DD263994A1 - Verfahren zur herstellung von oligodesoxyribonucleotiden zur splenopentinexpression - Google Patents
Verfahren zur herstellung von oligodesoxyribonucleotiden zur splenopentinexpression Download PDFInfo
- Publication number
- DD263994A1 DD263994A1 DD30479287A DD30479287A DD263994A1 DD 263994 A1 DD263994 A1 DD 263994A1 DD 30479287 A DD30479287 A DD 30479287A DD 30479287 A DD30479287 A DD 30479287A DD 263994 A1 DD263994 A1 DD 263994A1
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- expression
- prokaryotic
- splenopentin
- tac
- atg
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 3
- DRCNRVYVCHHIJP-AQBORDMYSA-N Arg-Lys-Glu-Val-Tyr Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 DRCNRVYVCHHIJP-AQBORDMYSA-N 0.000 abstract description 19
- 108010032486 splenopentin Proteins 0.000 abstract description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 abstract description 3
- IBXNCJKFFQIKKY-UHFFFAOYSA-N 1-pentyne Chemical compound CCCC#C IBXNCJKFFQIKKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 3
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KYVBNYUBXIEUFW-UHFFFAOYSA-N 1,1,3,3-tetramethylguanidine Chemical compound CN(C)C(=N)N(C)C KYVBNYUBXIEUFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSGYTJNNHPZFKR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropanenitrile Chemical compound OCCC#N WSGYTJNNHPZFKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- PAMDBWYMLWOELY-SDDRHHMPSA-N Lys-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O PAMDBWYMLWOELY-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N Met-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 230000006181 N-acylation Effects 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710195641 Splenin Proteins 0.000 description 1
- 102400000159 Thymopoietin Human genes 0.000 description 1
- MLKWIQODPVLVLN-SHVFRELUSA-N ac1q1oa8 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CN)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 MLKWIQODPVLVLN-SHVFRELUSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004202 aminomethyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000012011 nucleophilic catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligodesoxyribonucleotiden der allgemeinen Formel 1, die in pro- und eukaryotischen Vektoren insertions- und clonierungsfaehig sind sowie die Expression von Splenopentinen sowohl in pro- als auch in eukaryotischen Systemen codieren. 1 Oligodesoxyribonucleotid-Doppelstraenge:Erfindungsgemaess werden die neuen doppelstraengigen Oligodesoxyribonucleotide mit Splenopentininformation erhalten durch eine traegergestuetzte Phosphotriestersynthese des codierenden und nichtcodierenden Oligodesoxyribonucleotidstrangs und ihre anschliessende Hybridisierung zu in pro- und eukaryotischen Vektoren unmittelbar insertions-, clonierungs- und innerhalb von Fusionsproteininformationen in pro- und eukaryotischen Systemen expressionsfaehigen Splenopentingenen. Splenopentine sind immunomodulatorisch wirksam.
Description
wobei die Restriktionsenzymerkennungsbereiche mit 5'-bzw. 3'-überstehenden cohesiven bzw. glatten Enden für den in Leserichtung (Pfeil) initialen Restriktionsschritt gegebenenfalls 1 bis 2 zusätzliche Desoxyribonucleotidpaarungen zur Justierung des Leserasters enthalten, der Met-Code mit
