DD250932A1 - Verfahren zur herstellung von oligodesoxyribonucleotiden zur casomorphinexpression - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligodesoxyribonucleotiden der allgemeinen Formel 1, die in pro- und eukaryotischen Vektoren insertions- und clonierungsfaehig sind und die Expression von Casomorphinen codieren.1 Oligodesoxyribonucleotid-Doppelstraenge: Restriktions-schnittMet-Casomorphin-CodesStop-Restriktions-schnittDasZiel der Erfindung besteht in der chemischen Synthese von doppelstraengigen Oligodesoxyribonucleotiden, die aufgrund ihrer spezifischen Strang-, Code- und Leserastergestaltung direkt in pro- und eukaryotischen Vektoren insertions- und clonierungsfaehig sind und innerhalb von Fusionsproteinen die Expression von Casomorphinen gestatten. Erfindungsgemaess werden die neuen doppelstraengigen Oligodesoxyribonuleotide mit Casomorphininformationen erhalten durch eine traegergestuetzte Phosphoramiditsynthese des codierenden und nicht codierenden Oligodesoxyribonucleotidstrangs und ihre anschliessende Hybridisierung zu in pro- und eukaryotischen Vektoren unmittelbar insertions-, clonierungs- und innerhalb von Fusionsproteininformationen expressionsfaehigen Casomorphingenen.
Description
Rinder-ß-Casomorphin-Bib-CM-B):
Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly
Prokaryoten-Expression (E. coli): Eukaryoten-Expression (Hefe): Human-ß-Casomorphin-5 (h-CM-5):
5'-TAC CCG TTC CCG GGT-3' 3'-ATG GGC AAG GGC CCA-5' 5'-TAC CCA TTC CCA GGT-3' 3'-ATG GGT AAG GGT CCA-5' Tyr-Pro-Phe-Val-Glu
Prokaryoten-Expression (E. coli): Eukaryoten-Expression (Hefe): Human-ß-Casomorphin-ö'(h-CM-5'):
5'-TAC CCG TTC GTT GAA-3' 3'-ATG GGC AAG CAA CTT-5' 5'-TAC CCA TTC GTT GAA-3' 3'-ATG GGT AAG CAA CTT-5' Tyr-Pro-Val-Pro-Glu
Prokaryoten-Expression (E. coli): Eukaryoten-Expression (Hefe):
5'-TAC CCG GTT CCG GAA-3' 3'-ATG GGC CAA GGC CTT-5' 5'-TAC CCA GTT CCA GAA-3' 3'-ATG GGT CAA GGT CTT-5'
und als Stop-Code(s) 1-2 Codons der folgenden drei Tripletts
5'-TAA TAG TGA-3' Verwendung finden, 3'-ATT ATC ACT-5'
durch trägergestützte Phosphoramiditsynthese hergestellt und anschließend hybridisiert werden.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oiigodesoxyribonucieotiden der allgemeinen Formel 1, die in pro- und eukaryotischen Vektoren insertions- und clonierungsfähig sind und die Expression von Casomorphinen codieren.
Oligodesoxyribonucleotid-Doppelstränge:
Restriktionsschnitt
Met-
Casomorphin-Codes
Stop-
Restriktionsschnitt
Pfeil: Leserichtung
Restriktionsschnitt: Restriktionsenzymerkennungsbereichemitö'-bzw. S'-überstehendencohesiven bzw. glatten Enden,für den in Leserichtung initialen Restriktionsschnitt gegebenenfalls unter Einbeziehung von 1-2 zusätzlichen Desoxyribonucleotidpaarungen zur Justierung des Leserasters.
