DD253640A1

DD253640A1 - Verfahren zur herstellung von beta-glucosidase, endo-beta-glucanase und pilzprotein

Info

Publication number: DD253640A1
Application number: DD27524185A
Authority: DD
Inventors: Gerhard Kerns; Juergen Steffen; Elke Dalchow; Guenter Klappach; Dietrich Meyer; Peter Huebsch; Guenter R W Arnold
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-04-17
Filing date: 1985-04-17
Publication date: 1988-01-27

Abstract

Die Erfindung betrifft die aerobe Fermentation von Pilzen zur Gewinnung von b-Glucosidase, Endo-b-Glucanase und Pilzprotein. Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur kombinierten Herstellung von b-Glucosidase, Endo-b-Glucanase und Pilzprotein zu entwickeln, welches ermoeglicht, bei Einstellung hoher Myzelkonzentrationen auf kostenguenstigen Substraten mit Lebensmittelqualitaet sowohl b-Glucosidase als auch Endo-b-Glucanase in hoher Konzentration extrazellulaer herzustellen. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe geloest, indem der Pilz Aspergillus niger ZIMET 43 735 aerob und submers kultiviert wird und dass mittels Einstellung hoher Schergeschwindigkeiten und/oder mittels feststoffhaltiger Naehrmedien die Ausbildung von Pellets in der Wachstumsphase bewirkt wird. Die Erfindung ist anwendbar zur Erhoehung der cellulosespaltenden Wirkung von Cellulaseenzymen und zur Erzeugung proteinreicher Futtermittel.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kombinierten Herstellung von /3-Glucosidase, Endo-ß-Glucanase und Protein durch aerobe Züchtung von Pilzen.

Die Erfindung kann in die IPK C 12 N eingeordnet werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist allgemein bekannt, /3-Glucanasenwie beispielsweise die Enzyme des Cellulasekomplexes einschließlich /3-Glucosidase durch aerobe Submerszüchtung von Pilzen herzustellen. Beispielsweise werden gemäß den DDR-Patentschriften 145182, 145028 und 142130 (C 12 N-9/42) hierfür Pilze der Gattungen Cliocladium, Penicillium und Trichoderma eingesetzt, wobei das Nährmedium Cellulose in einer Konzentration von 0,5 bis 1 % als Induktor für die Cellulasebildung und als Kohlenstoffquelle enthalten muß.

Darüber hinaus sind verschiedene Pilzmutanten bekannt, welche auf geeigneten Nährmedien relativ hohe Cellulasemengen extrazellulär ins Medium ausscheiden, beispielsweise die Mutanten Trichoderma reesei QM 9414 oder T. reesei MCG 77 (US-Patent 4275163; IPKC 12 N-9/42). Es ist auch bekannt, daß die cellulosespaltende Wirkung derCellulase-Enzymkomplexe der meisten cellulasebildenden Pilze durch den relativ geringen Gehalt an /3-Glucosidase begrenzt wird. Deshalb wurden Verfahrensvarianten beschrieben, wo solchen Celklulasekomplexen Fremd-ß-glucosidase zugesetzt wird, um die cellulosespaltende Wirkung zu erhöhen. Allen und Sternberg (Biotechnology and Bioengineering-Symposium Nr. 10, 1980, S. 189-197) gewinnen die/3-Glucosidase durch aerobe Fermentation des Pilzes Aspergillus phoenicisQM 329 auf verschiedenen löslichen Kohlenstoffquellen, wobei die höchsten /3-Glucosidaseaktivitäten auf Basis von Hydrolysezucker (18,5U/ml/3-Glucosidaseaktivität) und Stärke (10U/ml /3-Glucosidaseaktivität) erhalten werden.

In einem anderen Verfahren (DE-OS 3013627) wird bei der Fermentation des Pilzes Thielavia terrestris mittels Zusatz von Glyzerin zum Nährmedium eine Erhöhung der/3-Glucosidaseaktivität bei gleichbleibender Cellulaseaktivität erhielt. Die bisher bekannten Verfahren zur /3-Glucosidasegewinnung haben jedoch den Nachteil, daß sie praktisch nur für die /3-Glucosidaseaktivität des extrazellulären Enzymkomplexes relativ gering ist oder daß ein relativ hoher Anteil der /3-Glucosidase nach der Fermentation noch zellgebunden ist.

Ziel der Erfindung

Es ist deshalb das Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur kombinierten Herstellung von /3-Glucosidase, Endo-/3-Glucariase und Pilzprotein zu entwickeln, welches ermöglicht, bei Einsatz eines ralativ kostengünstigen Substrates mit Lebensmittelqualität sowohl /3-Glucosidase als auch Endo-/3-G!ucanase in hoher extrazellulärer Konzentration herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe so gelöst, daß der Stamm Aspergillus niger 11 wie nachfolgend beschrieben aerob und submers gezüchtet wird, da überraschend gefunden wurde, daß dieser Stamm bei geeigneter Kultivierung sowohl hohe Konzentrationen /3-Glucosidase als auch Endo-/3-Glucanase extrazellulär ins Fermentationsmedium ausscheidet. Der Stamm Aspergillus niger 11 wurde in der Hinterlegungsstelle der ZIMET-Kulturensammlung im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR hinterlegt und unter der Nummer ZIMET 43735 registriert und wird durch folgende Merkmale charakterisiert.

Stammbeschreibung/Morphologie, Physiologie

Der Stamm weist die für Aspergillus niger typischen morphologischen Merkmale gemäß dem Bestimmungsbuch von Raper und Thorn auf (Raper and Thorn; The Aspergillus, 1965).

Die Erhaltung des.Stammes ist auf den für Aspergillus-Stämme typischen Nährmedien möglich. Beispielsweise sind Kartoffelagar, Czapek-Dox-Agar und Sporulationsagar (Ammoniumsulfat 0,2%, Kaliumdihydrogenphosphat 0,5%, Glukose 2%, Hefeextrakt 0,7%, Agar 2%) hierfür geeignet. Die Bebrütungstemperatur beträgt zweckmäßig 28-30⁰C; die Bebrütungsdauer bis zur vollen Entwicklung des Stammes beträgt etwa 7 Tage.

Die Überimpfung wird mittels Konidien vorgenommen, um das Sporulationsvermögen zu erhalten. Eine Erhaltung des Stammes in lyophilisierter Form in oder über flüssigem Stickstoff ist mittels der allgemein praktizierten Methoden möglich, ohne daß ein Rückgang des Enzymbildungsvermögens (/3-Glucosidase, Endo-/3-Glucanase) auftritt. Pathogene Eigenschaften des Stammes bezüglich Mensch oder Tier wurden nicht gefunden.

Der Fermentationsprozeß untergliedert sich praktisch in eine Wachstumsphase und eine Lysephase, wobei es auch zur Überlagerung von Wachstums- und Lysephase kommen kann, beispielsweise bei fed-batch oder kontinuierlicher Betriebsweise. Bei diskontinuierlicher Kultivierung des erfindungsgemäß verwendeten Pilzes Aspergillus niger 11 —ZIMET 43746 betrifft die Wachstumsphase den Zeitabschnitt der Fermentation, wo Substratüberschuß vorliegt, während bei einsetzendem Substratmangel die Lysephase beginnt. Die beschleunigte Bildung und Freisetzung von /3-Glucosidase wird erfindungsgeniäß erreicht, indem während der Wachstumsphase die Ausbildung von Myzelpellets bewirkt wird.

Diese Ausbildung von Pellets kann bewirkt werden, indem höhere Schergeschwindigkeiten mittels höherer Rührerdrehzahlen eingestellt werden. Dabei genügt es, wenn nur in einem bestimmten Raumabschnitt des Fermentors, beispielsweise in Rührernähe, höhere Schergeschwindigkeiten eingestellt werden. Es ist auch möglich, mittels feststoff haltiger Nährmedien die Ausbildung von Pellets zu bewirken, beispielsweise mittels Weizenkleie im Nährmedium.

Es wurde auch gefunden, daß bei den genannten Bedingungen eine Beimpfung mit Konidien die Ausbildung von Pellets begünstigt.

Während der Wachstumsphase werden die für das Wachstum günstigen Milieubedingungen eingestellt, insbesondere ein pH-Wert von 3,0 bis 5,0, eine Temperatur von 25 bis 35°C sowie ein Sauerstoff partialdruck in der bulk-Phase von mindestens 10% bezogen auf Luftsättigung. Während der Lysephase wird der pH-Wert erhöht und bei pH = 5,5... 6,5 konstant geregelt; die Begasung und Durchmischung des Fermentationsmediums können zur Energieeinsparung auf ein Mindestmaß herabgesetzt werden.

Mittels geeigneter Substrate im Nährmedium wird die Bildung von Endo-/3-Glucanase und/oder /3-Glucosidase induziert. Als Substrate für die Induktion der/3-Glucosidase sind beispielsweise Cellobiose, Laktose oder Stärke geeignet, als Substrate für die Induktion der Endo-/3-Glucanase sind Weizenkleie oder andere Pflanzenbestandteile in vorbehandelter oder unvorbehandelter Form geeignet. Mittels hoher Konzentrationen dieser Substrate im Nährmedium kann eine höhere Biomassekonzentration nach der Fermentation erhalten werden, beispielsweise ist ein Nährmedium mit Laktose in Form von Molke und einem Zusatz von 15g/l Weizenkleie geeignet, hohe Konzentrationen an/3-Glucosidase, Endo-/3-Glucanase und Myzelprotein zu erzielen.

In Abhängigkeit der Pelletbildung sowie der Lyse kann ein Anteil von etwa 2... 20% der Gesamt-ß-Glucosidase zellgebunden vorliegen. Mittels der bekannten Zellaufschlußverfahren (z.B. mittels Ultraschall) kann diese zellgebundene /3-Glucosidase freigesetzt werden.

Die Abtrennung bzw. Aufarbeitung und Reinigung der Enzyme können mittels der bekannten Verfahren vorgenommen werden:

Ausfuhrungsbeispiele Beispiel 1:

In einem Rührfermentor mit einem Bruttovolumen von 30 Litern wird der Pilz Aspergillus niger 11 —ZIMET43746 zur Gewinnung von/3-Glucosidase wie folgt kultiviert:

Nährmediumszüsammensetzung:

Nährmediumszusammensetzung:

KH₂PO₄	2,0 g/l
(NH₄J₂SO₄	4,8 g/l
MgSO₄-7 H₂O	0,7 g/l
Ca(NO₃I₂-4 H₂O	0,4 g/l
FeSO₄-7 H₂O	5,0mg/l
MnSO₄-7 H₂O	1,6mg/l
ZnSO₄-7 H₂O	1,4mg/l
CoCI₂	2,0mg/l
Weizenkleie	15g/l

Diese Bestandteile werden in der angegebenen Konzentration in 16 Liter frischer Molke mit einem Lactosegehalt von ca. 45 g/l in geeigneter Weise gelöst bzw. suspendiert und sterilisiert. Das Protein der Molke wird zweckmäßigerweise vorher durch Erhitzen ausgefällt und weitgehend abgetrennt.

Dieses Medium wird mit ca. 5 χ 10⁷... 10⁸ Konidien/I des o.g. Stammes beimpft und in dem 30-l-Fermentor unter Ausschluß von Fremdkeimen diskontinuierlich fermentiert. Mittels eines Sechsblatt-Scheibenrührers von 85mm 0 und einer Drehzahl von ca.

900U/min wird das Fermentationsmedium durchmischt.

Während der Wachstumsphase wird mit ca. 25 l/l Medium Luft begast; der pH-Wert wird mit Ammoniaklösung im Bereich 3,5...4,0 konstant geregelt. Die Temperatur wird bei 30⁰C konstant geregelt. Nach ca. 70 Stunden setzt die Lysephase ein, erkennbarem Ansteigen des pH-Wertes; mit Salpetersäure wird nun der pH-Wert im Bereich 5,5... 6,5 konstant geregelt. Nach ca. 140 Stunden ist die Fermentation beendet.

Die Feststoffe können mittels der bekannten Methoden durch Sedimentation/Separation bzw. Mikrofiltration abgetrennt werden.

Das Kulturfiltrat enthält 20 bis25U/ml /3-Glucosidaseaktivität und 5 bis6U/ml Endo-ß-Glucanaseaktivität. Die Feststoffe enthalten einen Reineiweißgehalt von ca. 16%; die abgetrennten Feststoffe können beispielsweise als tierisches Futtermittel verwendet werden. Mittels der bekannten Methoden können die Enzyme aus dem Kulturfiltrat abgetrennt und ggf. gereinigt werden; es ist auch möglich, durch Ultrafiltration bzw. Dialyse ein wäßriges Enzymkonzentrat herzustellen und dieses in der Applikation einzusetzen.

Schaumbekämpfung:

Während der Fermentation tritt zeitweise Schaumbildung auf. Die Schaumbekämpfung kann mittels Silikonentschäumer Antaphron NM 40 oder mit einem Entschäumer in Form eines Mischpolymerisates aus Butylenglykolformal und Diethylenglykolformal vorgenommen werden. Mit Hilfe eines geeigneten Regelkreises wird der verwendete Entschäumer bedarfsgerecht zudosiert.

Bestimmung der Enzymaktivitäten:

Die Bestimmung der Enzymaktivitäten erfolgt nach den international empfohlenen Methoden (Final Recommendations on the Measurement of Cellulase Activities, prepared for: International Union of Pure and Applied Chemistry, Commission onBiotechnology; July 1983). Die Bestimmung der/3-Glucosidaseaktivität erfolgt durch Abbau von Cellobiose bef50°C und einer Inkubationszeit von 30 Minuten; die Bestimmung der Endo-/3-Glucanasektivität erfolgt durch Abbau von Carboxymethylcellulose bei 5O⁰C und einer Inkubationszeit von 30 Minuten. Die Aktivität von 1 U entspricht der Freisetzung von 1 /xMol Glucose bzw. reduzierendem Zucker pro Minute.

Stammhaltung:

Die Stammhaltung erfolgt auf Kartoffelagar (PDA), wobei nur mit Konidien überimpft wird.

Beispiel 2:

Indem Fermentor, wie im Beispiel 1 beschrieben, wird der PiIzA. niger 11 —Zl M ET 43 746 zur Gewinnung von/3-Glucosidaseund Endo-/3-Glucanase kultiviert.

Nährsalzzusammensetzung:

KH₂PO₄	2,0 g/l
(NH₄I₂SO₄	4,8 g/l
CaCI₂ -2 H₂O	0,3 g/l
MgSO₄-7H₂O	0,4 g/l
Harnstoff	0,3 g/l
Twee n 80	1,0 g/l

Spurenelemente wie im Beispiel 1

Als Substrat dienen Kartoffelstärke in einer Konzentration von 20g/l zuzüglich Lactose in einer Konzentration von 20g/l. Diese Bestandteile werden in der angegebenen Konzentration in 14 Litern Wasser in geeigneter Weise gelöst und sterilisiert. Dieses Medium wird mit 1,61 einer Myzelsuspension (Pellets) mit einem Myzelgehalt von ca. 10g/l (bezogen auf Trockensubstanz) beimpft; das Inokulum wird auf dem gleichen Nährmedium in einem entsprechend kleineren Fermentor unter Ausschluß einer Sauerstofflimitation (in der wäßrigen Phase) angezogen. Die Beimpfung des Inokulums erfolgt mit Konidien wie im Beispiel 1 beschrieben; bei Erreichen der Myzelkonzentration von ca. 10g/l — vor Eintritt der Substratlimitation—wird.die diskontinuierliche Fermentation beendet und das Fermentationsmedium zur Beimpfung des 30-l-Fermentors verwendet. Die Fermentation im 30-l-Fermentor wird diskontinuierlich und in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Nach ca. 90 Stunden ist die Lysephase relativ weit fortgeschritten, erkennbar an der schwächeren Alkalisierung des Fermentationsmediums und somit einem geringeren Salpetersäureverbrauch zur pH-Regelung; es werden 8 Liter Fermentationsmedium zur /3-Glucosidasegewinnung entnommen, wofür 8 Liter Nährmedium folgender Zusammensetzung zur Substitution der entnommenen Menge in den Fermentor gegeben werden:

KH₂PO₄ 2,0 g/l

(NH₄J₂SO₄ 4,8 g/l

Tween80 1,0 g/l

Weizenkleie 30,0 g/l

Diese Bestandteile sind in entproteinisierter Molke mit einer möglichst geringen Milchsäurekonzentration gelöst bzw. suspendiert.

Nach weiteren 90 Stunden ist die Fermentation beendet. Die Aufarbeitung kann in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben vorgenommen werden.

Das Kulturfiltrat des ersten Ablaufes nach 90 Stunden enthält 16U/ml /3-Glucosidaseaktivität und keine oder nur eine sehr geringe Endo-ß-Glucanaseaktivität. Dieser Ablauf ist zur Gewinnung reiner 0-Glucosidase besonders geeignet.

Das Kulturfiltrat des Ablaufes nach insgesamt 180 Stunden enthält 28U/ml/3-Glucosidaseaktivität und 8U/ml Endo-/3-Glucanaseaktivität.

Beispiel 3:

In dem Fermentor, wie im Beispiel 1 beschrieben, wird der PiIzA. niger 11 —Zl M ET 43 746 zur Gewinnung von/3-Glucosidaseund Myzelprotein kultiviert.

Nährmedium:

Kartoffeln, mechanisch zerkleinert 200 g/l

KH₂PO₄ 2 g/l

(NH₄J₂SO₄ 4,8 g/l

Die Bestandteile werden in der angegebenen Konzentration in 14 Liter Wasser gelöst bzw. suspendiert und hitzesterilisiert.

Die Fermentation, einschließlich pH-Regelung sowie Schaumbekämpfung, wird diskontinuierlich, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Als Inokulum dienen 2 Liter einer Myzelsuspension, hergestellt wie im Beispiel 2 beschrieben.

Die Fermentation ist nach ca. 120 Stunden beendet. Das Fermentationsmedium enthält 24U/ml /3-Glucosidase und in Form der suspendierten Feststoffe 5g/l Reineiweiß.

Die Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel 1 beschrieben.

Claims

- I - 43O OtU

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung von /3-Glucosidase und/oder Endo-ß-Glucanase und/oder Pilzprotein gekennzeichnet dadurch, daß der Pilz Aspergillus niger 11,— ZIMET 43 746 aerob und submers gezüchtet wird und daß während der Wachstumsphase die Ausbildung von Pellets bewirkt wird und daß dem Nährmedium ein oder mehrere die /3-Glucosidase- und/oder die Endo-/3-Glucanasebildung induzierende Substrate zugegeben werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die induzierenden Substrate zu unterschiedlichen Zeitpunkten dem Fermentationsprozeß diskontinuierlich oder kontinuierlich zu geführt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß als Substrat für die Bildung von /3-Glucosidase und Endo-/3-Glucanase das Nährmedium ein Gemisch aus Molke und Weizenkleie enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die vollständige Freisetzung zellgebundener /3-Glucosidase durch mechanischen und/oder chemischen Zellaufschluß im Anschluß an die Wachstumsphase erfolgt.