LU85710A1 - Nouveaux derives de la gonadoliberine et procede pour leur preparation - Google Patents
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Description
% _ La présente invention est relative à de nouveaux , dérivés de la gonadolibêrine et à un procédé pour les prépa rer.
Plus spécifiquement, la présente invention est rela-5 tive à de nouveaux dérivés de la gonadolibêrine représentés par la formule générale (I) ci-après : G lp-Hi s -Tr p-S er -Tyr -X^X 2~X 3 -Pro -X 4 (I) % aux sels d'addition formés avec des acides utilisables en 10 thérapie, ainsi qu'aux complexes de ceux-ci et aux compositions pharmaceutiques les contenant. Dans la formule générale (I) : X1 est un groupe glycyle ou un D-isomère d'un quelconque groupe amino acide naturel ou synthétique, 15 représente un groupe L-aminoacide ayant 1 à 4 atomes de carbone dans la chaîne latérale, un groupe L-phényl-alanyle ou L-tryptophyle, * X2 représente un groupe L-aminoacide ayant une chaîne latérale alcoyle en ou alcanoyl (en C2à4^-amiâe' et, 20 X^ est un groupe glycylamide ou alcoyl (en C^^)-amide, à condition que dans le cas où X^ est un groupe autre que le radical glycyle et X2 est un groupe tryptophyle, X2 ne puisse pas être un groupe leucyle.
Les abréviations utilisées dans la formule sont iden-25 tiques à celles de la nomenclature acceptée dans la chimie des peptides, décrite par exemple dans J. Biol. Chem. Γ 241,527 * (19661?.
Une propriété générale propre à la gonadolibêrine ï (autres noms connus dans la littérature : hormone libérant les 30 gonadotropes, GnRH, hormone lutéinisante et stimulant les
V
<- follicules (LH/FSH) et à ses dérivés connus) réside en ce qu'ils sont capables de libérer l'hormone lutéinisante (LH) et l'hormone stimulant les follicules (FSH).
Depuis le début des années quatre-vingt, on sait 35 par la littérature que la gonadolibêrine de certains poissons i 2 fr et oiseaux diffèrent par leur structure de celle d'un mammifère jJ.A. King et R.P. Miliar, J. Biol. Chem. 257, 10722-28 4 (1982); South-African Journal of Science 78, 124 (1982) ; N.
Sherwood et coll., Proc. Natl. Acad. Sei. 8£, 2794-2798 (1983)J.
5 Ces différences sont trouvées dans les aminoacides des positions 7 et/ou 8.
• On sait également par la littérature, que les dérivés de la gonadolibérine qui contiennent en position 6 certains D-aminoacides à la place de la glycine, présentent une acti-10 vité biologique accrue par rapport à la gonadolibérine naturelle (J. Sandow et coli. Control of Ovulation, Butterworth, London, 1978, pp. 49-70).
^On sait de plus, que la substitution de la partie glycine amide en position 10 par des groupes amides ayant une 15 chaîne carbonée aliphatique [k. Fujino et al., J. Med. Chem, ç 16, 1144-1147 (1973)], élève 1' activité biologique encore à un niveau supérieur.
-if
La présente invention a pour but de préparer de nouveaux dérivés de la gonadolibérine qui peuvent être utilisés 20 efficacement dans le processus de reproduction de poissons, oiseaux et mammifères.
La présente invention fournit de plus d'autres dérivés ayant une activité biologique accrue par rapport aux dérivés naturels.
25 - La présente invention repose sur la constatation que le remplacement des aminoacides en position 7 et 8 dans la molécule de gonadolibérine par d'autres aminoacides et que certaines combinaisons de ces changements, respectivement, * fournissent des analogues de la gonadolibérine convenables 30 pour la reproduction des poissons, oiseaux et mammifères.
P
> De plus, la présente invention repose sur la cons tatation selon laquelle l'efficacité des dérivés de la gonadolibérine préparés par changement des aminoacides ep position 7 et 8, peut être accrue par l'insertion .de certains D-amino-35 acides en position 6 et de groupes alcoyl-amides en position 10, 3 à la place de la glycine et de la glycine amide respectivement.