Met-Code: 5'-ATG-3'als Codierung der späteren BrCN-S'-TAC-B' Spaltenstellen der Fusionsproteine
Rinder-iS-Casomorphin-Blb-CM-B): Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly
Prokaryoten-Expression (E. coli): Eukaryoten-Expression (Hefe): Human-ß-Casomorphin-ö (h-CM-5):
5'-TAC CCG TTC CCG GGT-3' 3'-ATG GGC AAG GGC CCA-5' 5'-TAC CCA TTC CCA GGT-3' 3'-ATG GGT AAG GGT CCA-5' Tyr-Pro-Phe-Val-Glu
Prokaryoten-Expression (E. CoIi): Eukaryoten-Expression (Hefe): Human-/3-Casomorphin-5' (h-CM-5'):
5'-TAC CCG TTC GTT GAA-3' 3'-ATG GGC AAG CAA CTT-5' 5'-TAC CCA TTC GTT GAA-3' 3'-ATG GGT AAG CAA CTT-5' Tyr-Pro-Val-Pro-Glu
Prokaryoten-Expression (E. coli): Eukaryoten-Expression (Hefe):
5'-TAC CCG GTT CCG GAA-3' 3'-ATG GGC CAA GGC CTT-5' 5'-TAC CCA GTT CCA GAA-3' 3'-ATG GGT CAA GGT CTT-5'
Stopp-Code(s): 5'-TAA TAG TGA-3'Verwendung von 1-2
3'-ATT ATC ACT-5' Tripletts
Sämtliche Casomorphin-Codes einschließlich der infolge Code-Degeneration anstelle der oben aufgeführten Tripletts verwendungsfähigen Codes.
Die Verbindungen besitzen biologisches und technisches Interesse, da sie als Passagier-DNA in pro- und eukaryotischen Vektoren zur Expression gebracht, Casomorphine mit neuroendocriner, cardiovasculärer, cardiotoner und nahrungsverwertungsbessemder Wirksamkeit liefern. Die insertions-, clonierungs- und expressionsfähigen Casomorphingene der allgemeinen Formell können mit Vorteil Verwendung finden zur Expression der Casomorphincodes in Fussionsproteinen.
Die Casomorphin-Typ-Peptide selbst sind bisher als Teilsequenzen der entsprechenden /3-Casein-Vorläuferproteine bekannt. Lediglich das b-CM-5 wurde bisher peptidsynthetisch hergestellt.
Die erfindungsgemäß synthetisierten Verbindungen dagegen sind neu. Zur Herstellung von Nucleinsäuresequenzen sind verschiedene Verfahren bekannt, so daß Phosphodiester-, das Phosphotriester- und das Phosphitverfahren. Die modernste Spielart des letzteren ist das Phosphoramiditverfahren (H. G. Gassen und A. Lang, Chemical and enzymatic synthesis of gene fragments — a laboratory man ual, Verlag Chemie, Wei η heim 1982). bisher sind jedoch keine in pro-und eukaryotischen Vektoren insertions-, clonierungs- und expressionsfähigen Casomorphingene bekannt.
Das Ziel der Erfindung besteht in der chemischen Synthese von doppelstränigen Oligodesoxyribonucleotiden, die aufgrund ihrer spezifischen Strang-, Code- und Leserastergestaltung in pro- und eukaryotischen Vektoren insertions-, clonierungs- und expressionsfähig sind. Die Expression der Casomorphincodes findet dabei innerhalb von Fusionsproteinen statt.
Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren nach dem entsprechende Oligodesoxyribonucleotidstränge herstellbar sind, die als hybridisierte Doppelstränge aufgrund ihrer spezifischen Strang-, Code- und Leserastergestaltung unmittelbar in pro- und eukaryotischen Vektoren insertions- und clonierungsfähig sind und dort Casomorphinexpressionen codieren. Erfindungsgemäß werden die Oligodesoxyribonucleotidstränge hergestellt durch trägergestützte Phosphoramiditsynthese. Die Hybridisierungen zu insertions-, clonierungs- und expressionsfähigen Casomorphingen-Doppelsträngen werden nach herkömmlichen Techniken durchgeführt. (T. Maniatis et al., Molecular cloning — a laboratory manual. Cold Spring Harbor, 1982 sowie B. Lewin in Gene expression Vol. 2/Wiley Interscience 1980).
Die Auswahl der Casomorphininformations-Tripletts erfolgt nach den Expressionsstrategien der zugrundeliegenden pro- und eukaryotischen Systeme (J. L. Bennetzen et al. J. Biol. Chem.257 [1982] 3026).
Die chemisch synthetisierten Casomorphingene sind aufgrund ihrer cohesiven bzw. glatten Restriktionsschnitte unmittelbar insertions-, clonierungs- und expressionsfähig in pro- und eukaryotischen Vektoren. Abhängig von der Spezifik der jeweiligen Vektoren sichern 0—2 zusätzliche Desoxyribonucleotidpaarungen im Übergang der in Leserichtung initialen Restriktionsschnitte zu den Met-Startcodes die Justierung der Leseraster.
