DD251995A5

DD251995A5 - Verfahren zur Herstellung von Gewebeplasminogenaktivatoren

Info

Publication number: DD251995A5
Authority: DD
Publication date: 1987-12-02

Abstract

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Gewebeplasminogenaktivatoren mit Hilfe neuer serumunabhaengiger Humanzellinien, Proteine sind in entsprechender Arzneimittelform fuer die prophylaktische und therapeutische Behandlung des menschlichen Koerpers geeignet. Ziel der Erfindung ist es, das Verfahren oekonomisch zu gestalten. Erfindungsaufgabe ist die Bereitstellung eines neuen Herstellungsverfahrens unter Zuhilfenahme einer Humanzellinie, das serumunabhaengig arbeitet. Erfindungsgemaess besteht das Verfahren darin, eine serumunabhaengige Zellinie in einem serumfreien Medium zu kultivieren und die Gewebeplasminogenaktivatoren aus der Erntefluessigkeit zu isolieren.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Gewebepiasminogenaktivatoren mit Hilfe von Humanzellinien, die bei Abwesenheit von Serum oder irgendeinem exogenen makromolekularen Wachstumsfaktor proliferieren. Die von den genannten Zeliinien produzierten Proteine können bei der Behandlung bestimmter menschlicher Krankheiten eingesetzt werden.

Bekannte technische Lösungen

Mit der in den letzten Jahren erfolgten Entwicklung der rekombinanten DNS-Technologie sowie der Entwicklung von Zellkulturtechniken ist die Möglichkeit einer gesteuerten biologischen Produktion von nützlichen und pharmakologisch interessierenden Verbindungen - insbesondere Proteinen - wie etwa von Interferon, Insulin und Antigenen entstanden. Es besteht ein steigender Bedarf hinsichtlich der Entwicklung biologischer Systeme, die die großtechnische Produktion weiterer Proteine von biologischem und insbesondere pharmakologischem Interesse gewährleisten.

Der Begriff „Protein", wie er weiter oben sowie im folgenden gebraucht wird, soll Polypeptide hoher relativer Molekülmasse - z. B. über etwa 34000 - aber auch Polypeptide geringerer relativer Molekülmasse - z. B. unter etwa 34000 - sowie deren Derivate wie etwa glycosylierte, phosphatierte und sulfatierte Derivate beinhalten.

- λ - ^O I 33Ο

Die Fortschritte auf dem Gebiet der rekombinanten DNS-Technologie machen es möglich, ein gewünschtes Protein kodierendes Gen in Mikroorganismen einzuführen und dann die Mikroorganismen zu veranlassen, das Protein zu synthetisieren. Viele biologisch bedeutsame Moleküle können mittels dieser Technologie jedoch nicht synthetisiert werden. Dies gilt insbesondere für jene Moleküle, deren Aufbau noch nicht bekannt ist. In den meisten Fällen handelt es sich bei den von genetisch modifizierten Mikroorganismen abgesonderten Proteinen nicht um eine originalgetreue Wiedergabe der authentischen Moleküle, diese differieren vielmehr von den letztgenannten hinsichtlich der N- und C-Terminale der Aminosäuresequenz. Diese Tatsache ist auf die experimentelle Verfahrensweise bei der rekombinanten DNS-Technologie zurückzuführen. Darüber hinaus können glycosylierte Proteine nicht von Mikroorganismen, wie etwa Bakterien und zu einem gewissen Ausmaß auch Hefen produziert werden, denen der erforderliche zelluläre Mechanismus fehlt. In vielen Fällen kann von der Zeil- und Gewebekultur-Technik vorteilhafter Gebrauch gemacht werden. Da Zellkulturen von intakten Organismen herrühren, entsprechen die von den Zellkulturen produzierten Proteine den natürlicherweise vorkommenden Proteinen in jeder Hinsicht.

Nichtsdestoweniger ist die Kultivierung von Zellen höherer Organismen - wie etwa von Säugerzellen — in großtechnischem Umfang ein schwieriges Problem. Die Nährstofforderungen derartiger Zellen sind zwingender als jene der meisten Mikroorganismen, die in künstlichen Medien wachsen. Zum Wachstumsmedium der meisten bislang beschriebenen Säuterzellen gehört mehr — teueres Serum. Der Kostenaufwand für das Serum bestimmt in großem Maße die ökonomische Durchführbarkeit der Zellkulturtechnik und kann deren Anwendbarkeit auf die Produktion von anderweitig nicht verfügbaren Proteinen begrenzen. Einige Zellen können in serumfreiem Medium kultiviert werden, das mit Hormonen oder Wachstumsfaktoren wie etwa Transferrin, Insulin, Epidermal-, Fibroblast- oder Nerven-Wachstumsfaktor ergänzt wurde. In den meisten Fällen werden sich die Zellen in diesen serumfreien Medien nicht unbegrenzt vermehren.

In einem serumfreien Medium wachsende Zellinien sind von spezieller Bedeutung bei der Herstellung jener Proteine, die für die Zerstörung oder Kontamination durch Serum oder exogen zugeführte Wachstumsfaktoren empfänglich sind. Ein derartiges Protein ist beispielsweise Pro-Gewebe Plasminogen Aktivator (Pro-TPA).

Die sogenannten Plasminogen-Aktivatoren wurden Gegenstand wissenschaftlicher Untersuchungen, die deren evidente klinische Anwendbarkeit bei der Auflösung von Blutgerinnseln zeigten. Blutgerinnsel setzen sich aus Fibrin zusammen, welches aus seinem löslichen Vorläufer Fibrinogen unter der Einwirkung des Enzyms Thrombin gebildet worden ist. Sie sind eine der Hauptursachen für Erkrankung und Sterblichkeit bei Menschen; deren Auflösung ohne Nebenwirkungen ist schwer zu erreichen. Säugerplasma enthält ein enzymatisches System, welches imstande ist, das Fibrin in Blutgerinnseln aufzulösen. Eine Komponente des fibrinolytischen Systems besteht aus den Enzymen - Plasminogenaktivatoren - welche Plasminogen (eine inaktive Proenzym-Form von Plasmin) in das proteolytische Enzym Plasmin umwandelt. Plasmin baut sodann das Fibrin-Netzwerk der Blutgerinnsel unter Bildung löslicher Produkte ab. In Fällen, in denen das thrombolytische Potential des Körpers nicht ausreicht, um gebildete intravaskulare Thrombi zu beseitigen — beispielsweise bei Patienten, die unter Thromboembolie oder postoperativen Komplikationen leiden, kann es sich als unerläßlich erweisen, zusätzlich thrombolytische Agenzien zu verabreichen. Es gibt zwei Aktivatoren für Human-Plasminogen, die für die thrombolytische Therapie kommerziell verfügbar sind: Urokinase, eine aus menschlichen Urin oder menschlichen kultivierten Nierenzellen isolierte Serinprotease, und Streptokinase, ein aus Streptokokken gewinnbares bakterielles Protein. Da keines der beiden Enzyme eine spezifische Affinität für Fibrin aufweist, ist die Thrombolyse mit diesen Substanzen mit einer systemischen Aktivierung von Plasminogen verbunden, welche eine unterschiedslose Aufarbeitung von Koagulationsproteinen und damit eine signifikante Steigerung der Gefahr innerer Blutungen (Blutsturz) während der Behandlung hervorrufen kann. Ein weiterer Nachteil von Urokinase ist ihre sehr kurze nutzbare Halbwertszeit nach ihrer Injektion beim Menschen. Aus diesem Grunde sind hohe Urokinase-Dosen erforderlich, um eine wirkungsvolle Fibrinolyse zu erreichen. Bei Streptokinase handelt es sich um ein für den Menschen fremdes Eiweiß, was wiederum die Gefahr der Bildung von neutralisierenden Antikörpern mit sich bringt, die dessen Wirkung blockieren und zu allergischen Reaktionen führt, die schmerzhaft und potentiell tödlich sein können.

Von einer weiteren Gruppe von Plasminogenaktivatoren, den sogenannten Gewebe-Plasminogenaktivätoren (im folgenden als „TPAs" bezeichnet) ist bekannt, daß sie in den meisten humanen Geweben existieren. Aus unterschiedlichen Geweben stammende TPAs unterscheiden sich möglicherweise voneinander hinsichtlich ihrer molekularen Eigenschaften, immunologisch sind sie einander jedoch ähnlich. Von der Urokinase unterscheiden sie sich hinsichtlich ihrer chemischen und immunologischen Eigenschaften, hinsichtlich ihrer in starkem Maße gesteigerten fibrinolytischen Wirkung in Anwesenheit von Fibrin wie auch hinsichtlich ihrer hohen Affinität für Fibrin (vgl. S. Thorsen et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 28, 65-74 [1972], D. C. Rijken and D. Collen, J. Biol. Chem. 256, 7035-7041 [1981]). Auf Grund ihrer hohen Affinität für Fibrin begrenzt sich die Wirkung der TPAs auf das Blutgerinnsel selbst, wodurch die Gefahr einer unkontrollierten Blutung beträchtlich vermindert wird. Das folgende Schema zeigt die Beziehung zwischen Plasminogen, Plasmin, Fibrin und den verschiedenen Plasminogenaktivatoren.

UROKIMSB STREPTOKINASE

Plasminogen (Inaktiver. Vorläufer im Blut)

Plasmin

(im Blut aktives Enzym, welches.Blutgerinnsel auflöst und Pro-TPA aktiviert

GEWEBE-PLASMINOGEIiAKT IVAT OR

4\

PRO-GEWEBE- . ' . .

PLASMINOGEIAKTIVATOR

Kürzlich sind zwei unter Koagulationsversagen leidende Patienten erfolgreich mit einem TPA behandelt worden, der aus der Kulturflüssigkeit einer humanen Melanom-Zellinie isoliert worden ist (vgl. W. Weimar et al., The Lancet [1981], 1018-1020). Es gibt zwei molekulare Formen von TPA: die aktive zweikettige Form sowie eine inaktive einkettige Form (Vorläufer-TPA oder „Pro-TPA"; vgl. auch D. C. Rijken und D. Collen, loc. cit.; D. C. Rijken et al., J. Biol. Chem. 257, 2920-2925 [1982] sowie P. Wallen et al., Progr. Fibrin. 5, 16-23 [1982]). Pro-TPA kann in den aktiven TPA durch Inkubation mit Fibrin oder durch den Einfluß von Plasmin umgewandelt werden, welches durch diese kaskadenartige Reaktion seine eigene Synthese auslöst.

Zu den Human-TPA-Quellen gehören Extrakte verschiedener humaner Gewebe (die für eine kommerzielle Ausnutzung nicht zur Verfügung stehen) wie auch verschiedene humane Tumorzellen, von denen es sich gezeigt hat, daß sie TPAs in einem unterschiedlichen Ausmaß freisetzen (E. L. Wilson et al., Cancer Research 40, 933-938 [1980]; E. L. Wilson et al., Blood 61, 568-574 [1983]).

Nach der EP-OS 41 766 (Erfinder D. Collen, D. C. Rijken und O. Matsuo) wird ein TPA mit einer relativen Molekülmasse von 72000 beschrieben, der von einer kultivierten humanen Melanom-Zellinie (Bowes) isoliert worden ist und der wahrscheinlich mit dem TPA identisch ist, der bereits von E. L. Wilson et al. (Cancer Research 40, 933—938 [1980]) beschrieben wurde. Gleich anderen bereits bekannten Zellinien erfordert diese humane Melanom-Zellinie - Bowes - für ihr Wachstum die Anwesenheit von Serum wie beispielsweise von fötalem Kälberserum. Serum ist jedoch sehr teuer und enthält darüber hinaus proteinartige Bestandteile, welche den produzierten TPA kontaminieren und die Isolation großer Mengen von Pro-TPA verhindern. Dies kann zu einer langwierigen und arbeitsaufwendigen Reinigungsprozedur entweder bei TPA oder Pro-TPA führen.

Ziel der Erfindung

Die vorliegende Erfindung überwindet die Nachteile der bekannten Verfahren zur Herstellung von TPA und ermöglicht eine ökonomisch rationelle Erzeugung von TPA mit Hilfe neuer Humanzellinien, die in Abwesenheit von Serum oder irgendeinem exogenen makromolekularen Wachstumsfaktor wachsen.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von TPA mit Hilfe einer Serumunabhängigen Humanzellinie oder einer daraus abgeleiteten serumunabhängigen mutanten Zellinie zu entwickeln.

Erfindungsgemäß werden neue Humanzellinien verwendet, die in Abwesenheit von Serum oder irgendeinem exogenen maktomolekularen Wachstumsfaktor wie etwa Insulin, Tcansferrin, epidermalem Wachstumsfaktor usw. wachsen. Die erfindungsgemäß verwendeten Zellen sind imstande, selbst in Abwesenheit von Serum oder Fibronectin am Kulturgefäß zu haften.

Die Hauptvorteile der erfindungsgemäß verwendeten neuen Zellinien sind:

eine enorme Kosteneinsparung, da Serum wie etwa fötales Kälberserum sehr teuer ist, die außerordentlich billige und einfache Reinigung der Produkte, die von den neuen Zellinien erzeugt werden, da es. im Medium keine Serumverunreinigungen gibt und das Produkt ohne weiteres vom serumfreien Medium gereinigt werden kann, und die Möglichkeit des Erzeugens von Proteinen, die - auf Grund der Anwesenheit von Proteasen in Serum - aus serumabhängenden Zellinien nicht (oder nur in geringen Ausbeuten) gewonnen werden können.

Das Verfahren der Herstellung der neuen serumunabhängigen Humanzellinien besteht aus folgenden Schritten:

a) Entfernen von serumhaltigem Medium von der Kultur einer serumabhängigen Humanzellinie und sein Ersetzen durch serumfreies Medium,

b) Zuführung von serumfreiem Medium zu den zusammengewachsenen oder.nicht zusammengewachsenen Zellen, und

c) Wachsenlassens der Zellen, bis sich eine serumunabhängige Zellinie gebildet hat.

Der Begriff „serumfreies Medium", wie er weiter oben sowie im folgenden verwendet wird, soll ein Medium bezeichnen, welchem nicht nur Serum, sondern auch jeglicher makromdekulare Wachstumsfaktor entzogen worden ist. Dementsprechend wird eine Zellinie, die in Abwesenheit sowohl von Serum als auch von exogenen makromolekularen Wachstumsfaktoren wächst, als „serumunabhängige Zellinie" bezeichnet.

Bei der im obigen Verfahren als „Ausgangsmaterial" verwendeten serumabhängigen Humanzellinie handelt es sich speziell um eine kontinuierliche Linie; sie kann von humanen Neoplasmen wie etwa von einem Melanom, maligem Tetratom, Sarkom, Glioblastom, Meningiom, Neuroblastom, Lipom; Adenom, Brust- oder Blasenkarzinom stammen. Bevorzugte Zellinien sind jene, die TPA und/oder Pro-TPA produzieren. In einer bevorzugten Verkörperung der vorliegenden Erfindung wird eine humane Melanom-Zellinie und dabei speziell die Bowes-Melanom-Zellinie (im folgenden als „Bowes I"-Zellinie bezeichnet) verwendet. Es können auch Zellinien als „Ausgangsmaterial" verwendet werden, die von normalem Humangewebe stammen, wobei diese aber eine begrenzte in vitro Lebenszeitspanne aufweisen (das Wachstum hört nach beispielsweise etwa 50 Zellteilungen auf) und in bezug auf die vorliegende Erfindung von geringerer Bedeutung sind.

Das serumfreie Nährmedium ist beispielsweise ein im Handel erhältliches Medium wie etwa minimal Eagle's medium (MEM), MEM-Spinners medium, Dubecco's modified Eagle's medium (DMEM) oder Roswell Perk Memorial Institute culture medium (RPMi)-1640. Desgleichen können andere äquivalente Medien verwendet werden. Das serumfreie Medium kann eine ausreichende Menge eines Puffers enthalten - etwa in Gestalt von Natriumhydrogenkarbonat - um so einen stabilen p-Wert aufrechtzuerhalten. Da in Kultur befindliche Zellen des vollkommenen Immunabwehrsystems als eines integralen Teiles des intakten Organismus beraubt sind, werden vorteilhafterweise Antibiotika wie etwa Penizillin, Streptomyzin, Tylozin und dergleichen einbezogen, um eine Infektion der Kultur zu verhindern.

Normale Humanzellen werden lediglich dann ordnungsgemäß wachsen, wenn sie an der Oberfläche angebracht sind, wohingegen Tumorzellen häufig besser gedeihen, wenn sie sich in Suspension befinden. Laborgefäße zum Verankern abhängiger Zellen sind im Fachgebiet weithin bekannt. Sie reichen von „Mikrowellen"-Schalen sowie flachbödigen Petrischalen bis zu Gewebekolben verschiedener Größen oder zylindrischen Flaschen, als Walzenflaschen bezeichnet, die ununterbrochen rotieren. Verankerungsunabhängige'Zellen können in Kulturgefäßen angebaut werden, die mechanisch bewegt werden, oder bei denen durch Vermischen mit einem Gasstrom eine homogene Suspension aufrechterhalten wird. Das Verfahren kann beispielsweise in einem Gewebekulturkolben mit einer zusammengewachsenen oder auch nahezu zusammengewachsenen Monoschicht einer Humanzellinie wie beispielsweise einer humanen Melanom-Zellinie — speziell Melanom Bowes I — durchgeführt werden, die in einem serumhaltigen Nährmedium angebaut wurde. Die weitere Prozedur erfolgt in einer Kohlendioxid enthaltenden humiden Atmosphäre, beispielsweise in einer humiden Atmosphäre von ungefähr 95% Luft und ungefähr 5% CO₂, bei einer Temperatur zwischen etwa 35⁰C und etwa 4O⁰C und insbesondere bei etwa 37⁰C. Das serumhaltige Medium wird verworfen und durch ein serumfreies Medium wie beispielsweise RPMI-1640 oder DMEM ersetzt. Nach ein paar Tagen beginnen sich die Zellen von der Kolbenoberfläche abzulösen und frei im Medium zu schwimmen. Nach ein paar Wochen werden der Großteil der Zellen in einem von Serum oder irgendwelchen Wachstumsfaktoren freien Medium abgestorben sein. Zur Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen wird den Kulturen während der Anpassungsperiode an serumfreies Medium ein konditioniertes Medium zugesetzt. Das konditionierte Medium kann von einer Begleit-Zellkultur gesammelt werden, die für eine gewisse Zeitspanne — beispielsweise 24 h — in serumfreiem Medium gehalten wurde. Konditioniertes Medium enthaltendes serumfreies Medium muß in Abständen von beispielsweise 3 bis 7 Tagen ausgewechselt werden, bis sich die Zellenanzahl ausreichend erhöht hat, d. h. bis ungefähr ein Drittel der Gefäßoberfläche bedeckt ist. In diesem Stadium wird das konditionierte Medium nicht langer benötigt, und die Zellen werden nun ausschließlich mit serumfreiem Medium gespeist. Nachdem sich eine konfluente Monoschicht gebildet hat, müssen die Zellen passiert werden - beispielsweise durch kräftiges Aufstoßen des Gefäßes -, wodurch die meisten der Zellen von der Oberfläche abgetragen werden, oder aber mit Hilfe von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), wobei darauf zu achten ist, daß zwecks Gewährleistung des Oberlebens die Neuansetzung der frischen Kulturkoben bei einer ausreichend hohen Zelldichte erfolgt. Das Anbauen und Passieren der Zellen bei Konfluenz wird solange fortgesetzt, bis die Zelle als stabile und adhärente Monoschichten wachsen. Auf diese Weise wird über eine Periode von beispielsweise 1 bis 6 Monaten - speziell 1 bis 3 Monaten — eine serumunabhängige Zellinie etabliert.

In einer alternativen Variante kann die serumunabhängige Zellinie ohne ein Zusetzen von konditioniertem Medium, welches von der serumabhängigen Begleit-Zellkultur gesammelt wurde, angelegt werden, sofern die Zelldichte hoch genug ist. In diesem Falle konditionieren die Zellen ihr eigenes Medium. Die Zelldichte kann hoch gehalten werden, indem die nichtadhärenten Zellen nicht ausgeschieden werden. Nach wenigen Tagen im serumfreien Medium löst sich beispielsweise die Mehrheit der Zellen vom Gewebekulturgefäß ab und schwimmt frei im oben beschriebenen Medium. Die sich ablösenden Zellen bleiben solange lebensfähig, solange sie bei einer ausreichend hohen Dichte gehalten werden. Wird das die nicht anhaftenden, aber lebensfähigen Zellen enthaltende serumfreie Medium zentrifugiert und wird das Zellpellet in frisches serumfreies Medium aufgenommen und in den die wenigen anhaftenden Zellen enthaltenden Kolben zurückgesetzt, dann werden die adhärenten Zellen zu wachsen anfangen. In diesem Falle konditionieren die in Suspension befindlichen Zellen gemeinsam mit den anhaftenden Zellen ihr eigenes Medium. Nach zwei bis drei Wochen werden die zuvor in Suspension befindlichen Zellen damit beginnen, sich erneut an die Oberfläche des Kulturgefäßes anzusetzen, diese Zellen haften mit der Zeit an und können - sind sie erst einmal wieder zusammengewachsen durch kräftiges Aufstoßen oder aber mit Hilfe von EDTA in der oben beschriebenen Weise wieder abgetragen werden. Eine weitere Methode des Herstellens des „konditionierten Mediums" in Anwesenheit der anhaftenden Zellen besteht im Ersetzen eines Teiles des serumfreien Mediums - ungefähr der Hälfte davon - durch frisches serumfreies Medium sowie im Wiederholen dieses Vorganges alle 24 bis 72 h, bis eine ausreichend hohe Zelldichte erreicht ist (nach ungefähr 3 Wochen). Die Zellen können dann - beispielsweise unter Anwendung von EDTA - passiert werden. Bei der ersten Passage wird das frische serumfreie Medium in einem Umfang von etwa 40% des vor der EDTA-Behandlung von der Kultur entfernten konditionierten Mediums ergänzt, worauf die Zellen in Abwesenheit des konditionierten Mediums fortfahren werden, sich zu teilen. Die Zelldichte sollte ausreichend hoch sein, d. h. einer etwa 30%igen oder höheren - vorzugsweise etwa 60 bis 70%igen - Konfluenz entsprechen. Bei einer geringen Zelldichte, d. h. bei etwa 20%iger Konfluenz oder bei etwa 1 x 10⁵ Zellen/ml im Falle von Suspensionskulturen benötigen die Zellen konditioniertes Medium für ihr Wachstum. Bei einer hohen Zelldichte, d. h. bei etwa 60 bis 70%iger Konfluenz oder bei etwa 2 χ 10⁵ bis 5 x 10⁵ oder mehr Zellen/ml im Falle von Suspensionskulturen werden die Zellen im serumfreien Medium ohne das Zusetzen von konditionierten Medium wachsen und proliferieren.

Die serumunabhängigen Zellinien können als anhaftende Kulturen - beispielsweise an der Innenwandung eines Laborgefäßes — oder als Suspensionskulturen angewendet werden.

Es können" auch mutante Zeliinien verwendet werden, die aus den erfindungsgemäßen Zeliinien gewonnen werden können und die in der Lage sind, in einem serumfreien Kulturmedium zu proliferieren. Die Mutanten bilden sich spontan oder können in einer an und für sich bekannten, Weise hergestellt werden. Die Mutanten können zum Beispiel durch chemische Mittel wie etwa durch die Einwirkung eines Mutagens wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin oder Senföle, oder auch durch Bestrahlung beispielsweise mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen gewonnen werden.

Bevorzugte erfindungsgemäß verwendete serumunabhängige Zeiiinien und mutante Zeliinien sind jene, die TPA und/oder Pro-TPA produzieren.

Die erfindungsgemäß verwendeten Humanzellinien sowie die daraus gewonnenen mutanten Zeliinien haben eine unbegrenzte Lebenszeitspanne und können in einer ähnlichen Weise wie die originalen serumabhängigen Zeliinien eingesetzt werden; so etwa zur kommerziellen Produktion biologisch aktiver Verbindungen wie etwa Proteinen wie beispielsweise Interferone^ Antigenen, angiogenen Faktoren und insbesondere Plasminogenaktivatoren unter serumfreien Bedingungen oder zur Herstellung von Hybridomzellinien.

Wie bereits weiter oben erwähnt, ist die Melanom-Zellinie Bowes I dafür bekannt, in hohem Maße Gewebe-Plasminogenaktivator auszuscheiden (vgl. EP 41766); im obigen Verfahren wird sie vorzugsweise als „Ausgangsmaterial" verwendet. Die daraus resultierende serumunabhängige neue Zellinie wird im folgenden als „Bowes II" bezeichnet.

Die neuen serumunabhängigen Zeiiinien unterscheiden sich von den entsprechenden serumabhängigen Elternzellinien in vielerlei Hinsicht. Beispielsweise unterscheiden sich Bowes-Il-Zellen von den elterlichen Bowes-I-Melanomzellen in bezug auf ihr morphologisches Erscheinungsbild. Bei Prüfung unter dem Phasenkontrollmikroskop zeigt sich, daß es bei Bowes-Il-Zellen im Vergleich zu serumberaubten Bowes-I-Zellen zu merklich häufigeren Mitosen kommt. Das Zusetzen von Serum zu Bowes-Il-Zellen ruft eine auffallende morphologische Veränderung vor.

Die bevorzugten serumunabhängigen Zeliinien der vorliegenden Erfindung - speziell die Bowes-Il-Zellinie - scheiden in hohem Maße Gewebe-Piasminogenaktivate aus, der - im Gegensatz zu den elterlichen serumabhängigen Zeliinien wie etwa der Bowes-I-Zellinie — vorwiegend als Proaktivator vorliegt. Außer TPA und Pro-TPA erzeugen die neuen Zeiiinien auch noch anderweitige pharmakologisch wertvolle Substanzen. Beispielsweise erzeugt die Bowes-Il-Zellinie ihren eigenen Wachstumsfaktor sowie einen tumornekrotischen Faktor.

Kultivierung serumunabhängiger Humanzellen sowie Ernte der Kulturflüssigkeiten Serumunabhängige Humanzellen können im wesentlichen nach der oben beschriebenen Art und Weise kultiviert werden. Zum Beispiel werden Bowes-Il-Zellen mit einer zur Gewährleistung des Überlebens ausreichenden Zelldichte in Gewebekulturkolben eingesät, und in einem serumfreien Medium - z. B. RPMI-1640 -, ergänzt mit Antibiotika, bei einer Temperatur zwischen etwa 35 °C und etwa 40°C - speziell bei etwa 37°C - in einer etwa 5% CO₂ enthaltenden humiden Luftatmosphäre angebaut. Das Abnehmen von Ernteflüssigkeiten kann begonnen werden, sobald die Zellen adhärend werden, und es kann beispielsweise in 23-h-lntervallen wiederholt werden. Das tägliche Entnehmen von Ernteflüssigkeiten kann fortgesetzt werden, bis das Zusammenwachsen der Monoschichten das Überführen in frische Kulturgefäße erforderlich macht. Da die Proliferationsgeschwindigkeit von Bowes-Il-Zellen, die in serumfreien Medium kultiviert werden, sehr niedrig ist (das Verdoppeln dauert bis zu 6 Tagen; verglichen mit einer Verdoppelungszeit von ungefähr 1 Tag bei den elterlichen Bowes-I-Melanomzellen), ist das Überführen lediglich in längeren Abständen (in Intervallen von etwa 4 bis 6.Wochen) erforderlich, und die Ernteflüssigkeit können von einem Kolben für eine Zeitspanne von etwa 3 bis 6 Monate gesammelt werden, wodurch beträchtliche Zeit und Mühe eingespart und das Sammeln der Flüssigkeiten zu einer einfachen Aufgabe gemacht wird. Desgleichen ist es möglich, die Proliferationsgeschwindigkeit von Bowes-Il-Zellen zu steigern, indem dem Kulturmedium gelegentlich ein Wachstumsfaktor wie z. B. Insulin zugesetzt wird. Petrischalen, Gewebekulturkolben und andere in der Laborarbeit brauchbare Gefäße reichen nicht aus, um ein genügend großes Oberflächen-Volumen-Verhältnis für die praktische großtechnische Kultur der an der Oberfläche haftenden serumunabhängigen Zellen zu bieten. Für die großtechnische Produktion kann das Flächen-Volumen-Verhältnis durch verschiedene der.im Fachgebiet bekannten Hilfsmittel gesteigert werden. Beispielsweise können die Zellen auf schwammigen Polymeren, auf Gestellen dünner Scheiben, auf kleinen Kügelchen und dergleichen angebaut werden. Alternativ hierzu können die neuen serumunabhängigen Zeliinien wie etwa Bowes Il in Suspension angebaut werden. Großtechnische Gärbottische, die für eine Kultivierung in Suspension geeignet sind, sind im Fachgebiet weithin bekannt; Si₁B wurden durch Modifizierung der Gärbehälter für einzellige Mikroorganismen entwickelt. Um die Zellen gleichmäßig' in Mediurp suspendiert zu halten und um aufgelöste Gase (z. B. Sauerstoff) gleichmäßig zu verteilen, ist ein Umrühren erforderlich. Dies kann von herkömmlichen Turbinenrühren, Rührern in Schiffsschraubenform, vertikal oszillierenden Vibrationsmischern und dergleichen übernommen werden. Bevorzugt wird ein langsames Umrühren, um die Zellen vor Beschädigungen zu schützen. Ein homogenes Bewegen kann auch aufrechterhalten werden, indem ein Gasstrom durch die Kultur hindurchgeleitet wird.

Die von den serumunabhängigen Humanzellen wie etwa Bowes-Il-Zellen gewonnenen Ernteflüssigkeiten müssen zwecks Beseitigung abgelöster Zellen und Zellbruchstücke zentrifugiert werden. Es empfiehlt sich, dem Medium ein nichtionisches Detergens zuzusetzen, um so die Adsorption von TPA, Pro-TPA, und anderen von den Zellen abgesonderten wertvollen Substanzen an der Gefäßoberfläche zu verhindern und die Enzymaktivität zu bewahren. Vorzugsweise wird das nichtionische Detergens wie etwa Triton X-100® oder Tween 80® in einer finalen Konzentration von ungefähr 0,01 bis 0,1 % zugesetzt. Da die höchste Aktivität bie einem pH von 5,5, bis 6,0 aufrechterhalten wird, werden die Ernteflüssigkeiten mit einer schwachen Säure azidifiziert. Dies erfolgt beispielsweise mit einer niederen Alkansäure wie etwa Essigsäure, wobei die Flüssigkeiten vor der Niedertemperaturlagerung - z. B. bei etwa 4⁰C für eine 48stündige Lagerung oder bei -20⁰C für eine ausgedehnte Lagerung - auf den genannten pH-Wert eingestellt werden.

Der Gehalt an TPA, Pro-TPA und anderen wertvollen Substanzen in den Ernteflüssigkeiten kann unter Anwendung herkömmlicher Techniken ermittelt werden. Beispielsweise kann der TPA-Gehalt unter Anwendung des ¹²⁵l-Fibrin-Assay oder vermittels eines fluorometrischen Assayverfahrens gemessen werden. Beim erstgenannten Verfahren wird der zeitliche Verlauf der plasminogenabhängigen Freisetzung von radioaktiven Fibrin-Degradationspeptiden aus ¹²⁶l-markiertem Fibrin gemessen, welches als eine unlösliche Beschichtung auf der Oberfläche von Kunststoffgestellen aufgetragen wurde (vgl. E. L. Wilson und E. Dowdle, Int. J. Cancer 22, 390-399 [1978]). Im zweiten Falle wird der Fluoreszenzanstieg gemessen, der sich aus der Amidolyse eines geeigneten synthetischen Substrates wie etwa Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC (AMC: Aminomethylkumarin-Rückstand) oder Boc-Val-Gly-Arg-AMC ergibt (vgl. M. Zimmermann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 750-753 [1978]). Während das '²⁵I-Fibrin-Assay die gesamte Enzymaktivität sowohl von TPA als auch von Pro-TPA angibt, kann die iluorimetrische Bestimmung in einer Weise durchgeführt werden, daß lediglich die die TPA-Aktivität gemessen wird oder - alternativ hierzu - daß nach dem

Behandeln der Ernteflüssigkeit mit Plasmin, welches Pro-TPA zu TPA umwandelt, sowohl TPA als auch Pro-TPA einbezogen werden.

Unter Anwendung der obigen TPA-Bestimmungen kann nachgewiesen werden, daß die erfindungsgemäß gewinnbaren Ernteflüssigkeiten Pro-TPA in einem hohen Prozentsatz enthalten. Dies ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, daß im verwendeten Kulturmedium Plasmin oder andere Proteasen fehlen, welche Pro-TPA zu TPA umwandeln können. Das Überwiegen von Pro-TPA in Ernteflüssigkeiten, die beispielsweise aus kultivierten Bowes-Il-Zellen gewonnen wurden, kontrastiert in augenfälliger Weise mit Ernteflüssigkeiten von Bowes-I-Melanomzellen, die Pro-TPA nur in geringem Ausmaß enthielten.

Isolation und Reinigung von Proteinen, die von serumunabhängigen Zellen abgesondert werden Die Isolation der gewünschten Proteine von der aus serumunabhängigen Zellen wie etwa Bowes-Il-Zellen gewonnenen Kulturflüssigkeit sowie deren Reinigung kann im Prinzip auf jede geeignete Weise erfolgen, wie sie in der Proteinchemie üblich ist; so etwa vermittels fraktionierter Ausfällung beispielsweise mit anorganischen Salzen, durch Gelfiltration beispielsweise auf vernetzten Dextranen oder Agarose, durch Gelelektrophorese oder chromatografische Mittel wie etwa beispielsweise Adsorptionschromatografie, lonenaustauschchromatografie oder Affinitätschromatografie. Entsprechende Methoden der Isolation und Reinigung von TPA und Pro-TPA umfassen beispielsweise die folgenden:

— Chromatografie auf Zinkchelatagarose, Concanavalin-A-Agarose und Sephadex G-150® (vgl. D. C. Rijken und D. Collen, J. Biol. Chew. 246, 7035-7041 [1981]). Die Ernteflüssigkeit wird durch eineZinkchelatagarose-Säule durchgesetzt. Das adsorbierte Enzym wird mit einem imidazolhaltigen Puffer eluiert. Die so gewonnene Lösung wird einer Concanavalin-A-Agarose-Säule appliziert. Die Elution kann mit Methylmannosid und KSCN vorgenommen werden. Im letzten Schritt wird das Enzym auf einer Sephadex-G-150® Säule einer Gelfilterung unterzogen.

_K — Chromatografie auf Affi-Gel Blue® und Aminobenzamidin-Sepharose® (vgl. L. C. Gilbert und J. T. Wachsmann, Biochim. Biophys. Acta 704, 450-460 [1982]). Das Enzym wird nacheinander an Affi-Gel Blue® und Aminobenzymidin-Sepharose® adsorbiert. Die Desorption kann mit einem argininhaltigen Puffer vorgenommen werden.

— Selektive Adsorption von TPA und Pro-TPA auf einem Trägerstoff von spezifischer Affinität löslicher Fibrinfragmente, die kovalent an eine unlösliche Matrix wie etwa Dextran gebunden sind (vgl. Europäisches Patent Nr. 23 860). Das adsorbierte Enzym kann mit einem Essigsäurepuffer eines pH-Wertes von 4,2 eluiert werden.

— Chromatografie auf einer Immunoaffinitätssäule von Anti-TPA-Antikörpern - speziell monoklonalen Anti-TPÄ-Antikörpern - die an eine unlösliche Matrix wie etwa Affi-Gel® oder Sephadex-48® gebunden sind.

— Affinitätschromatografie auf DE-3-Sepharose®. Die Samen der Leguminose Erythrina latissirna enthalten einen als DE-3 bezeichneten Trypsininhibitor, (F. J. Joubert et al., Hoppe-Seyler's Zeitschr. Physiol. Chem. 302, 531-538 [1981]). Es hat sich gezeigt, daß DE-3 auch die TPA-Aktivität zu inhibieren vermag. Mithin kann der gereinigte DE-3-lnhibitor unter Anwendung von Standardverfahren an eine unlösliche Matrix geknüpft werden. Das TPA und Pro-TPA enthaltende Medium wird adsorbieren Und kann durch einen chaotropes Agens enthaltenden Puffer₍wie z. B. KSCN eluiert werden.

— Elektrophorese auf Polyacrylamidgele enthaltendem SDS (SDS-PAGE). Diese Methode eignet sich insbesondere für · Analysenzwecke sowie für die Bestimmung relativer Molekülmassen.

Zwecks Erlangung eines ausreichend reinen Produktes können ein einzelner Reinigungsgang oder einige aufeinanderfolgende Reinigungsschritte gewählt werden. Darüber hinaus können sich zusätzliche Reinigungsschritte wie beispielsweise eine Dialyse in einer geeigneten Puffermischung, Umkehrphasen-HPLC und dergleichen erforderlich machen.

Zum Beispiel können die Ernteflüssigkeiten einer Chromatografie auf Zink-Chelat-Agarose, Concanavaiin-A-Agarose und Sephadex-G-150® als einem ersten Isolationsschritt unterzogen werden (der auch dazu dienen kann, das in den großen Volumina an . Ernteflüssigkeit vorhandene gewünschte Protein zu konzentrieren), worauf das so gewonnene angereicherte Protein abschließend vermittels Affinitätschromatografie gereinigt werden kann.

In einer bevorzugten Verkörperung der vorliegenden Erfindung wird die aus serumunabhängigen Humanzellen — wie etwa Bowes-Il-Zellen - gewonnene und TPA sowie Pro-TPA enthaltende Ernteflüssigkeit zwecks Beseitigung ganzer Zellen und Zellbruchstücke zentrifugiert und wird dann bei Raumtemperatur durch eine Säule durchgesetzt, die aus einer unlöslichen Matrix besteht, an welche ein hinsichtlich TPA und Pro-TPA selektives Affinitätsreagens angeschlossen ist - beispielsweise BrCN-aktivierte Sepharose® -, an welches wiederum der DE-3-lnhibitor angeknüpft worden ist. Nach dem Waschen der Säule wird der adsorbierte TPA und Pro-TPA durch Behandeln der Säule mit einer Pufferlösung wie beispielsweise phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von etwa 5,5—6,0 sowie mit Gehalt an einem chaotropen Reagens wie etwa KSCN - etwa 1,4 bis 2,0 molar, vorzugsweise 1,6 molar - desorbiert. Alternativ hierzu können Benzamidin oder Arginin als desorbierendes Agens gewählt werden.

In einer alternativen Annäherung werden TPA und Pro-TPA durch Chromatografie auf einer monoklonalen Antikörpersäule isoliert, die durch Anknüpfung von monoklonalen Anti-TPA-Antikörpern beispielsweise an Affi-Gel® hergestellt worden ist. Vorteilhafterweise wird sämtlichen in den Reinigungsschritten verwendeten Pufferlösungen ein Detergens und dabei speziell ein nichtionisches Detergens wie etwa Triton-X-TOO® oder Tween 80® zugesetzt, um auf diese Weise die Adsorption von TPA und Pro-TPA an die Gefäßoberfläche zu verhindern und die Stabilität zu verbessern. Das Detergens kann auf eine finale Konzentration von 0,01 bis 0,1 % zugesetzt werden.

Die resultierende gereinigte Lösung enthält TPA und Pro-TPA. Zur Herstellung von TPA, der frei von jedwedem Pro-TPA ist, kann der Pro-TPA enzymatisch in TPA umgewandelt werden, dies beispielsweise durch das Einwirken von Plasmin oder einem Enzym mit einem gleichwertigen Effekt auf Pro-TPA.

In einer bevorzugten Verkörperung der vorliegenden Erfindung wird Pro-TPA in im wesentlichen reiner Form und frei von TPA isoliert: Bei Pro-TPA handelt es sich um ein echtes Proenzym, d. h. es ist die enzymatisch inaktive Form von TPA, Pro-TPA adsorbiert in einem größeren Ausmaß als TPA an Fibrin, er wirkt daher bei der Herbeiführung der Fibrinolyse selektiver als TPA, da er sich als erster an Fibrin angelagert und nur dann zu TPA umgewandelt wird, wohingegen im Falle von TPA nur eine begrenzte Möglichkeit dafür besteht, daß er einiges Plasminogen im Blutstrom vor jener Fibrinstelle aktivieren wird, an der die lokalisierte Wirkung eigentlich erst erwünscht ist. Zur Herstellung von im wesentlichen TPA-f r.eiem pro-TPA wird vorteilhafterweise während des Reinigungsvorganges ein Proteaseinhibitor wie etwa Aprotinin oder ein basischer pankreatischer Trypsininhibitor einbezogen, um Spuren von Proteasen zu inhibieren, die vorhanden sein können und die eine (teilweise) Umwandlung von Pro-TPA in TPA hervorrufen können. Die abschließende Reinigung erfolgt dann vermittels Chromatografie auf einer ein selektives Affinitätsreagens wie etwa DE-3 enthaltenden Säule in Anwesenheit eines Inhibitors, der, wie beispielsweise Diisopropylfluorophosphat oder Nitrophenylguanidinobenzoat selektiv nur TPA und nicht Pro-TPA bindet. Diese Reagenzien verhindern, daß TPA an die

Affinitätssäble adsorbiert wird. Demzufolge wird der gebundene TPA durch die DE-3-Säule hindurchgehen, wohingegen Pro-TPA an der Säule adsorbieren kann.

Dementsprechend besteht die vorliegende Erfindung in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von TPA, Pro-TPA oder deren Gemischen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Erzeugung von TPA, Pro-TPA oder deren Gemischen fähige serumunabhängige Humanzellen oder deren Mutanten wie etwa Bowes-Il-Zellen in einem serumfreien Medium kultiviert und die gewünschten Proteine aus der Ernteflüssigkeit isoliert werden und daß - sofern gewünscht — eine Mischung der so gewonnenen Proteine in die einzelnen Komponenten separiert oder umgewandelt wird. Speziell vermittelt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Pro-TPA-freiem TPa, gekennzeichnet dadurch, daß in einer gewonnenen Mischung vorliegender Pro-TPA enzymatisch in TPA umgewandelt wird. Speziell vermittelt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von TPA-freiem Pro-TPA, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß während der Isolation ein Protaseinhibitor einbezogen wird und daß die Reinigung einschließlich der abschließenden Reinigung in Anwesenheit eines Inhibitors vorgenommen wird, welcher TPA selektiv inhibiert

Pharmazeutische Präparationen

Die neuen Proteine, speziell TPA und Pro-TPA, die erfindungsgemäß beispielsweise aus kultivierten Bowes-Il-Zellen gewonnen werden können, weisen wertvolle pharmakologische Eigenschaften auf. So können TPA und Pro-TPA aus Bowes-Il-Zellen in Analogie zu bekannten Plasminogen-Aktivatoren bei Menschen zur Verhütung oder Behandlung von Thrombose oder anderen Zuständen verwendet werden, bei denen es gewünscht wird, über den Mechanismus der Plasminogenaktivierung eine lokale fibrinolytische oder proteolytische Aktivität zu erzeugen. Dies betrifft Krankheiten wie etwa Arteriosklerose, myokardialen und zerebralen Infarkt, Venenthrombose, Thromboembolie, postoperative Thrombose, Thrombophlebitis und diabetesbedingte Gefäßerkrankungen.

Die Erfindung bezieht sich darüber hinaus auf pharmazeutische Präparate, die eine therapeutisch wirksame Menge des aktiven Bestandteiles (insbesondere TPA, Pro-TPA oder deren Gemische) gemeinsam mit organischen oder anorganischen, festen oder flüssigen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffen enthalten, wobei sich letztere für eine parenterale, d. h. intramuskuläre, subkutane oder intraperitonale Verabreichung eignen müssen und keine nachteilige Wechselwirkung mit den Wirkstoffen entwickeln dürfen.

Besonders geeignet erscheinen Infusionslösungen und dabei zugsweise wäßrige Lösungen oder Suspensionen, wobei es möglich ist, diese vor der Anwendung beispielsweise aus gefriergetrockneten Präparaten herzustellen, welche den Wirkstoff allein oder gemeinsam mit einem Trägerstoff wie etwa Mannitol, Laktose, Glukose, Albumin und dergleichen enthalten. Das pharmazeutische Präparat kann sterilisiert und - sofern gewünscht - mit Zusatzstoffen wie etwa Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Emulgatoren, Lösungshilfsmitteln, Puffern und/oder Salzen zur Regulierung des osmotischen Druckes vermischt werden. Die Sterilisierung kann durch sterile Filtration durch Filter kleiner Porengröße (0,45 μπ\ Durchmesser oder kleiner) erreicht werden, worauf das Präparat bei Bedarf lyophilisiert werden kann. Desgleichen können Antibiotika zugesetzt werden, um zur Erhaltung der Sterilität beizutragen. Das erfindungsgemäße pharmazeutische Präparat wird in einheitlichen Dosierungsformen verteilt, so beispielsweise in Form von Ampullen mit 1 bis 2000 mg eines pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffes pro Dosierungsform sowie etwa 1 bis 20 mg vorzugsweise etwa 3 bis 15 mg - des aktiven Bestandteiles (TPA, Pro-TPA oder deren Gemische) pro Dosierungseinheit. Je nach Art der Krankheit sowie nach Alter und Zustand des Patienten liegt die zur Behandlung eines Patienten von etwa 70 kg Körpermasse zu verabreichende tägliche Dosis im Bereich von 3 bis 15 mg - vorzugsweise 5 bis 10 mg — pro 24 Stunden. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß ein erfindungsgemäßes biologisch aktives Protein einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff beigemischt wird. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Verfahren zur Herstellung der in den Ausführungsbeispielen beschriebenen Proteine.

Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, ohne daß diese dadurch eingegrenzt werden soll.

Experimenteller Teil

Im experimentellen Teil verwendete Abkürzungen

BPTI basischer pankreatischer Trypsininhibitor

BSA bovines Serumalbumin

DEP Diisopropylfluorophosphat

DMEM Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

DTT 1,4-Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintatraessigsäure

FCS fötales Kälberserum

PBS phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung 8 mM Na₂HPO₄; 1,5 mM KH₂PO„;0,14 M NaCI; 2,7 mM KCI)

RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute Kulturmedium 1640

SDS Natriumdodecylsulfat

TCA Trichloressigsäure

Tris tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan

T-T (0,1) 0,1 M Tris · HCIpH 9,1, 0,1 %TritonX-100 enthaltend

Ausführungsbeispiel 1: Anlegen der serumunabhängigen Zellinie Bowes Il

a) Anlegen der Bowes-Il-Zellinie mit Hilfe des von Bowes-I-Zellen gesammelten konditionierten Mediums Eine humane Melnsomzellinie (Bowes-RPMI 7272; beschrieben von D. C. Rijken und D. Collen, J. Biol. Chem. 256, 7035-7041 (1981) wurde über Dr. E. Reich, Rockefeller University, NewYork bezogen. Die Zellinie wird in Gewebekulturkolben (150 cm², Coster) bei 37 °C CO₂ in einer humiden Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO₂ kultiviert. Die Zellen wachsen als adhärente Monoschichten in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium-1640 (Gibco), welches durch Natriumbikarbonat (2 g/l). Antibiotika (300 μg/ml

Penizillin; 200 μg/ml Streptomyzin; 10 ug/ml Tylozin) sowie 10%iges hitzeinaktiviertes (56⁰C; 30 min) fötales Kälberserum (FCS) ergänzt ist.

Ein eine adhärente Zellen-Monoschicht enthaltender Gewebekulturkolben wird ausgewählt. Bei Konfluenz wird das serumhaltige Mediums entfernt und durch 50 ml des durch Antibiotika ergänzten (siehe oben) RPMI-1640-Mediums ersetzt. In dieses Medium werden keine anderen Zusätze einbezogen. Die Zellen werden bei 37°C in feuchter atmosphärischer Luft gehalten, die mit 5% CO₂ angereichert wurde. Das Medium wird in 24-h-lntervallen ausgewechselt. Anfangs erscheinen die Zellen gesund und bleiben adhärent. Nach 12 Tagen beginnen sich die Zellen vom Kulturgefäß abzulösen und schwimmen frei im Medium. Nach 14 Tagen hat sich die Mehrzahl der Zellen abgelöst, und nur noch ein geringer Anteil lebensfähiger Zellen verbleibt am Kolben haftend. Das die abgelösten Zellen enthaltende Medium wird beseitigt. Die spärliche adhärente Kultur von Melanomzellen, der das Serum über eine langer Zeitspanne hinweg entzogen worden ist, wird mit 50 ml neuen Mediums bedeckt, welches sich aus „konditioniertem Medium" zusammensetzt, welches mit einem gleichen Volumen an RPMI-1640 verdünnt wurde. Das „konditionierte Medium" wird folgendermaßen gewonnen:

Se.rumhaltiges Medium wird von zusammenhängenden serumabhängigen Melanomzellen Bowes-RPMI 7272 abgenommen und durch RPMI-1640-Medium allein ersetzt. 24 h später wird dieses Medium geerntet, 5 min lang bei 2000 U/min zentrifugiert und durch einen 0,45 μητι Milliporenfilter durchgesetzt. Die resultierende Lösung wird als „konditioniertes Medium" bezeichnet und wird unverzüglich mit einem gleichen Volumen RPMI-1640 verdünnt

Mit frischem RPMI-1640 verdünntes „konditioniertes Medium" wird der Kultur in Abständen von 4 bis 5 Tagen über eine Periode von

3 Monaten hinweg zugesetzt. Nach dieser Zeit hat sich die Zellanzahl beträchtlich gesteigert, und die serumfreie Kultur benötigt kein weiteres „konditioniertes Medium". Die Kultur wird dann einzig und allein mit RPMI-1640-Medium gespeist.

Die auf diese Weise gewonnenen serumunabhängigen Zellen werden in Gewebekulturkolben (150 cm², Costar) kultiviert und müssen zwecks Sicherung des Überlebens in einer Dichte von ungefähr 10⁶ Zellen/ml Medium eingesät werden, typischerweise werden die Zellen mit 5 x 10⁷ Zellen/50 ml RPMI-1640/150 cm² Kolben eingesät. Die Zellen wachsen im serumfreien Medium sehr langsam und zeigen eine Generationszeit von ungefähr 6 Tagen (verglichen mit einer Generationszeit von ungefähr 24 Stunden bei der serumabhängigen Zellinie Bowes-RPMI 7272). BeiXonfluenz werden die Zellen durch lebhaftes Aufstoßen des Kolbens abgelöst, um adhärente Zellen in das Medium zu übertragen. Die auf diese mechanische Weise umgesetzten Zellen werden mit einer Konzentration von etwa 10⁶ Zellen/ml in RPMI-1640 suspendiert und dazu verwendet, erneut frische Gewebekulturkolben zu bestellen. Die durch das Aufstoßen nicht abgelösten Zellen werden mit frischem RPMI-1640-Medium versorgt. Auf diese Weise wird über eine Gesamtzeitspanne von 5 Monaten hinweg eine Kultur der serumunabhängigen Zellinie Bowes-Il angelegt. b) Anlegen der Bowes-H-Zellinie in Abwesenheit des von Bowes-I-Zellen gesammelten konditionierten Mediums

4 ml eines gefrorenen Vorrates der serumabhängigen Melanomzellinie Bowes-RPMI 7272 (2,5 x 10⁶ Zellen/ml in DMEM), 15% fötales Kälberserum um 10% DMSO enthaltend, werden aufgetaut und zu 15 ml serurhfreiem vorgewärmtem DMEM in einem 75-cm²-Gewebekulturkolben zugesetzt. Die Zellen werden über Nacht bei 37⁰C in humider atmosphärischer Luft, die durch 5% CO₂ ergänzt wurde, bebrütet. Nach dieser Zeitspanne wird das gesamte Medium einschließlich nicht adährenter Zellen abgeführt und durch 15 ml serumfreies DMEM ersetzt. Die Bebrütung wird fortgesetzt, bis die Zellen unter dem Mikroskop granuliert erscheinen (24 bis 72 Stunden); zu diesem Zeitpunkt werden 50% des Mediums entfernt und durch frisches serumfreies DMEM ersetzt. Diese Prozedur wird alle zwei bis drei Tage je nach Erfordernis (mikroskopisches Erscheinungsbild der Zellen, pH-Veränderung des Mediums) wiederholt, wobei das Gesamtvolumen des Mediums allmählich auf 30 ml gesteigert wird. Nachdem eine 60 bis 70%ige Konfluenz erreicht ist (nach etwa 3 Wochen), werden die Zellen in zwei neuen Kolben gleicher Größe überführt, wobei 0,02%ige EDTA zu verwenden ist, um die Zellen von der Oberfläche der Kulurschale abzulösen. Beim ersten Überführen wird serumfreies DMEM zu 40% mit Medium ergänzt, welches vor der EDTA-Behandlung von der Kultur abgenommen worden war. Zu diesem Zeitpunkt ist die serumfreie Linie angelegt, und die Zellen werden fortfahren, sich in Abwesenheit von konditioniertem Medium zu teilen, sofern eine ausreichend hohe Zelldichte, d. h. eine mindestens 30%ige Konfluenz aufrechterhalten wird.

Ausführungsbeispiel 2: Kultivierung von Bowes-Il-Zellen in Submerskultur

In Gewebekulturkolben sowie in serumfreiem Medium RPMI-1640 bis zur Konfluenz angebaute Bowes-Il-Zellen werden durch kräftiges Aufstoßen der Kolben per Hand abgelöst, zwecks Erbringung von 0,6 I Suspension mit 2 x 10⁵ Zellen/ml zusammengefaßt und in einen dampfsterilisierten 3-l-Glasbehälter überführt. Die Zellsuspension wird mit einem mechanischen Rührer langsam bewegt (40 U/min). Die Temperatur wird auf 37 ±0,1 ⁰C eingeregelt, und die Kultur wird durch Oberflächenbelüftung mit 5% CO₂ enthaltender Luft bei einer Strömungsmenge von 0,2 l/min mit Sauerstoff versorgt. Das Abfallen des pH-Wertes unter 6,9 wird durch Zurückgreifen auf reine Luft verhindert. Während der anfänglichen Anpassungsperiode von etwa einer Woche wird frisches serumfreies Medium zugesetzt, um ein Erschöpfen der Glukose zu verhindern. Das abschließende Kulturvolumen beträgt 1 Liter. Nach dem Erreichen einer Zelldichte von 3...4 x 10⁵ wird mit dem Abziehen der Kulturflüssigkeit in periodischen Abständen begonnen. Alle 2 bis 4 Tage wird das Umrühren für 3 Stunden unterbrochen, um dem Großteil der lebensfähigen Zellen Gelegenheit zu geben, sich abzusetzen, worauf die oberen 50% des verbrauchten Mediums abgezogen und durch frisches serumfreies Medium ersetzt werden. Die Ernteflüssigkeiten werden 5 min lang bei 2000 U/min (~ 300 g) zentrifugiert, um ganze Zellen und Zellbruchstücke zu beseitigen. Die Lösungen werden mit Triton X-100 · ® auf eine finale Konzentration von 0,1 % stabilisiert und vor der Lagerung bei -20⁰C mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 5,5...6,0 azidifiziert.

Ausführungsbeispiel 3: Kultivierung von Bowes-Il-Zellen in Gewebekulturkolben sowie Sammlung von Ernteflüssigkeiten

Die serumabhängige Zellinie Bowes-Il wird mit 5 χ 10⁷ Zellen/150 cm² Gewebekulturkolben (Costar) in 50 ml RPMI-1640, welches mit Antibiotika ergänzt ist (vgl. Ausführungsbeispiel 1) bei 37⁰C in einer humiden Atmosphäre aus 95% Luft und 5% CO₂ inokuliert. Nach dem Anhaften der Zellen wird das Medium von den Zellen abgesammelt und durch frisches, mit Antibiotika ergänztes RPMI-1640 ersetzt. Das Abnehmen von serumfreien Ernteflüssigkeiten wird in 24-h-lntervallen wiederholt, bis das Zusammenwachsen der Monoschicht ein Abtragen erforderlich macht. Konfluenz wird nach ungefähr 5 Wochen erreicht. Das Abtragen erfolgt in der in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Weise. Die Ernteflüssigkeit wird in der in Ausführungsbeispiel 2 beschriebenen Weise aufbereitet.

Ausführungsbeispiel 4: Bestimmung des Gehaltes an TPA und Pro-TPA in Ernteflüssigkeiten

Die TPA und Pro-TPA enthaltenden Ernteflüssigkeiten werden mit ³H-DFP (Diisopropylfluorophosphat) von bekannter spezifischer Wirksamkeit behandelt. Nach der Inkubation werden die markierten Enzyme zurückgewonnen und von nicht in Reaktion gegangenen radioaktivem DFP befreit, indem seine Ausfällung und Waschung mit Trichloressigsäure unter Anwendung jener Verfahren vorgenommen wird, die in der Literatur für Serienproteasen empfohlen werden {J. A. Cohen et al., Methode in Enzymology, Bd. Xl, S. 768 [1967]). Diese Titration der aktiven Stellen des Aktivators bewirkt, daß die von serumunabhängigen Bowes-Il-Zellen abgesammelten Ernteflüssigkeiten ungefähr 10...20 nMol Gesamt-TPA pro Liter enthalten.

Die Freisetzung von Gesamt-TPA (TPA und Pro-TPA) durch Bowes-I- und Bowes-Il-Zellen über 4 aufeinanderfolgende Tage hinweg kann folgendermaßen bestimmt werden:

Über 4 Tage hinweg werden alle 24 Stunden die Ernteflüssigkeiten von Bowes-I-Melanomzellen entnommen, die in 75-cm²-Gewebekulturkolben (1,3 x 10⁵ Zellen/cm²; 20 ml/Kolben) angebaut werden oder sie werden von Bowes-Il-Zellen entnommen, die in 150-cm²-Kolben (410⁵ Zellen/cm²; 50 ml/Kolben) angebaut werden. Die Aktivität des Plasminogenaktivators wird in der '²⁵I-Fibrin-Bestimmung (siehe weiter unten) gemessen. Im Falle der Bowes-Il-Zellen bleibt die TPA-Freisetzung über die viertägige Zeitspanne hinweg konstant, wohingegen im Falle der Bowes-i-Melanomzellen die TPA-Aktivität während der ersten 3 Tage leicht, ansteigt, um dann am vierten Tag abzusinken. Während dieser Zeit hatten sich viele der Zellen von der Oberfläche abgelöst, worauf mit 10% FCS ergänztes RPMI zugesetzt werden muß, um die Adhäsion wiederherzustellen (vgl. Tabelle 1). Bei der¹²⁵l-Fibrin-,Bestimmung (E. L. Wilson und E. Dowdle, Int. J. Cancer 22, 390-399 [1978]) wird ein Festphasensubstrat geschaffen, indem radioaktives '²⁵I-Fibrinogen/Fibrin als eine dünne Schicht auf der Boden-Innenfläche von Kunststoff-Gewebekulturgestellen abgeschieden wird. Proben der zu bestimmenden Ernteflüssigkeiten werden den Gestellen zugesetzt, worauf die TPA-Aktivität als plasminogenabhängige Löslichmachung von Radioaktivität in Abhängigkeit von der Zeit gemessen wird. Da die ¹²⁵l-Fibrinbestimmung sowohl die TPA- als auch die Pro-TPA-Aktivität mißt, beziehen sich die in Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse zur TPA-Aktivität auf das Gesamtenzym.

Tabelle 1:

Gesamt-TPA-Freisetzung durch serumabhängige Bowes-I-Melanomzellen sowie serumunabhängige Bowes-Il-Zellen in Gewebekulturkolben, ausgedrückt in internationalen Urokinase (UK)-Einheiten.

Zelltyp	Zeit (Tage)	Gesamt-TPA (UK-Einh.)
Bowes Melanom I	1 2 3 4	1 154 1 254 1 380 976
Bowes Il	1 2 3 4	3 560 3 660 3 950 3 850

Zusätzlich werden die Kulturflüssigkeiten sowohl der serumabhängigen Bowes-Melanomzellen als auch der serumunabhängigen Bowes-Il-Zellen hinsichtlich ihres individuellen Gehaltes an TPA und Pro-TPA untersucht:

Bowes-I-Melanomzellen werden mit 5 x 10⁵ Zellen pro 35-mm-Replikatschale in 2 ml 10% FCS enthaltendem RPMI plattiert. Nach 24 h wird das Medium durch serumfreies RPMI ersetzt, und 3 aufeinanderfolgende Tage lang wird alle 24 h Ernteflüssigkeit abgesammelt. Am Ende jeder der 24-h-Perioden wird die Zellzahl pro Platte gezählt. Bowes-Il-Zellen werden mit 3 x 10⁶ Zellen pro 35-mm-Schale in 2 ml RPMI plattiert.

Die Bestimmung der Plasminogenaktivator-Aktivität erfolgt unter Anwendung der fluoromatrischen Bestimmung, wobei als Substrat Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC verwendet wird. Die direkte amidolylische Wirkung des TPA wird fluorometrisch gemessen, indem die Fluoreszenz-Steigerungsrate bei 455 nm verfolgt wird, die sich aus der amidolytischen Freisetzung von Aminomethylkumarin (AMC) aus dem fluorogenen Substrat ergibt (vgl. M. Zimmermann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 750-753 [1978]). 1 FU entspricht jener Menge Enzym, die 10 pMol Substrat in einer Minute in der amidolytischen Bestimmung hydrolysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2: TPA- und Pro-TPA-Freisetzung durch serumabhängige Bowes-I. Melanomzellen und serumunabhängige Bowes-Il-Zellen ' .

	Tage	Plasminogenaktivator-Freisetzung	Gesamt	TPA (%)	Pro-TPA (%)^b>
	in Kultur	(FU/10⁶Zellen/24 h)	aktivität
Zelltyp		Zelldichte
	1	(Zellen χ	46,62	87,5	12,4
	2	10⁵xcm-²)	51,96	92,1	7,9
Bowes-Melanom I	3	1,04	64,86	83,9	16,1
	1	1,27	26,06	12,7	87,3
	2	1,43	25,10	12,4	87,5
Bowes Il	3	3,88	24,40	,10,9	88,9
	3,88
	4,01

a) Die Gesamt-TPA-Aktivität wird nach Inkubation von 295 μΙ Ernteflüssigkeit mit 5 μΙ Plasmin (0,1 mg/ml) über 60 min hinweg bei Raumtemperatur gemessen. Für die Bestimmung wird Plasmin durch Trasylol® inhibiert.

b) Die Menge an Proaktivator (Pro-TPA) wird ermittelt, indem die ohne Piasminaktivierung gemessene Aktivität von der Gesamtaktivität abgezogen wird. '

Wie aus Tabelle 2 zu ersehen ist, liegen annähernd 10% des von den serumabhängigen Bowes-Il-Zellen abgesonderten TPA in Form des aktiven Enzyms vor, während annähernd 90% in Form des Proenzyms (Pro-TPA) vorliegen. Im Gegensatz hierzu enthält das von den serumabhängigen Bowes-I-Melanomzellen gesammelte Medium 90%TPA und ungefähr 10% Pro-TPA.

Ausführungsbeispiel 5: Darstellung und Reinigung von TPA und Pro-TPA

a) Herstellung einer DE-3 Sepharose® Säule

26 mg gereinigter DE-3-lnhibitor von Erythrina latissima (F. J. Joubert et al., Hoppe-Seyler's Zeitschr. Physiol. Chem. 302, 531-538 [1981]) werden an 5 ml cyanogenbromidaktivierte Sepharose 4b® (Pharmacia) entsprechend den Anweisungen des Herstellers angeschlossen. Die Matrix wird mitO,4 M NaCI, 0,1 %Triton X-100® und 0,02% Natriumazid enthaltender phosphatgepufferter Kochsalzlösung („PBS") pH 7,4 ins Gleichgewicht gebracht. Die Matrix wird sodann in eine 5-ml-Säule gepackt.

b) Chromatografische Reinigung von TPA und Pro-TPA enthaltenden Emteflüssigkeiten auf DE-3 Sepharose 4b® Zwei Liter der von serumunabhängigen Bowes-Il-Zellen gewonnenen Ernteflüssigkeit (siehe Ausführungsbeispiel 3) werden hinsichtlich NaCI auf 0,4 M eingestellt sowie hinsichtlich Triton-X-100® auf eine Konzentration von 0,1 % eingestellt und durch eine 0,45 μηη Membran (Millipore) gefiltert. Die Ernteflüssigkeit wird dann der DE-3-Sepharose®^:Säule (siehe weiter oben) mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 45 ml/h bei Raumtemperatur appliziert, worauf das abfließende Medium verworfen wird. Nach dem Durchsetzen des gesamten Ernteflüssigkeitsvolumens wird die Säule mit etwa 50 ml PBS gewaschen, die 0,4 M NaCI und 0,1 % Triton X-100® enthält. Die adsorbierten Proteine werden dann unter Verwendung von 1,6 M KSCN, 0,4 M NaCI und 0,1 % Triton X-100® enthaltender PBS eluiert, worauf bei 4°C 2-ml-Fraktionen gesammelt werden. Der Proteingehalt jeder der Fraktionen wird durch Messen der UV-Extinktion bei 280 nm bestimmt. Es zeigt sich, daß das adsorbierte Protein als ein scharfer Gipfel eluiert ist. Die Fraktionen mit der höchsten UV-Extinktion sowie der höchsten fibrinolytischen Aktivität gemäß Bestimmung in der ¹²⁵l-Fibrinbestimmung werden zusammengefaßt, um 8 ml Lösung zu ergeben, welche bei -20⁰C gelagert wird. Diese Lösung repräsentiert annähernd 70...80% der der Säule applizierten Gesamtaktivität. Die Fraktionen niedrigerer Aktivität werden separat zusammengefaßt. Die Gesamtaktivität in beiden Zusammenfassungen macht gewöhnlich 90...100% aus.

Dem Bestand wird eine Probe entnommen. Das Protein wird durch Zusetzen von Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 10% ausgefällt und einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen. Das Elektrophoretogramm zeigt ein einzelnes Proteinband mit einer ungefähren relativen Molekülmasse von 73000 Dalton bei Bestimmung entsprechend der Methode von Weber und Osborne (J. Biol. Chem. 244,4406-4412 [1969]) unter Verwendung von gleichzeitig der Elektrophorese unterzogenen Marker-Proteinen mit bekannter relativer Molekülmasse.

Der TPA- und Pro-TPA-Gehalt des zusammengefaßten Bestandes wird unter Anwendung der fluorometrischen Bestimmung mit CBz-Gly-Gly-Arg-AMC als Substrat ermittelt (vgl. Ausführungsbeispiel 4). Die Gesamt-Aktivität wird nach Inkubation mit Plasming gemessen, das für die Bestimmung mit Trasylol® inhibiert wird. Die Menge an Pro-TPA wird durch Subtrahieren der ohne Piasminaktivierung gemessenen Aktivität von der Gesamtaktivität berechnet. Es kann festgestellt werden, daß die Reinigung des Plasminogenaktivators aus dem Medium von Bowes-Il-Zellen ein Gemisch aus TPA und Pro-TPA in etwa gleichen Proportionen erbringt. Mithin wird während des Isolationsvorganges Pro-TPA teilweise in das aktive Enzym überführt, da in den von Bowes-Il-Zellen gesammelten unverarbeiteten Emteflüssigkeiten der Anteil von TPA 10% und der Anteil von Pro-TPA 90% beträgt (vgl. Ausführungsbeispiel 4, Tabelle 2).

Die Behandlung der Emteflüssigkeiten aus der serumunabhängigen Bowes-Il-Zellinie mit niedrigen Konzentrationen von föralem Kälberserum (0,01 %) resultiert in einer Umwandlung von Pro-TPA zu TPA. Dies ist höchstwahrscheinlich auf das Vorhandensein von Plasmin im FCS zurückzuführen.

c) Chromatografische Reinigung von TPA- und Pro-TPA-haltigen Emteflüssigkeiten auf DE-3-Sepharose 4b in Anwesenheit eines Proteinaseinhibitors

Die Chromatografie der von serumunabhängigen Bowes-Il-Zellen gewonnenen Emteflüssigkeiten wird in ähnlicher Weise vorgenommen, wie sie in Ausführungsbeispiel 5b beschrieben worden ist: eine Ausnahme besteht insofern, als basischer pankreatischer Trypsininhibitor (BTI) mit 0,1 KlU/mi in das Verfahren eingezogen wird. Unter Anwendung der fluorometrischen Bestimmung mit Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC als Substrat (siehe weiter oben) werden die TPA- und Pro-TPA-Gehalte der gereinigten Lösung ermittelt; 90% des TPA liegt in der Proenzymform und 10% in der aktiven Form vor. Mithin wird die Umwandlung von Pro-TPA zu TPA während des Reinigungsvorganges durch BPTI inhibiert.

-11 - zö ι aab

Ausführungsbeispiel 6: Nachweis des Vorhandenseins einer Kette Pro-TPA in gereinigten TPA-Präparationen

Von der serumunabhängigen Zellinie Bowes Il gewonnene Ernteflüssigkeiten werden gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 5c durch Affinitätschromatografie auf DE-3 Sepharose® gereinigt. In der resultierenden gereinigten Lösung liegen annähernd 90% des TPA in der Proenzymform und annähernd 10% in Form des aktiven Enzyms vor, wie sich anhand der amidolytischen Bestimmung vor und nach der Piasminbehandlung zeigt. Die Lösung wird in T-T (0,1) dialysiert. Proben dieser Lösung werden mit gleichen Volumina PBS oder 5 Mg/ml Plasmin enthaltender PBS vermischt. Nach 16stündiger Bebrütung bei 20°C wird SDS auf eine finale Konzentration von 0,1 % zugesetzt, worauf die Proteine mit 6%iger TCA ausgefällt werden. Die Präzipitate von 200^I-Proben der originalen Enzymlösung werden in Aceton gewaschen und in 20 μ! 1 % SDS und 10% Glycerol enthaltender 0,06 M Tris-HCI pH 6,8 wieder aufgelöst. Sofern erforderlich, werden diese Proben in diesem Stadium durch Zusetzen von 2 μ11 M DTT reduziert und 30 min lang bei 37⁰C bebrütet. Sodann werden sämtliche Proben 1 min lang gekocht, und 20 μΙ jeder Probe werden in einer 0,1 % SDS enthaltenden 5...15% Polyacrylamidgel-Platte einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wird das Gel mit Coomassie brilliant blue® gefärbt und wie gewöhnlich entfärbt. Die elektrophoretischen Spuren enthalten (a) Marker der relativen Molekülmasse, (b) unbehandelte und nichtreduzierte TPA-Lösung, (c) unbehandelte und reduzierte TPA-Lösung sowie (d) plasmrnbehandelte und reduzierte TPA-Lösung.

Spur (b) zeigt lediglich ein Proteinband mit einer relativen Molekülmasse von annähernd 73000. Unter reduzierenden Bedingungen (Spur c) wandert der größte Teil des TPA ebenfalls in die 73000-Dalton-Regierung. Es können allerdings auch zusätzliche schwache Bänder in der 35000-Dalton-Region beobachtet werden. Die Piasminbehandlung sowie die Reduktion mit DTT wandelt das 73000-Dalton-Protein in zwei Untereinheiten mit apparenten relativen Molekülmassen von 35000 Dalton bzw. 38000 Dalton um. Diese Experimente demonstrieren, daß die einzelne Kette Pro-TPA mit einer relativen Molekülmasse von 73000 Dalton durch Piasminbehandlung zu der S—S-verknüpften zweikettigen Form (TPA) umgewandelt wird. TPA wird dann unter reduzierenden Bedingungen gespalten, um die beiden Untereinheiten zu ergeben.

Ausführungsbeispiel 7: Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Pro-TPA

Proben (500 μΙ) einer ungefähr 20 FU/ml Gesamtaktivator (TPA und Pro-TPA) in T-T (0,1) enthaltenden TPA-Präparation werden in Anwesenheit (a und b) oder in Abwesenheit (c und d) von 5 mM DFP 60 min lang bei 2O⁰C bebrütet. Freies DFP wird nach der Methode von H. S. Penefsky (J. Siol. Chem. 252, 2891-2899 [1977]) entfernt, indem Proben von jeweils 100 μΙ der Reaktionsmischungen durch 1-ml-Säulen zentrifugiert werden, die mit T-T (0,1) genau ins Gleichgewicht gebrachtes Sephades G25® enthalten. Diesen Proben werden Volumina von 3 μΙ 0,5 mg/ml Plasmin (b und d) oder 3 μΙ PBS (a und c) zugesetzt, worauf die Proben 30 min lang bei 20⁰C bebrütet werden. Fünfzig Mikroliter jeder Probe werden dann der Lösung entnommen und zu 10 μΙ BPTI (1 000 KlU/ml) zugesetzt, um die Piasminaktivität zu inhibieren. Unter Anwendung der fluorometrischen Bestimmung wird die amidolytische Aktivität in jeder der Proben ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3: Aktivierung von DFP-resistentem Pro-TPA mit Plasmin

Behandlung Aktivität

DFP Plasmin

a) + 0,00

b) + + 8,23

c) - . - 6,25

d) - + 17,48

Die Probe hat einen Gesamt-TPA-Gehalt von 17,48 FU/ml (d), davon liegen 6,25 FU/ml in aktiver Enzymform vor (c). Durch Behandlung mit DFP (a) wird das wirksame Enyzm auf nicht nachweisbare Pegel inhibiert. Nach der Behandlung mit DFP kann das aktive Enzym durch Inkubation mit Plasmin (D) erzeugt werden, woraus sich zeigt, daß Pro-TPA gegenüber DFP-Behandlung resistent ist und meßmarer Enzymaktivität ermangelt.

Ausführungsbeispiel 8: Separierung von Pro-TPA von TPA

Die gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 5c gewonnene Lösung von TPA (10%) und Pro-TPA (90%) wird mit0,1 %Triton X-100® enthaltender 0,1 M Tris · HCI auf pH 8,0 eingestellt und in bezug auf DFP auf 1 mM adjustiert. Nach vierstündiger Inkubation bei 37°C wird das Gemisch durch eine 5 ml DE-3 Sepharose® Säule durchgesetzt (vgl. Ausführungsbeispiel 5a). Das den irreversibel inhibierten TPA enthaltenden abfließende Medium wird verworfen. Die Säule wird mit 6 Säulenvolumina PBS gewaschen, welche 0,4 M NaCI und 0,1 %Triton X-100® enthält, anschließend wird sie gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 5b mit PBS eluiert, die 1,6 M KSCN, 0,4 M NaCI und 0,1 % Triton X-100® enthält. Die Fraktionen mit der höchsten UV-Extinktion werden zusammengefaßt. Der so erhaltene Bestand enthält Pro-TPA in im wesentlichen reiner Form, da in der fluorometrischen Bestimmung unter Verwendung von Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC als Substrat keine amidolytische Aktivität nachweisbar ist. Die amidolytische wie auch die fibrinolytische Aktivität können dureh Behandlung mit Plasmin, welches Pro-TPA in das aktive Enzym umwandelt, wiederhergestellt werden.

Ausführungsbeispiel 9: Die Bindung von TPA und Pro-TPA an unlöslich gemachtes Fibrin

Fünf TPA und Pro-TPA ih unterschiedlichen Anteilen enthaltende Proben werden gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 5c oder durch Umwandeln von Pro-TPA in TPA in einer solchen Lösung gewonnen. Ihre Gehalte an aktivem TPA und Pro-TPA werden aus den Ergebnissen der fluorometrischen Bestimmung vor und nach der Piasminbehandlung gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 4 bestimmt. Diese Proben werden dann in T-T (0,1) verdünnt, so daß - bei Vorhandensein von 2 Mg Plasminogen - 0,2 ml ungefähr 30...50% des auf dem Boden von Linbro-Gestellen aufgebrachten ¹²⁵l-Fibrins während des Verlaufes

von 1 Stunde freisetzen würden.

Sodann werden aliquote Mengen (0,2 ml) der Proben in vierfacher Wiederholung Linbro-Gestellen zugesetzt, die mit ¹²⁵l-Fibrin (30 Mg; 100000 cpm) beschichtet sind. Nach einstündiger Inkubation bei O⁰C werden jeweils zwei Gestelle eines jeden Vierfachsatzes dreimal mit T-T (0,1) gewaschen, um ungebundene TPA-Proteine zu entfernen.

Als Bindungsaktivität wird jene Menge an ¹²⁵l-Fibrin gemessen, die in 1 h nach dem Zusetzen von 0,3 ml 2 Mg Plasminogen und 80Mg BSA enthaltende Trie · HCI pH 8,1 löslich gemacht wurde. Die den Gestellen zugesetzte Gesamt-TPA-Aktivität wird als jene Menge ¹²⁵l-Fibrin gemessen, die innerhalb von einer Stunde nach dem Zusetzen von 2 Mg Plasminogen und 80 Mg BSA (0,3 ml des gleichen Puffers) zu Gestellen, die nicht gewaschen worden sind, löslich gemacht wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4: Die Bindung von Pro-TPA an unlöslich gemachtes Fibrin

Probe

, Pro-TPA

Fibrinolytische Aktivität {% I-Fibrin in 60 min löslich gemacht)

Gesamtaktivität

Aktivität nach der Wäsche

ι gebunden

88,7 34,0 64,0 87,0 88,0

29,83 45,90 56,56 48,88 53,85

29,48	98,8
37,52	81,7
41,53	73,4
48,76	99,8
52,49	97,5

Tabelle 4 zeigt, daß ein größerer Prozentsatz von Gesamt-TPA-Enzym an unlöslich gemachtes Fibrin gebunden wird, wenn sich das TPA-Präparat in der PrO-Aktivatorform befindet.

Ausführungsbeispiel 10: Pharmazeutisches Präparat für die parenterale Verabreichung

Eine gemäß Beschreibung in Ausführungsbeispiel 5b, 5c oder 8 gewonnene TPA und/oder Pro-TPA enthaltende Lösung wird gegenüber 0,01 % Tween 80® enthaltendes 0,3 molares Natriumchlorid dialysiert und bei -80°C gelagert. Vor der Verabreichung wird die Konzentration auf 75 Mg/ml Gesamt-TPA (d.h. TPA oder Pro-TPA oder TPA plus Pro-TPA) sowie 0,3 M NaCI eingestellt. Die Lösung wird vermittels Filtration durch einen 0,22 Mm-Membranfilter sterilisiert.

Diese Verfahrensweise eignet sich für die Herstellung von Lösungen von TPA, Pro-TPA oder TPA plus Pro-TPA für die partenterale wie etwa intravenöse Verabreichung.

Ausführungsbeispiel 11: Selektion einer Mutante der serumunabhängigen Zellinie Bowes II, die zur Erzeugung gesteigerter TPA-Pegel imstande ist

Einer Petrischalenkultur der serumunabhängigen Bowes-lI-Zellinie wird 5% fötales Kälberserum zugesetzt, um die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen zu steigern und zu gewährleisten, daß sich zu einem bestimmten Zeitpunkt mehr Zellen in der s-Phase befinden. Zum Zeitpunkt eines raschen Teilens der Zellen sowie in der exponentiellen Wachstumsphase und wenn eine ungefähr 70%ige Konfluenz erreicht ist, werden der Kultur 0,1 mM N-Methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidin (MNNG) zugesetzt. Diese Konzentration bewirkt den Tod von ungefähr 70 bis 80% der Zellen. Nach 36 Stunden werden die verbleibenden lebensfähigen Zellen durch Trypsinisation von der Petrischale entfernt. Die Zellen werden mit einer Dichte von 1 x 10⁵ Zellen/60 mm Petrischale wieder ausgesät. Zwei Wochen später werden Kolonien von Zellen auf dem Boden der Schale beobachtet, wobei jede Kolonie die Nachkommenschaft einer einfachen, die Mutsgenese überlebt habenden Zelle, darstellt. Diese Kolonien werden dann mit 1 ml einer überlagernden Lösung bedeckt, welche sich zusammengesetzt aus:

50 μΙ Plasminogen (1 mg/ml),

300 μΙ 8% Kasein in isotonischer Kochsalzlösung,

600 μΙ 2,5% Ager in isotonischer Kochsalzlösung sowie

800 μΙ RPMI-1640-Medium.

Um die TPA erzeugenden Klone herum entwickeln sich Lysis-Areale, wobei die größten Lysin-Flächen um jene Klone herum beobachtet werden, welche den meisten TPA produziert. Der den höchsten TPA-Pegel erzeugende Klon wird isoliert und auf einer Petrischale expandiert.

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung von TPA, Pro-TPA oder deren Gemischen und gegebenenfalls der üblichen pharmazeutischen Anwendungsformen, gekennzeichnet dadurch, daß zur Erzeugung von TPA und/oder Pro-TPA fähige serumunabhängige Humanzellen in einem serumfreien Medium kultiviert und die gewünschten Proteine aus der Ernteflüssigkeit isoliert wird und gekennzeichnet weiter dadurch, daß - sofern gewünscht - eine gewonnene Mischung von TPA und Pro-TPA separiert oder in die einzelnen Komponenten umgewandelt wird und gegebenenfalls TPA, Pro-TPA oder deren Gemischen mit üblichen gallenischen Hilfs- und/oder Trägerstoffen zu üblichen pharmazeutischen Anwendungsformen verarbeitet werden.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei den serumabhängigen Humanzellen um Bowes-Il-Zellen oder deren Mutanten handelt.
3. Verfahren nach Punkt 1, zur Herstellung von Pro-TPA-freien TPA, gekennzeichnet dadurch, daß der in einer gewonnenen Mischung vorhandene Pro-TPA enzymatisch in TPA umgewandelt wird.
4. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung von TPA-freien Pro-TPA, gekennzeichnet dadurch, daß während der Isolations- und Reinigungsprozedur ein Proteaseinhibitor einbezogen wird und daß die abschließende Reinigung in Anwesenheit eines Inhibitors vorgenommen wird, welcher TPA selektiv inhibiert.
5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich um ein Verfahren zur Herstellung von Gemischen aus Gewebe-Plasminogenaktivator handelt.
6. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß es sich um ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aus Gewebe-Plasminogenaktivatoren handelt, wobei 90% in der Proenzymform und 10% in Form des aktiven Enzyms vorliegen.
7. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß ein gewonnenes Gemisch aus TPA und Pro-TPA mit Plasmin odereinem Enzym behandelt wird, welches eine äquivalente Wirkung und Pro-TPA ausübt.
8. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß der Protaseinhibitor unter Aprotinin und basischem pankreatischem Trypsininhibitor ausgewählt wird.
9. Verfahren nach irgendeinem der Punkte 4 oder 8, gekennzeichnet dadurch, daß die abschließende Reinigung durch Chromatografie auf einer Säule vorgenommen wird, die ein selektives Affiniträtsreagenz in Anwesenheit von Diisopropylfluorophasphat oder Nitrophenylguanidinobenzoat enthält.
10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die abschließende Reinigung durch Chromatografie auf einer monoklonalen Anti-TPA-Antikörpersäule vorgenommen wird.
11. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Zellen als eine adhärente Kultur kultiviert werden.
12. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Zellen als eine Suspensionskultur kultiviert werden.
13. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die gewonnene Ernteflüssigkeit zentrifugiert und anschließend einer Affinitätschromatografie unterzogen wird.
14. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß während des isolations- und Reinigungsvorganges ein Datergen einbezogen wird.