Les nonapeptide-C^4~alcoyl-amides et les dëcapep-tide amides représentés par la formule générale (I) ci-après : 5 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-x1-x2-x3-Pro-X4 (I) dans laquelle X^, X2, X3 et X4 sont tels que définis plus haut, leurs sels et leurs complexes peuvent être préparés conformément à la présente invention de la façon suivante ; a) en utilisant la méthode de la synthèse des peptides de 10 phase solide, on couple, selon la séquence requise, les amino- acides protégés de façon appropriée à un support polymère solide à l'aide de carbodiimide ou d'un ester actif et, dans un cas donné, on détache le peptide terminé du support par une aci-dolyse ou une aminolyse, et, si cela est désiré, on élimine 15 les groupes protecteurs des aminoacides du peptide, pendant, ç avant ou après le détachement du peptide du support polymère, ou b) on construit le produit final recherché à partir des - aminoacides protégés convenables, en utilisant une combinaison appropriée de condensation de fragment et de synthèse en 20 étape, en fonction du caractère chimique des composants aminoacides variables.
Il est avantageux d'utiliser une résine benzhydryl-amine ou une résine Boc-proline, comme support solide.
Il convient de détacher du support le peptide pro-25 tégé, en le traitant avec de l'acide fluorhydrique et/ou en effectuant une éthyl-ammonolyse.
Conformément à la variante b), il est préférable de préparer les nouveaux dérivés de nona- ou décapeptide, en r * condensant un pentapeptide azide représenté par la formule (II) 30 ci-après : i Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 (II) avec un tëtra- ou pentapeptide de formule générale (III) ci- après : 35 X1-X2-X3-Pro-X4 (III) 4 ou en condensant un hexapeptide azide représenté par la formule ; générale (IV) ci-après :
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-N3 (IV) 5 avec un tri- ou tétrapeptide de formule générale (V) ci-après : X2-X3-Pro-X4, (V) ' ou en condensant un heptapeptide azide représenté par la for- 10 mule générale (VI) ci-après :
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-N3 (VI) avec un di- ou tripeptide représenté par la formule générale (VII) ci-après : 15 X3-Pro-X4 , (VII) où X^, X2, X3 et X4 sont tels que définis plus haut.
0 On peut éventuellement convertir le nona- ou le " décapeptide amide obtenu en un sel acide en le faisant réagir 20 avec un acide convenable du point de vue pharmaceutique, ou si cela est désiré, on peut libérer la base libre à partir d'un sel d'addition acide avec une base, et si cela est désiré, on peut convertir en un complexe métallique un nona- ou un décapeptide-amide.
25 De plus, la présente invention est relative aussi à des compositions pharmaceutiques contenant comme composés actifs, les composés de la formule générale (I), leurs sels * et leurs complexes.
Λ Les compositions pharmaceutiques sont généralement 30 préparées par mélange d'au moins un composé de formule (I)/ ou d'un sel ou complexe de celui-ci acceptable du point de vue ^ pharmaceutique, avec des supports et/ou des additifs utilisés couramment dans la préparation des compositions pharmaceutiques, suivi de la mise des compositions obtenues, par exemple, sous 35 la forme de comprimés, dragées, capsules, suppositoires, solu-
V
5 tions injectables, pulvérisations nasales, etc..
Les dérivés de la gonadolibérine de formule (I) f peuvent efficacement être utilisés chez des poissons, des oiseaux et des mammifères, lorsqu'ils sont administrés par 5 voie intra-musculaire ou sous-cutanée à une dose de 0,1 ÿg à 5 mg.
Le principal avantage des composés conformes à la présente invention réside en ce que les nouveaux dérivés de la gonadolibérine de formule générale (I), contiennent des 10 combinaisons d'aminoacides en positions 7 et 8 qui sont caractéristiques des poissons et des oiseaux, si bien qu'ils peuvent être utilisés de préférence pour le processus de reproduction de ces espèces animales également.
Outre les dispositions qui précèdent, l’invention 15 comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
20 II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Dans les exemples 1 à 5, les composés sont synthé-25 tisés par la technique en phase solide f" Merrifield, R. B., J. Am . Chem. Soc. 85, 2149-2151 (1953)J , avec une résine polystyrène divinylbenzène chlorométhylée dans le cas des peptides alcoyl-amides ou une résine benzhydrylamine dans le cas „ de peptide-amides. Les aminoacides individuels sont couplés 30 à la résine sous forme de leurs dérivés N-a-ter-butyloxy- carbonyles (Boc) à l'aide de dicyclohexylcarbodiimide (DCC), Ν,Ν'-diisopropylcarbodiimide (DIC) ou bien selon la méthode de l'ester actif. Les groupes réactifs des chaînes latérales des aminoacides sont protégés, si cela est désiré, avec des 35 groupes protecteurs appropriés.
b
Le degré d*achèvement de la réaction de couplage est mesuré par le test de la ninhydrine ^Kaiser, E., Coles-cott, R.L., Bossinger, C.D. et Cook, P.I., Anal. Biochem.