als Codierung der späteren BrCN-Spaltstellen der Fusionsproteine eingefügt ist, die Splenopentincodierungen — einschließlich der infolge Code-Degeneration außerdem verwendungsfähigen Codons — durch die folgenden Sequenzen repräsentiert werden:
Splenopentin (SP-5) Arg-Lys-Glu-Val-Tyr
Prokaryoten-Expression (E. coli) 5'-CGT-AAA-GAA-GtA-TAC-S'
3'-GCA-TTT-CTT-CAT-ATg-B' Eukaryoten-Expression (Hefe) 5'-AGA-AAG-GAA-GTT-TAc-S'
3'-TCT-TTC-CTt-CAA-ATG-B' Pro2-Splenopentin (Pro?-SP-5-) Arg-Pro-Glu-Val-Tyr
Prokaryoten-Expression (E. coli)
3'-GCA-GGC-CTt-CAT-ATG-B' Eukaryoten-Expression (Hefe) 5'-AGA-CCA-GAA-GTT-TAc-S'
3'-TCT-GGT-CTT-CAA-ATg-S' Pentin (I) Arg-Pro-Gln-Val-Tyr
Prokaryoten-Expression (E. coli) B'-CGT-CCG-CAG-GTA-TAC-S'
3'-GCA-GGC-GTC-CAt-ATG-B'
Eukaryoten-Expression (Hefe) B'-AGA-CCA-CAA-GTT-TAC-S'
3'-TCT-GGT-GTt-CAA-ATG-B'
Pentin (II) Arg-Pro-Gln-Pro-Tyr
Prokaryoten-Expression (E. coli) B'-CGT-CCG-CAG-CCG-TAC-S'
3'-AGA-CCA-CAa-CCA-TAC-S'
Eukaryoten-Expression (Hefe) B'-AGA-CCA-CAA-CCA-TAC-S'
3'-TCT-GGT-GTTGGT-ATg-B'
Pentin (III) Glu-Pro-Gln-Va!-Tyr
Prokaryoten-Expression (E. coli) S'-GAA-CCA-CAG-GTA-TAC-S'
3'-CCT-GGc-GTC-CAT-ATG-B'
Eukaryoten-Expression (Hefe) B'-GAA-CCA-CAA-GTT-TAC-S'
3'-CCT-GGT-GTt-CAA-ATG-B'
und alsStop-Codierungen 1-2 Condons der folgenden drei Tripletts Verwendung finden:
3'-ATTATCACT-B'
durch trägergestützte Phosphotriestersynthesen hergestellt und anschließend hybridisiert werden.
Die Erfindung betrifft ein Verführen zur Herstellung von Oligodesoxyribonucleotiden der allgemeinen Formel 1, die in pro- und eukaryotischen Vektoren insertions- und clonierungsfähig sind und die Expression von Splenopentinen codieren.
1 Oligodeeoxyribonucleotid-Dojppeletränge:
| Re8trikt:Lone- schnitt | Mat- Spleinopentin- I etop- - Codierung | Reetriktione- echnitt |
Pfail; Läserichtung ———— Splenopentine sind irnmunomodulatorisch wirksam.
Charakteristik der bekannten technis :hen Lösungen
Splenopentin-Typ Peptide sind bisher nur als Teilsequerizen des entsprechenden Vorläuferproteinr. Splenin (T. Audhya et öl.,
Biochemistry 20 (1981) 6195) bzw. als Strukturanaloge bekannt. Splenopeniin-5 (SP-5) (W. Diezel et al., Biomed. B'ochim. Acta 43 (1984 K9) wurde neban einer Reihe von Strukturanalogen bisher peptidsynthetisch dargestellt. Nurdie Gensequenz des Thymopentin-5 wurde bisher in einer von der spezifischen Expression innerhalb eines Fusionsproteins abweichenden Tandom-Oligomer-Va riante formuliert (C. Russells et al. DE 3102 721A1 vom 28.1.1981). Eine direkte chemische Synthese von Splenopentingenen so /vie die Gene selbst sind bisher nicht bekannt. Zur Herstellung von Nucleinsäuresecuenwn sind verschiedene Verfahren bekannt, so das Phosphordiester-, das Phosphotriester- und das Phosphora nidilverfahren (HG<. Gassen und A. Lang, Chemical and enzymatic synthesis of gene fragments — a laboratory manual, V<rlag Chemie, Weinheim 1982).
Ziel dei' Erfindung
Das Ziel der Erfindung besteht in der chemischen Synthese von doppelsträngigen Oligodesoxyribonucleotiden, die aufgrund ihrer spezifischen Strang-, Code- und Leserastergestaltiing in pro- und eukaryotischen Vektoren insertions- und clonierungssowie in pro- und eukaryotischen Wirtssystemen expreusionsfähig für Splenopentine sind.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren, nach dem entsprechende Oligodesoxyribonucieotidstränge herstellbar sind, die als hybrid vierte Doppelstränge die Expression von Splenopentinen codieren.
