DD273286A1 - Verfahren zur herstellung polylinker-tragender streptococcus-escherichia coli-multicopy-shuttle-plasmide minimierter molekuelgroesse - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Streptococcus-Escherichia coli-multicopy-shuttle-Plasmide minimierter Molekuelgroesse mit Polylinker. Sie verfolgt das Ziel, neue universelle Vektorplasmide fuer die Belange der Gentechnik bereitzustellen. Die dieser Zielstellung zugeordnete Aufgabe wird geloest, indem man- zunaechst ein Polylinker-tragendes Streptokokkenplasmid der pLKM-Serie in seinem Polylinker oeffnet und das E. coli-Phasmid pMc, einen Polylinker-tragenden Vektor, in zwei Fragmente zerlegt,-danach diese Fragmente in eine Ligationsansatz gibt und mit diesem einen E. coli--Rezipientenstamm transformiert sowie-anschliessend unter den Transformantenklonen Deletionsplasmide der Typen pLM2 und pLM3 selektiert, die sich durch eine geringe Molekuelgroesse, durch den Besitz eines Polylinkers und nach Ruecktransformation in Streptococcus sanguis-Rezipienten durch den Status eines multicopy-Plasmids auszeichnen.

Description

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Streptococcus-Escherlchia coli-multicopy-shuttle-Plasmide minimierter Molekülgröße, die einen Polylinker tragen und vorteilhaft zur Klonierung von Fremdgenen in Streptococcus und Escherlchia coil herangezogen werden können.

Die Erfindung bietet Anwendungsmöglichkeiten In der Gentechnologie sowie auf anderen Gebieten der Molekularbiologie und nachgelagert damit vor allem in der pharmazeutisch-biotechnologischen Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Bekannt sind eine Reihe von Streptococcus-Escherlchia coll-shuttle-Vektoren, die auf der Basis des bekannten Streptokokken-Vektors pSM6 und verschiedener E. coli-Vektoren konstruiert wurden, wie z.B. pSM618 oder pSM6322 (Übereicht bei FERRETTI & CURTISS [Eds.] 1987, Streptococcal Genetics, American Society for Microbiology, Washington, sowie LAPLACE et al., 1988, J. Basic Microbiology). Diese Plasmide zeichnen sich aus

- durch eine Molekülgröße von mindestens 8,4 kb,

- durch singuläre Spaltorte für eine Reihe von Restriktasen (z. B. EcoRI, BamHI, Hindill, Sail, Xbal) sowie '

- durch das Vorhandensein von mindestens zwei Resistenzmarkern (z. B. für Erythromycin-Lincomycinresistenz und Ampicillinresistenz).

Nachteilig schlagen bei ihrem Einsatz als Plasmidvektoren in gentechnischen Konstruktionen ihr relativ großes Molekulargewicht und ihre geringe Kopiezahl zu Buche.

Ziel der Erfinduno

Die Erfindung vorfolgt das Ziel, neue Streptococcui-Eicherlchla coll-multlcopy-ehuttle-Plasmlde mit minimierter Molekülgröße und Polylinker für die Belange der Gentechnologie bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung Hegt die Aufgabe zugrunde, ein gentachnisch-mikrobiologlsches Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe durch aufeinanderfolgend ausgeführte Komplexe gentechnologischer Verfahrensschritte neue Streptococcus-E. coll-multicopyshuUle-Plasmlde minimierter Molekülgröße mit Polylinker gewonnen werden können. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe In ihrem Grundzug wie folgt gelöst: Unter Anwendung gentechnologischer Standardverfahrensschritte wird zunächst

- einerseits ein Streptococcut-Klonierungsvektor der pLKM-Serle, der neben der Erythromycin-Resistenz als PhBnotyp-Marker einen Polylinker mit 10 elngutären Restriktionsorten in sich trägt, durch Behandlung mit der Restriktaee Pstl llnearisiert sowie

- andererseits das literaturbekannte Escherlchla coll-Plasmld pMc (Molekülgröße 3,8kb; Chloramphenikol-Resistenz // siehe auch P.STANSSENS et al., Gene 36,1985,211-223), das einen Polylinker mit 7 slngulören Restriktionsorten, nämlich für die Restriktasen EcoRI, Smal, BamHI, Sail, Hindill und Xbal, In sich trägt, gleichfalls durch Behandlung mit der Restriktase Pstl in 2 Fragmente (der Teilgrößen 2,0kb und 1,8kb) zerlegt.