Die den Casomorphininformationen, den eigentlichen Casomorphingenen, vorgeschalteten Met-Start-Informationen gewährleisten die nachträgliche Abspaltung der Casomorphininformationen aus den Fusionsproteinen, die den Casomorphinen nachgeschalteten Stop-Signale die ordnungsgemäßen Terminationen.
Die Freisetzung der Casomorphininformationen aus den (in eukaryotischen Systemen ausgeschleusten) Fusionsproteinen liefert die neuroendocrin, ardiovasculär, cardioton und verbessernd auf die Nahrungsverwertung wirksamen Casomorphinpeptide.
Die direkten chemischen Synthesen dieser in pro- und eukaryotischen Vektoren unmittelbar einbettungs-, clonierungs- und expressionsfähigen Casomorphingene sind — wie die Casomorphingene selbst — neu.
Ausführungsbeispiele
Synthese der beiden Oligodesoxyribonukleotidstränge des h-CM-5-Gens: 28mer: nicht codierender Strang 26mer: codierender Strang
EcoRI Met Tyr Pro Phe VaI GIu Stop CIaI
28mer:5'- AATTC ATG TAC CCG TTC GTT GAA TAA AT-3'
26mer:3'- G TAC ATG GGC ' AAG CAA CTT ATT TAGC-5'
Rsa I
Die Codoauswahl erfolgte entsprechend der natürlichen Codonverwendung in hoch exprimierten E.coli-Genen als Beispiel für ein prokaryotisches Expressionssystem. Die beiden Restriktionsschnitte EcoRI und CIa I ergeben sich aus den Anforderungen des verwendeten prokaryotischen Vektors. Eine Justierung des Leserasters durch zusätzliche spacer-Desoxyribonucleotide wurde nicht benötigt.
Zur Realisierung der vorgegebenen Genstruktur wurden das obige 26er und 28erOligdesoxyribonucleotid synthetisiert. Zur Synthese wurde das Phosphoramiditverfahren an fester Phase in 3'-5'-Richtung gewählt. Der Aufbau der Oligodesoxyribonucleotide fand in einer Reaktionsspritze statt.
Die 2'-Desoxynucleoside wurden nach bekannten Verfahren in 5'-Position dimethoxytrityliert, im Basenteil durch N-Acylierung geschützt und in die 3'-Methyl-morpholino-phosphoramidite überführt. Diese kamen frisch nach Chromatographie an Kieselgel und Fällung (η-Hexan/—780C) zum Einsatz.
Entsprechend Schema I erfolgte der sch rittweise Aufbau bei einer Cyclusdauer von 20-30 min. Als Träger gelängte Fractosil 500 zum Einsatz. Die Fixierung der Startnucleoside erfolgte mit 3-Aminopropyltriethoxysilan und einem Succinylspacer. Es wurde eine Nucleosidbeladung von 40-45,umol/g Träger erreicht.
Ausgegangen wurde von 50-70mg derivatisiertem Träger, entsprechend einer Ansatzgröße von 2-3/xmol. Nach einem Null-Capping und der Detritylierung des Startnucleosids begann die Kettenverlängerung unter Verwendung eines 10fachen Amidit-Überschusses.
Schema 1
1. Waschen
2. Capping
3. Waschen
4. Detritylierung
5. Waschen
6. Kondensation
7. Waschen
8. Oxidation
Gesamtdauer:
Nach Beendigung der Synthese durch letzte Detritylierung und Waschen mit Acetonitril verblieb der Träger mit dem gebundenen Oligodesoxyribonucleotid in der Spritze und wurde im Verlauf von 1 h mitThiophenol/Triethylamin/Dioxan (1/1/2)
entmethyliert. Anschließend wurde sorgfältig mit Methanol und wenig Triethylamin, sodann noch mit Diethylether gewaschen.
Unter Verschluß der Kanüle des Spritzenreaktors wurde unter Zusatz von 1 ml 20%iger NH3-Lösung das Oligodesoxyribonucleotid im Verlauf von 2-3h vom Träger abgespalten. Die Lösung wurde unter Nachspülung mit NH3-Lösung
bis zu einem Gesamtvolumen von 3-4ml in ein Bombenrohr überführt, mit NH3-GaS aufkonzentriert, abgeschmolzen und bei 600C über Nacht belassen. Danach wurde die Lösung in einen Spitzkolben überführt und vorsichtig zur Trockne eingeengt.
