DD251158A1

DD251158A1 - Verfahren zur herstellung von streptokokken-vektorplasmiden mit polylinker

Info

Publication number: DD251158A1
Application number: DD29256886A
Authority: DD
Inventors: Frank Laplace; Christian Klessen; Horst Malke
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1986-07-17
Filing date: 1986-07-17
Publication date: 1987-11-04

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Streptokokken-Vektorplasmiden. Sie verfolgt das Ziel, insbesondere neue Streptokokken-Vektorplasmide mit Polylinker fuer die Belange der Gentechnologie bereitzustellen. Die dieser Zielstellung zugeordnete Aufgabe wird geloest, indem man- zunaechst Plasmid pSM6, eine Deletionsmutante des bekannten Streptokokken-Vektorplasmids pSM7, mit dem E.-coli-Plasmid pUC18, Traeger eines Polylinkers mit 8 pSM6-fremden singulaeren Restriktase-Spaltorten, zu den neuen chimaeren Plasmiden pLKM618 und pLKM619 (Molekuelgroesse je 8,3 kb) fusioniert sowie-anschliessend diese Zwischenplasmide durch Heraustrennen des pUC18-Rumpfes unter Selbstligation in die neuen, Polylinker-tragenden Streptokokken-Vektorplasmide pLKM6181 und pLKM6191 (Molekuelgroesse je 5,9 kb) umwandelt.Die verfahrensgemaess erhaltenen Vektorplasmide pLKM6181 und pLKM6191 verfuegen je ueber eine modifizierten Polylinker mit 9 pSM6-fremden singulaeren Restriktase-Spaltorten.

Description

Hierzu 4 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Streptokokken-Vektorplasmiden, die einen Poly linker tragen und vorteilhaft zur Klonierung von Fremdgenen in Streptokokken herangezogen werden können.

Die Erfindung bietet Anwendungsmöglickeiten in der Gentechnologie sowie auf anderen Gebieten der Molekularbiologie und nachgelagert damit vor allem in der pharmazeutisch-biotechnologischen Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bekannt ist das Streptokokken-Vektorplasmid pSM7 (H. Malke, FEMS Microbiol. Lett. 11,1981, S. 27-30). Dieses Plasmid ist

— durch eine Molekülgröße von 6,4kb,

— durch singuläre Spaltorte für die Restriktasen EcoRI, Aval, Avail, Kpnl und Pvull sowie

— durch das Vorhandensein eines Resistenzmarkers für die Erythromycin- und die Lincomycinresistenz (Em-Lm^R) charakterisiert.

Daneben verfügt das Plasmid pSM 7 jedoch auch über Eigenschaften, die bei seinem Einsatz als Plasmidvektor in gentechnischen Konstruktionen nachteilig zu Buche schlagen. Insbesondere besitzt dieses Plasmid keine Spaltorte für so gebräuchliche Restriktionsenzyme wie Pstl, BamHI, Sail und Smal.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, neue Streptokokken-Vektorplasmide mit Polylinker für die Belange der Gentechnologie bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe unter Rückgriff auf eine Deletionsmutante des Streptokokken-Plasmids pSM7 durch aufeinanderfolgend ausgeführte Komplexe gentechnologischer Verfahrensschritte neue Streptokokken-Vektorplasmide mit Polylinker erzeugt werden sollen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe wie folgt gelöst:

Ausgehend von dem literaturbekannten Streptokokken-Plasmid pSM7 wurde in an sich bekannter Weise eine spontane Delionsmutante isoliert, die als Streptokokken-Vektorplasmid pSM6 (vgl. Abb. 1) bezeichnet wurde. Dieses Plasmid pSM6trägt der in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, DDR-6900 Jena, Beutenbergstraße 11, unter der Registriernummer ZIMET 11181 als biologisch reine Kultur hinterlegte Stamm Streptococcus sanguis Challis 6 (pSM6) in sich.

Das Plasmid pSM 6 ist durch eine Molekülgröße von 5,6kb charakterisiert, ansonsten verfügt es über die Eigenschaften von Plasmid pSM7.

