DD250456B1 - Verfahren zur bekaempfung von phytopathogenen bodenpilzen im gartenbau - Google Patents

Verfahren zur bekaempfung von phytopathogenen bodenpilzen im gartenbau

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DD250456B1
DD250456B1 DD28076185A DD28076185A DD250456B1 DD 250456 B1 DD250456 B1 DD 250456B1 DD 28076185 A DD28076185 A DD 28076185A DD 28076185 A DD28076185 A DD 28076185A DD 250456 B1 DD250456 B1 DD 250456B1
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Helmut Bochow
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Marthe Jacob
Karla Storek
Eberhard Juhr
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Ve Forschungszentrum Biotechno
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
    • A01C1/00—Apparatus, or methods of use thereof, for testing or treating seed, roots, or the like, prior to sowing or planting

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  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Die Bekämpfung mikrobieller pilzlicher Erreger von Pflanzenkrankheiten in Gewächshäusern und Pflanzensubstraten erfolgt,
neben den üblichen anbautechnischen Maßnahmen, gegenwärtig durch den Einsatz synthetisch oder mikrobiell hergestellter
Fungizide oder durch chemische und/oder thermische Behandlung der Substrate sowie neuerdings im Versuchsstadium auch
mittels biologischer Bekämpfungsmaßnahmen.
Die Herstellung synthetisch oder mikrobiell erzeugter Fungizide ist aufwendig und teuer. Die Anwendung der synthetischen- Fungizide kann vielfach die Erden und Substrate durch nicht erwünschte Nebenwirkungen belasten; außerdem schränken
jeweils notwendige Karenzzeiten den Einsatz dieser Syntheseprodukte ein. Fungizide mikrowellen Ursprungs (DD-WP 218388)haben nach ihrer Applikation nur eine begrenzte Wirkungsdauer. Diese Nachteile sind beim direkten Einsatz fungistatischwirksamer Mikroorganismen nicht gegeben, da die Bereitstellung der Mikroorganismen, sei es in Form von Kulturlösungen oder
Zell-Sporen-Suspensionen, nur einen geringen Aufwand erfordert, das ökologische System des Bodens bzw. der Pflanzenerden
in keiner Weise negativ beeinflußt wird und die applizierten Mikroorganismen im Boden oder den Erdsubstraten (aus denen sieisoliert wurden) ein natürliches Areal finden.
Ein Verfahren zur Verhütung pilzlicher Krankheiten bei verschiedenen Kulturpflanzen auf torf haltigem Substrat durch Streptomyces-Stämme, die selbst aus Torf isoliert wurden, ist in der DE-OS 3311071 beschrieben worden. Es gibt ferner mehrere Literaturhinweise, die den Einsatz mikrobieller Äntagonisten gegen pilzliche Welke- oder andere - Krankheitserreger im Boden unter speziellen Applikationsbedingungen bei unterschiedlichen Wirtspflanzen und
geographischen Besonderheiten beinhalten. Als antagonistisch wirksam werden bakterielle Mikroorganismen folgender Taxagenannt: Streptornyceten, Bacillen, Pseudomonaden, Arthrobacter sp., Corynebacterium sp. und nicht näher beschriebenechitinolytische Bakterien. Die taxonomische Species-Zugehörigkeit o.g. Taxa wurde bis auf wenige Ausnahmen nichtangegeben.
Die zur Bekämpfung von bodenbürtigen pilzlichen Pflanzenkrankheiten verwendeten Mikroorganismen werden als Zell-Sporeh-
oder Mycelsuspensionen im Labormaßstab hergestellt und eingesetzt. Mitteilungen über die Herstellung und Verwendung von
Applikationsformen, die im technischen Maßstab produziert werden, liegen nicht vor. Schließlich sind die hier bekannt gewordenen bakteriellen Äntagonisten nur gegen eine begrenzte Anzahl von phytopathogenen Pilzen getestet worden bzw. wirksam. Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, Applikationsformen eines antagonistisch wirksamen Mikroorganismus zu entwickeln und für den Einsatz, insbesondere in der gärtnerischen Produktion, bereitzustellen.
Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit einem antagonistisch wirkenden Bakterienstamm der Gattung Bacillus eine
wirkungsvolle Bekämpfung boden bürtiger phytopathogener Schadpilze durchzuführen.