34, 595-598 (1970)J . Si le test est positif, le couplage 5 est répété . La durée du couplage varie entre 1 et 16 heures, en fonction de l'aminoacide.
La déprotection du peptide, ainsi que la séparation du peptide de la résine, sont de préférence réalisées en une étape, avec de l’acide fluorhydrique liquide (HF) [Sa^aki-10 bara, S., Shimonishi, Y., Kishida, Y., Okada, M., et Sugi- kara, H., Bull . Soc. Japan 40, 2164-2167 (1967)~J. Lorsqu’on utilise un groupe protecteur Nlin-àinitrophënyle (DNP), on l'enlève de la chaîne latérale de l'histidine avant de procéder à la coupure par HF. La peptide-résine protégée est agitée 15 dans du diméthylformamide (DMF) contenant quelques gouttes de propylamine. Après élimination du solvant, la résine portant le peptide est traitée avec l'acide fluorhydrique de façon habituelle. Lorsqu'on veut préparer un composé de type ^ peptide alcoylamide, on sépare le peptide de la résine par 20 une alcoyl-ammonolyse, suivie d'une hydrogénolyse et/ou d'une acidolyse en fonction de la nature des groupes protecteurs
Le produit brut récupéré après la coupure par HF, est soumis à une filtration sur gel, dans une colonne garnie de Sephadex 6-25, avec une solution d’acide acétique comme 25 êluant.
Une purification supplémentaire est réalisée par chromatographie préparative en phase liquide haute performance (CLHP) et/ou chromatographie sur gel de silice. La pureté des peptides est évaluée par l'analyse des aminoacides et ; 30 par chromatographie sur couche mince (CCM). Les valeurs de R^ en CCM sont déterminées sur Kieselgel (DC, Alufolien, g Merck) avec les mélanges de solvants suivants ; ! 7 1. Acétate â'éthyle/pyridine/acide acétique/eau 30: 20: 6: Il 2. Acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau 60: 20: 6: Il ^ 3.Acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau 120: 20: 6: Il 4. Acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau 240: 20: 6: 11 5 5. n-Butanol/acide acétique/eau/acëtate d'éthyle 1: 1: 1: 1 6. n-Butanol/acide acétique/eau 4: 1: 1 7. i-Propanol/acide acétique 1 M 2: 1 8. Acétate d*éthyle/pyridine/acide acétique/eau 5: 5: 1: 3 9. n-Butanol/acide .acétique/ammoniac 10 (1 ce NH3 : 4 H20)/eau 6: 1: 1: 2 ldi Méthyl-ëthyl-cétone/acide acétique/eau 120: 15:20
Exemple 1 h 8
Préparation de la D-Phe , Gin -gonadolibérine M: 1243 15 a) Synthèse
On fait gonfler 1,25 g (1 mmole) de résine benzhydry-lamine, HCl (0,8 meq/g) (Pierce) dans du CH2C12 pendant deux heures, puis on suit les étapes suivantes pour effectuer le couplage des résidus aminoacides : 20 -
Etape Réactifs et opérations Durée du mélange _(min. )_ 1 CH2C12, laver 3 fois 1 2 Acide trifluoro acétique à 33 % (TFA) dans CH2C12 1 25 3 TFA à 33 % dans CH2Cl2 25 4 CH2C12, laver 3 fois 1 5 CHCl^, laver 2 fois 1 6 Triéthyl-amine à 10 % (TEA) dans CHC13, 2 fois 2 i 30 7 CHCl^, laver 2 fois 1 8 Ethanol, laver 2 fois 1 5 9 CH2C12, laver 2 fois 1 10 Boc-amino acide (3 mmoles) dans CH2C12 et si cela est désiré, DMF,plus DIC * ou DCC (3 mmoles) dans CH2Cl2* ’ 60 - variable ^ 11 CH2C12, laver 2 fois 1 12 Ethanol, laver 2 fois 1 8 * Gin est couplé sous forme de son dérivé Boc-Gln-ONP i (p-nitrophënyl),selon la méthode de l'ester actif ; le groupe α-amino n'est pas protégé dans le cas de Flp.