Benötigte Mengen an pSM 6-DNS werden vorzugsweise in der Weise gewonnen, daß aus einer Kultur von S. sanguis ZIMET 11181 das Plasmid in an sich bekannter Weise isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst wird.

Aus so bereitgestellten Proben von DNS des Plamids pSM 6 wird durch Öffnen mit dem Restriktionsenzym EcoRI die linearisierte Form des Plasmids erhalten.

Weiterhin werden benötigte Mengen des an sich bekannten E. coli-Plasmids pUC 18 (vgl. Abb. 2), das charakterisiert ist

— durch eine Molekülgröße von 2,7kb

— durch das Vorhandensein eines Polylinkers für die singulären Spaltorte der Restriktasen Hindill, Pstl, Sphl, Sail, Accl, Hincll, Xbal, BamHI, Xmal, Smal, Kpnl, Sstl und EcoRI, darunter also durch das Vorhandensein von 8 pSM 6-fremden singulären Restriktase-Spaltorten,

sowie weiterhin

— durch das Vorhandensein von 10 Spaltorten für die Restriktase Haelll und

— durch das Vorhandensein eines Resistenzmarkersfürdie Ampicillin-Resistenz,

in an sich bekannter Weise aus dem E. coli-Stamm JM101 (pUC18) isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst. Aus so bereitgestellten Proben von DNS des Plasmids pUC18 wird durch Öffnen mit dem Restriktionsenzym EcoRI die lineare Form des Plasmids pUC 18 erhalten.

Die so präparierten linearisierten Formen der Plasmide pSM 6 und pUC 18 werden mittels Ligation überdieEcoRI-Spaltortezu den neuen chimären Plasmiden pLKM618 bzw. pLKM619 geschlossen, die anschließend zur Transformation von Escherichia coliHb101 herangezogen werden.

DieZwischenplasmidepLKM618und pLKM619weisen eine Molekülgröße von je 8,3kb auf und sind gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit, sowohl in Streptokokken- als auch in Escherichia coli-Stämmen funktions- und replikationsfähig zu sein. Die Plasmide pLKM 618 und pLKM 619 tragen bereits die Sequenz des Polylinkers.

Beide Plasmide unterscheiden sich hinsichtlich der Insertionsrichtung der pUC 18-Komponente voneinander. Bei Plasmid pLKM 618 ist der pUC 18-Anteil so in die pSM 6-Komponente eingefügt, daß der Pstl-Spaltort des Polylinkers näher am Avall-Spaltort von pSM 6 liegt, während bei Plasmid pLKM 619 diese Einfügung in der Weise vorliegt, daß der Pstl-Spaltort des Polylinkers näher am Pvull-Spaltort von pSM6 liegt (vgl. Abb.3).

Aus dem bei obiger Ligation anfallenden Reaktionsgemisch werden die chimären Plasmide in der Weise abgetrennt, daß mit Proben dieses Gemisches Kulturen eines E. coli-Rezipientenstammes, vorzugsweise Kulturen von E. coli Hb 101, transformiert werden und auf der Basis der resultierenden Amp^R Em^R-Transformanten ein screening nach DNS-Molekülen der Größe 8,3kb durchgeführt wird. Über eine anschließende Restriktionsanalyse werden unter den (den einzelnen Transformantenstämmen eindeutig zugeordneten) DNS-Portionen der Größe 8,3 kb diejenigen ermittelt, die dem Plasmid pLKM618 oder dem Plasmid pLKM 619 zugeordnet sind. Auf diesem Wege können unter den Transformantenkionen eindeutig solche, die vom Typ E. coli ,Hb 101 (pLKM618) sind, von jenen abgetrennt werden, die vom Typ E. coli Hb 101 (pLKM619) sind. Ausreichende Mengen an pLKM618-DNS und pLKM619-DNS, wie sie für die anschließenden Teile des vorliegenden Verfahrens zur Herstellung von Streptokokken-Vektorplasmiden mit Polylinker benötigt werden, werden auf an sich bekannte Weise aus den E. coli-Stämmen Hb101 (pLKM618)undHb101 (pLKM 619) isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst.

