (nicht chromogen) Säurebildung aus: D-Glukose, D-Xylose, L-Arabinose, D-Fructose, D-Mannit, D-Galactose, Salicin Keine Säurebildung aus: L-Rhamnose, Raffinose, Saccharose, meso-lnosit Nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1974) 8.Ausgabe ist dieser Stamm der Gruppe von Streptomyces-Arten zuzuordnen, die durch folgende Merkmale charakterisiert sind:

— graugelbliches Luftmycel

— Sporenketten des Rectusflexibilis-Typs

— Sporenoberfläche glatt

— Chromogenität negativ

Der hier als Streptomyces spec. G 43 bezeichnete Stamm unterscheidet sich deutlich von dem von G.Turhan (1981), J. of Plant Diseases and Protection 88,373-381, für ähnliche Zwecke benutzten Streptomyces ochraceiselerotiens Pridham.

Bacillus subtilisT99

Form/LagederSporen: oval/zentral Sporulationsverhalten: 75 %, Auf Grießagar, 4 d, 37 ⁰C

Beweglichkeit: beweglich

Gramverhalten: Gram-positive Kurzstäbchen

Koloniemorphologie auf

— Blutplatte: grau-beige, glänzend, Rand glatt

— Nähragar: hellbeige, matt, stark, gefaltet, Rand gelappt

Säurebildung aus: D-Xylose, Glucose, d-Mannose, d-Fructose, Maltose, Trehalose, Saccharose, D-Mannit, Aesculin

Keine Säurebildung aus: d-Galactose, Lactose, Dulcit, Rhamnose, Raffinose, Sorbit, D-Ribose

VPR: ' positiv

Zitratverwertung: negativ

Urease: positiv

Gasbildung aus Nitrat: negativ

Katalase: positiv

Stärkehydrolyse: Hydrolysezone 4 mm

Caseinhydrolyse: Hydrolysezone 5 mm

Gelatinehydrolyse Hydrolysezone 7 mm

Lezithinase: negativ

Starkes Wachstum auf: Glucose-NitratagarundGlucose-Asparaginagar Kein Wachstum in 10% NaCI-Bouillon Serodiagnostik, FAT mit Antisporenserum von B. subtilis

ATCC 6051: positiv

Bacillus subtilis T99 unterscheidet sich vom type strain Bacillus subtilis ATCC 6051 in folgenden Punkten:

— a-Hämolyse

— keine Säurebildung aus: Raffinose, d-Sorbit, D-Ribose

— Säurebildung aus: Xylose und Aesculin

— keine Zitratverwertung

Streptomyces spec. G 43 wird zweckmäßig so vermehrt, daß in der Kulturlösung ein diffus verteiltes Mycel gebildet wird. Das Diffusmycel ist bei der Applikation eine entscheidende Voraussetzung für eine gleichmäßige Verteilung im Boden bzw. Erdsubstrat als Einsatzmedium. Die Herstellung der Kulturlösung erfolgt unter aseptischen Submersbedingungen in zwangsbelüfteten und gerührten Fermentern. Die Bildung eines diffus verteilten Mycels (Pelletbildung ist zu umgehen) wird beispielsweise erreicht durch die in den Beispielen 1 und 2 angegebenen Verfahrensbedingungen.

Bacillus subtilis T99 wird ebenfalls unter Submersbedingungen im Rührfermenter kultiviert. Die Beimpfung des Produktionsmediums erfolgt mit einer Vorkultur. Nach einer Kultivationsdauer von etwa 30 Stunden wird eine Zelldichte von 10¹⁰ Keimen/ml erreicht. 25% der Zellen sind dann versport.

Neben submers erzeugten Kulturlösungen können für besondere Applikationszwecke auch hochtitrige Sporensuspensionen von Oberflächenkulturen mit Streptomyces spec. G 43 und mit Bacillus subtilis T99 gewonnen werden. Die Oberflächenkulturen, insbesondere von Streptomyces, werden angelegt auf Schrägagar in speziell gefertigten Eprouvetten mit einem Volumen von 110ml (Ausmaße: 30mm Durchmesser, 190mm Länge). Diese Eprouvetten gewährleisten mit 30ml Agar infolge günstiger Feuchtigkeits- und Belüftungsbedingungen eine gleichmäßige Versporung des Streptomyces-Stammes.

