DD252002A1

DD252002A1 - Zyklisches fermentationsverfahren

Info

Publication number: DD252002A1
Application number: DD29355086A
Authority: DD
Inventors: Reinhard Guthke; Michael Peissker; Georg Gira; Werner Hess; Michael Menner; Katharina Mund; Wolfgang A Knorre
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1986-08-11
Filing date: 1986-08-11
Publication date: 1987-12-02

Abstract

Die Erfindung "zyklisches Fermentationsverfahren" ist anwendbar in der mikrobiologischen und pharmazeutischen Industrie fuer die mikrobielle Herstellung von Antibiotika und anderen Produkten. Ziel der Erfindung ist die Erhoehung der Raum-Zeit-Ausbeute und des Konversionsgrades derartiger Fermentationen. Die durch die Erfindung zu loesende Aufgabe besteht darin, auf waehrend der zyklischen Fermentation gesetzmaessig oder zufaellig eintretende Veraenderungen des Prozesszustandes im Sinne einer Zustandsrueckfuehrung so zu reagieren, dass die Produktivitaet und der Konversionsgrad erhoeht und eine in ihrer Zusammensetzung fuer die Aufarbeitung guenstige Kulturloesung am Ende eines jeden Zyklus erzielt wird. Die Aufgabe wird durch ein Verfahren geloest, in dem die Leitgroessen Produkt-, Biomasse-, Substrat- und Geloestsauerstoffkonzentration gemessen, abgeleitete Groessen, insbesondere die Produktivitaet, berechnet, und nach Feststellung des Zustandes die Prozessparameter Zyklusdauer des laufenden Zyklus sowie Substitutionsanteil und Zusammensetzung der Substitutionsmedien der folgenden Zyklen erfindungsgemaess veraendert werden. Fig. 2

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein zyklisches Fermentationsverfahren und ist anwendbar in der mikrobiologischen und pharmazeutischen Industrie für die mikrobielle Herstellung von Antibiotika und anderen Produkten. Es dient zur Verbesserung der ökonomischen Kennziffern derartiger Fermentationsverfahren.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bekannt sind eine Reihe von Verfahren zur zyklischen Fermentation, auch als semikontrnuierliche Fermentation bezeichnet, bei denen eine Anzahl von Zyklen durchgeführt werden, die aus drei Arbeitsschritten:

— Ernte eines Teiles der Kulturlösung

— Wiederauffüllen mit frischer Nährlösung (Substitutionsmedium)

— Fortsetzen der Kultivierung

bestehen, wobei die Zyklusdauer, die prozentuale Menge der teilweisen Ernte, Substitutionsanteil genannt, sowie die Zusammensetzung des Substitutionsmediums für alle Zyklen identisch sind.

Bekannt sind Verfahren zur zyklischen Fermentation sowohl zur Herstellung von Benzylpenicillin /US 2 442 141/, /US 2 584 009/, /US 2 609 327/, /Pilat, P. (1978), Contin. Cultiv. Microorg., Proc. 7^th Symp. Prague, July 10-14, 1978; 753-758/, und Nourseothricin /DD-WP 2 631 022/als auch für die Herstellung anderer Antibiotika /Bosnjak, M., Gamulin, S. (1972), Kemija u Industriji 1972,397/, /Trilli, A., Michelini, V., Mantovani, V„ Pirt, S. J. (1977), J. Appl. Chem. Biotechnol. 27, 219/,/Bosnjak, M.,Topolovec, V., Johanides,

V. (1978), Contin, Cultiv. Microorg., Proc. 7^th Symp. Prague, July 10-14,1978; 723-727/sowie anderer Produkte/GB 1 525 535/, /DD-WP 204 942/,/DD-WP 209 945/.

Nachteil dieser Verfahren ist, daß die Prozeßparameter Zykluszeit, Substitutionsanteil und Zusammensetzung des Substitutionsmediums für alle Zyklen identisch sind und damit die Fermentation nach fest vorgegebenen, starren Zeitregimen, also nicht dem aktuellen Prozeßzustand angepaßt, durchgeführt werden.