Die so gewonnene DNS der Plasmide pLKM618und pLKM619wird nun anschließend mit der Restriktase Haelll gespalten. Man erhält auf diese Weise von jedem der Plasmide 10 lineare DNA-Fragmente. Die größten dieser Fragmente sind durch eine Molekülgröße von je 5,9kb charakterisiert. Sie bestehen aus dem vollständigen Plasmid pSM6 mit dem Resistenzmarker für Em-Lm" und einem 260 bp-großen Anteil des Plasmids pUC 18. Der 260bp-große Anteil dieses Fragments trägt die Polylinkersequenz aus dem Plasmid pUC18.

Mit Hilfe des an sich bekannten Verfahrens der Agarose-Gelelektrophorese wird das 5,9kb-große Fragment des Plasmids pLKM618von den übrigen neun Haelll-Fragmenten getrennt, isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst. Auf gleiche Weise wird das 5,9 kb-große Fragment von Plasmid pLKM 619 gewonnen.

Die so präparierten linearen 5,9kb-großen Hauptfragmente von Plasmid pLKM618 und Plasmid pLKM 619 werden mittels blunt end-Selbstligation unter Wiederherstellung des Haelll-Spaltortes zu den neuen Plasmiden pLKM6181 und pLKM6191 geschlossen. Anschließend werden mit diesen Plasmiden Zellen von Stamm Str. sanguis Challis 6 transformiert. Die neuen Streptokokken-Vektorplasmide pLKM6181 und pLKM6191 sind charakterisiert (vgl. Abb.4)

— durch das Vorhandensein eines Resistenzmarkers für die Erythromycin- und Lincomycinresistenz (Em-Lm^R) sowie

— durch das Vorliegen eines modifizierten Polylinkers mit singulären Spaltorten für die nunmehr 9 Restriktasen Haelll, Sphl, Pstl, Sail, Xbal, BamHI, Smal, Xmal und Sstl.

Beide Plasmide unterscheiden sich voneinander durch die Insertionsrichtung des Polylinkers. Während bei pLKM6181 der Pstl-Spaltort des Polylinkers näher zum Avall-Spaltort liegt, ist der Pstl-Spaltort des Polylinkers bei Plasmid pLKM 6191 näher zum Pvull-Spaltort gelegen.

Mit den neuen. Polylinker tragenden Plasmiden pLKM6181 und pLKM6191 stehen für gram-positive Bakterien der Gattung Streptococcus zwei primäre, strukturoptimierte Klonierungsvektoren als Trägerreplica für anschließende gentechnologische Projekte zur Verfügung. Besonders vorteilhaft lassen sich die neuen Plasmide pLKM6181 und pLKM6191 für die Konstruktion von Expressionsvektoren für Streptokokken einsetzen, was durch die Anhäufung zusätzlicher singulärer Spaltorte, darunter so gebräuchlicher wie BamHI, Pstl, Sail, Haelll und Smal, ermöglicht wird.

Ausführungsbeispiel

1 a) Gewinnung derZwischenplasmide pLKM618 und pLKM619

DNS des Plasmids pSM 6 wird aus Zellen des Stammes ZIMET11181 in der folgenden Weise gewonnen:

500ml einer Übernachtkultur dieses Stammes, die in BHI-Medium mit 2 M Glukose, 0,5 M D-L-Threonin, 2,5% Pferdeserum und oyxg/ml Erythromycin gezüchtet wurde, werden 15 Minuten bei 6000U/min zentrifugiert. Diesedimentierten Zellen werden mit 5OmMTHsHCI (pH8,2) gewaschen und anschließend in 50ml desselben Puffers resuspendiert. Nach Zugabe einer Lysozymlösung (100mg Lysozym in 5ml 5OmM TrisHCI, pH8,2) wird 90 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Danach werden die Zellen abzentrifugiert und in 16ml 5OmM TrisHCI resuspendiert. Anschließend werden 20mg Pronase in 2ml TrisHCI zugegeben, und es wird 10 Minuten bei 37⁰C inkubiert.