On prélève un aliquot après chaque cycle (après 5 l'étape 12) pour réaliser le test à la ninhydrine ; si le test est négatif, le cycle suivant est commencé à l'étape un i * et dans le cas où le test est positif, un autre recouplage (étapes 5 à 12) est introduit.
A la fin de la synthèse, on recueille 2,28 g de Glp-10 -His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-peptide-résine. AW : 1,05 g (66 %).
(^peptide protégé : 1577)
b) Séparation par HF
Le peptide protégé (2,28 g) est traité avec du HF 15 redistillé (30 ml) en présence d'anisol (3 ml) et de dithio- thréitol (100 mg), pendant 60 minutes à 0°C. Le HF est éliminé dans un courant d'azote gazeux anhydre, la résine est ensuite mise en suspension dans de l'éther absolu et filtrée. Le résidu solide est lavé avec de l'acide acétique à 50 %, puis 20 la solution est évaporée sous vide à 37°C. La matière évaporée est directement soumise à une filtration sur fel (voir l'étape c) ci-dessous).
c) Filtration sur gel
Le peptide brut (obtenu dans l'étape b) ) est purifié 25 sur une colonne de Sephadex G-25 (2,5 X 100 cm) dans de l'acide acétique à 50 % avec un débit de 15 ml/h. La séparation est suivie par spectre d'absorption UV à 280 nm et par CCM.
Des fractions (300 à 350 ml) sont collectées et lyopholisées. Rendement : 690 mg (55 %).
30 d) CLHP préparative
Une autre purification est réalisée à l'aide d'une colonne CLHP préparative (Whatman) du gel de silice LRP-1 (13-24y .) lié en C4Q à phase inverse, équilibrée avec 1 Ö * une solution de méthanol à 25 % dans de l'acide acétique à 35 30 %. Après équilibre, on charge 230 mg de la matière filtrée i » 9 sur gel, sur la colonne. L'ëlution est effectuée avec un système de gradient linéaire du méthanol-acide acétique à 30 % (25 _ à 40 % de mëthanol) avec débit de 2 ml/minute et sous une pres- 5 sion de 3,5.10 Pa. Le contenu des fractions est analysé à 5 280 nm et suivi par CCM. La collecte et la lyophilisation du produit fournissent 133 mg de D-Phe , Gin -GnRH. La quantité absolue doit être multipliée par 3 pour correspondre aux 690 mg de la matière ayant subi une filtration sur gel (399 mg, 32 %) = 0,76 ; τζ « 0,68 ? R® = 0,33 ? rI = 0,93 ; R? « 0,83.
10 1 1 Analyse des aminoacides .
Ser 0,93, Glu 1,96, Pro 0,95, Gly 1,02, Leu 1,00,
Tyr 1,01, Phe 1,02, His 0,99.
Point de fusion : 175 à 178°C ; [a]^ = “ 68,0e (c = 0,1 , 15 0, 1 M ACOH).
Exemple 2 c 7 8
Préparation de la Trp , Gin -gonadolibérine M: 1226 a) Synthèse 20 On fait gonfler 2,5 g (1 mmole) de résine benzhydry- lamine, HCl (0,4 meq/g) dans du CH2Cl2' puis on prépare 3,62 g de Glp-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-peptide résine selon la procédure décrite dans l'exemple 1 a).
ΔΡ: 1,12 g (76 %) (Mpeptide protégé : 1468).
25 b) Dëprotection- et séparation du peptide de la résine.
Elimination du_groupe DNP La résine portant le décapeptide protégé (3,63 g) est agitée dans 20 ml de DMF et 1 ml de propylamine pendant 30 60 minutes, à la température ambiante, puis la résine portant î le peptide partiellement protégé est séparée par filtration, v lavée avec du CH2C12 et de 1'.éthanol, puis séchée sous vide.
Séparation par HF
Après élimination du groupe DNP .protecteur, le peptide 35 .est traité -par du HF selon la procédure de l'exemple 1 b) . On ( 10 obtient de cette façon 0,8 g (65 %) de dëcapeptide amide brut, c) Filtration sur gel
La filtration sur gel est effectuée selon la procédure de l'exemple 1 c). Rendement : 520 mg (42 %).