Erfindungsgemäß werden die Oiigodesoxyribonucleotidstränge der allgemeinen Formel 1 mit:
Restriktionsschritt:
Met-Codierung:
Restrlktionsenzymerkennungsbereiche mit 5'- bzw. 3'-überstehenden cohesiven bzw. glatten Enden, für Jen in Leserichtung initialen Restriktionsschritt gegebenenfalls unter Einbeziehung von 1 bis 2 zusätzlichen Desoxyribonucleotidpaaren zur Justierung des Leserasters. 5'-ATG-3' als Codierung der späteren 3'-TAC-5' 8rCN-Spaltstelle der Fusionsproieine
Splenopsntin der allgemeinen Formel A-B-C-D-Tyr
Peptid
| Splenopontin (Sp-5) | Arg | Arg-Lys-Glu-Val-Tyr | Lys | GIu |
| Pro2-Splenopentin | Arg | Pro | GIu | |
| (Pro2-SP-5) | ||||
| Pentin(l) | Arg | Pro | GIn | |
| Pentin(ll) | Arg | Pro | GIn | |
| Pentin(lll) | GIu | Pro | GIn | |
| Splenopentin-Codierungen: | ||||
| Splenopentin(Sp-5) |
VaI VaI
VaI Pro VaI
Prokaryoton-Expression (E. coli) Eukaryoten-Expression (Hefe) Pro2-Splenopentin (Pro2-Sp-5)
Prokaryoten-Expression (E. coli) Eukaryoten-Expression (Hefe) Pentin(l)
5'-CGT-AAa-GAA-GTA-TAC-S' 3'· GCA-TTT-CTT-CAT-ATG-B' 5'-AGA-AAG-GAA-GTT-TAc-S' 3'-TCT-TTC-CTT-CAa-ATG-B' Arg -Pro-Glu-Val-Tyr
5'-CGT-CCG-GAA-GTa-TAC-S' 3'-GCA-GGC-CTT-CAT-ATg-B' 5'-AGA-CCA-GAA-GtT-TAC-S' 3-TCT-GGT-CTT-CAa-ATG-B' Arg-Pro-Gln-Val-Tyr
Prokaryoten-Expression (E. coli) Eukaryoten-Expression (Hefe) Pentin(ll)
5'-CGT-CCG-CAG-GTA-TAc-S' 3'-GCA-GGC-GTC-CAt-ATG-B' B'-AGA-CCA-CAA-GTT-TAC-S' 3'-TCT-GGt-GTT-CAA-ATG-S' Arg-Pro-Gln-Pro-Tyr
Prokaryoten-Expression (E. coli) Eukaroyten-Expression (Hefe) Pentin(lll)
5'-CGT-CCG-CAG-CCG-TAc-S' 3'-GCA-GGc-GTC-GGC-ATG-B' B'-AGA-CCA-CAA-CCA-TAC-S' 3'-TCT-GGT-GTT-GGt-ATG-B' Glu-Pro-Gln-Val-Tyr
Prokaryoten-Expression (E. coli)
Eukaryoten-Expression (Hefe)
5'-GAA-CCG-CAG-GTA-TAc-S'
3'-CTT-GGC-GTC-CAt-ATG-B'
5'-GAA-CCA-CAA-GTt-TAC-S'
3'-CTT-GGT-GTt-CAA-ATG-B' Stop-Codierungen: 5'-TAA TAG TGA-3' Verwendung von 3'-ATT-ATC-ACT-B' 1-2Tripletts
sowie sämtliche Splenopentin-Codierungen einschließlich der infolge Code-Degeneration anstelle der oben aufgeführten Tripletts verwendungsfähigen Codierungen hergestellt durch eine trägergestützte Phosphotriestersynthese. Die Hybridisierungen zu insertions-, clcnierungs- und expressionsfähigen Splenopentin-Doppelsträngen werden nach herkömmlichen Techniken durchgeführt (T. Maniatis et al.. Molecular cloning — a laboratory manual, Cold Spring Harbor, 1982, sowie B.Lewin in gene expression Vol.2/Wiley lnterscience 1980).
Die Auswahl der Splenopentin-Informations-Tripletts erfolgte nach den Expressionsstrategien der zugrundeliegenden pro- und eukaryotischen Systeme (J. L Bennetzen et al., Biol. Chem. 257 [1982] 3026) sowie nach den Erfordernissen zusätzlicher Restriktionserkennungen für Restriktionskartierungen der Insertionen und Cionierungen.