Schließlich wurde mit 150μΙ Wasser/50μ\ Methanol aufgenommen, vom evtl. Niederschlag abzentrifugiert und an Kieselgel- , Platten im System i-Propanol/NH3/H2O (55/35/10) über Nacht Chromatographien. Die unter UV-aktive Hauptbande wurde isoliert und mit6-8ml H2Oeluiert. (Konz.-Bestimmung anhand der UV-Absorption).
Das lyophilisierte Material wurde in herkömmlicher Weise mit Jy32P)ATP und T4-Kinase 5'-endmarkiert und in 20%igem PAA-GeI elektrophoretisch aufgetrennt. Die Einheitlichkeit der Proben wurde durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Die reinen 5'-markierten Einzelstränge wurden nach einem modifizierten Maxam-Gilbert-Verfahren an CCS-Papier sequenziert.
Die autoradiograhisch erhaltenen Bandenmuster entsprechen den Erwartungen.
Die Hybridisierung der beiden Stränge zum einbettungsfähigen Gen erfolgte nach herkömmlichen Techniken.
Auf diese Weise wurde beispielsweise das 26mer bei einer Gesamtsynthesedauer von 13 h in einer Gesamtausbeute von 11 % (91,5%Cyclusausbeute) und das28merin 14h mit 3% Gesamtausbeute erhalten.
| 3 x 1,5 ml Acetonitril | 0,5 min |
| DMAP/THF/Collidin 0,2 ml Ac2O/THF | 1 min |
| 3 x 1,0 ml Acetonitril | |
| 2 χ 1,0 ml Dichlorethan | 2 min |
| 3%Trichloressigsäure | |
| 3 x 1,5mlin1,2-Dichlorethan | max. 2 min |
| 3 x 1,5 ml 1,2-Dichlorethan | |
| 6 χ 1-1,5 ml Acetonitril | 2min |
| 0,125 ml Morpholid | |
| !0,5 molar in Acetonitril) | |
| 0,2 ml Tetrazol | |
| ;0,5 molar in Acetonitril) | 10-20 min |
| 2 χ 1,5 ml Acetonitril | 0,5 min |
| 2/Collidin/THF/H2O 0,5-1 ml | 1 min |
| 20-30 min |
Claims (1)
- Erfindungsanspruch:Verfahren zur Herstellung von Oiigodesoxyribonucieotiden zur Casomorphinexpression, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligodesoxyribonucleotidstränge der allgemeinen Formel 1,RestriktionsschnittMet-Casomorphin- Stop-CodesRestriktionsschnittwobei die Restriktionsenzymerkennungsbereiche mit 5'- bzw. 3'-überstehenden cohesiven bzw. glatten Enden für den in Leserichtung (Pfeil) initialen Restruktionsschnitt gegebenenfalls 1-2 zusätzliche Desoxyribonucleotidpaarungen zur
Justierung des Leserasters enthalten, der Met-Code mit ^-ATG-3' a|s Codierung der späterenBrCN-Spaltstellen der Fusionsproteine eingefügt ist, die Casomorphin-Codes durch die folgenden Gensequenzen — einschließlich der infolge Code-Degeneration außerdem verwendungsfähiges Condons — repräsentiert werden:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD29226686A DD250932A1 (de) | 1986-07-08 | 1986-07-08 | Verfahren zur herstellung von oligodesoxyribonucleotiden zur casomorphinexpression |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD29226686A DD250932A1 (de) | 1986-07-08 | 1986-07-08 | Verfahren zur herstellung von oligodesoxyribonucleotiden zur casomorphinexpression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD250932A1 true DD250932A1 (de) | 1987-10-28 |
Family
ID=5580730
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD29226686A DD250932A1 (de) | 1986-07-08 | 1986-07-08 | Verfahren zur herstellung von oligodesoxyribonucleotiden zur casomorphinexpression |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD250932A1 (de) |
-
1986
- 1986-07-08 DD DD29226686A patent/DD250932A1/de not_active IP Right Cessation
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