Weiterhin sind Vorrichtungen und Verfahren bekannt zur Steuerung von Fermentationsprozessen mit Zustandsrückführung. Es ist bekannt /DD-WP 142 452/, /DD-WP 155 320/, /DD-WP 211 124/, /DD-WP 225 720/, daß Verfahren und Vorrichtungen mit Leitgrößenrückführung den als günstig erkannten stationären Prozeßzustand mit größerer Genauigkeit realisieren als solche ohne diese Rückführung und somit vorteilhaft sind.

Nachteil dieser Verfahren und Vorrichtungen ist, daß die Mikroorganismenpopulation einer mehr oder weniger starken Veränderung durch Mutation, Revertantenbildung und Differenzierung unterliegt, womit die gewünschte Stationarität (d. h. zeitliche Konstanz) nicht oder nur näherungsweise aufrecht erhalten werden kann. Daraus resultiert auch, daß insbesondere für Sekundärmetabolitproduktionen (Antibiotika, Toxine) die kontinuierliche Fermentation im industriellen Maßstab als ungeeignet , eingeschätzt wird /Humphrey, A. E. (1980), Advances in Biotechnology, Proc. 6^th Int. Ferm. Symp. London, Canada, July 20-25,1980; Pergamon Press 1981, 203/.

Es sind weiterhin Verfahren und Vorrichtungen zur nicht stationären Prozeßführung diskontinuierlicher Fermentationen bekannt /DD-WP 140 150/, /DD-WP 143 087/, /DD-WP 229 854/. Nachteil dieser Verfahren ist, daß die Produktivität nach einer bestimmten Zeit, beispielsweise für die Benzylpenicillin-Fermentation erfahrungsgemäß nach etwa 100 bis 200 Stunden, absinkt. Deshalb müssen die entsprechend diesen Verfahren durchgeführten Fermentationen nach dieser Zeitdauer abgebrochen werden. Der Neustart einer Fermentation, verbunden mit der Sterilisation des Fermentors und des Nährmediums, der Hydrolyse des Nährmediums, der Vorkultur des Impfmaterials sowie nach erfolgter Beimpfung mit einer Wachstumsphase, in der kein oder nur wenig Produkt gebildet wird, bedeutet einen festen Aufwand an Zeit und Material, der nicht unmittelbar in einen Zuwachs an Produkt eingeht. Aus diesem Nachteil resultiert, daß insbesondere für die Herstellung von Benzylpenicillin, die diskontinuierliche Fermentation als ungünstig eingeschätzt wird /Pilat, P. (1980), Contin. Cultiv. Microorg., Proc. 7^th Symp. Prague, July 10—14,1978;

Weiterhin ist ein Verfahren bekannt/DD 219 036 A3/, bei dem das Nährstoffangebot und/oder die Verweilzeit periodisch verändert wird in Abhängigkeit von der Abfolge der Zeilzustände der synchronisierten Kultur. Nachteil dieses Verfahrens ist, daß es auf synchronisierbare Kulturen beschränkt ist und damit für bekannte Antibiotikafermentationen nicht geeignet ist.

Bekannt sind Methoden zur Bestimmung von Leitgrößen, insbesondere zur Bestimmung der Benzylpenicillinkonzentration nach der jodometrischen Methode.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung beinhaltet das Ziel, mikrobielle Produkte, wie Antibiotika, Steroide, Proteine, mit hoher Ökonomie, d. h. hoher Produktivität und damit hoher Raum-Zeit-Ausbeute sowie mit hohem Konversionsgrad herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein geeignetes zyklisches Fermentationsverfahren zu beschreiben.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, bei dem die Prozeßparameter Zyklusdauer, Substitutionsanteil und Zusammensetzung des Substitutionsmediums bei zyklischer Fermentation erfindungsgemäß durch Zustandsrückführung, d. h. in Abhängigkeit vom aktuellen Prozeßzustand, für jeden Zyklus individuell festgelegt werden.