Ausgewählte Polyllnker-tragende Streptococcus-pLKM-Klonierungsvektoren sind inzwischen in Anwendung des Verfahrens

einer kürzlichen Erfindung des Zentralinstituts verfügbar geworden.

Die auf diese Weise erhaltenen 3 Pstl-Pstl-DNS-Fragmente werden in einen Llgationsansaiz gegeben, und mit diesem Ansatz

wird eine Population eines Erythromycin-sensitiven Escherlchla coll-Rezlpientenstammes transformiert. Unter den

Erythromycin-resistenten Escherlcla coli-Klonen, die im Ergebnis dieser Transformationsprozedur gewonnen wurden, werden

dann anschließend solche selektiert, welche rekombinante Polyllnker-tragende Plasmide der pLM-Famllie mit einer Größe von weniger als 7,7 kb tragen.

Nachdem aus diesen Klonen die Plasmid-DNS isoliert worden ist, wird mit der so bereitgestellten Plasmld-DNS abschließend ein Erythromycin-sensitiver Streptococcus-Rezipientenstamm transformiert. Unter den im Ergebnis dieser Prozedur erhaltenen Erythromycin-resistenten Streptococcus-Transformantenklonon werde.» letztlich noch solche ausgewählt, deren pLM-Plfasmide

den Status eines multicopy-Plasmids aufweisen, und aus den Klonen dieser Charakterisierung wird in an sich bekannter Weise die Plasmid-DNS isoliert. .

Der Grundzug des Verfahrens wird nun zunächst dahingehend weiter ausgestaltet, daß im Eingangsschritt des Verfahrens der Streptococcus-Klonierungsvektor pLKM6181 (Moie-.ülgröße 6,9 kb; Erythromycin-Resistenz) herangezogen wird. Dieser Vektor

trägt einen Polylinker, der slngulKre Spaltorte unter anderem für die Restriktasen Haelll, Sphl, Pstl, Sail, Xbal, BamHI, Xmal, Smal und Sstl aufweist.

Ein mit dam Vektor pLKM transformierter Streptococcus sanguls Challis-Stamm ist in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, Beutenbergstr. 11, Jena, DDR - 6900 unter der Registriernummer IMET deponiert worden. Am Beginn werden benötigte Mengen

a) an pLKM 6181-Plasmid-DNS aus einer Kultur von S. sanguls Challis 57 (pLKM6181) bzw.

b) anpMc-Phasmid-DNSauselnerKulturvonE. C0IIJMIOI (pMc)

in an sich bekannter Weise Isoliert, gereinigt und im TrisHCI-Puffer gelöst,

Zur Transformation mit dem verfahrensgemäß bereiteten Ligatlonsansatz, der neben den Pstl-Pstl-DNS-Fragmenten obiger Beschaffenheit von 1,8kb und 2,0kb Größe als ein drittes Pstl-Pstl-DNS-Fragment von 5,9kb Größe enthäit, wird nunmehr der E.coli-RezipientJM101 eingesetzt. Im Anschluß an die Transformationsreaktion wird unter den erhaltenen Erythromycin-resistenten E. coll JM101- Transformantenklonen ein Screening nach Plasmiden minimierter Molekülgröße, insbesondere nach solchen mit einer Molekülgröße vn weniger als 7,7 kb durchgeführt. Unter diesen Mini-Plasmiden wird dann ein erneutes Screening nach Polylinker-tragenden Delektionsplasmiden vom Typ pLM2 (Molekülgröße 4,1 kb) sowie vom Typ pLM 3 (Molekülgröße 4,6kb)

vorgenommen. Beide Neuplasmide, sowohl pLM 2 als auch pLiVO, weisen einen Polylinker auf, der insbesondere singuiäre