Die Zellyse erfolgt durch Zugabe von 2 ml einer 10%igenSDS-Lösung. Danach wird der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 1 M NaOH auf 12,1 eingestellt, wodurch die Denaturierung derchromosomalen DNS erreicht wird. Anschließend erfolgt durch ιλΙμμ>ΙΙ/ι 7,,„,k» ™„n,1M TricUri.l Acnnn oin nU.ohlf» auf O G

Nach der Zugabe von 0,6g kristallinem NaCI folgen schließlich zur Deproteinisierung je eine Extraktion mit einem Volumen NaCI-gesättigtem Phenol und Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (24:1). Anschließend wird die DNS-Lösung mit0,1 Volumenteilen einer 3Μ Na-acetat-Lösung und 2 Volumenteilen 96%igem Alkohol bei -20⁰C gefällt, sedimentiert und getrocknet. Die DNS wird zuletzt in 5ml TES-Puffer aufgenommen. Zur Abtrennung und Reinigung der Plasmid-DNS von kontaminierender chromosomaler DNS wird in an sich bekannter Weise eine Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation ausgeführt. Schließlich liegt die gereinigte zirkuläre Plasmid-DNS in einer Lösung in 10mMTrisHCI,pH7,5, vor und wird bei +4"C aufbewahrt.

Parallel hierzu wird DNS des Plasmids pUC 18 aus Zellen des Stammes Escherichia coli JM 101 (pUC18) in der folgenden Weise gewonnen:

500 ml einer Übernachtkultur von E. coli J M101 (pUC18), die in LB-Medium mitiOOjug ml"' Ampicillin gezüchtet wurde, werden 15 Minuten bei 6000U/min zentrifugiert. Diesedimentierten Zellen werden mit 5OmM TrisHCI gewaschen und anschließend in 13ml eines 5OmM TrisHCI-Puffers mit 25% Saccharose (pH8,0) resuspendiert. Danach werden 20mg Lysozym zugegeben, und es erfolgt eine 5minütige Inkubation des Ansatzes. Nach der Zugabe von 3 ml einer 0,25 M EDTA-Lösung werden die Zellen 5 Minuten auf Eis gekühlt. Die Lyse erfolgt durch die Zugabe von 21 ml eines Lysemediums (5OmM TrisHCI, 62 mM EDTA, 1% SDS, pH 8,0). Danach werden 11ml einer 5 M NaCI-Lösung zugegeben und der Ansatz wird vorsichtig gemischt und anschließend 20 Minuten auf Eis gekühlt.

Nach 20minütigerZentrifugation bei 15000 U/min ist im Überstand die DNS enthalten, die durch Zugabe von 0,6 Volumenteilen Isopropanol bei -2O⁰C über Nacht ausgefällt wird. Nach20minütigerZentrifugation bei 15000 U/min wird das Sediment gewonnen, getrocknet und in 4,5ml TES-Puffer resuspendiert.

Noch in der Lösung verbliebene Proteine werden durch 15minütiges Zentrifugieren bei 12 000 U/min abgetrennt. Zur Abtrennung und Reinigung der Plasmid-DNS von kontaminierender chromosomaler DNS wird in an sich bekannter Weise eine Ethiumbromid-Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation ausgeführt.

Schließlich liegt die gereinigte zirkuläre Plasmid-DNS in einer Lösung von 1OmM TrisHCI, pH7,5, vor und wird bei +4⁰C aufbewahrt.