Das zyklische Fermentationsverfahren wird folgendermaßen durchgeführt: In einem oder mehreren Fermentoren wird ein Hauptkulturmedium angesetzt und aus einer Vorkultur beimpft, wobei während der anschließenden Fermentation Zugaben von Nährlösungen erfolgen oder unterbleiben. Dieser Startphase schließen sich Zyklen an, die aus den drei Arbeitsschritten:

- Ernte eines Teiles der Kulturlösung, Substitutionsanteil genannt,

- Wiederauffüllen mit frischem Nährmedium, Substitutionsmedium genannt,

- Fortsetzen der Kultivierung bis Ablauf einer Zeitspanne, Zyklusdauer genannt besteht.

Erfindungsgemäß werden während eines jeden Zyklus i der zyklischen Fermentation einzelne oder mehrere der Leitgrößen,

- Produktkonzentration,

- Biomassekonzentration, ~~"

- Substratkonzentration,

- Gelöstsauerstoffkonzentration

gemessen, einzelne oder mehrere der abgeleiteten Größen

- Produktivität oder/und Raum-Zeit-Ausbeute als Quotient aus dem Zuwachs an Produkt, in der Kulturlösung befindlich bzw. aufgearbeitet und gereinigt, dividiert durch die entsprechende Zeit, die für die Fermentation bzw. für die Fermentation plus Fermentorvorbereitung erforderlich war, und dividiert durch das Füll- bzw. das Bruttovolumen des Fermentors,

- Substratverbrauchsraten als Summe aus dem Quotienten aus der Differenz zweier Substratkonzentrationen dividiert durch die entsprechende Zeitdifferenz und dem Quotienten aus der dosierten Substratmenge dividiert durch das Füllvolumen und die Zeitdifferenz,

- Konversionsgräd als der Quotient aus der Produktivität dividiert durch die Substratverbrauchsrate berechnet, und bei den Prozeßparametern

- Substitutionsanteil,

- Zusammensetzung des Substitutionsmediums,

- Zyklusdauer

nachstehende Veränderungen einzeln oder kombiniert durchgeführt.

Ausführungsbeispiel

An zwei Ausführungsbeispielen soll die Erfindung näher erläutert werden. Die Erfindung wird für die Herstellung zweier Antibiotika erläutert, ist aber auch für andere Produkte, wie Steroide und Proteine, anwendbar. Es zeigen die '

Fig. 1: den zeitlichen Ablauf des zyklischen Fermentationsverfahrens zur Herstellung von Benzylpenicillin, Fig. 2: den zeitlichen Ablauf des zyklischen Fermentationsverfahrens zur Herstellung von Nourseothricin.

In den Fig. 1 und 2 bedeuten

BP Konzentration von Benzylpenicillin,

NTC Konzentration von Nourseothricin,

X Konzentration der Biomasse,

GLC Konzentration der Glucose,

S Konzentration der Stärke,

pO₂ Gelöstsauerstoffkonzentration,

0 Start des Basiszyklus 0, d. h. Beimpfen,

1 Start des Zyklus 1, d. h. Ernte eines Teils der Kulturlösung und anschließendes Wiederauffüllen mit Substitutionsmedium sowie Fortsetzen der Kultivierung,

2 Start des Zyklus 2, analog wie Start des Zyklus 1, jedoch mit ggf. veränderten Prozeßparametern Substitutionsanteil, Zusammensetzung des Sub'stitutionsmediums und Zyklusdauer,

3 bis 8 Start des Zyklus 3 bis 8, analog wie Start des Zyklus 2, A1 bis A5 Aktivitäten A1 bis A5.