Spaltorte wenigstens für die Restriktacen Smal, BamHI, Xbal, Sail und Pstl besitzt. Klone von E.coll JM101, welche die gewünschten minimierten Plasmide vom Typ pLM2 sowie pLM3 tragen, werden kultiviert,

und aus diesen Kulturen wird in an sich bekannter Weise die jeweilige Plasmld-DNS isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst. Mit Proben dieser Plasmid-DNS wird für den abschließenden Schritt des Verfahrens der Rezipientenstamm S. sanguls

Challis 6 (rück-) transformiert und eine Selektion auf Erythromycin-resistente Challis-Transformantenklone durchgeführt. Aus Kulturen dieser Transformantenstämme wird gleichfalls die Plasmid-DNS isoliert und durch Behandlung mit einer Kollektion

von Restriktasen, so insbesondere mit EcoRI, Hindill, Hindi, Avail, Pvull, Small, Sail, Xbal, BamHI, Pstl, Haelll, Hpall und Aval erneut

a) die Molekülgröße bestimmt sowie

b) jeweils die Anwesenheit eines Polylinkers nachgewiesen;

weiterhin werden unter den durch diese Rücktransformation gewonnenen pLM-shuttle-Plasmiden solche ausgewählt, die über einen multicopy-Status verfügen.

im Ergebnis dieser Untersuchungen wurden für die Streptococcus-Escherlchia coli-multicopy-shuttle-Plasmide pLM2 und pLM 3 jeweils folgende Parameter bestätigt (s.a. Abbildung}:

PlasmidpLM2: - Molekülgröße4,1 kb;

- Vorliegen eines Polylinkera mit singulären Spaltorten für die oben angeführten Restriktasen sowie EcoRI;

- Vorhandensein eines Markers für die Erythromycin-Resistenz;

- vierfach erhöhte Kopiezahl (26 Kopien pro Zelle) im Vergleich zum Ausgangsplasmid pLKM 6181;

PlasmldpLM3: - Molekülgröße 4,6 kb;

- Vorliegen eines Polylinkers mit slngulären Spaltorten für die o. a. Rostriktasen;

- Vorhandensein eines Markers für die fc'rythromycln-Reelsteni;

- vierfach erhöhte Kopiezahl Im Vergleich zum Ausgangsplasmld pLKM 6181.

Wie in der Abbildung erkenntlich, fehlt o'em shuttle-Plasmld pLM 2 Im Vergleich zum Plasmld pLM 3 ein DNS-Abschnitt, der durch eine charakteristische Anordnung von | a einem EcoRI- und Hlncll-Spaltort gekennzeichnet ist.

Mit pLM2 und pLM3, den neuen, Polylinker-tragenden Streptoeoccus-Escherlchla coll-multlcopy-shuttle-Klonierungsvektoren inlnlrr iertur Molekülgröße, stehen originäre, strukturoptimierte Trägerrepllca für anscl .ließende gentechnologische Projekte zur Verfügung. Besonders vorteilhaft lassen sich diese beiden neuen ehuttle-Plaemlde zur Expression von Genen In grampositiven Wirten einsetzen, was durch ihre geringe Molekülgröße, durch die Anhäufung von slngulären Spaltorten, darunter so gebräuchlicher wie Pst!, Sail und Smal, sowie durch die erhöhte Kopio:?hl ermöglicht wird.

Ausführuugsbelsplol

a) Gewinnung von Phasmid-DNS pLKM 6181 und Plasmid-DNS pMc.

DNS des Plasmids pLKM6181 wird aus Zellen des Stammes S. sanguls Challis 6 (pLKM6181) in der folgenden Welse gewonnen.