Die chemisch synthetisierten Splenopentingene sind aufgrund ihrer cohesiven bzw. glatten Restriktionsschnitte unmittelbar insertions-, clonierungs- und expressionsfähig in pro- und eukaryotischen Systemen. Abhängig von der Spezifik der jeweiligen Vektoren sichern 0-2 zusätzliche Desoxyribonucleotidpaarungen im Übergang der in Loserichtung initialen Restriktionsschritte zu den Met-Startcodes die Justierung der Leseraster.
Die den Splenopentininformationen, den eigentlichen Splenopentingenen, vorgeschalteten Met-Start-Informationen gewährleisten die nachträgliche Abspaltung der Splenopentininformationen aus den Fusionsproteinen, die den Splenopentingenen nachgeschalteten Stop-Signale die ordnungsgemäße Termination.
Die Freisetzung der Splenopentininformationen aus den aus pro- und eukaryotischen Systemen ausgeschleusten Fusionsproteinen liefert die immunomodulatorisch wirksamen Splenopentine.
Die direkte chemische Synthese dieser in pro- und eukaryotischen Systemen unmittelbar insertions-, clonierungs- und expressionsfähigen Splenopentingene ist — wie die. Splenopentingene selbst — neu.
Synthese des Splenopentin (Sp-5)-Gens 28mer: nichtcodiorender Strang 26mer: codierender Strang
1) 28mer 5'-AATTC ATG CGT AAA GAA GTA TAC TAA AT -3'
2) 26mer 31- G TAC GCA TTT CTT CAT ATG ATT TAGC-5'
L Accil Sn a I
Zur Realisierung der vorgegebenen Genstruktur wurde ein 26- und ein 28mer Oligodesoxyribonucleotid synthetisiert. Zur Synthese wurde ein modifiziertes Phosphotriesterverfahren an fester Phase in 5'-3'-Richtung gewählt.
Der Kettenaufbau erfolc^e in Einzelschritten in einer manuell betriebenen geschlossenen Apparatur.
Die entsprechenden 2'-Desoxyribonucleotide wurden nach bekanntem Verfahren im Basenteil durch N-Acylierung geschützt und am Zucker in δ'-Ροελίοη dimethoxytrityliert. Die Phosphorylierung der 3'-OH-Gruppe erfolgte mit p-Chlorphenylphosphorditriazolid zu dem entsprechenden Monotriazolid und mit 2-Cyanoethanol zum voll geschützten Desoxyribonucleosid-S'-monophosphorsäuretriester. Danach erfolgte eine Säurespaltung der 4,4'-Dimethoxytritylschutzgruppe vom 5'-Ende. Diese Verbindungen kamen nach der Chromatographie an Kieselgel zum Einsatz.
Als Endbaustein diente ein basenges-;hütztes und 3'-acetyliertes Nucleosid.
Entsprechend Schema 1 erfolgte ein schrittweiser Aufbau bei einer Cyclusdauer von 20-22 min.
Als Träger diente ein 12% auf Teflon gepfropftes Polystyren, welcher mit einer Aminomethy!gruppe versehen wurde. Die Aminogruppenbestimmung erfolgte mittels Pikrinsäuretitration. Sie lag in unserem Fall bei 170μητιοΙ -NH2/g Träger. Als Spacer diente die Bernsteinsäure. Die Beladung des Trägers erfolgte mit 5'-Succinyl-nucleosid-3'-p-chlorphenyl-2-cyanoethylphosphorsäuretriester in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Es wurde eine Nucleotidbeladung im Fall 1) von 76μπιοΙ dAp/g (bei 20mg Trägereinsatz = 1.5μπιοΙ) und bei 2) von ΘΟμιποΙ dCp/g (bei einem Trägereinsatz von 1,2μιτιοΙ) erreicht. Ausgegangen wurde von 20mg derivatisiertem Träger. Es wurde mit einem 10fachen Überschuß Nucleotidkomponente
It- If
in absolutem Pyridin, einem 30fachen Überschuß Kondensationsmittel (Triisopropylbenzertsulfonylchlorid TIPS) und einem SOfachen Überschuß an nucleophilem Katalysator 1-Methylimidazol (MeIm) gearbeitet (bezogen auf die Nucleotidbeladung des Trägers). Nach der Überführung des Trägers in den Reaktor erfolgte zur Blockierung der noch freien NH2-Gruppen eine „Null-Kondensation" mit TIPS/1-Methylimidazol (10:30) in 10min.