1. Eine lyophilisierte, an Glucose-Gelatine getrocknete Mycelkonserve des Stammes Penicillium chrysogenum C1/2 (früher hinterlegt im ZIMET, Jena, unter Nr. 102) wird zur Beimpfung von Eprouvetten und das daraus erhaltene Sporenmaterial zur Beimpfung von ungeschälter Hirse in 500 ml-Erlenmeyerkolben sowie das daraus gewonnene Impfmaterial für die Vorkultur im

. Laborfermentor LF2 (ZWG mytron, DDR) mit einem Bruttovolumen von 3 I und einem Arbeitsvolumen von 2,5 I verwendet. Die Vorkultur erfolgt bei der Temperatur 25 ⁰C bis 26°C, der Belüftungsrate 2,5 l/min, der Rührerdrehzahl 600 U/min, solange bis die Stickstoffquelle aus folgendem Vorkulturmedium verbraucht ist:

Komponente	Konzentration	g/l
Glukose	25	g/i
(NH₄J₂SO₄	CJl	g/i
Melasse	5
Maisquellwasser		g/i
(als Trockensubstanz)	25	g/i
NaNO₃	3	g/i
KH₂PO₄	0,5	g/i
MgSO₄ · 7 H₂O	0,1	g/i
ZnSO₄ 7 H₂O	0,02	g/i
MnSO₄ · 5 H₂O .	0,007	g/i
CaCO₃	2	ml/l
Sonnenblumenöl	CJl	ml/l
Polypropylenglykoll	0,2

Das Vorkulturmedium wird im Autoklaven bei 121 ⁰C 60 Minuten lang sterilisiert, nachdem mit Hilfe von NaOH bzw. HCI ein pH-Wert von 6,5 eingestellt wurde.

500 ml der Vorkultur dienen als Impfmaterial für die Hauptkultur. Für die Hauptkultur wird der Laborfermentor LF2 (ZWG mytron, DDR) mit dem folgenden Hauptkulturmedium (2,5 I) verwendet:

Komponente	Konzentration	g/i
Glukose	10	g/i
Maisquellwasser	60	g/i
Na₂S₂O₃ · 5 H₂O	8	g/i
CaCO₃	4,5	ml/l
Sonnenblumenöl	20	ml/l
Polypropylenglykoll	0,04

Der mit dem Hauptkulturmedium gefüllte Fermentor wird im Autoklaven bei 121⁰C 60 Minuten lang sterilisiert, nachdem ein pH-Wert von 6,7 bis 7,0 eingestellt wurde.

Die Bedingungen für die Hauptkultur sind charakterisiert durch folgende Parameter: Temperatur 25 bis 26°C, Belüftungsrate 2,5 l/min, Rührerdrehzahl geregelt mit einem Proportionalregler im Intervall von 600 bis 1000 U/min entsprechend der Gelöstsauerstoffkonzentration von 80 bis 40% der Sättigungskonzentration, pH-Wert zwischen 6,35 und 7,35 zu Beginn und ab 20. Fermentationsstunde geregelt auf größer bzw. gleich pH 6,6 durch NH₄-OH-Zugaben. Der Hauptkultur wird ein Nährmedium zugeführt, das 500 g/l Glukose enthält, das 60 Minuten bei 121⁰C im Autoklaven sterilisiert wurde und dessen Dosierrate entsprechend dem Fermentationsalter, der Gelöstsauerstoffkonzentration und dem pH-Wert geregelt wird, so daß die Dosierrate proportional mit der Zeit und zusätzlich proportional der Abweichung des pH vom Regelwert 6,6 erhöht wird, solange die Gelöstsauerstoffkonzentration mehr als 60% beträgt und zu Beginn eines jeden Zyklus auf einen Ausgangswert (1 g/l/h) zurückgesetzt wird.

Außerdem wird zur Hauptkultur ein Substitutionsmedium zugeführt, das sterilisiert wurde, wie für das Hauptkulturmedium angegeben, und folgende Zusammensetzung hat:

Komponente Konzentration

Sojabohnenmehl 50 g/l

für 1., 2., 6. Zyklus

60 g/l

für 3.-5. Zyklus

Na₂S₂O₃ · 5 H₂O 8 g/l

Sonnenblumenöl 20 ml/l

Im folgenden wird anhand der Fig. 1 das zyklische Fermentationsverfahren am B.eispiel des Benzylpenicillin im zeitlichen Ablauf erläutert. Die Hauptkultur wird zur nullten Stunde mit dem Beimpfen 0 aus der Vorkultur gestartet. Zur 99. Stunde, das heißt nach Abschluß des Basiszyklus, erfolgt die Ernte eines Teils der Hauptkultur sowie das Wiederauffüllen 1 mit dem Substitutionsmedium in der gleichen Menge, die mit 30 Prozent (Substitutionsanteil) des Füllvolumens bemessen wird. Im Abstand von 48 h, 48 h, 48 h, 46 h, 50 h (Zyklusdauer) erfolgen Ernte eines Teils (30%) der Hauptkultur und Wiederauffüllen 2, 3, 4, 5, 6. Die Konzentration von Benzylpenicillin (BP) wird nach der jodometrischen Methode bestimmt und die mittlere Produktivität eines jeden Zyklus i als Quotient aus der Differenz der Produktkonzentration am Ende minus derjenigen am Anfang des Zyklus i, wobei im Falle der Veränderung der Füllvolumina die Produktkonzentrationen mit diesen gewichtet werden, dividiert durch die Zyklusdauer des Zyklus i berechnet

Die Fig. 1 zeigt, daß

— Die Produktivität des Zyklus 2 mit 98 IE · ml"¹ · h"' kleiner ist als die des Zyklus 1 (Merkmal M2) und die Biomassekonzentration mit 45 g/l kleiner, die Gelöstsauerstoff konzentration mit 65% der Sättigungskonzentration größer als die erfahrungsgemäß bekannten Grenzwerte von 50 g/l bzw. 60% sind (Merkmal M3), keine Prozeßstörung beobachtet wurde (Nichtzutreffen des Merkmals M1) und nachfolgend genannte Maßnahme (Aktivität A2) nicht bereits ausgeführt wurde (Merkmal M4), so daß die Konzentration von Sojabohnenmehl im Substitutionsmedium für Zyklus 3 auf 60 g/l erhöht wurde (Aktivität A2),

— im Zyklus 4 eine die Produktivität nachhaltig verringernde Prozeßstörung in der Weise antritt, daß die Glucosekonzentration zeitweise über dem Grenzwert von etwa 0,5 g/l liegt (Merkmal M1), so daß die Zyklusdauer des Zyklus 4 verkleinert wurde (Aktivität A1),

— die Glukosekonzentration im Zyklus 5 prozeßschritthaltendgemessen wurde, so daß die Zyklusdauer des Zyklus 5 so vergrößert wurde, daß diese Konzentration am Ende des Zyklus 5 Null ist (Aktivität A5),

- die Produktivität des Zyklus i = 5 mit 98 IE · ml"¹ h"¹ kleiner ist als die des Zyklus i - k = 1 (Merkmal 2), keine Prozeßstörung im Zyklus 5 beobachtet wurde (Nichtzutreffen des Merkmals M1) und der Substitutionsanteil des Zyklus 5 mit 30% kleiner als 50% war (Merkmal M5), und eine Erhöhung der Konzentration von Sojabohnenmehl im Substitutionsmedium bereits erfolgte, ohne daß eine Erhöhung der Produktivität erreicht wurde (Nichtzutreffen des Merkmals M4), so daß der Substitutionsanteil für den Zyklus 6 auf 80% erhöht wurde (Aktivität A3).

2. Eine lyophilisierte, an Glucose-Gelatine getrocknete Mycelkonserve des Stammes Streptomyces noursei, hinterlegt in der Stammsammlung des ZIMET unter Nr. ZIMET43708, wird mit 4 ml sterilem aqua dest. aufgeschwemmt, davon wird 0,5 ml zur Beimpfung einer 1. Vorkultur verwendet, die über einen Zeitraum von 52 Stunden in zwei 2,5 I-Steilbrustf laschen bei einem Füllvolumen von je 400 ml erfolgt und diese 800 ml werden zur Beimpfung einer 2. Vorkultur verwendet, die über einen Zeitraum von 44 Stunden im Fermentor Chemap-30 (Chemap-AG, Schweiz) bei einem Füllvolumen von 16 I erfolgt. Beide Vorkultivierungen erfolgen bei einer Temperatur von 28-29⁰C mit folgendem Vorkulturmedium:

Komponente	Konzentration
Glucose	15 g/l
. Sojamehl	15 g/l
NaCI	5 g/l
CaCO₃	1 g/l

KH₂PO₄ 0,3 g/l

Das Vorkulturmedium wird bei 121⁰C 35 Minuten lang sterilisiert, nachdem mit Hilfe von NaOH bzw. HCI ein pH-Wert von 6,2 bis 6,5 eingestellfwurde.

16 I der Vorkultur dienen als Impfmaterial für die Hauptkultur. Für die Hauptkultur kommt der Fermentor Chemap-450 (Chemap-AG, Schweiz) mit einem Bruttovolumen von 450 1 und einem Füllvolumen von 316 I zum Einsatz.

Für die Hauptkultur wird folgendes Hauptkulturmedium verwendet:

Komponente	Konzentration
Maisstärke	60 g/l
Glucose	5 g/l
Sojamehl	16 g/l
(NH₄J₂SO₄	11 g/l
MgSO₄	2 g/l
NaCI	1 g/l
CaCO₃	6 g/l
ZnSO₄	0,5 g/l
Antaphron	0,5 ml/l
Polypropylenglykoll	0,5 ml/l

Der mit dem Hauptkulturmedium gefüllte Fermentor wird über den Fermentormantel bei 12O⁰C 15 Minuten lang sterilisiert, wobei jedoch die Glukose im Autoklaven separat sterilisiert und erst nach erfolgter Sterilisation dem Hauptkulturmedium zugesetzt wird.

Die Bedingungen für die Hauptkultur sind charakterisiert durch folgende Parameter: Temperatur 29⁰C ± 0,5⁰C Belüftungsrate bis zur 4. Fermentationsstunde 4,5 m³/h und danach 9 m³/n, Rührerdrehzahl 330 U/min. Der pH-Wert wird, ausgehend von 7,0 durch NH₄OH-Zugaben auf pH 6,0 + 0,1 nach unten begrenzt.

Im folgenden wird anhand Fig. 2 das zyklische Fermentationsverfahren am Beispiel der Nourseothricin-Fermentation im zeitlichen Ablauf erläutert. Die Hauptkultur wird zur nullten Stunde mit dem Beimpfen 0 aus der Vorkultur gestartet. Zur 100. Stunde, das heißt nach Abschluß des Basiszyklus erfolgt die Ernte eines Teils der Hauptkultur sowie das Wiederauffüllen 1 mit Substitutionsmedium der gleichen Menge, die mit 30 Prozent (Substitutionsanteil) des Füllvolumens bemessen wird. Im Abstand von jeweils 48 Stunden (Zyklusdauer) erfolgen Ernte eines Teils (30%) der Hauptkultur und Wiederauffüllen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Es wird das Substitutionsmedium für einen jeden Zyklus i + 1 in Abhängigkeit vom Prozeßzustand während des Zyklus i in individueller Weise festgelegt:

Komponente	Konzentration für Zyklen	2	3 bis 5	g/i	6	g/i	7 und	8
	1 und	g/i	90	g/i	120	g/i	150	g/i
Maisstärke	150	g/i	30	g/i	45	g/i	45	g/i
Sojabohnenmehl	30	g/i	11	g/i	11	g/i	11	g/i
(NH₄J₂SO₄	11	g/i	2	g/i	2	g/i	2	g/i
MgSO₄	2	g/i	1	g/i	1	g/i	1	g/i
NaCI	1	g/i	0,5	ml/l	0,5	ml/l	0,5	g/i
ZnSO₄	0,5	ml/l	0,5	>g/i	0,5	g/i	0,5	ml/l
Antaphron	0,5	ig/l	0,1E		0,20			0,25 g/l
Brauereienzym	0,2E

Vor der Sterilisation der Substitutionsmedien bei 120⁰C 15 Minuten lang durch Direktdampf erfolgt Stärkeaufschluß bei 65°C ± 5°C 15 Minuten lang.