600ml einer Übernachtkultur dieses Stammes, die in BHI-Meäium mit 2M Glukoso, 0,BM D-L-Threonin, 2,6% Pferdeserum und 5pg/ml Erythromycin gezüchtet wurde, werden 15 Minuten bei 600OUAnIn zentrifugiert. Die eedlmentierten Zellen werden mit 5OmM TrisHCI (pH8,2) gewaschen und anschließend in 60ml desselben Puffers resuspendiert. Nach Zugabe einer Lysozymlösung (100mg Lysozym in 5ml öOmM TrisHCI, pH8,2) wird 90 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Danach werden die Zellen abzentrifugiert und in 16ml 5OmM TrisHCI resuspendiert. Anschließend werden 20mg Pronase in 2ml TrisHCI zugegeben, und es wird 20 Minuten bei 37⁰C inkubiert.

Die Zellyse erfolgt durch Zugabe von 2ml einer 10%lgen SDS-Lösung. Danach wird der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 1MNaOH auf 12,1 eingestellt, wodurch die Denaturierung derchromosomalen DNS erreicht wird. Anschließend erfolgt durch schnelle Zugabe einer 2 M TrisHCI-Lösung ein pH-shlft auf pH 8,5. Nach Zugabe von 0,6g kristallinem NaCI folgen schließlich zur Deproteinisierung je eine Extraktion mit einem Volumen NaCI-gesättigtem Phenol und Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (24:1). Anschließend wird die DNS-Lösung mit 0,1 Volumenteilen einer 3M Na-acetat-Lösung und 2 Volumenteilen 96%igem Alkohol bei -2O⁰C gefällt, sedimentiert und getrocknet. Die DNS wird zuletzt in 5 ml TES-Puffer aufgenommen.

Zur Abtrennung und Reinigung der Plasmid-DNS von kontaminierender chromosomaler DNS wird in an sich bekannter Weise eine Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation ausgeführt. Schließlich liegt die gereinigte zirkuläre Plasmid-DNS in einer Lösung in 1OmM TrisHCI (pH7,5) vor und wird bei +4⁰C aufbewahrt. Weiterhin wird die DNS des Phasmids pMc aus Zellen des Stammes E. coll JM101 (pMc) in folgender Weise gewonnen: 500ml einer Übernachtkultur von E.coll JM101 (pMc) in folgender Weise gewonnen: 500ml einer Übernachtkultur von E. coll JM101 (pMc), die in LB-Medium mit 25\igfm\ Chloramphenikol bei 37⁰C gezüchtet wurdu, werden 15 Minuten bei 6000U/min zentrifugiert. Die sedimentierten Zellen werden mit 5OmM TrisHCI gewaschen und anschließend in 13ml eines 5OmM TrisHCI-Puffers mit 25% Saccharose resuspendiert. Danach werden 20 mg Lysozym zugegeben, und es erfolgt eine 5minütige Inkubation des Ansatzes. Nach der Zugabe von 3 ml einer 0,25 M EDTA-Lösung werden die Zellen 5 Minuten auf Eis gekühlt. Die Lyse erfolgt durch die Zugabe von 21 ml eines Lysemediums (5OmM TrisHCI, 62 mM EDTA, 1 % SDS, pH 8,0). Danach werden 11 ml einer 5 M NaCI-Lösur.fl zugegeben, und der Ansatz wird vorsichtig gemischt und anschließend 20 Minuten auf Eis gekühlt.

Nach 20minütiger Zentrifugation bei 15000 U/min ist im Überstand die DNS enthalten, die durch Zugabe von 0,6 Volumenteilen Isopropanol bei -20⁰C über Nacht ausgefällt wird. Nach 20minütiger Zentrifugation bei 15000U/min wird das Sediment gewonnen, getrocknet und in 4,5ml TES-Puffer resuspendiert.

Noch in der Lösung verbliebene Proteine werden durch 15minütiges Zentrifugieren bei 12 000U/min abgetrennt. Zur Abtrennung und Reinigung der Phasmid-DNS von kontaminierender chromosomaler DNS wird in an sich bekannter Weise eine Ethidiumbromid-Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation ausgeführt.