Es wurde gefunden, daß ein Bacillusstamm mit der Bezeichnung T 99nein sehr wirkungsvoller Antagonist gegen phytopathogene Bodenpilze ist. Er besitzt sowohl antifungale als auch mycellysierende Wirkung. Die antifungale Wirkung wird üblicherweise im Plattentest, s. u., nachgewiesen. Die mycellysierende Wirkung kann in Kulturlösungen des Äntagonisten nach Zusatz von lebendem Mycel der Schadpilze ermittelt werden. Nach einer Schütteldauer
der mit Pilzmycel versetzten Bacilluskulturen von drei Tagen wird die An* oder Abwesenheit von Pilzmycel mikroskopisch unddurch Ausstreichen der Kulturlösung auf Czapek-Dox-Agar (nach 48 Stunden Bebrütung) erfaßt.
Der erfindungsgemäße Stamm wurde aus Erdsubstratproben eines Gartenbaubetriebes isoliert. Der Stamm Bacillus T 99 wurde
in der zentralen Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena unter der
Nummer ZIMET 11095 hinterlegt. Stammcharakteristik Bacillus subtilis T 99 — ZIMET1109S Form/Lage der Spore: oval/zentral Sporulationsverhalten: 75%,aufGrießagar,4d,37°C Beweglichkeit: beweglich Gramverhalten: Gram-positive Kurzstäbchen Koloniemorphologie auf
— Blutplatte: graubeige, glänzend, Rand glatt
— Nähragar: hellbeige, matt, stark gefaltet, Rand gelappt
Säurebildung aus: D-Xylose, Glucose, d-Mannose, d-Fructose, Maltose, Trehalose, Saccharose, O-Mannit,Aesculin
keine Säurebildung aus: d-Galactose, Lactose, Dulcit, Rhamnose, Raffinose, Sorbit, O-Ribose
VPR: positiv Zitratverwertung: negativ Urease: positiv Gasbildung aus Nitrat: negativ Katalase: positiv Stärkehydrolyse: Hydrolysezone 4 mm Caseinhydrolyse: Hydrolysezone 5 mm Gelatinehydrolyse: Hydrolysezone 7 mm Lezithinase: negativ
starkes Wachstum auf: Glucose-Nitratagar und Glucose-Asparaginagar
kein Wachstum in: 10%NaCI-Bouülon
Serodiagnostik FAT mit Antisporenserum von B. subtilis ATCC 6051: positiv Bacillus subtilis T 99 unterscheidet sich vom type strain Bacillus subtilis ATCC 6051 in folgenden Punkten:
— a-Hämolyse
— keine Säurebildung aus: Raffinose, d-Sorbit, D-Ribose
— Säurebildung aus: Xylose und Aesculin
— keine Zitratverwertung
— B. subtilis ATCC 6051 besitzt gegenüber dem .erfindungsgemäßen Stamm T 99 nur eine geringe Hemmwirkung gegen Fusarium oxysporum dianthi. Die Hemmzonenbreite in Strichtest, s. u. liegt bei Stamm T 99 bei 18-20 mm und bei dem Typusstamm B. subtilis ATCC 6051 bei 5-6 mm.
Bacillus subtilis T 99 wird unter Submersbedinguogen im Rührfermenter kultiviert. Die Beimpfung des Produktionsmediums
erfolgt mit einer Vorkultur.
Neben submers erzeugten Kulturlösungen können für besondere Applikationszwecke auch hochtitrige Sporensuspensionen
von Oberflächenkulturen mit Bacillus subtilis T 99 gewonnen werden. Die Oberflächenkulturen werden angelegt auf Schrägagarin speziell gefertigten Eprouvetten mit einem Volumen von 110ml (Ausmaße: 30mm Durchmesser, 190mm Länge). Diese
Eprouvetten gewährleisten mit 30ml Agar infolge günstiger Feuchtigkeits- und Belüftungsbedingungen sin gleichmäßiges Wachstum und Versporung des Stammes. Die antagonistische Wirkung des erfindungsgemäßen Bacillus-Stammes wurde gegen mehrere phytopathogene Bodenpilze in
vitro- und z.T. in vivo-Versuchen getestet.
In vitro-Test: 72 Stunden alte Kulturlösungen des Stammes wurden sterilfiltriert. Das Filtrat wurde heißem Waksman-Agar im Verhältnis 1:4 und 1:8 beigemischt. Nach dem Ausgießen und Erkalten des Agars in den Petrischalen wurden die zu prüfenden Pilze jeweils in das Zentrum der Agarplatte geimpft. Parallel angelegte Kontrollen enthielten kein Kulturfiltrat. Durch Ausmessen der Koloniedurchmesser nach einer Inkubationszeit von 4 bis 7 Tagen wurde die wachstumshemmende Wirkung der Kulturfiltrate im Vergleich 2u den Kontrollen ermittelt (siehe Tabelle). Bodenpilze B. subtilis T Fusarium oxysporun» Schlecht, f. sp. dianthi
(Snyder et Hanson) xxx
Fusarium oxysporum Schlecht, f. sp. gladioli
(Snyder et Hanson) xxx
Fusarium oxysporum Schlecht, f. sp. gerberae
(Gordon) xxx
Fusarium oxysporum Schiecht, f. sp. tulipae Apt. - Fusarium oxysporum Schlecht, f. sp.
