DD255164A5 - Verfahren zur herstellung von gonadoliberin-derivaten - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Gonadoliberin-Derivaten. Die neuen Nonapeptid-C1-4-alkylamide beziehungsweise Dekapeptidamide entsprechen der allgemeinen Formel GlpHisTrpSerTyrX1X2X3ProX4worin X1 fuer eine Glycylgruppe oder eine natuerliche oder synthetische D-Aminosaeuregruppe, X2 fuer eine L-Phenylalanyl- oder L-Tryptophylgruppe oder eine L-Aminosaeuregruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen in der Seitenkette, X3 fuer eine als Seitenkette eine Alkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder eine Alkanoylgruppe mit 2-4 Kohlenstoffatomen enthaltende L-Aminosaeuregruppe und X4 fuer eine Glycylamidgruppe oder eine Alkylamidgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen steht. Einschraenkungen sind aus dem Anspruch ersichtlich. Die neuen Verbindungen werden nach bekannten Methoden der Peptidchemie hergestellt. Die neuen Gonadoliberin-Derivate enthalten in 7- und 8-Stellung die fuer die Gonadotropine der Fische charakteristischen Aminosaeurekombinationen und koennen deshalb zur Vermehrung dieser Tiergattung eingesetzt werden.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Gonadoliberin-Derivaten, deren Salzen und Metallkomplexen. Die neuen Nonapeptid-C^-alkylamide beziehungsweise Dekapeptidamide entsprechen der allgemeinen Formel (I)
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-XrX2-X3-Pro-X4 ,(D
Xi für eine Glycylgruppe oder eine natürliche oder synthetische D-Aminosäuregruppe, .
X2 für eine L-Phenylalanyl- oder L-Tryptophylgruppe oder eine L-Aminosäuregruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen in der
Seitenkette, X3 für eine als Seitenkette eine Alkylgruppe mit 1—4 Kohlenstoffatomen oder eine Alkanoylgruppe mit 2—4 Kohlenstoffatomen enthaltende L-Aminosäuregruppe und
X4 für Glycylamidgruppe oder eine Alkylamidgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen steht mit der Einschränkung, daß — falls X1 eine andere Bedeutung als eine Glycylgruppe hat und X2 für eine Tryptophylgruppe steht — X3 keine Leucylgruppe ist.
Die in der Formel verwendeten Symbole entsprechen der in der Peptidchemie üblichen Nomenklatur (s. z. B. J. Biol.Chem.241, 527 [1966]).
Das Gonadoliberin (es wird in der Fachliteratur auch als gonadotropin releasing hormon Gn-RH, luteinisierendes und Follikel stimulierendes Hormon, releasing hormon, LH/FSH-RH bezeichnet) und seine bekannten Derivate haben die allgemeine Eigenschaft zur Freisetzung der luteinisierenden und Follikel stimulierenden Hormone (LH und FSH) geeignet zu sein.
Zu Beginn der 80er Jahre wurde bekannt, daß sich die Struktur des Gonadoliberins verschiedener Fische von der Struktur des Gonadoliberins der Säugetiere unterscheidet (J. A. Kung und R. P. Millar, J. Biol. Chem.257,10722-28(1982]; South-African Journal of Science 78,124 [1982]; N..Sherwood et al., Proc, Natl. Acad Sei. 80,2794-2798 [1983]). Dieser Unterschied ist auf die an der 7. beziehungsweise der 8. Stelle befindlichen Aminosäure zurückzuführen.
Aus der Literatur ist ferner bekannt, daß die statt des Glycinsin 6-Stellung bestimmte D-Aminosäuren enthaltenden Gonadoliberin-Derivat eine stärkere Wirkung ausüben als das Gonadoliberin selbst (J.Sandowetal.: Control of Ovulation,
Butterworth, London S.49-70). .'
Bekannt ist auch, daß durch Austausch derGlycinamidgruppe in der 10-Stellung gegen Amidgruppen mit aliphatischen Ketten die biologische Wirksamkeit des Gonadoliberins weiter erhöht werden kann (M.Fujinoet al., J.Med.Chem. 16,1144—1147
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung neuer Gonadoliberin-Derivate, die in der Vermehrung von Fischen wirksam eingesetzt werden können, bereitzustellen. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, von diesen Verbindungen Derivate herzustellen, die vorteilhaftere biologische Eigenschaften als die Grundverbindungen aufweisen.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß durch Austausch der in der 7- und 8-Stellung befindlichen Aminosäuren des Gonadoliberins beziehungsweise durch gewisse Kombinationen dieses Austausches Gonadoliberin-Derivate hergestellt werden können, die zur Vermehrung von Fischen geeignet sind. Die Erfindung beruht ferner auf der Erkenntnis, daß die biologische Wirksamkeit der durch Austausch der in der 7- und 8-Stellung befindlichen Aminosäuren des Gonadoliberins entstandenen Gonadoliberin-Derivate durch Austausch derGlycingruppein der6-Stellung gegen gewisse D-Aminosäuren beziehungsweise derGlycinamidgruppe in der 10-Stellung gegen Alkylamidgruppen noch weiter erhöht werden kann. Gegenstand der Erfindung ist, wie bereits ausgeführt, ein Verfahren zur Herstellung der Nonapeptid-C^-Alkylamide beziehungsweise Dekapeptidamide der allgemeinen Formel (I)
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-CrX2-X3-Pro-X4 (I)
worin die Bedeutung von X1, X2, X3 und X4 die gleiche wie oben ist, sowie ihrer Salze und Metallkomplexe. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (1) werden erfindungsgemäß hergestellt, indem man
a) unter Anwendung der Methode der Peptidsynthese in der festen Phase die entsprechend geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge durch Koppeln mit Carbodiimid oder über einen aktiven Ester an einem festen Träger fixiert und gewünschtenfalls das Endprodukt durch saures oder basisches Abspalten von dem Träger abgelöst und gewünschtenfalls die Schutzgruppen vor, während oder nach dem Abspalten vom Träger ebenfalls abspaltet, oder
b) in Abhängigkeit vom chemischen Charakter der variablen Aminosäureteile indem der herzustellenden Verbindung das Endprodukt aus in dem gewünschten Umfang geschützten Aminosäuren durch entsprechende Kombinationen von schrittweiser Kondensation und Fragmentkondensation aufbaut.
Als fester Träger wird zweckmäßig Benzhydrylaminharz oder BOC-Prolinharz verwendet.
Das Schutzgruppen enthaltende Endprodukt wird zweckmäßig durch Abspalten mit Fluorwasserstoff und/oder durch Äthylammonolyse vom Harz abgespalten.
Von den unter b) genannten Kombinationen sind die folgenden bevorzugt:
das Pentapeptidazid der Formel (II)
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 (II)
wird mit einem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel (III)
X1-X2-X3-Pm-X4 (III)
kondensiert; oder
ein Hexapeptidazid der allgemeinen Formel (IV)
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-XvNg (IV)
wird mit einem Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel (V)
X2-X3-PrO-X4 (V)
kondensiert; oder
ein Heptapeptidazid der allgemeinen Formel (Vl)
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-XrX2-N3 (Vl)
wird mit einem Di-oder Tripeptid der allgemeinen Formel (VII)
X3-PrO-X4 (VII)
kondensiert.
In den Formeln (IH)-(VlI) ist die Bedeutung von X·,, X2, X3 und X4 die gleiche wie obeij angegeben.
Das gebildete Nona- beziehungsweise Dekapeptidamid kann gewünschtenfalls durch Umsetzen mit einer physiologisch verträglichen Säure zu einem Säureadditionsalz umgesetzt werden. Aus dem Säureadditionsalz kann gewünschtenfalls durch Behandeln mit einer Base die Verbindung freigesetzt und gewünschtenfalls das Nona- beziehungsweise Dekapeptidamid zu einem Metallkomplex umgesetzt werden.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können gewünschtenfalls zu Arzneimittelpräparaten formuliert werden. Zu diesem Zweck werden die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder ihre physiologisch verträglichen Säureadditionsalze oder ihre Metallkomplexe zusammen mit üblichen Träger- und/oder Hilfsstoffen zu Tabletten, Dragees, Kapseln, Suppositorien, Injektionslösungen, Nasensprays usw. formuliert.
Die Gonadoliberin-Derivate der allgemeinen Formel (I) werden den Fischen durch intramuskuläre oder subcutane Injektion appliziert und sind in einem Dosisbereich von 0,1 ^g-5mg wirksam.
Der Hauptvorteil der Erfindung besteht darin, daß die neuen Gonadoliberin-Derivate in der 7- und 8-Stellung für Fische charakteristische Aminosäurekombinationen enthalten und deshalb zur Vermehrung dieser Tiergattung erfolgreich eingesetzt werden können.
Die Erfindung wird an Hand derfolgenden Beispiele näher erläutert. Gemäß den Beispiel 1-5 wurden die Verbindungen mit den allgemein üblichen Methoden der Peptidsynthese in der festen Phase (Merrifield, R.B., J.Am.Chem.Soc.85,2149-2151 [1983]) hergestellt. Je nach der Struktur der herzustellenden Verbindung ging man im Fall eines Peptidalkylamids von chlormethylierten Polystyrol-Divinylbenzol-Harzen, im Fall von Peptidsäureamiden von Benzhydrylaminharzen aus. Die einzelnen Aminosäuren wurden mit Hilfe von Diisopropylcarbodiimid (DIC) beziehungsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Form ihrer mit t-Butoxycarbonyl (BOC) geschützen Derivate beziehungsweise mittels der Methode des aktiven Esters schrittweise an das Harz gekoppelt.
Der Verlauf der Kupplungsreaktion wurde mit dem Ninhydrin-Test (Kaiser, E., Colescott, R. L, Bossinger, C. D., Cook, P. l„ Anal. Biochem.34, 595-598 [1979]) verfolgt. Bei Anzeige freier Aminogruppen wurde die Acylierung wiederholt. Die Zeitdauer der Kupplungsreaktionen beträgt in Abhängigkeit von den Aminosäuren 1 bis 16 Stunden.
Das Abspalten der Schutzgruppen und das Abspalten des Peptids von dem Harz kann mit flüssigem, wasserfreiem Fluorwasserstoff in einem Schritt erfolgen (Sakakibara S., Shimonishi Y., Kishida Y., Okada M., Sugikara H., Bull Soc. Japan 40, 2164-2167 [1067]). Bei der Verwendung von N'm-Dinitrophenyl wird die Entfernung der Schutzgruppe noch vor der mit HF vorgenommenen Abspaltung durchgeführt. Das geschützte Peptidharz wird in propylaminhaltigem Dimethylformamid verrührt und nach Entfernung des Lösungsmittels in der üblichen Weise mit HF behandelt. Ist die hergestellte Verbindung ein Peptidalkylamid, so wird das Peptid durch Alkylammonolyse von dem Harz abgetrennt und dann —abhängend von dem Charakter der Schutzgruppen — katalytisch hydriert und/oder sauer hydrolysiert.
Das Rohprodukt wird nach dem HF vorgenommenen Abtrennen durch Gelfiltration gereinigt. Dazu dient eine Säule aus .
Sephadex G 25, eluiert wird mit essigsauren Lösungen.
Zur weiteren Reinigung werden HPLC-Säulen (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) und/oder Silikagelchromatographie herangezogen. Die Reinheit der Peptide wird durch Aminosäureanalyse und mittels Dünnschichtchromatographie untersucht. Die RrWerte der Dünnschichtchromatographie wurden an Kieselgel (DC Alufolie, Merck) mit den folgenden Lösungsmittelgemischen ermittelt:
1. Äthylacetat (Pyridin)Essigsäure/Wasser 30:20:6:11
2. Äthylacetat (Pyridin)Essigsäure/Wasser 60:20:6:11
3. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 120:20:6:11
4. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 240:20:6:11
5. n-Butanoi/Essigsäure/Wasser/Äthylacetat 1:1:1:1
6. n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1
7. i-Propanol/IM Essigsäure 2:1
8. Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser 5:5:1:3
9. n-Butanol/Essigsäure/Ammoniakiconc. Ammoniak u. H2O = 1:4)/Wasser6:1:1:2 10. Methyläthylketon/Essigsäure/Wasser 125:15:20
D-Phes,Gln8-Gonadoliberin M: 1243
a) Synthese
1,25g (1 Mol) Benzhydrylaminhydrochlorid-Harz(0,8mM/g, Pierce) werden 2 Stunden lang in Dichlormethan gequellt. Bei der Acylierung mit den Aminosäuren wird jeweils der folgende Zyklus wiederholt:
Schritt Reagens, Arbeitsgang Rührdauer, min
1 CH2CI2, Waschen 3x 1
2 33%Trifluoressigsäure im Gemisch mit67%CH2CI2,Waschen3x 1
3 Gemisch mit 670ACH2CI2, Waschen3x 25
4 CH2CL2, Waschen 3x 1
5 CHCI3, Waschen 2x "1
6 Gemischaus10%Triäthylaminund90%CHCI3,Waschen2x 2
7 CHCI3, Waschen 2x 1
8 Äthanol, Waschen 2x 1
9 CH2CI2, Waschen 2x 1
10 3 mMol BOC-Aminosäure, in Dichlormethan gelöst*, und 3 mMol DCC
oder DIC, in CH2CI2 gelöst 60 (verschieden)
11 CH2CI2 Waschen 2x 1
12 Äthanol, Waschen 2x 1
* Bei Kopplung von GIn wird mittels der Methode des aktiven Esters über BOC-GIn-ONP gekoppelt; im Falle von Pyroglutaminsäure wurde ohne
• Schutzgruppe gearbeitet.
Nach dem letzten Schritt beträgt das Gewicht des Glp-His (Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)rD-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-Peptidharzes
AW: 1,05g (66%)
(Mgesch.Peptid: 1577)
b) Abspalten mit HF
Zu dem Harz werden 3ml Anisol und 100mg Dithiotreit gegeben, dann werden in dem Gemisch 30ml HF kondensiert. Das Gemisch wird bei 00C eine Stunde lang gerührt. Anschließend wird der Fluorwasserstoff im Stickstoffatom entfernt, der Rückstand wird in absolutem Äther suspendiert und dann filtriert. Der feste Rückstand wird in 50%iger Essigsäure gewaschen. Das Filtratwird bei 37°Ceingedampft. Der Rückstand wurde unmittelbar der Gelchromatographie zugeführt (s. folgenden Punkt).
c) Gelchromatographie
Die gemäß dem vorhergehenden Punkt erhaltene Substanz wurde an einer Säule aus Sephadex G 25 (2,5 x 100 cm) mit 50%iger Essigsäure als Elutionsflüssigkeit gereinigt. Die Elution wurde mittels der Absorption von UV-Licht der Wellenlänge 280 nm sowie mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 15 ml/h. Die Fraktionen zwischen 300ml und 350ml werden gesammelt und lyophilisiert. Gewicht: 690mg (55%).
d) Präparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Es wurde eine präparativeHPLC-Säule mit den Abmessungen 2,5 χ 45cm (C18-Silikagel LRP-1,13-24 μ.ηη; Whatman) verwendet. Diese wurde mit einem Gemisch aus 25% Methanol und 75% 30%iger Essigsäure äquilibriert. Nach Einstellen des Gleichgewichtes werden 230 mg der gelchromatisch gereinigten Substanz, gelöst in dem gleichen Lösungsmittelgemisch, auf die Säule aufgebracht. Eluiert wurde mit einem Methanol/Essigsäure-Gradienten, dessen Zusammensetzung sich zwischen 25% Methanol/75% 30%ige Essigsäure und 40% Methanol/60% 30%ige Essigsäure-linear ändert.
Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 2ml/min, der Druck 3,5 · 105Pa. Die Fraktionen werden mit UV'Licht der Wellenlänge 280 nm detektiert, ihr Gehalt wird dünnschichtchromatographisch kontrolliert. Das Gewicht des reinen Endproduktes D-Phe6, Gln8-GnRH beträgt nach dem Lyophilisieren 133 mg. Das entspricht, auf die Gesamtmenge der Substanz bezogen, 399 mg (32%) an gereinigtem Endprodukt.
Rj = 0,76; R? = 0,68 Rf = 0,33 Rf = 0,93 Rf = 0,83
Aminosäureanalyse:
GIy: 1,02 Pro: 0,95 Leu: ί,ΟΟ Phe:1,02
Tyr:1,01 Ser: 0,93 His: 0,99 GIu: 1,96
Schmp.: 175-178°C; [a]g2 = -68° (c = 0,1,0,1 M AcOH)
Trp7, Gln8-Gonadoliberin M: 1226
a) Synthese
Ausgehend von 2,5g (1 mM) Benzhydrylaminhydrochloridharz(0,4mÄqu./g)wird auf die im Beispiel 1 unter Punkt a) beschriebene Weise das Peptidharz Glp-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-Harz hergestellt. Das Gewicht des Peptidharzes beträgt 3,62 g Aw: 1,12g (76%) (Mgesch.Peptid: 1468)
b) Entfernung der Schutzgruppen und Abspalten des Peptides vom Harz Abspalten der Dinitrophenyl-Schutzgruppe (DNP)
Das Peptidharz wird in einem Gemisch aus 20 ml Dimethylformamid und 1 ml Propylamin bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt. Anschließend wird das Harz abfiltriert und mit Dichlormethan, dann mit Äthanol gewaschen.
Spaltung mit HF
Nach der Entfernung der Dinitrophenyl-Schutzgruppe werden auf die im Beispiel 1 unter Punkt b) beschriebenen Weise das Peptid vom Harz beziehungsweise die Schutzgruppen vom Peptid abgespalten. Nach Abschluß der beiden Schritte verbleiben 0,8g (65%) Substanz.
c) Gelchromatographie
Man arbeitet auf die im Beispiel 1 unter Punkte) angegebene Weise. Das Gewicht der gesammelten und lyophilisierten Fraktionen beträgt 520 mg (42 %).
d) Preparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Man arbeitet auf die im Beispiel 1 unter Punkt d) angegebene Weise mit dem Unterschied, daß die Äquilibrierung mit einem Gemisch aus 18% Methanol und 82% 30%iger Essigsäure vorgenommen wird. Diegelchromatographisch gereinigte Substanz wird mit einem Methanol/Essigsäure-Gemisch, dessen Zusammensetzung sich zwischen 18% Methanol/82% 30%ige Essigsäure und 35% Methanol/65% 30%ige Essigsäure linear ändert, von der Säule eluiert. Die Fraktionierung sowie die sonstigen Bedingungen stimmen mit denen in Beispiel 1 d) überein. Das Gewicht des lyophilisierten Endproduktes beträgt 380mg (31%).
R? = 0,66 Rf = 0,57 R? = 0,78
Aminosäureanalyse:
GIu: 1,93 GIy: 2,04 Pro: 1,00 Tyr: 0,98
Ser: 0,93 Trp: 1,86 His: 1,03
Trp7, Leu8, desGlyNH2 10-Gonadoliberin-äthylamid (M = 1192)
a) Synthese
Als erster Schritt des Synthese wird BOC-Pro in literaturbekannter Weise (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 86,304 [1964]) an ein chlormethyliertes Polystyrolharz gekoppelt. 2g des auf diese Weise erhaltenen BOC-Pro-Harzes (0,5mÄqui./g) werden zwei Stunden lang in Dichlormethan gequellt, und dann werden auf die unter Punkt a) in Beispiel 1 beschriebene Weise schrittweise die entsprechenden geschützten Aminosäuren an das Harz gekoppelt. Nach dem letzten Zyklus erhält man 3,02g des Peptidharzes Glp-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Trp-Leu-Pro
AW: 1,02 g (83%)
(Mgesch. Peptid: 1486) . '
b) Entfernung der Schutzgruppen und Abspalten des Peptids vom Harz
Zuerst wird gemäß Punkt b) des Beispiels 2 die Dinitrophenyl-Schutzgruppe von dem Histidin abgetrennt. Anschließend wird das Peptid in Form des Äthylamids vom Harz abgespalten (Coy, D;H. et al., Biochemistry 13,323-326 [1974]). Zu diesem Zweck werden auf das geschützte Peptidharz 15ml Äthylamin aufkondensiert, und das Gemisch wird bei 00C 3 Stunden lang gerührt. Der Überschuß des Amins wird mittels Stickstoff ausgetrieben. Dann wird mit Methanol, anschließend mit Dimethylformamid gewaschen. Die DMF-Lösung wird eingedampft und das als Eindampf rückstand erhaltene Öl mit Äther verrieben. Der Niederschlag wird abfiltriert.
Die auf diese Weise erhaltene Festsubstanz wird gemäß Punkt b) des Beispiels 1 zwecks Entfernung der Schutzgruppen mit gasförmigem Fluorwasserstoff behandelt. Manerhält710mg (59%) Nonapeptidäthylamid.
c) Gelchromatographie
Man arbeitet auf die unter Punkte) des Beispiels 1 beschriebene Weise mit einer Säule aus SephadexG25 und Verwendetals Elutionsmittel 30%ige Essigsäure. Das Gewicht der gesammelten und lyophilisierten Fraktionen beträgt 490 mg (41%).
Das rohe Peptid wird an einer Säule aus Kieselgel 60 (230-400 mesh, Merck) mit den Abmessungen 2 χ 100cm weiter gereinigt.
Eluiert wird mit einem Gemisch aus Äthylacetat, Pyridin, Essigsäure und Wasser im Verhältnis 30:20:6:11. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt 8ml/h. Fraktionen zu je 4ml werden aufgefangen, und die Elution wird dünnschichtchromatographisch verfolgt.
DiedemGonadoliberinäthylamidTrp7, Leu8, des GIyNHj0 entsprechenden Fraktionen werden auf Grund der Aminosäureanalyse bestimmt. Man erhält 320mg (26%) lyophilisiertes Material.
Rl = 0,61 Rf = 0,42 R? = 0,75
Aminosäureanalyse:
GIu: 0,96 GIy: 0,97 Pro: 0,95 Leu: 1,00
Ser:0,89 Tyr: 1,02 Trp:1,88 His: 1,03
Phe7, Gln8-Gonadoliberin M = 1187
a) Synthese
1,25g (1 mMol) Benzhydrylaminhydrochlorid-Harz (0,8mÄqu./g) läßt man zwei Stunden lang in Dichlormethan quellen. Daraus werden auf die im Beispiel 1 a) beschriebene Weise 2,9g des Peptidharzes Glp-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-Harz hergestellt
AW: 1,27 g (83%), Mgesch.Peptid = 1521
b) Abspalten der Schutzgruppen
Das geschützte Peptid wird auf die im Beispiel 1 b) beschriebene Weise mit wasserfreiem HF behandelt. 980 mg (82%) ungeschütztes Peptid werden erhalten.
c) Gelfiltration
Das rohe Decapeptidamid wird auf die im Beispiel 1 c) beschriebene Weise an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule mit 2 M Essigsäure gereinigt. Ausbeute: 576mg (49%).
d) Präparative HPL-Chromatographie
Man arbeitet auf die im Beispiel 1 d) beschriebene Weise mit dem Unterschied, daß das Gel LRP-1 mit einer 10% Methanol und 20% Essigsäure enthaltenden wäßrigen Lösung äquilibriertwird, Eluiertwird mit einem linearen Gradienten, der in 20%iger Essigsäure von 10% aus ansteigend bis zu 25% Methanol enthält (2 χ 150ml). Dann wird dieElution mit einem zwischen 25% und 40% ansteigend Methanol enthaltender linearen Gradienten (2 χ 150ml) fortgesetzt. Die das reine Peptid enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und eingedampft. Ausbeute: 448mg (38%)
R? = 0,12 R? = 0,7 R? = 0,24 R? = 0,87
Aminosäureanalyse:
SerO,87 GIu 2,05 Pro 1,03 GIy 2,13
Tyr 0,92 Phe 1,00 His 0,95 TrpO,81.
Phe7, Leu8-Gonadoliberin M = 1172
a) Synthese
0,62g (0,5mMol) Benzhydrylaminhydrochlorid-Harz (0,8m Ägu./g) läßt man zwei Stunden lang in Dichlormethan quellen. Dann wird auf die im Beispiel 1 a) beschriebene Weise das PeptidharzGlp-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-Harz hergestellt. Ausbeute: 1,33g AW: 695mg (92%) Mgesch.Peptid) = 1506
b) Behandeln mit HF
DasgeschütztePeptidwirdaufdieim Beispiel 1 b) beschriebene Weise mit wasserfreiem HF behandelt. Man erhält 510 mg (87%) rohes Decapeptid.
c) Gelfiltration
Das gemäß Schritt b) erhaltene rohe Decapeptidamid wird auf die im Beispiel 1 c) beschriebene Weise an einer Säule aus Sephadex G-25 mit 2M Essigsäure gereinigt
Ausbeute: 363mg (62%).
d) Chromatographie an Silikagel
Zur weiteren Reinigung des Peptids dient eine mit Kieselgel 60 gefüllte Säule mit den Abmessungen 2 χ 100cm, die mit einem im Verhältnis 1;1:1:1 hergestelltes Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure, Wasser und Äthylacetat eluiertwird. Der Gehalt der Fraktionen wird UV-spektroskopisch sowie mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Man erhält 299 mg (51%) des reinen Decapeptidamids.
R] = 0,55 R? = 0,39 Rf = 0,62 R? = 0,73
Aminosäureanalyse
SerO,91 GluO,97 Pro 1,07 Gly2,12,
Leu1,00 Tyr1,03 PheO,94 His 1,05.
D-Phe6,Gln8,desGlyHNl°-Gonadoliberin-äthylamid (M = 1198)
a) BOC-His(DNP)-Trp-OMe (M = 622,52)
21,12g (5OmMoI) BOC-His(DNP)-OH werden in 100ml Dimethylforamid gelöst. Die Lösung wird auf 00C gekühlt und unter Rühren mit 10,32g (5OmMoI) Dicyclohexylcarbodiimid und 7,66g (5OmMoI) N-Hydroxybenztriazol versetzt. Das Gemisch wird bei O0C 10 Minutenlang gerührt, dann wird das ausgeschiedene Dicyclohexylkarbamid abfiltriert.
12,74g (5OmMoI) H-Trp-OMe · HCI in 70ml Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird auf 00C gekühlt. Man gibt 6,94ml (5OmMoI) Triäthylamin zu der Lösung und filtriert nach 5-minütigem Rühren das ausgeschiedene Triäthylamin-hydrochlorid
Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei O0C gerührt. Am nächsten Tag wird das ausgeschiedene DCU abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in 500 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird zuerst mit3 χ 100ml eiskalter 1 M KHSO4-Lösung, dann mit 5 χ 100ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich mit 2 x 100 ml 10%iger NaCI-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und nach dem Filtrieren zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Petroläther verrieben, filtriert und-dan η getrocknet. Die erhaltene kristalline Substanz wurde in Äthylacetat ge'löst und mit Petroläther ausgefällt.
Ausbeute: 27,70g (89%)
Schmp. 119-122°C
[α]2)2 = +14,1° (c = 1, in Dimethylformamid)
Rf = 0,62 Rf = 0,41
b) H-His(DNP)-Trp-OMe-2HCI
M = 522,49 (freie Base) 595,41 (· 2 HCI)
24,9g (4OmMoI) des Dipeptide BOC-His(DNP)-Trp-OMe werden in 100ml Methanol gelöst. Zu der Lösung werden 100 ml methanolische Salzsäure gegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehen gelassen. Dasin dieser Zeit auskristallisierende Dipeptidesterhydrochlorid wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet.
Ausbeute: 21,91g (92%)
schmp.: 198-2020C
[α]2,2 = 0,49° (c = 1, in Dimethylformamid)
R? = 0,46 Rf = 0,18
c) Glp-His(DNP)'Trp-OMe
M = 633,60
4,85g (36,8mMol) L-Pyroglutaminsäure, 7,58g Dicyclohexylcarbodiimid und 5,63g N-Hydroxybenztriazol werden in 100ml Dimethylformamid gelöst. Das Gemisch wird bei 5-100C 10 Minuten lang gerührt und dann das ausgefallene DCU abfiltriert. 20,84g (35mMol) H-His(DNP)-Trp-OMe · 2HCI werden in 100ml Dimethylformamid gelöst und zu der Lösung 9,72ml (7OmMoI) Triäthylamin gegeben. Nach 5minütigem Rühren wird das ausgeschiedene Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert. Die beiden Lösungen werden vereinigt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Am nächsten Tag wird das Gemisch mit 90ml Aceton versetzt, die sich ausscheidende unlösliche Substanz wird abfiltriert. Das Filtrat wird eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird mit Äthylacetat verrieben und dann getrocknet. Die trockene kristalline Substanz wird mit 3 x 25 ml Wasser gewaschen und erneut getrocknet. Die Substanz kann durch kochendes Lösen in Äthylacetat und Abkühlen der Lösung umkristallisiert werden. Ausbeute: 18,42g (83,1%)
Schmp.: 148-151 °C '
[α]2,3 = +5,2° (c = 1, in Dimethylformamid) R? = 0,53 Rf = 0,38
d) Glp-His-Trp-OMe
M = 466,50
15,84g des geschützten Tripeptids Glp-His(DNP)-Trp-OMe werden in einem Gemisch aus 100ml Dimethylformamid und 40ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 4ml Mercaptoäthanol versetzt und dann mit Triäthylamin auf einen pH-Wert von 8 gestellt.
Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehengelassen und dann im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Äther verrieben, filtriert und getrocknet. Die erhaltene Substanz wird in wenig Methanol gelöst und durch Zusatz von Äther ausgefällt. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute: 10,92g (93,6%)
Schmp.: 228-232T
[α]2)2 = +4,04° (c = 0,42, in Dimethylformamid)
Rf = 0,30 '
e) Glp-His-Trp-N2H3
M= 466,51
9,33g (2OmMoI) des Tripeptids Glp-His-Trp-OMe werden in 250ml Methanol gelöst und zu der Lösung 20ml 98%iges Hydrazinhydrat gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden lang bei 40°C, dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Am nächsten Tag wird die ausgeschiedene Substanz abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und dann getrocknet.
Ausbeute: 7,58g (81,2%)
Schmp.: 166-169 °C
Md2 = -22,3° (c = 0,5, in Dimethylformamid)
Rj = 0,50 Rf = 0,14
f) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe
7,0g (15mMol) Glp-His-Trp-N2H3 (Produkt des Schrittes e) werden in 60ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0C gekühlt und unter Rühren mit 7,5ml (45mMol) 6n HCI versetzt. Dann tropft man langsam die gesättigte wäßrige Lösung von 1,035g (1SmMoI) NaNO2ZU dem Gemisch und rührt weitere 15 Minuten bei 0°C. Dann versetzt man das Gemisch mit einer Lösung von 4,78g (15mMol) H-Ser-Tyr-OMe. HCI in 15ml Dimethylformamid und stellt den pH-Wert mit 6,25 ml (45mMol) Triäthylamin auf neutral. Das Gemisch wird über Nacht bei 0-40C gerührt, am nächsten Tag im Vakuum zur Trockne eingedampft und der ölige Rückstand mit Äther verrieben.
Das Gewicht des pulverförmigen Produktes beträgt 12,1 g (100%). Das Chromatogramm zeigt Flecken von zwei geringfügigen Verunreinigungen, jedoch kann das Produkt ohne zwischenzeitliche Reinigung zum Hydrazid Umgesetzt werden, welches gut kristallisiert. Physikalische Daten der zur Kontrolle aus Methanol umkristallisierten Substanz:
Schmp.:188-190°C
Hd2 =-3,48° (c = 1, Dimethylformamid)
R{ = 0,58 Rf = 0,26
g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3
12g des rohen, pulverisierten Pentapeptidesters Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe werden in 200ml Methanol gelöst und zu der Lösung 10 ml 98%iges Hydrazinhydrat gegeben. Das Gemisch wird bei 4O0C drei Stunden lang und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert und im Exsikkator über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Die getrocknete kristalline Substanz wird in 250 ml 0,5n HCI gelöst, die Lösung mit konzentrierter Sodalösung auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und bei O0C zwei Stunden lang stehen gelassen. Die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit eiskaltem Wasser gewaschen und dann getrocknet.
Ausbeute: 6,12g (auf beide Schritte bezogen 56,9%)
Sch'mp.: 205-206°C
[a\l2 = -21,51° (c = 1, Dimethylformamid)
R] = 0,39 R? = 0,14
Hydrazinstickstoff: berechnet: 3,91%
gefunden: 3,79%, 3,76%
h) Z-Gln-Pro-NHEt
3,242g Prolinäthylamid (hergestellt aus 22,8mMol Z-Pro-NHEt durch Hydrieren) werden in 70ml Tetrahydrofuran gelöst und zu der Lösung 5,60g (2OmMoI) Z-GIn-OH und 1,034g N-Hydroxybenztriazol gegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf dem Eisbad gekühlt und unter Rühren mit der Lösung von 5,34g (25,9mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Tetrahydrofuran gegeben. Das Reaktionsgemisch wird auf dem Eisbad 5 Stunden lang, dann bei Raumtemperatur noch 20 Stunden lang gerührt, filtriert und das Filter mit Tetrahydrofuran nachgewaschen. Das Filtratwird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Chloroform gelöst Die Lösung wird mit 3 x 35ml mit derfünffachen Menge Wassers verdünntem Ammoniak, dann mit2 x 20ml Wasser, anschließend mit 3 x 35ml Salzsäure und schließlich erneut mit 2 χ 20 ml Wasser gewaschen. Dann wird die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filter wird mit Chloroform nachgewaschen. Dann wird die Lösung zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird in einem Gemisch aus 35 ml Tetrahydrofuran und 50 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung filtriert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels bleibt ein Öl zurück, das mit 100 ml Äther kristallisiert wird. Die feste Substanz wird auf dem Filter mit Äther gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Man erhält 7,68g (95%) Produkt. R? = 0,45 Rj = 0,73
i) Z-Leu-Glm-Pro-NHEt
4,5g (11 mMol) des geschützten Dipeptidamids Z-Gln-Pro-NHEt werden in 30 ml Eisessig gelöst. Zu der Lösung werden 55 ml 4η eisessigsaure Bromwassersfoffsäure gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur IV2 Stunden lang stehen gelassen, dann mit 250 ml Äther versetzt und wieder eine Stunde stehen gelassen. Die über dem Niederschlag stehende Flüssigkeit wird dekantiert, der Rückstand mit 100ml Äther aufgeschlämmt, nach 15 Minuten abfiltriert und mit reichlich Äther gewaschen. Die hygroskopische feste Substanz wird im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Natriumhydroxyd getrocknet. Ausbeute: 4,9g (hygroskopisch).
3,8g (11 mMol) des erhaltenen Dipeptidäthylamidhydrobromids werden in 150 ml Chloroform suspendiert. Zu der Suspension werden 7,0 ml Triäthylamin gegeben. Dann wird das Reaktionsgemisch mit der Lösung von 6,4g Z-Leu-pentachlorphenylester in 65 ml Chloroform versetzt und über Nacht gerührt. Anderntags wird das Reaktiönsgemisch mit 1 η Salzsäure, gesättigter Kochsalzlösung, 2 η Ammoniak und schließlich wieder mit gesättigter Kochsalzlösung extrahiert. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, die Festsubstanz abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Man erhält 4,6 g (81 %) Rohprodukt.
j) H-Leu-Gln-Pro-NHEt · HBr
Von dem auf die unter Punkt i) beschriebene Weise hergestellten TripeptidZ-Leu-Gln-Pro-NHEt wird die Schutzgruppe ohne zwischenzeitliche Reinigung entfernt. Zu diesem Zweck wird das Produkt in 10 ml eisessigsaurer Bromwasserstoff lösung gelöst.
Die Lösung wird bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt und dann das Produkt durch Zusatz von 100 ml wasserfreiem Äther ausgefällt. Die Substanz wird abfiltriert und im Exsikkator getrocknet. Das Produkt ist ein gelbes hygroskopisches Pulver. Ausbeute: 3,54g (76%) Rf = 0,42 Rf = 0,13 Rf = 0,55 R? = 0,1
k) BOC-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt
2,33g(5mMol)desTripeptidhydrochloridsH-Leu-Gln-Pro-NHEt · HBrwerdenin5ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 00C gekühlt und zuerst mit 0,70ml (0,5mMol) Triäthylamin und dann mit der Lösung von 2,57 ml (5mMol) BOC-D-Phe- pentachlorphenylester in 10ml Dimethylformamid versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit Trimethylamin auf einen Wert zwischen 7 und 8 gestellt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert mit Triäthylamin auf dem angegebenen Wert gehalten. Dann wird die Lösung im Vakuum eingedampft, der Rückstand wird in 100ml Chloroform gelöst und die Lösung mit 10 χ 10ml 0,1 M Ammoniak gewaschen. Dann wird die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und eingedampft. Der ölige Rückstand kann durch Behandeln mit Äther in ein Pulver überführt werden. Das getrocknete Rohprodukt wiegt 2,81 g (89%). Die Schutzgruppe wird ohne weitere Reinigung entfernt.
I) H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt TFA
1,26g (2 mMol) des Tetrapeptide BOC-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt werden in 10ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt. Die Trifluoressigsäure wird dann im Vakuum schnell entfernt. Der Rückstand wird an einer Silikalgelsäule mit einem im Verhältnis 4:1:1 bereiteten Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser chromatographiert. Die Produktfraktionen werden gesammelt und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und dann lyophilisiert.
Ausbeute: 880mg (68%)
Rf = 0,25 Rf = 0,35
Schmp.: 1420C;
[a]§° = -66° (c = 0,1, Dimethylformamid).
m) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt
286g (0,4mMol) des gemäß Schritt g hergestellten Pentapeptidhydrazids Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 werden in 10ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf-1O0C gekühlt und unter Rühren mit 0,27 ml 6η Salzsäure und dann mit der gesättigten wäßrigen Lösung von 30,2mg NaNO2 versetzt.
Nach 5 Minuten gibt man die mit einem'Gemisch aus 1 ml Dimethylformamid und 0,27 ml Triethylamin hergestellte und auf -100C gekühlte Lösung von 258mg (0,4mMol) H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt TFA zu dem Gemisch. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei -50C, dann eine weitere Stunde lang bei 00C gerührt, wobei der pH-Wert notwendigenfalls durch Zusatz von Triäthylamin auf einem neutralen Wert gehalten wird. Schließlich läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen und dampft das Reaktionsgemisch im Vakuum ein.
Das nach dem Verdampfen erhaltene Öl wird in 5 ml 0,2 η Essigsäure gelöst und an einer Säule aus Sephadex G 25 (2 x 95 cm) mit 0,2n Essigsäure chromatographiert. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert.
Ausbeute: 298mg (62%)
R^ 0,74 Rf »0,65 R? = 0,37 Rf = 0,80
Aminosäureanalyse
SerO,89 Pro 0,97 Leu 1,00 PheO,99
Glu1,98 His1,01 Tyr1,03 TrpO,91
Trp7, GIn8, des Gly10-Gonadoliberinäthylamid M = 1220
a) BOC-Gln-Pro-NHEt
1,0 (7 mMol) Prolinäthylamid wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird mit Triäthylamin auf 8 eingestellt. Zu der Lösung wird die Lösung von 3,2g (8,4mMol)tert.-Butoxycarbonyl-glutaminyl-p-nitrophenylesterin 15 ml Dimethylformamid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert mit Triäthylamin bei 8 gehalten. Der nach dem Eindampfen des Reaktionsgemisches verbleibende ölige Rückstand wird in Wasser gelöst, die Lösung mit Äther gewaschen und die wäßrige Phase im Vakuum eingedampft. Ausbeute: 1,93g (74,5%) Rf = 0,76.
b) H-Gln-Pro-NHEt TFA
M = 270 (freie Base) M = 367 (TFA-SaIz)
1,9g (7,2mMol) BOC-Gln-Pro-NHEt werden in 10ml Trifluoressigsäure gelöst. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, abfiltriert und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 1,52g (58%).
R) = 0,45 R? = 0,45 R? = 0,25 R}° = 0,30
Die Substanz ist hygroskopisch
[a]g° = -34,8° (c = 1, Methanol).
c) BOC-Trp-Gln-Pro-NHEt
500mg (1,85mMol) H-Gln-Pro-NHEt werden in 10ml Dimethylformamid gelöst. Der pH-Wert wird mitTriäthylamin auf 8 eingestellt. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man 608g (2 mMoDtert.-Butoxycarbonyl-tryptophan in 10 ml Dimethylformamid und 620μΙ (4mMoi). Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimid. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 48 Stunden lang gerührt und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und mit Äther ausgefällt. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und dann getrocknet. .
Ausbeute: 740mg (72%) Rf = 0,75 R? = 0,38
d) H-Trp-Gln-Pro-NHEt TFA
M = 456,5 (freie Base) M = 554 (TFA-SaIz)
700 mg (1,25mMol) BOC-Trp-Gln-Pro-NHEt werden in 15 ml eines im Verhältnis 1:1 bereiteten Gemisches aus Trifluoressigsäure und Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 20 Minuten lang gerührt und anschließend im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, abfiltriert und getrocknet. Das Rohprodukt (500 mg) wird an einer Silikalgesäule mit einem im Verhältnis 47:20:6:11 bereiteten Gemisch aus Äthylacetat, Pyridin, Essigsäure und Wasser chromatographisch gereinigt. Die Produktfraktionen werden gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Man erhält 360mg (52%) eines weißen Pulvers. Rl = 0,46 R? = 0,18
Schmp.:119-123°C .
[a\i°= -4,8°(c = 0,1,0,1 η HCI)
e) BOC-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt M = 613,7
350 mg (0,76mMol) H-Trp-Gln-Pro-NHEt werden in Dimethylformamid gelöst und mit 104mg (0,8mMol) BOC-GIy auf die im Schritte) beschriebene Weise gekoppelt. Man erhält 373 mg (81%) einer kristallinen Substanz. R? = 0,88 Rf = 0,83 R? = 0,61 .
f) H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt · TFA
M = 609,6 ' -
375 mg (0,6mMol) BOC-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt werden auf die im Schritt d) beschriebene Weise von der Schutzgruppe befreit und gereinigt. Man erhält 285mg (76,6%) eines weißen Pulvers
R? = 0,08 R? = 0,16 Rf = 0,67 Rf = 0,28
g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt M = 1216,4
286g (0,4mMol) des Pentapeptidhydrazids Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 werden mit 243,8mg (0,4mMol) des gemäß Schritt m) des Beispiels 6 erhaltenen H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt · TFA gekoppelt. Man erhält 252,9mg (52%) Reinsubstanz R? = 0,26 Rf = 0,32
Aminosäureanalyse
SerO,87 GIu 2,02 Pro 0,91 GIy 1,00
Tyr1,12 His 1,05 Trp1,8O
Herstellung von Injektionen für intramusculare, subcutane oder intravernöse Applikation
a) Das Gonadoliberin-Derivat der allgemeinen Formel (I) wird in einer Konzentration von 1-10mg/ml in destilliertem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder gepufferter wäßriger Lösung gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert und dann in 50-500/ng Wirkstoff enthaltenden Volumina in Ampullen gefüllt, lyophilisiert. Dann werden die Ampullen verschlossen.
Vor der Anwendung wird die in der Ampulle enthaltene Substanz in 1-10ml destilliertem Wasser aufgelöst, und von der Lösung wird eine der notwendigen Dosis entsprechende Menge injiziert.
b) Aus dem Gonadoliberin-Derivat der allgemeinen Formel (I) stellt man mit einer 0,9% NaCI und 0,9% Benzylalkohol
' -"- ~ !~ ι--.."-. Aar- i^n-rontratinn wnn 9D—Kon /,n/ml und füllt diese in Ampullen. Die Ampullen
Claims (5)
1. Verfahren zur Hersteilung von Gonadoliberin-Derivaten der allgemeinen Formel (I)
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-XrXa-Xa-Pro-X^ . (D
Χι für eine Glycylgruppe oder eine natürliche oder synthetische D-Aminosäuregruppe, X2 für eine L-Phenylalanyl- oder eine L-Tryptophylgruppe oder eine L-Aminosäuregruppe mit 1-4
Kohlenstoffatomen in der Seitenkette,
X3 für eine als Seitenkette eine Alkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder eine Alkanoylgruppe mit 2-4 Kohlenstoffatomen enthaltende L-Aminosäuregruppe und
X3 für eine als Seitenkette eine Alkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder eine Alkanoylgruppe mit 2-4 Kohlenstoffatomen enthaltende L-Aminosäuregruppe und
X4 für eine Glycylamidgruppe oder eine Alkylamidgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen steht mit der Einschränkung, daß — falls X1 eine andere Bedeutung als eine Glycylgruppe hat und X2 für eine Tryptophylgruppe steht — X3 eine andere Bedeutung als eine Leucylgruppe hat, und ihren physiologisch verträglichen Säureadditionssalzen und Komplexen, gekennzeichnet dadurch, daß man
a) unter Anwendung der Methode der Peptidsynthese in der festen Phase die entsprechend geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge durch Koppeln mit Carbodiimid oder über einen aktiven Ester an einem festen Träger fixiert und gewünschtenfalis das Endprodukt durch saures oder basisches Abspalten von dem Träger ablöst und gewünschtenfalis die Schutzgruppe vor, während oder nach dem Abspalten vom Träger ebenfalls abspaltet, oder
b) in Abhängigkeit vom chemischen Charakter der variablen Aminosäureteile in der herzustellenden Verbindung das Endprodukt aus in dem gewünschten Umfang geschützten Aminosäuren durch entsprechende Kombinationen von schrittweiser Kondensation und Fragmentkondensation aufbaut.
2. Verfahren nach Punkt 1, Variante a), gekennzeichnet dadurch, daß man als festen Träger Benzhydrylaminharz oder BOC-Prolinharz verwendet.
3. Verfahren nach Punkt 1, Variante a), gekennzeichnet dadurch, daß das geschützte Peptid durch Behandeln mit Fluorwasserstoff und/oder durch Äthylammonolyse vom Harz ablöst.
4. Verfahren nach Punkt 1, Variante b), gekennzeichnet dadurch, daß man das Pentapeptidazid der Formel (II)
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 (II).
mit einem Tetra- oder Pentapeptid der allgemeinen Formel (ill)
' X1-X2-X3-Pr0-X4 , (lll)
worin die Bedeutung von X1, X2, X3 und X4 die gleiche wie im Punkt 3 ist, kondensiert.
5. Verfahren nach Punkt 1, Variante b), gekennzeichnet dadurch, daß man ein Hexapeptidazid der allgemeinen Formel (IV)
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-XrN3 (IV)
mit einem Tri- oder Tetrapeptid der allgemeinen Formel (V)
X2-X3-PrO-X4 t (V)
vX2, X3 und X4 wie im Punkt 1 definiert sind, kondensiert. 6. Verfahren nach Punkt 1, Variante b), gekennzeichnet dadurch, daß man ein Heptapeptidazid der allgemeinen Formel (Vl)
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-XrX2-N3 , (Vl)
worin X1 und X2 wie im Punkt 1 definiert sind, mit einem Di- oder Tripeptid der allgemeinen Formel (ViI) ." '
X3-PrO-X4 (Vl!)
wnrin X, und X„ wie im Punkt 1 definiert sind, kondensiert.
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