Die Herstellung der neuen, rekombinanten Zwischenplasmide pLKM618 und pLKM619 wird nunmehrfolgendermaßen durchgeführt:

Je 5/zg derauf oben beschriebene Weise gewonnenen DNS von pSM6und pUC 18 werden in getrennten Ansätzen mit je 10 Einheiten des Enzyms EcoRI linearisiert. Nachdem die Vollständigkeit der Spaltung gelelektrophoretisch nachgewiesen wurde, wird das Enzym EcoRI durch Hitzebehandlung inaktiviert (7O⁰C, 5 Minuten). Anschließend werden beide linearisierten Plasmide durch Zugabe von je 3 Volumenteilen 96%igem Alkohol gefällt (-7O⁰C, 60 Minuten), in der Eppendorfzentrifuge sedimentiert, 2mal mit 70%igem Alkohol gewaschen, getrocknet und in je 8μ.Ι Aqua dest. gelöst. Danach werden die Plasmidlösungen vereinigt, mit 2μ.Ι Ligationspuffer (10fach konzentriert) und 2 Einheiten T4-DNS-Ligase (in 2μ,Ι Ligasepuffer) versetzt und über Nacht bei einer Temperatur von +12⁰C belassen. Neben den rekonstruierten Ausgangsplasmiden (pSM6und pUC18) befinden sich in der Ligationslösung auch die neuen rekombinanten Plasmide pLKM618 und pLKM619. Das Gemisch dieser Plasmide wird durch Transformation in den plasmidfreien Stamm E. coli Hb 101 eingeführt. Die Herstellung kompetenter E. coli Hb 101-Zellen und die Transformation werden in an sich bekannter Weise ausgeführt. Klone, die die neuen rekombinanten Plasmide pLKM618und pLKM619tragen, werden auf LB-Agarplatten selektiert, die mit 100/xg ml"¹ Ampicillin und 50^g · ml"¹ Erythromycin versetzt waren. Im Ergebnis dieser Transformation lagen ca. lOOErythromycin-Ampicillin-resistente Transformantenklone vor. Einige davon wurden einem Plasmid-screening unterworfen, das in an sich bekannter Weise abläuft.

Von diesen Plasmid-Schnellisolaten wurden je 10μ.Ι mit dem Enzym EcoRI behandelt und im Vergleich mit linearisierten pSM 6 und pUC18-Plasmiden gelelektrophoretisch in an sich bekannter Weise analysiert. Je 10μ,Ι dergleichen Plasmid-Schnellisolate wurden außerdem mit den Enzymen Pstl, Hindlll, BamHI und Sail behandelt und ebenfalls in an sich bekannter Weise analysiert.

Im Ergebnis wurden zwei Transformantenklone identifiziert, von denen einer das 8,3 kb große rekombinante Plasmid pLKM618 und der andere das 8,3 kb große rekombinante Plasmid pLKM 619 trägt (s. Abb. 3). Beide Plasmide besitzen den Polylinker und je zwei Resistenzmarker (Amp^R, Em-Lm^R).

1b) Konstruktion der Polylinker tragenden Plasmide pLKM6181 undpLKM6191 Ausreichende Mengen gereinigter pLKM 618-DNS und pLKM619-DNS, wie sie für die nachfolgenden Verfahrensschritte nötig sind, werden in der oben bereits für pUC 18 beschriebenen Weise aus den Stämmen E. coli Hb 101 (pLKM618) und E. coli Hb 101 (pLKM619) gewonnen.

Je 5 ju.g dieser pLKM 618-DNS bzw. pLKM 619-DNS werden sodann in getrennten Ansätzen in einem Gesamtvolumen von jeweils 50μ\ mit dem Restriktionsenzym Haelll in an sich bekannter Weise gespalten. Die entstandenen 10 Fragmente des Plasmids pLKM618bzw. des Plasmids pLKM619 werden gelelektrophoretisch in an sich bekannter Weise voneinander getrennt. Das aus dieser Spaltung hervorgehende jeweils größte Fragment des Plasmids pLKM618bzw. des Plasmids pLKM 619 zeichnet sich durch eine Molekülgröße von jeweils 5,9kb aus und besteht aus dem vollständigen Plasmid pSM6mitdem Resistenzmarker Em-Lm^R und einem 260bp großen Anteil des Plasmids pUC18 mit der Polylinkersequenz. Diese 5,9kb-großen DNS-Fragmente werden in an sich bekannterWeiseausdem Agarosegel extrahiert. Am Schluß liegen diese DNS-Fragmente gelöst in jeweils 15/u.l 1OmM TrisHCI, pH7,5, vor.