cucumormum Owen . xxx
Fusarium oxysporum Schlecht, f. sp. lycopersici xxx Phomopsis sclerotiodes v. Kest xxx Stromatinia gladioli (Drayt.) Whetz xxx Thanatephoruscucumeris (Frank) Donk xxx Botrytis cinerea Pers. ex Nocca & Bulb xxx Nectria radicicola Gerlach & Nilsson xx Pyrenochaeta lycopersici R. Schneider et Gerlach xxx Phytophtoracryptogea xxx Curvularia radicinum xxx
Bewertung: xxx starke Hemmwirkung (Hemmzonenbreite: 18-20 mm) xx weniger stark gehemmt (Hemmzonenbreite: 10-12 mm) - keine Hemmwirkung
Hemmzonenbreite ermittelt im Strichtest, s. Filippi et al., Plant and Soil 80,119 (1984) Für die in vivo-Versuche wurden Jungpflanzen der Edelnelke — Dianthus caryophyllus L — und der Gerbera — Gerbera jamesonii H. Bolus ex Hooker—verwendet. Es gelangten Kulturlösungen oder Sporensuspensionen des erfindungsgemäßen Stammes zwecks Prüfung des Bekämpfungseffektes gegen die Welkeerreger Fusarium oxysporum Schlecht, f. sp. dianthi (Prill et al.) Snyder et Hanson und Fusarium oxysporum Schlecht, f. sp. gerberae Gordon zum Einsatz, siehe Beispiele 4 und 5.
Anwendungsbeispiele Beispiel 1
Zur Herstellung einer Applikationslösung mit Baccilus subtilis T 99 wurde ein 12-l-Rührfermenter mit 71 Füllung verwendet.
Der Stamm wurde als Schrägagarkultur auf Waksman-Agar, nachdem er 48 Stunden bei 300C gewachsen war, bei +40C aufbewahrt.
Zusammensetzung des Waksman-Agars: Bacto-Peptone (Difco) 5g, Glucose 10g, Fleischextrakt 3g, NaCI 5g, Agar 20g je Liter Leitungswasser, pH 6,8. Sterilisation 30min bei 121 °C.
Mit einer Platinöse wurden die Bakterien auf eine Vorkultur überimpft, die bei 3O0C 24 Stunden (in 500-ml-Rundkolben mit 100ml Füllung) geschüttelt wurde. Die Vorkultur diente zur Beimpfung des Produktionsmediums des Fermenters. Vorkultur· und Produktionsmedium bestanden aus Glucosenährbouillon folgender Zusammensetzung: Pankreatisches Pepton 22,5g, Glucose 1,0g, K2HPO4 2,0g, NaCI 3,0g je Liter Leitungswasser, pH 7,2 ± 0,2. Sterilisation des Mediums bei 121"C 30 min.
Das Produktionsmedium des Fermenters wurde mit einer Impfdichte von 107 Keimen/ml beimpft.
Fermentationsparameter: Belüftung 0,1 vvm, Umdrehung des Rührers 200/min, Temperatur 30°C, Schaumbekämpfung mit Polypropylenglycol. Nach einer Kulturdauer von 28 Stunden befanden sich die Zellen in der stationären Phase, sie waren etwa zu einem Viertel versport. Die Zellzahl lag bei etwa 10l0/ml.
Beispiel 2
Zur Herstellung größerer Mengen von Kulturlösung mit B. subtilis T 99 wurde ein 350-l-Fermenter verwendet.
Die Zusammensetzung des Produktionsmediums (220I) war die gleiche wie in Beispiel 1. Das Medium wurde bei 121 "C 30 min sterilisiert und danach mit einer 20h alten Vorkultur aus einem gerührten Laborfermenter mit etwa 109 Keimen beimpft. Die Impfdichte in dem Produktionstank lag bei etwa 107 Keimen/ml.
Die Nährbodenzusammensetzung der Vorkultur entsprach der von der Produktionskultur, siehe Beispiel 1.
Fermentationsparameter: Belüftung O.ivvm, Umdrehung des Rührers 200/min, Temperatur 30°C, Schaumbekämpfung mit Polypropylenglycol.
Nach einer Kulturdauer von 28Stunden befanden sich die Zellen in der stationären Phase, Die Zellzahl lag bei 3 · 10'/ml. Die Kulturlösung wurde unter aseptischen Bedingungen aus dem Fermenter in keimfreie Behältnisse gefüllt. Sie stand dann für die Anwender zur Verfugung.