Schema 1
Operation
Reagenz
Zeit
1. Trocknen des Trägers
2. Abspaltung der CNEt-Schutzgruppe
3. Waschen
4. Kondensation
5. Waschen
Pyridin
0,1 m Tetramethylguanidin in abs. Pyridin
abs. Pyridin
Kupplungsmischung b) in abs. Pyridin
Pyridin
a)
1-2 min
a)
12-15 min
a)
a) Die Waschvorgänge sind beendet, wenn die relative Leitfähigkeit den Endwert des abs. Pyridine erreicht hat.
b) Die Kupplungsmixture besteht aus einer Mischung von 10 äquiv. der getrockneten Nucleotidkomponente, Zusatz von 30 fiquiv. TIPS und 90 äquiv. von 1-Methylimidazol in abs. Pyridin (0,1-0,15molar) bezogen auf die Erstbeladung des Trägers.
Nach der Beendigung der Synthese und Waschen mit Ether wurde der Träger in ein verschraubbares Bombenrohr überführt, mit 30%igem NH4OH + 10% Pyridin versetzt und über Nacht bei 5O0C erwärmt. Nach dem Filtrieren und Waschen mit Pyridin wurde vorsichtig zur Trocknung eingeengt. Die Menge an Rohprodukt wurde UV-spektroskopisch bestimmt. Sie betrug beim 28mer 295 O. D. E. und beim 26mer 240 O. D E. Ein Teil dieser Rohprodukte (Viο der Gesamtmenge) wurde an einem 20%igen denaturierten Polyacrylamidgel gereinigt (20 χ 40 χ 0,3 cm). Als Marker dienten XC, BPB und entsprechende Referenzsubstanzen. Die längsten UV-aktiven Banden wurden zugeschnitten, zermörsert und mit Wasser versetzt. Nach etwa 5 h bei 5O0C Inkubation wurde von) Polyacrylamid abzentrifugiert und der klare Überstand an DEAE-Sephacel entsalzt. Nach Waschen mit Wasser, 0,1 m TEAB v/urde das entsprechende Oligodesoxyribonucleotid mit 1 m TEAB-I ösung von der Säule eluiert und vorsichtig unter Zugabe von Pyridin eingeengt. Das gereinigte Endprodukt wurde UV-spektroskopisch vermessen. Zur Beweisführung erfolgte nach 5'-Markierung eine Autoradiographie der beiden Einzelstränge mit nachfolgender Sequenzierung an CCS-Papier (A. Rosenthal et al.. Nucleic Acids Res. 13 (1985] 1173). Weiterhin wurden die Restriktionsorte durch Ligation der hybridisierten Stränge über die EcoRI- und Cial-Orte und entsprechende Rückspaltungen unter zusätzlicher Verwendung der Accl-Schnitte überprüft.
Die Hybridisierung selbst wurde nach Maniatis et al. (T. Maniatis) et al.. Molecular cloning — a laboratory manual. Cold Spring Harbor, 1982) durchgeführt.
Die Ausbeuten betrugen beim 28mer nach der Polyacrylamidgeireinigung 23,9% = 94,8%/Stufe und beim 26mer 16,7% = 93,1 %/Stufe.