Schließlich liegt die gereinigte zirkuläre Phasmid-DNS in einer Lösung von 1OmM TrisHCI (pH7,5) vor und wird bei +4⁰C aufbewahrt.

b) Konstruktion der neuen multicopy-shuttle-Plasmide pLM 3 und pLM 2.

Die Konstruktion der neuen shuttle-Plasmide pLM3 und pLM2 wird nunmehr folgendermaßen durchgeführt: 2pg derauf oben beschriebene Weise isolierten Plasmid-DNS von pLKM6181 werden mit 10 Einheiten des Enzyms Pstl linearisiert. Nachdem die Vollständigkeit der Spaltung gelelektrophoretisch nachgewiesen wurde, wird das Enzym Pstl durch Hitzebehandlung inaktiviert (70⁰C, 10 Minuten). Anschließend wird die linearislerte Plasmid-DNS durch Zugabe von Vio Volumenteilen 3M Na-acetat und 3 Volumenteilen 96%igem Alkohol gefällt (-7O⁰C, 30 Minuten), in der Eppendorfzentrifuge sedimentiert (12 000 U/min, 10 Minuten), 2mal mit 70%igem Alkohol gewaschen, getrocknet und in 10 μΙ Aqua dest. gelöst.

Parallel dazu werden 5 pg der auf oben beschriebene Weise isolierten Phasmid-DNS von pMc mit 20 Einheiten des Enzyms Pstl gespalten. Nachdem die Vollständigkeit der Spaltung wiederum durch den gelelektrophoretischen Nachweis der dabei entstehenden 2 Fragmente (2,0 kb + 1,8 kb) festgestellt wurde, wird das Enzym Pstl durch Hitzebehandlung inaktiviert (7O⁰C, 10 Minuten). Anschließend wird die'Plasmid-DNS in der bereits für pLKM 6181 beschriebenen Weise gefällt, gewaschen, — getrocknet und in ΊΟμΙ Aqua dest. resuspendiert. Danach werden die Lösungen vereinigt, mit 1,5μΙ Ligationspuffer (lOfach konzentriert) und 4 Einheiten T4-DNS-Ligase (in 2,5 μΙ Ligasepuffer) versetzt und über Nacht bei einerTemperatur von 12⁰C belassen. Mit diesem Ligationsgemisch wird der plasmidfreie Rezipientonstamm E. coll JM101 transformiert. Die

Herstellung kompetenter E. ο ell JM101 -Zellen und dio Transformation selbst werden In an eich bekannter Welse ausgeführt. Auf LB-Agarplatten, die mit 10OMg/ml Erythromycin versetzt waren, wurden etwa 100 Transformantenklone celektlert. DiesaTransformantenklone wurden in an sich bek.nnUr Welse einem Plasmld-Screnning unterworfen. Von diesen Plasmld-Schnelllsolaten wurden je 6μΙ gelelektrophoretlsch annlyslert, und unter Ihnen wurden dlejenlg jn ausgewählt, welche sich durch die geringste Molekülnröße auszeichnen. Jo 10μΙ dieser Schnelllsolate mit geringer Molekülgröße wurden mit den Enzymen EcoRI, Smal, BamHI, Xbal, Sail sowie PstI behandelt und in an sich bekannter Weise gelelektrophoretisch analysiert

Im Ergebnis wurde

a) ein Transformantenklon, der das 4,6 kb große Plasmid pLM 3 trägt, welches einen Polylinker mit den Spaltorten Smal, BamHI, XBaI, Sail sowie PstI und dio Determinante für die Erythromycln-Resistenz besitzt sowie

b) ein weiterer Transformantenklon, der das 4,1 kb große Plasmid pLM 2 trägt, welches einen Polylinker mit den Spaltorten EcoRI, Smal, BamHI, Xbal, Sail sowie PstI und die Determinante für die Rythromycln-Reslstenz aufweist,

identifiziert.

Der Nachweis der Replikationsfähigkeit beider Plasmide in Streptococcus wurde erbracht, indem 1er plosmidfreie Reziplentenstamm S. sanglus Challis β mit je 30μΙ eines pLM 3- bzw. pLM 2-Schnellisolats In an sich bekrnntor Weise

transformiert und anschließend Erythromycln-resistente Klone Isoliert wurden.

Einige dieser S. sanguls-Transformantenklone wurden in an sich bekannter Weise einem Piasmid-Screening unterworfen. Die

erhaltenen Plasmld-Schnellisolate wurden mit den Enzymen EcoRI, Smal, BamHI, Xbal, Sail, PstI behandelt und anschließend auf an sich bekannte Weise gelelektrophoretisch analysiert. Dabei konnte die Identität dieser Plasmid-Schnellisolate mit den

Plasmlden pLM3 bzw. pLM2 nachgewiesen werden. In an sich bekannter Weise wurde die Kopiezahl der Plasmide pLM3 und pLM 2 in Streptococcus bestimmt. Dabei wurde

festgestellt, daß beide Plasmide eine gegenüber dem Ausgangsplasmid pLKM 6181 vierfach höhere Kopiozahl bei Replikation in

Stämmen der Gattung Streptococcus aufweisen.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung Polyllnker-tragender Streptococoue-Eecherlchla coll-multlcopy-ehuttlo-Plosmide minimierter Molekülgröße unter Anwendung gentechnologischer Standardverfahrensschritte, gekennzeichnet dadurch, daß man zunächst

- einerseits einen Polylinker-tragenden Streptococcus-Klonlerungsvektor der pLKM-Serie durch Behandlung mit der Restrikiase Pstl linearisiert,

- andererseits das Polyllnker-t^agende Escherichla colt-Phasmid pMc durch Behandlung mit der Restriktase Pstl in zwei DNS-Fragmente zerlegt,

- dia auf diese Weise gewonnenen 3 DNS-Fragmente in einen Ugalionsansatz gibt und mit diesem Ansatz einen Erythromycin-sensitiven Escherichla colt-Rezipientenstamm transformiert,

- unter den erhaltenen Erythromycin-resistenten Escherlchla coll-Transformantenklonen solche selektiert, die rekombinante Polylinker-tragende Plasmide der pLM-Familie mit einer Größe von weniger als 7,7 kb tragen, und aus diesen Klonen die Plasmid-DNS isoliert,

- mit der so bereitgestellten Plasmid-DNS anschließend einen Erythromycin-sensitiven Streptococcus-Rezipientenstamm transformiert sowie

- unter den erhaltenen Erythromycin-resistenten Streptococcus-Transformantenklonen solche ausgewählt, deren pLM-Plasmide den Status eines multicopy-Plasmids tragen, und aus diesen Klonen die Plasmid-DNS isoliert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man im Eingangsschritt den Polylinker-tragenden Streptococcus-Klonierungsvektor pLKM6181 einsetzt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Transformation mit dem Ligationsansatz den Rezipienten Escherichla coil JM101 heranzieht.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß man unter den Erythromycinresistenten Escherichla coll-Transformantenklonen, vorzugsweise unter den Erythromycinresistenten E. coil JM101-Transformantenklonen, solche selektiert, die Deletionsplasmide vom Typ pLM 2 (Polylinker-tragend; Molekülgröße 4,1 kb) oder vom Typ pLM 3 (Polylinker-tragend; Molekülgröße 4,6 kb) besitzen.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Rücktransformation der pLM2- sowie der pLM3-Plasmid-DNS den Rezipientenstamm Streptococcus sanguls Challis 6 heranzieht.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß man unter den erhaltenen Erythromycin-resistenten Streptococcus sanguis Challis 6-Transformanten solche auswählt, deren pLM2- bzw. pLM3-Plasmid jeweils den Status eines multicopy-Plasmids tragen.