Beispiel 3
Zur Herstellung einer Sporen-Zell-Suspension von B. subtilis T 99 wurden Schrägagarkulturen in Eprouvetten angelegt. Die Beimpfung der Agaroberflache erfolgte, von Aufbewahrungskulturen ausgehend, mit der Öse, so daß ein einheitlicher Mycelrasen entstand.
Als Schrägagar diente Fleischpeptonagar folgender Zusammensetzung: Bacto-Pepton (Difco) 10g, Hefeextrakt 10g, NaCI 5g, Agar 20g in einem Liter dest. Wasser, pH 7,0 ± 0,2. Sterilisation 15 min bei 1200C.
Die Bebrütung der Kulturen dauerte 8 Tage bei 300C. Danach wurde der Oberflächenrasen mit 100ml Leitungswasser abgeschwemmt. In der erhaltenen Suspension waren etwa 10'° Keime/ml vorhanden.
Beispiel 4
Zur Bekämpfung der gefäßparasitären Welke der Edelnelke, verursacht durch Fusarium oxysporum f. sp. dianthi, wurden Kulturlösungen von Bacillus subtilis T 99 mit 3 · 109 Keimen/ml verwendet. Die Applikation der 1; 100 verdünnten Kulturlösungen erfolgte durch Wurzeltauchung der Nelkenjungpflanzen und durch Inoculation des Erdsubstrates (20 ml Kulturlösung je 1 kg gebrauchsfertiges Substrat). Vor der Bepflanzung'wurden die torfhaltigen Kultursubstrate mit einer Konidiensuspension des phytopathogenen Pilzes Fusarium oxysporum dianthi inokuliert. Sie waren die Ausgangssubstrate sowohl für die unbehandelten Kontrollstecklinge (ohne Kontakt mit dem Antagonisten) als auch für die Bekämpfungsversuche mit dem Antagonisten, siehe Tabelle.
Applikation Anzahl gesunder Pflanzen (in %) Krankheitsindex Ki (in %)
8Wochen nach Pflanzung 1... 100 (Totalbefall)
Kontrolle 16,6 80,0
Wurzeltauchung mit Bac. subtilisT99 56,5 34,6
Bodenapplikation und Wurzeltauchung
mit Bac. subtilis T 99 66,7 18,3
Beispiel5 Die Bekämpfung der gefäßparasitären Erkrankungen bei der Edelnelke und bei der Gerbera, verursacht durch Fusarien, wurde
unter praxisüblichen Versuchsbedingungen mittechnisch hergestellten Kulturlösungen von Bacillus subtilis T 99durchgeführt.
Bei 35000 Jungpflanzen der Edelnelke wurden folgende Applikationsmethoden mit der verdünnten Kulturlösung von B. subtilis T 99 mit etwa 10 Keimen/ml angewandt:
— Wurzeltauchung der Jungpflanzen (Dauer 15 Minuten)
— Gießen des Substrats vor der Pflanzung mit 21 Kulturlösung/m2 und
— Spritzen des Substrates mit 0,51 Kulturlösung/m2 vor der Pflanzung.
Als Kontrollen dienten 18000 Jungpflanzen mit einer betriebsüblichen fungiziden Behandlung.
In einem weiteren Versuch wurden 1000 Jungpflanzen von Gerbera jamesonii eingesetzt. Die Applikation erfolgte durch Gießen des Bestandes (21 Kulturlösung/m2) unmittelbar nach der Pflanzung mit Kulturlösungen von Bacillus subtilis T 99 (~ 107 Keime/ ml), siehe Tabelle.
Applikation Edelnelke kranke Pflanzen (in %) Gerbera kranke Pflanzen Applikation 12 Wochen nach Pflanzung (in%)
Kontrolle
(ehem. Bekämpfungsmaßnahmen) 5,0 2,4
Bodenbehandlung
—Gießen— 2,5 0,9
Bodenbehandlung
— Spritzen— 3,4 - 1,0

Claims (2)

1. Verfahren zur Bekämpfung phytopathogener Bodenpilze im Gartenbau mit Bacillen in verschiedenen Applikationsformen, dadurch gekennzeichnet, daß Bacillus subtilis T 99, ZIMET 11 095, verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß submers erzeugte Kulturlösungen oder Sporenzellsuspensionen von Emerskulturen eingesetzt werden.
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bekämpfung von phytopathogenen Bodenpilzen in dergärtnerischen Pflanzenproduktion mit Bacillen in verschiedenen Applikationsformen.
DD28076185A 1985-09-18 1985-09-18 Verfahren zur bekaempfung von phytopathogenen bodenpilzen im gartenbau DD250456B1 (de)

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