Die Fig. 2 zeigt, daß

- die Konzentration der die Produktionskosten wesentlich beeinflussenden Stärke am Ende der Zyklen 1 und 2 mit Werten größer 35 g/l wesentlich über dem Grenzwert Null liegt, so daß die Konzentration von Maisstärke in den Substitutionsmedien für die Zyklen 3 bis 5 auf 90 g/l und proportional dazu die Konzentration von Brauereienzym verkleinert wurde (Aktivität A4),

- die Produktivität im Zyklus 5 mit 0,111 g I"¹ · h"¹ kleiner ist als die des Zyklus 4 mit 0,125 g I"¹ h"¹ und des Zyklus mit 0,138 g · I"' h~' (Merkmal M2), und die Biomassekonzentration mit 12 g/l kleiner und die Gelöstsauerstoffkonzentration mit 60% der Sättigungskonzentration größer als erfahrungsgemäß bekannte Grenzwerte von etwa 20 g/l bzw. 30% sind (Merkmal 3), nachfolgend genannte Maßnahme im Fermentationslauf noch nicht bzw. im Zyklus 6 mit produktivitätserhöhender Wirkung realisiert worden ist (Merkmal M4) und keine Prozeßstörung beobachtet wurde (Nichtzutreffen des Merkmals M1), so daß die Konzentration von Maisstärke auf 120 g/l im Substitutionsmedium für Zyklus 6 und auf 150 g/l in den Substitutionsmedien für Zyklen 7 und 8 vergrößert wurde bei dazu proportionaler Veränderung der Konzentration von Brauereienzym sowie die Konzentration von Sojabohnenmehl auf 45 g/l in den Substitutionsmedien für die Zyklen 6 bis 8 vergrößert wurde (Aktivität A2).

Die Erfindung beinhaltet eine Vielzahl von Vorteilen. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß

- im Ausführungsbeispiel 1 die Produktivität im Zyklus i + 1 =6 mit 113 IE · ml"¹-- h"¹ nach Erhöhung des Substitutionsanteiles höher ist als die des Zyklus i = 5 mit 98 IE · ml"¹ · h"¹,

- im Ausführungsbeispiel 1 nach Prozeßstörungen, nämlich Überdosierungen von Glucose, die zu einer Verringerung der Produktivität führt, nach Starteines neuen Zyklus (Zyklus 5) die Produktivität wieder (auf 98 IE · ml"¹ · h"¹ im Zyklus 5) erhöht werden kann,

- im Ausführungsbeispiel 1 nach Veränderung der Zusammensetzung der Substitutionsmedien (für Zyklen 3 bis 5) eine weitere Verringerung der Produktivität (von Zyklus 1 mit 113 IE · ml"¹ · h"¹ zu Zyklus 2 mit 98 IE ml"¹ · h"¹) im folgenden nicht gestörten Zyklus (Zyklus 5) aufgehalten werden kann,

- im Ausführungsbeispiel 2 nach Veränderung der Zusammensetzung der Substitutionsmedien (für die Zyklen 6 bis 8) eine weitere Verringerung der Produktivität (von Zyklus 3 bis 5) nicht nur aufgehalten, sondern die Produktivität erhöht werden kann (von Werten kleiner 0,15 g · I"¹ · h"¹ in Zyklen 3 bis 5 auf Werte größer 0,175 g I"¹ · h"¹ in Zyklen 6 bis 8),

- im Ausführungsbeispiel 2 nach Verringerung der Konzentration von Maisstärke im Substitutionsmedium (für Zyklen 3 bis 5) der Konversiohsgrad von Werten kleiner 11 % für Zyklen 1 und 2 auf Werte größer 17% für Zyklen 3 bis 5 erhöht werden kann,

- die Fermentation in beiden Ausführungsbeispielen ohne Verringerung der Produktivität über mindestens 400 Stunden geführt werden kann, so daß infolge des Einsparens unproduktiver Rüstzeiten zur Vorbereitung neuer Starts von Fermentationen und geringproduktiver Wachstumsphasen zu Beginn einer jeden Fermentation die Raum-Zeit-Ausbeute durch zyklische Fermentation in Verbindung mit Zustandsrückführung gegenüber einer nichtzyklisch geführten, diskontinuierlichen Fermentation erhöht werden kann.