Ihre blunt-Enden werden anschließend in getrennten Ligationsexperimenten durch Selbstligation miteinander verknüpft, wobei der Haelll-Spaltort rekonstruiert wird. Dazu werden jeweils 15μΙ DNS-Lösung mit 2/xl Ligationspuffer (10fach konzentriert) und 2 Einheiten T4-DNS-Ligase versetzt und über Nacht bei einer Temperatur von +4⁰C belassen.

Mit diesem Ligationsgemisch werden am darauffolgenden Tag kompetente Zellen des plasmidfreien Streptococcus sanguis-Stammes Challis 6 in an sich bekannter Weise transformiert. Plasmidtragende Transformanten aus beiden Ligationsexperimenten werden auf BHI-Agarplatten mit 5^g Erythromycin je ml Agar selektiert. Eine bestimmte Anzahl von Transformantenklonen wird isoliert und in an sich bekannter Weise einem Plasmid-screening unterzogen.

Zur Identifizierung der gewünschten neuen Streptokokken-Vektorplasmide mit Polylinker werden je 15μ,Ι der Plasmidschnellisolate mit den Restriktionsenzymen, EcoRI, Hindlll, Pstl, Sail, BamHI, Haelll, Avail und Pvull gespalten und im Vergleich mit geeigneten Standard-DNS (pSM 6 mit EcoRI gespalten; DNS des E. coli-Bacteriophagen λ mit Hindlll gespalten; pBR322 mit Avail gespalten) in an sich bekannter Weise analysiert.

Zwei Transformantenklone, die je ein Plasmid mit der Größe 5,9kb enthalten, die erwarteten Spaltbilder zeigen, jedoch unterschiedliche Insertionsrichtungen des Polylinkers aufweisen, werden für die Isolation gereinigter Plasmid-DNS ausgewählt.

Die Spaltung dieser gereinigten Plasmid-DNS mit den Enzymen EcoRI, Hindlll, BamHI, Pstl, Smal, Sail, Haelll, Avail und Pvull sowie die nachfolgende gelelektrophoretische Größenanalyse der entstandenen Fragmente gestatten eine eindeutige Identifizierung der neuen Streptokokken-Vektorplasmide pLKM6181 und pLKM 6191. Diese Analyse bestätigt, daß das Polylinker-Fragmentvon pUC18 in der erwarteten Weise in pLKM6181 bzw. pLKM6191 vorliegt (vgl. Abb.4).

Folgende Spaltorte des Polylinkers erweisen sich als singuläre Spaltorte der Plasmide pLKM 6181 und pLKM6191: Sstl,Xmal, Smal, BamHI, Xbal, Sail, Pstl, SpHI und Haelll.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Streptokokken-Vektorplasmiden mit Polylinker unter Anwendung gentechnologischer Standardverfahrensschritte, gekennzeichnet dadurch, daß man

— Plasmid pSM6, ein Derivat von Plasmid pSM7, mit dem E. coli-Plasmid pUC18, das einen 8 pSM 6-fremde, singuläre Restriktase-Spaltorte aufweisenden Polylinker in sich trägt, mittels Ligation über die EcoRI-Spaltorte zu den neuen Chimären Zwischenplasmiden pLKM 618 und pLKM.619 (Molekülgröße je 8,3 kb) fusioniert,

— aus diesen Zwischenplasmiden durch Verdauung mit der Restriktase Haelll den pUC18-Rumpf heraustrennt und

— die so bereitgestellten 5,9 kb großen Hauptfragmente der Zwischenplasmide jeweils mittels Selbstligation zu den neuen, Polylinker tragenden Streptokokken-Vektorplasmiden pLKM 6181 und pLKM6191 schließt.