Abkürzungen: Xylencyanol (XC)
Bromphenolblau (BPB)
Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung von Oligodesoxyribonucleotiden zur Splenopentinexpression, dadurch ,. gekennzeichnet, daß die Oligodesoxyribonucleotidstränge der allgemeinen Formel 1RestriktlonssohnlttMet-Splenopentln-Oodierungatop-Eeetriktionssohnitt
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30479287A DD263994A1 (de) | 1987-07-09 | 1987-07-09 | Verfahren zur herstellung von oligodesoxyribonucleotiden zur splenopentinexpression |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD30479287A DD263994A1 (de) | 1987-07-09 | 1987-07-09 | Verfahren zur herstellung von oligodesoxyribonucleotiden zur splenopentinexpression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD263994A1 true DD263994A1 (de) | 1989-01-18 |
Family
ID=5590614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD30479287A DD263994A1 (de) | 1987-07-09 | 1987-07-09 | Verfahren zur herstellung von oligodesoxyribonucleotiden zur splenopentinexpression |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD263994A1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0445581A1 (de) * | 1990-03-06 | 1991-09-11 | Berlin-Chemie Ag | Parenteral applizierbares lagerbeständiges immunstimulierendes Präparat, Verfahren zu seiner Herstellung und dessen Verwendung |
| EP0517464A1 (de) * | 1991-06-03 | 1992-12-09 | Immunobiology Research Institute, Inc. | Peptide zur Steuerung des Immunsystems und des Nervensystems |
-
1987
- 1987-07-09 DD DD30479287A patent/DD263994A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0445581A1 (de) * | 1990-03-06 | 1991-09-11 | Berlin-Chemie Ag | Parenteral applizierbares lagerbeständiges immunstimulierendes Präparat, Verfahren zu seiner Herstellung und dessen Verwendung |
| EP0517464A1 (de) * | 1991-06-03 | 1992-12-09 | Immunobiology Research Institute, Inc. | Peptide zur Steuerung des Immunsystems und des Nervensystems |
| WO1992021366A1 (en) * | 1991-06-03 | 1992-12-10 | Immunobiology Research Institute, Inc. | Immunoregulatory and neuroregulatory pentapeptides |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3111405C2 (de) | ||
| EP0171024B1 (de) | Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Hirudinen und Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens | |
| EP0519463B1 (de) | Synthetische katalytische Oligonukleotide | |
| EP0211299B1 (de) | Fusionsproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
| EP0161504B1 (de) | Herstellung von Polypeptiden mit Human-Gammainterferon-Aktivität | |
| DE2848052A1 (de) | Synthetische dna und verfahren zu ihrer herstellung | |
| DE2848051A1 (de) | Synthetische dna und verfahren zu ihrer herstellung | |
| DE19947456A1 (de) | C-Peptid zur verbesserten Herstellung von Insulin und Insulinanaloga | |
| EP0115613B1 (de) | DNA-Sequenzen, deren Herstellung, diese Sequenzen enthaltende Plasmide und deren Verwendung zur Synthese eukaryotischer Genprodukte in Prokaryoten | |
| EP0163249B1 (de) | Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Human-Interleukin-2 und Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens | |
| DE69733150T2 (de) | Verfahren zur herstellung von nukleotiden oder oligonukleotiden phosphoramitiden | |
| EP0133282B1 (de) | Herstellung von Polypeptiden mit einem Säureamid-Carboxyterminus | |
| EP0219781A2 (de) | Biologisch aktive Derivate des Human-gamma-Interferons, ihre Herstellung und Arzneimittel, die solche Derivate enthalten | |
| DD263994A1 (de) | Verfahren zur herstellung von oligodesoxyribonucleotiden zur splenopentinexpression | |
| EP0292763A2 (de) | Gentechnologisches Verfahren zur Herstellung von Angiogeninen | |
| DE3544459C2 (de) | Verfahren zum Synthetisieren von langkettiger Desoxyribonucleinsäure (DNA) | |
| DE69613971T2 (de) | Oligonukelotide mit transversalkovalenter bindung, verfahren zu ihrer herstellung und darin benutztes synthon | |
| EP0173149B1 (de) | Synthetische Regulationsregion | |
| DE3436818A1 (de) | Synthetische signalsequenz zum transport von proteinen in expressionssystemen | |
| DE3781865T2 (de) | Klonierung von dns, welche einen menschlichen gip-vorlaeufer kodiert und expressionsverfahren des vorlaeufers. | |
| EP0136472A1 (de) | Herstellung von Sekretin | |
| DD250932A1 (de) | Verfahren zur herstellung von oligodesoxyribonucleotiden zur casomorphinexpression | |
| DE3490055T1 (de) | Menschliches Leukozyteninterferon N und Verfahren zu dessen Herstellung in Bakterienzellen | |
| DE68915841T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Epidermal-Wachstumsfaktor durch genetische Transformation. | |
| DE69001296T2 (de) | Verfahren zur reinigung von spezifischen oligonukleotiden. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |