DD252000A1 - PROCESS FOR MICROBIAL PRODUCTION OF GIBBERELLIN ACID - Google Patents

PROCESS FOR MICROBIAL PRODUCTION OF GIBBERELLIN ACID Download PDF

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DD252000A1 DD29341486A DD29341486A DD252000A1 DD 252000 A1 DD252000 A1 DD 252000A1 DD 29341486 A DD29341486 A DD 29341486A DD 29341486 A DD29341486 A DD 29341486A DD 252000 A1 DD252000 A1 DD 252000A1
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fusarium moniliforme
gibberellic acid
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DD29341486A
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Inventor
Gerhard Reuter
Ortwin Haessler
Bettina Brueckner
Dieter Blechschmidt
Peter Huebsch
Guenther Sembdner
Klaus Schreiber
Bernd Geyer
Horst Haeckert
Sieghard Lang
Klaus Jasche
Elke Schikowsky
Dietmar Paul
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Univ Schiller Jena
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Gibberellinsaeure. Es ist das Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Gibberellinsaeure zu entwickeln, bei dem mit einem Festsubstrat-Naehrmedium oekonomisch relevante Gibberellinsaeure-Konzentrationen erreicht werden fuer den Einsatz als Wachstumsregulator an Pflanzen. In der Erfindung werden geeignete Fermentationsbedingungen fuer Fusarium moniliforme SHELD. m567 auf pflanzlichen Festsubstrat-Fermentationsmedien zur Produktion von Gibberellinsaeure beschrieben.The invention relates to a method for the microbial production of gibberellic acid. It is the object of the invention to develop a process for the microbial production of gibberellic acid, in which ecologically relevant gibberellic acid concentrations are achieved with a solid substrate nutrient medium for use as a growth regulator on plants. In the invention, suitable fermentation conditions for Fusarium moniliforme SHELD. m567 on plant solid substrate fermentation media for the production of gibberellic acid.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Gibberellinsäure. Gibberellinsäure kann als Wachstumsregulator bei Pflanzen eingesetzt werden.The invention relates to a process for the microbial production of gibberellic acid. Gibberellic acid can be used as a growth regulator in plants.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

In bisher beschriebenen Verfahren wird Gibberellinsäure = GA in mikrobiellen Submerskulturen hergestellt, indem die zunächst eingeleitete aktive Wachstumsphase der Mikroorganismen unterbrochen wird, wenn ein erforderlicher Bestandteil des Nährmediums, z. B. Stickstoff oder Kohlenstoff, aufgebraucht ist. Die anschließende Phase der GA-Bildung wird durch allmähliche Zufütterung unter Vermeidung hemmender Konzentrationen von Kohlenstoff-Verbindungen positiv beeinflußt (BORROW, A. et al. [1958/1963] DPAS 1 150 348; zusammenfassende Literaturübersicht bei BRUECKNER, B. und BLECHSCHMIDT, D. [1986], J. Basic. Microbiol. im Druck). Die vorhandenen Patente befassen sich ausschließlich mit der fermentativen Bildung von GA in Flüssigmedien. Nachteilig bei diesen Verfahren ist ein Fermentationsregime mit der Notwendigkeit einer Zufütterung nach unterbrochener Wachstumsphase und die erforderliche GA-Isolierung aus großem wäßrigem Flüssigkeitsvolumen. Bei Untersuchungen über den Einfluß komplexer Nährsubstrate auf die Gibberellinbildung von Fusarium moniliforme SHELD. wurde die höchste GA-Bildung auf festem Reissubstrat in Standkulturen mit 10 g und 100 g Substrat in einer Konzentration von 1 500-2500 mg GA/kg Substrat halbquantitativ dünnschichtchromatographisch ermittelt (FOCKE, J. et al. [1967], Biol. Zbr. 86, 509-519). Diese Ausbeuten sind für eine industrielle GA-Produktion unzureichend.In previously described methods, gibberellic acid = GA is produced in microbial submerged cultures by interrupting the initially initiated active growth phase of the microorganisms when a required component of the nutrient medium, e.g. As nitrogen or carbon is used up. The subsequent phase of GA formation is positively influenced by gradual addition while avoiding inhibitory concentrations of carbon compounds (BORROW, A. et al., [1958/1963] DPAS 1,150,348, reviewed by BRUECKNER, B. and BLECHSCHMIDT, D.B. [1986], J. Basic, Microbiol., In press). The existing patents deal exclusively with the fermentative formation of GA in liquid media. A disadvantage of these methods is a fermentation regime with the need for feeding after interrupted growth phase and the required GA isolation from a large aqueous liquid volume. In studies on the influence of complex nutrient substrates on the gibberellin formation of Fusarium moniliforme SHELD. the highest GA formation on solid rice substrate was determined by semi-quantitative thin layer chromatography in stationary cultures with 10 g and 100 g substrate at a concentration of 1500-2500 mg GA / kg substrate (FOCKE, J. et al. [1967], Biol. Zbr. 86, 509-519). These yields are insufficient for industrial GA production.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von GA zu entwickeln, bei dem mit einem Festsubstrat-Nährmedium ökonomisch relevante GA-Konzentrationen erreicht werden.The aim of the invention is to develop a method for the microbial production of GA, in which with a solid substrate nutrient medium economically relevant GA concentrations are achieved.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von GA durch Anwendung der Festsubstratfermentation zu erhalten. Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Submerskulturen von Ga bildenden Pilzen mit der Notwendigkeit einer Substrat-Zufütterung nach unterbrochener Wachstumsphase sollen dabei Bedingungen geschaffen werden, die ein mikrobielles Wachstum mit allmählicher Freisetzung zunächst überwiegend polymer gebundener Kohlenstoff- und Stickstoff-Verbindungen gestatten. Damit soll unter Umgehung einer dosierten Zufütterung von Kohlenstoffverbindungen der GA-Gehalt im Nährmedium erhöht werden, um günstige Voraussetzungen für die präparative Gewinnung von GA zu schaffen. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß der Stamm m567 von Fusarium moniliforme SHELD. oder eine seiner Selektanten oder Mutanten in einem Festsubstrat kultiviert wird. Fusarium moniliforme SHELD. ist die imperfekte Form von Giberella fujikuroi (SAW.)WR., einem Ascomyceten, dem Erreger der „rosaroten Kolbenfäule" von Mais und der „Bakanae-Krankheit" von Reis. Der Pilz scheidet bei Wachstum auf Reis-Metabolite aus, die zu einem übersteigerten Längenwachstum der Pflanzen führen. Der Stamm ist beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, der AdW der DDR unter der Bezeichnung hinterlegt.The object of the invention is to obtain a simple process for the microbial production of GA by using the Festsubstratfermentation. In contrast to the submucosal cultures of Ga-forming fungi described so far, which require the substrate to be added after an interrupted growth phase, conditions are to be created which permit microbial growth with gradual release, initially predominantly of polymer-bound carbon and nitrogen compounds. This is intended to increase the GA content in the nutrient medium while avoiding a metered addition of carbon compounds in order to create favorable conditions for the preparative recovery of GA. According to the invention, the object was achieved in that the strain m567 of Fusarium moniliforme SHELD. or one of its selectants or mutants is cultured in a solid substrate. Fusarium moniliforme SHELD. is the imperfect form of Giberella fujikuroi (SAW.) WR., an ascomycete, the causative agent of the "pink rot" of corn and the "Bakanae disease" of rice. The fungus excretes on growth on rice metabolites, which lead to an exaggerated growth in length of the plants. The strain is deposited with the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy, Jena, the AdW of the GDR under the name.

Die Fermentation erfolgt unter aeroben Bedingungen in einem Festsubstrat-Nährmedium aus vorbehandelten Bestandteilen von Früchten unterschiedlicher Pflanzen als C- und N-Quelle in einem Temperatur-Bereich von 20°C bis 35°C, vorzugsweise von 25°C bis 29°C und einem Feuchtigkeitsgehalt von 35% bis 60%, vorzugsweise von 40% bis 50%. Die als Festsubstrat-Fermentation durchzuführenden Hauptkulturen werden mit einer 3 Tage alten Vorkultur beimpft. Als Impfmaterial für die Vorkultur dienen Mycel-Agarstücke.The fermentation is carried out under aerobic conditions in a solid substrate nutrient medium from pretreated components of fruits of different plants as C and N source in a temperature range of 20 ° C to 35 ° C, preferably from 25 ° C to 29 ° C and a Moisture content of 35% to 60%, preferably 40% to 50%. The main cultures to be carried out as solid substrate fermentation are inoculated with a 3-day old preculture. Mycelium agar pieces serve as seed material for the preculture.

Im Gegensatz zu den bisher durch Festsubstrat-Fermentation von Fusarium moniliforme SHELD. bei 14tägiger Kulturzeit erzielten Konzentrationen von 1 500-2500 mg GA/kg Substrat werden mit dem Stamm m567 unter den gewählten Bedingungen bei 14- bis 20tägiger Kulturzeit Konzentrationen von durchschnittlich 8000 mg GA/kg Festsubstrat erreicht. Im Gegensatz zu den bisher gewählten Bedingungen erfolgt die Fermentation als Standkultur oder in rotierenden Gefäßen unter Belüftung, so daß im Gegensatz von bisher eingesetztem 10 g und 100 g Substrat jetzt mindestens 500 g Substrat eingesetzt werden können. Im Gegensatz zu den Befunden, daß nur mit Reis höchste GA-Biidung möglich ist, können vorbehandelte Bestandteile von Früchten auch anderer Pflanzen, wie Gerste, Hirse, Mais, Hafer, vorzugsweise Gerstengraupen, an Stelle von Reis eingesetzt werden. GA wird aus dem Medium in einer im Prinzip bekannten Weise isoliert (SCHARCH, I. [1976], Dissertation MLU Halle [S.]).In contrast to the hitherto by solid substrate fermentation of Fusarium moniliforme SHELD. Concentrations of 1 500-2500 mg GA / kg substrate obtained at a culture time of 14 days are achieved with the strain m567 under the selected conditions at an average of 8000 mg GA / kg solid substrate for 14 to 20 days culture time. In contrast to the previously selected conditions, the fermentation is carried out as a stand culture or in rotating vessels under ventilation, so that in contrast to previously used 10 g and 100 g of substrate now at least 500 g of substrate can be used. In contrast to the findings that only with rice highest GA-Biidung is possible, pretreated components of fruits of other plants, such as barley, millet, corn, oats, preferably barley barley, can be used in place of rice. GA is isolated from the medium in a manner known in principle (SCHARCH, I. [1976], dissertation MLU Halle [p.]).

Ausführungsbeispieleembodiments

Beispiel 1example 1

Die Fermentation erfolgt mit einer Selektante des Stammes.Fusarium moniliforme SHELD. m567. Mit 2 ml einer 3 Tage alten Vorkultur (Saccharose/NHaNCyFlussigmedium als Schüttelkultur) wird das Festsubstrat-Medium angeimpft. Vorbereitung des Festsubstrat-Mediums: In 500 ml Enghals-Standkolben werden 20 g Naturreis mit 16 ml H2O versetzt, 1 h gequollen und 25 min im Autoclaven bei 1210C erhitzt. Die Kultur erfolgt bei 29°C, wobei der GA-Gehalt bis zum 20. Tag nach dem Animpfen ansteigt: Kulturzeit in Tagen: 10 14 18-20The fermentation is carried out with a selectante of the strain.Fusarium moniliforme SHELD. M567. With 2 ml of a 3-day old preculture (sucrose / NHaNCyFlussigmedium as shaking culture), the solid substrate medium is inoculated. Preparation of the solid substrate medium: In 500 ml narrow-mouth bottom flask 20 g of brown rice with 16 ml of H 2 O are added, swollen for 1 h and 25 min heated in an autoclave at 121 0 C. The culture is carried out at 29 ° C, with the GA content increasing until the 20th day after inoculation: culture time in days: 10 14 18-20

mg GA/kg Substrat: 1 990 5 310 6 310 7 550mg GA / kg Substrate: 1 990 5 310 6 310 7 550

Die Analysenwerte sind Durchschnittswerte aus jeweils 3 Einzelkolben-Analysen. Die Analysen erfolgen in bekannter Weise (BU'LOCK, J. D. et al. [1974] Trans. Br. mycol. Soc. 62, 377-389; SCHARCH, I. [1976], Dissertation MLU Halle [S.]) nach Extraktion mit Essigsäureethylester durch Fluoreszensmessung.The analytical values are average values from in each case 3 single-piston analyzes. The analyzes are carried out in a known manner (BU'LOCK, JD et al. [1974] Trans. Br. Mycol. Soc. 62, 377-389; SCHARCH, I. [1976], dissertation MLU Halle [S.]) after extraction with ethyl acetate by fluorescence measurement.

Beispiel 2Example 2

Die Fermentation erfolgt mit einer Selektante des Stammes Fusarium moniliforme SHELD. m567. Mit 2 ml einer 3 Tage alten Vorkultur (Saccharose/NH4NOrFlüssigmedium als Schüttelkultur) wird das Festsubstrat-Medium angeimpft. Vorbereitung des Festsubstrat-Mediums: In 500 ml Weithals-Standkolben werden 20 g Gersten-Graupen mit 18 ml H2O versetzt, 1 h gequollen und 25 min im Autoclaven bei 121 °C erhitzt. Die Kultur erfolgt bei 290C, wobei der GA-Gehalt nach 15 Tagen Kulturzeit 8240 mg/kg Substrat beträgt. The fermentation is carried out with a selectant of the strain Fusarium moniliforme SHELD. M567. With 2 ml of a 3-day old preculture (sucrose / NH 4 NO r liquid medium as a shaking culture), the solid substrate medium is inoculated. Preparation of the solid substrate medium: 20 ml of barley barley are mixed with 18 ml of H 2 O in 500 ml of a wide-necked stand-up flask, swollen for 1 hour and heated at 121 ° C. for 25 minutes in an autoclave. The culture is carried out at 29 0 C, wherein the GA content after 15 days of culture time is 8240 mg / kg substrate.

Beispiel 3Example 3

Die Fermentation erfolgt mit einer Selektante des Stammes Fusarium moniliforme SHELD. m567. Mit 10 ml einer 3 Tage alten Vorkultur (Saccharose/NH4NO3-Flüssigmedium als Schüttelkultur) wird das Festsubstrat-Medium angeimpft. Vorbereitung des Festsubstratmediums: In einer 5-l-Glasflasche werden 500 g Naturreis mit 260 ml H2O 1 h gequollen und 25 min im Autoclaven bei 1210C erhitzt. Die Kultur erfolgt bei 29°C unter Rotation der Glasflasche und Belüftung mittels steriler Luft, wobei der GA-Gehalt der Kultur nach 24 Tagen Kulturzeit 7950 mg/kg Substrat beträgt.The fermentation is carried out with a selectant of the strain Fusarium moniliforme SHELD. M567. 10 ml of a 3-day old preculture (sucrose / NH 4 NO 3 liquid medium as a shake culture), the solid substrate medium is inoculated. Preparation of the solid substrate medium: In a 5-liter glass bottle, 500 g brown rice with 260 ml H 2 O are swollen for 1 h and 25 min heated in an autoclave at 121 0 C. The culture is carried out at 29 ° C with rotation of the glass bottle and aeration by means of sterile air, wherein the GA content of the culture after 24 days of culture time is 7950 mg / kg substrate.

Beispiel 4Example 4

Die Fermentation erfolgt mit einer Selektante des Stammes Fusarium moniliforme SHELD. m567. Mit 10 ml einer 3 Tage alten Vorkultur (Saccharose/NH4N03-Flüssigmedium als Schüttelkultur) wird das Festsubstrat-Medium angeimpft. Vorbereitung des Festsubstrat-Mediums: In einer 5-l-Glasflasche werden 500 g Gerstengraupen mit 260 ml H2O 1 h gequollen und 25 min im Autoclaven bei 121 °C erhitzt. Die Kultur erfolgt bei 29°C unter Rotation der Glasflasche und Belüftung mittels steriler Luft, wobei der GA-Gehalt der Kultur nach 14 Tagen Kulturzeit 8230 mg/kg Substrat beträgt.The fermentation is carried out with a selectant of the strain Fusarium moniliforme SHELD. M567. 10 ml of a 3-day old preculture (sucrose / NH 4 N0 3 liquid medium as a shake culture), the solid substrate medium is inoculated. Preparation of the solid substrate medium: In a 5 l glass bottle, 500 g of barley barley are swollen with 260 ml of H 2 O for 1 h and heated for 25 min at 121 ° C. in an autoclave. The culture is carried out at 29 ° C with rotation of the glass bottle and aeration by means of sterile air, wherein the GA content of the culture after 14 days of culture time is 8230 mg / kg substrate.

Claims (4)

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Gibberellinsäure, gekennzeichnet dadurch, daß der Stamm Fusarium moniliforme SHELD. m567 oder eine seiner Selektanten oder Mutanten in einem Festsubstrat-Nährmedium kultiviert wird.1. A process for the microbial production of gibberellic acid, characterized in that the strain Fusarium moniliforme SHELD. m567 or one of its selectants or mutants is cultured in a solid substrate nutrient medium. 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Fusarium moniliforme SHELD. m567 unter aeroben Bedingungen in einem Festsubstrat-Nährmedium aus vorbehandelten Bestandteilen von Früchten unterschiedlicher Pflanzen bei 20-35°C, vorzugsweise bei 25-29°C und einem Feuchtigkeitsgehalt von 35-60%, vorzugsweise von 40-50% kultiviert wird.2. The method according to claim 1, characterized in that Fusarium moniliforme SHELD. m567 under aerobic conditions in a solid substrate nutrient medium from pretreated components of fruits of different plants at 20-35 ° C, preferably at 25-29 ° C and a moisture content of 35-60%, preferably 40-50% is cultivated. 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Kulturzeit 14-20 Tage beträgt.3. The method according to any one of claims 1 and 2, characterized in that the culture time is 14-20 days. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß Fusarium moniliforme SHELD. m567 unter Rotation und Belüftung kultiviert wird.4. The method according to any one of claims 1 and 2, characterized in that Fusarium moniliforme SHELD. m567 is cultivated under rotation and aeration.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008062447A3 (en) * 2006-09-15 2008-12-11 Reliance Life Sciences Pvt Ltd Improved process for gibberellic acid production with fusarium moniliforme strains

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2008062447A3 (en) * 2006-09-15 2008-12-11 Reliance Life Sciences Pvt Ltd Improved process for gibberellic acid production with fusarium moniliforme strains

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