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Zyklisches Fermentationsverfahren, wobei ein Hauptkulturmedium angesetzt wird, aus einer Vorkultur beimpft wird, während der anschließenden Fermentation Zugaben von Nährmedien erfolgen oder unterbleiben, sich Zyklen anschließen, die aus drei Arbeitsschritten:

- Ernte eines Teils der Kulturlösung, Substitutionsanteil genannt,

- Wiederauffüllen mit frischer Nährlösung, Substitutionsmedium genannt,

- Fortsetzen der Kultivierung bis Ablauf einer Zeitspanne, Zyklusdauer genannt,

bestehen, gekennzeichnet dadurch, daß während des Zyklus i einzelne oder mehrere der Leitgrößen

- Produktkonzentration,

. - Biomassekonzentration,

- Substratkonzentration,

- Gelöstsauerstoffkonzentration,

gemessen, einzelne oder mehrere der abgeleiteten Größen

- Produktivität

- Raum-Zeit-Ausbeute

-Substratverbrauchsraten .

- Konversionsgrad

berechnet werden und nachstehende Veränderungen der Prozeßparameter

- Substitutionsanteil

- Zusammensetzung des Substitutionsmediums

- Zyklusdauer

einzeln oder kombiniert durchgeführt werden,

- falls Erhöhung einer Substratkonzentration über oder/und das Absinken der Gelöstsauerstoffkonzentration unter erfahrungsgemäß bekannte Grenzwerte beobachtet werden (Merkmal M1), wird die Zyklusdauer des Zyklus i verkürzt (Aktivität A1),

- falls die Produktivität des Zyklus i kleiner ist als die eines der vorangegangenen Zyklen i-k (Merkmal M2),

und Merkmal M1 in negierter Weise zutrifft,

und die Biomasse- und Gelöstsauerstoffkonzentration erfahrungsgemäß bekannte Grenzwerte unter- bzw. überschreiten (Merkmal M3), und nachfolgend genannte Maßnahme (Aktivität A2) in den vorangegangenen Zyklen keinmal oder aber mit produktivitätserhöhendem Effekt ausgeführt wurde (Merkmal M4),

wird die Konzentration der limitierenden Komponente(n) im Substitutionsmedium für folgende Zyklen

i + 1 erhöht (Aktivität A2), .

- falls der Substitutionsanteil des Zyklus i kleiner als 50% ist (Merkmal M5), ' und das Merkmal M2 zutrifft,

und das Merkmal M1 in negierter Weise zutrifft,

und die Merkmale M3 und/oder M4 in negierter Weise zutreffen, wird der Substitutionsanteil für den

Zyklus i + 1 auf 40 bis 90%, vorzugsweise auf 80% erhöht (Aktivität A3), ;

- falls die Konzentrationen von die Produktionskosten wesentlich beeinflussenden Substraten am Ende des Zyklus i höher als erfahrungsgemäß bekannte Grenzwerte sind, werden die Konzentrationen dieser Substrate im Substitutionsmedium für den Zyklus i + 1 verkleinert (Aktivität A4),

- falls die Konzentration des die Produktionskosten wesentlich beeinflussenden Substrates prozeßschritthaltend gemessen sowie dessen Verbrauchsrate berechnet wird, wird die Zyklusdauer i so festgelegt, daß die Zeitdifferenz bis zum Ende des Zyklus i multipliziert mit der Substratverbrauchsrate gleich der Differenz zwischen der gemessenen Substratkonzentration und einem erfahrungsgemäß bekannten Grenzwert, vorzugsweise der Wert Null ist (Aktivität A5).

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