Die antagonistische Wirkung der erfindungsgemäßen Streptomyces- und Bacillus-Stämme wurde gegen mehrere phytopathogene Bodenpilze in vitro- und z.T. in vivo-Versuchen getestet.

Invitro-Teste:72 Stunden alte Kulturlösungen beider Stämme wurden sterilfiltriert. Das Filtrat wurde heißem Waksman-Agar im Verhältnis 1:4 und 1:8 beigemischt. Nach dem Ausgießen und Erkalten des Agars in den Petrischalen wurden die zu prüfenden Pilze jeweils in das Zentrum der Agarplatte geimpft. Parallel angelegte Kontrollen enthielten kein Kulturfiltrat.

Durch Ausmessen der Koloniedurchmesser nach einer Inkubationszeit von 4 bis 7 Tagen wurde die wachstumshemmende Wirkung der Kulturfiltrate im Vergleich zu den Kontrollen ermittelt (s. Tab.).

Antagonisten Bodenpilze Str. spec. G 43 B. subtilisT99

Fusarium oxysporum Schlecht.

f. sp. dianthi (Snyder et Hansen) xx . xxx*¹

Fusarium oxysporum Schlecht, f. sp. gladioli (Snyder

et Hanson) xx xxx

Fusarium oxysporum Schlecht, f. sp. gerberae

(Gordon) xx xxx

Fusarium oxysporum Schlecht, f. sp. tulipae Apt. — —

Fusarium oxysporum Schlecht f. sp. cucumormum

Owen xx xxx

Fusarium oxysporum Schlecht, f. sp. lycopersici xxx xxx

Phomopsissclerotiodesv. Kest xxx xxx

Stromatinia gladioli (Drayt.) Whetz. χ xxx

Thanatephoruscucumeris (Frank) Donk xxx xxx

Botrytiscinerea Pers. exNocca&Bulb xx xxx

Nectriaradicicpla Gerlach &Nilsson — xx

Pyrenochaeta lycopersici R. Schneideret Gerlach — xxx

Phvtophtora cryptogea χ . xxx

Curvularia radicinum — xxx

·' Bewertung: xxx starke Hemmwirkung

xx weniger stark gehemmt

χ noch gehemmt

— keine Hemmwirkung

Für die in vivo-Versuche wurden Jungpflanzen der Edelnelke — Dianthus caryophyllus L. — und der Gerbera — Gerbera jamesonii H. Bolus ex Hooker — verwendet. Es gelangten Kulturlösungen oder Sporensuspensionen der erfindungsgemäßen Stämme zwecks Prüfung des Bekämpfungseffektes gegen die Welkeerreger Fusarium oxysporum Schlecht, f. sp. dianthi (Prill et Del.) Snyder et Hanson und Fusarium oxysporum Schlecht, f. sp. gerberae Gordon zum Einsatz, s. Beispiele 6 und

Anwendungsbeispiele Beispiel 1

Für die Gewinnung von Applikationsformen antagonistischer Bakterien zur Bekämpfung von phytopathogenen Bodenpilzen wurde Streptomyces spec. G 43 verwendet. Der Stamm wurde als Schrägagarkultur mit Waksmanager, nachdem er 5 Tage lang bei 29⁰C gewachsen war, bei+4⁰C aufbewahrt.

Zusammensetzung des Waksman-Agars: Bacto-Peptone (Difco) 5g, Glucose 10g, Fleischextrakt 3g, NaCI 5g, Agar 20g je Liter Leitungswasser, pH 6,8. Sterilisation 30 min bei 121⁰C.

Für die Herstellung der Kulturlösung wurde ein 121-Rührfermenter mit 81 Füllung benutzt. Das Produktionsmedium hatte folgende Zusammensetzung: Saccharose 0,05%, Glucose 0,2%, Stärke 1,5%, Harnstoff 0,1 %, Hefeextrakt 0,1 %, Pepton 0,5%, (NH₄I₂HPO₄ 0,2%, KCI 0,05%, Leitungswasser, pH 6,9 ± 0,1. Sterilisation 30min bei 121⁰C.

Das Produktionsmedium wurde mit einer Sporensuspension von einer Schrägagarkultur beimpft. Die Impfdichte belief sich auf etwa 10⁶ colony forming units (cfu)/ml. Fermentationsparameter: Belüftung 0,15vvm, Umdrehung des Rührers 300/min, Temperatur 29⁰C, Schaumbekämpfung mit Polypropylenglycol. Nach einer Kulturdauer von 40 Stunden war die stationäre Wachstumsphase erreicht, die Kulturlösung enthielt etwa 5 · 10⁷cfu/ml. Nach dem Verdünnen mit Leitungswasserstand diese Kulturlösung zur Bekämpfung der phytopathogenen Testpilze der Fusarienwelkeerreger bei Nelke und Gerbera zur Verfügung.

Beispiel 2

Zur Herstellung größerer Mengen von Kulturlösung mit Streptomyces spec. G43 wurde ein 3501-Fermenter verwendet. Die Zusammensetzung des Produktionsmediums (220I) war die gleiche wie in Beispiel 1. Das Medium wurde bei 121⁰C 30 min sterilisiert und danach mit einer Vorkultur aus einem gerührten Laborfermenter mit diffus verteiltem Mycel beimpft. Die Impfdichte in dem Produktionsmedium lag bei etwa 10⁶cfu/ml.

Fermentationsparameter: Belüftung 0,1 vvm, Umdrehung des Rührers 200/min, Temperatur 29°C, Schaumbekämpfung mit Polypropylenglycol.

Nach einer Kulturdauer von 38 Stunden war in der Kulturlösung eine Myceldichte von etwa 8 · 1.0⁷cfu/ml erreicht. Sie wurde abgebaut, mit Leitungswasser 1:10 verdünnt und für einen Großversuch zur Bekämpfung der Fusarienwelke der Nelke eingesetzt.

Beispiel 3

Zur Herstellung einer Applikationslösung mit Bacillus subtil is T 99 wurde ein 121-Rührfermenter mit 71 Füllung verwendet. Der Stamm wurde als Schrägagarkultur auf Waksman-Agar (Zusammensetzung s. Beispiel 1), nachdem er 48 Stunden bei 3O⁰C gewachsen war, aufbewahrt.

MiteinerPlatinösewurden die Bakterien auf eine Vorkultur überimpft, die bei 30⁰C 24 Stunden (in 500 ml-Rundkolben mit 100 ml Füllung) geschüttelt wurde. Die Vorkultur diente zur Beimpfung des Produktionsmediums des Fermenters. Vorkultur- und Produktionsmedium bestanden aus Glucosenährbouillon folgender Zusammensetzung: Pankreatisches Pepton 22,5g, Glucose 1,0g, K₂HPO₄ 2,0g, NaCI 3,0g je Liter Leitungswasser, pH 7,2 ± 0,2. Sterilisation des Mediums bei 121⁰C 30min. Das Produktionsmedium des Fermenters wurde mit einer Impfdichte von 10⁷ Keimen/ml beimpft.

Fermentationsparameter: Belüftung 0,1 vvm, Umdrehung des Rührers 200/min, Temperatur 30⁰C, Schaumbekämpfung mit Polypropylenglycol. Nach einer Kulturdauer von 28 Stunden befanden sich die Zellen in der stationären Phase, sie waren etwa zu einem Viertel versport. Die Zellzahl lag bei etwa 10^l0/ml.

Beispiel 4

Zur Herstellung einer Mycel-Sporensuspension von Streptomyces spec. G 43 wurden Schrägagarkulturen in den Eprouvetten angelegt. Die Beimpfung der Agaroberfläche erfolgte, von Aufbewahrungskulturen ausgehend, mit der Öse, so daß ein einheitlicher Mycelrasen entstand.

Als Schrägagar diente Fleischpeptonagar folgender Zusammensetzung: Bacto-Pepton (Difco) 10g, Hefeextrakt 10g, NaCI 5g, Agar 20g in einem Liter dest. Wasser, pH 7,0 ± 0,2. Sterilisation 15min bei 120⁰C.

Die Bebrütung der Kulturen dauerte 14 Tage bei 29⁰C. Nach einem weiteren Aufenthalt dieser Kulturen — 1 Woche — im Kühlschrank bei +4⁰C wurde der Mycelsporenrasen in mehreren Portionen mit insgesamt 100 ml Leitungswasser abgeschwemmt. In der Mycel-Sporensuspension waren etwa 10⁹cfu/ml vorhanden.

Beispiel 5

Die Herstellung einer Sporen-Zell-Suspension von Bacillus subtilis T99 erfolgte analog zu Beispiel 4. Die Bebrütung der Schrägagarkulturen dauerte 8 Tage bei 3O⁰C. Danach wurde der Oberfläch en rasen mit 100 ml Leitungswasser abgeschwemmt. In der erhaltenen Suspension waren etwa 10¹⁰ Keime/ml vorhanden.

Beispiele

Zur Bekämpfung der gefäßparasitären Welke der Edelnelke, verursacht durch Fusarium oxysporumf. sp. dianthi, wurden Kulturlösungen von jeweils Streptomyces spec. G43mit5 10⁷cfu/ml und Bacillus utilis T99 mit 3 10⁹ Keimen/ml verwendet. Die Applikation der 1:10 bzw. 1:100 verdünnten Kulturlösungen erfolgte durch Wurzeltauchung der Nelkenjungpflanzen und durch Inoculation des Erdsubstrates (20ml Kulturlösung je 1 kg gebrauchsfertiges Substrat). Vor der Bepflanzung wurden die torfhaltigen Kultursubstrate mit einer Konidiensuspension des phytopathogenen Pilzes Fusarium oxysporum dianthi inokuliert. Sie waren die Ausgangssubstrate sowohl für die unbehandelten Kontrollstecklinge (ohne Kontakt mit dem Antagonisten) als auch für die Bekämpfungsversuche mit dem Antagonisten, s. Tab.

	Anzahl gesunder	Krankheitsindex
	Pflanzen (in %)	Ki(in%)
	8 Wochen nach	1 ... 100
Applikation	Pflanzung	(Totalbefall)

Kontrolle 16,6 80,0

Wurzeltauchung

— Str. spec. G 43 50,0 35,0

— Bac. subtilis T 99 56,5 34,6 Bodenapplikation und

Wurzeltauchung

— Str. spec. G 43 63,6 23,6

— Bac. subtilis T 99 66,7 18,3

Beispiel 7 \

Die Bekämpfung der gefäßparasitären Erkrankungen bei der Edelnelke und bei der Gerbera, verursacht durch Fusarien, wurde unter praxisüblichen Versuchsbedingungen mit technisch hergestellten Kulturlösungen von Streptomyces spec. G43 und Bacillus subtilis T99 durchgeführt.

Bei 35000 Jungpflanzen der Edelnelke wurden folgende Applikationsmethoden mit der verdünnten Kulturlösung von Streptomyces spec. G 43 mit etwa 3 · 10⁶cfu angewandt:

— Wurzeltauchung der Jungpflanzen (Dauer 15 Minuten)

— Gießen des Substrats vor der Pflanzung mit 2I Kulturlösung/m² und

— Spritzen des Substrates mitO,5l Kulturlösung/m² vor der Pflanzung

Als Kontrollen dienten 18000 Jungpflanzen mit einer betriebsüblichen fungiziden Behandlung.

in einem weiteren Versuch wurden 1 000 Jungpflanzen von Gerbera jamesonii eingesetzt. Die Applikation erfolgte durch Gießen des Bestandes (21 Kulturlösung/m²) unmittelbar nach der Pflanzung mit Kulturlösungen von Streptomyces spec. G43 (~3 10⁶cfu/ml) und Bacillus subtilisT99 (~10⁷ Keime/ml), s. Tab.

Gerbera kranke Pflanzen

2,4 n.b.*

1,5 0,9

n.b.

	— G43 —	Edelnelke
		kranke Pflanzen
Applikation	— G43 —	(in%)
Kontrolle	—T99 —
		5,0
	— G43—	4,8

	2,6
(ehem. Bekämpfungsmaßnahmen)	n.b.
Wurzeltauchung
Bodenbehandlung	3,4
— Gießen —

Boden behänd lung
— Spritzen —

*' n.b. = nicht bestimmt

Claims

1. Herstellung mikrobieller Antagonisten zur Bekämpfung von phytopathogenen Bodenpilzen mit Streptomyceten oder Bacillen in verschiedenen Applikationsformen, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces spec. G43 ZIMET Nr.43801 bzw. Bacillus subtilis T99 ZIMET Nr. 11 095 submers oder auf Oberflächen von Nährböden kultiviert werden.

2. Die Herstellung von mikrobiellen Antagonisten nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß submers erzeugte Kulturlösungen mit hohen Keimzahlen oder hochtitrige Sporen-Zell-Suspensionen von Oberflächenkulturen nach ihrer Verdünnung für großflächige Applikationsmaßnahmen bereitgestellt werden.