5 d) CLHP préparative
Le procédé est réalisé selon la méthode qui est décrite dans l'exemple 1 d), si ce n'est que le gel LRP-1 est équilibré avec une solution à 18 % du méthanol dans de l'acide acétique à 30 %. La matière brut ayant subi une filtration sur 10 gel, est ëluée de la colonne avec un système à gradient linéaire de mëthanol-acide acétique à 30 % (18 à 35 % de méthanol).
On obtient ainsi 380 mg du peptide pur (31 %)..
Rf - 0,66 ; r| = 0,57 ; R® = 0,78.
Analyse des aminoacides :
Ser 0,93, Glu 1,93, Pro 1,00, Gly 2,04, Tyr 0,98, Trp 1,86, His 1,03.
Exemple 2 7 8 10 - Préparation de Trp , Leu , desGly -gonadolibérine 20 éthylamide M: 1198 a) Synthèse
On prépare d'abord la Boc-résine selon la méthode de Merrifield ^Serrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. 86, 304 (1964)/. 25 On fait gonfler 2,0 g (1 mmole) de Boc-Pro-rêsine (0,5 meq/g) pendant deux heures, puis on couple les aminoacides appropriés ä la résine, l'un après l'autre, selon la procédure qui est décrite dans l'exemple 1 a). Après le dernier cycle, on obtient 3,02 g de résine portant le Glp-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-> 30 -Gly-Trp-Leu-Pro-nonapeptide.
c ΔΡ; 1,02 g (83 %) (Mpeptide protégé : 1486) .
b) Dëprotection et séparation du peptide de la résine t. Le groupe DNP protecteur est d'abord éliminé suivant 35 la procédure de l'exemple 2b). Le peptide partiellement i 11 protégé est alors détaché de la résine sous forme de son ëthylamide ^Coy, D.H. et coli. Biochemistry 13, 323-326 (1974J/. A ce propos, la résine portant le peptide est agitée avec 15 ml d'ëthylamine condensée à 0°C, pendant 3 heures. L'excès d'êthyl-5 amine est éliminé dans un courant d'azote gazeux. Le résidu est lavé avec de l'éthanol et du DMF, puis filtré. Le filtrat est évaporé sous vide, le résidu est traité avec de l'éther et la matière solide est filtrée.
Une déprotection complète du peptide est effectuée 10 par traitement avec le HF anhydre selon la procédure de l'exemple 1 b). Rendement : 710 mg (59 %) .
c) Filtration sur gel
Le nonapeptide éthylamide est envoyé à travers une colonne de Sephadex G-25 dans l'acide acétique à 30 %, selon la 15 procédure de l'exemple 1 c) . Ren dement 490 mg (41 %) .
d) Chromatographie sur gel de silice.
^ Le peptide brut est purifié sur une colonne de
Kieselgel 60, 2x 100 cm (230-400 mesh, Merck) dans un mélange 30:20:6:11 d'acétate d'éthyle : pyridine : acide acétique : eau, 20 avec un débit de 8 ml/h. On collecte des fractions de 4 ml et suit l'élution par CCM. Les fractions renfermant la substance pure sont évaporées et lyophilisées.
Rendement : 320 mg (26 %).
R* = 0,61 ? R? = 0,42 ? R? = 0,75.
25
Analyse des aminoacides :
Ser 0,89, Glu 0,96, Pro 0,95, Gly 0,97, Leu 1,00, Tyr 1,02, Trp 1,88 His 1,03.
Exemple 4 5 7 8 30 Préparation de la Phe , Gin -gonadolibërine M : 1187 a) Synthèse
On fait gonfler 1,25 g (1 mmole) de résine benzhy-drylamine, HCl (0,8 meq/g) dans du Œ^Cl^ .pendant deux heures, 35 puis on prépare selon la procédure de l'exemple la), 2,9 g de
• I
12 résine portant le Glp-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly--Phe-Gln-Pro-Gly-peptide.
ΔΡ î 1,27 g (83 %) (^peptide protégé : 1521).
5 b) Séparation par HF
Le peptide protégé est traité avec du HF anhydre selon la procédure de l'exemple 1 b) . On recueille ainsi 980 mg (82 %) de matière dëprotëgëe.
c) Filtration sur gel ^0 Le dëcapeptide amide brut est purifié sur une colonne de Sephadex G-25 dans de l'acide acétique 2M, selon la procédure de l'exemple 1 c) . Rendement : 576 mg (49%).
d) CLHP préparative
Le procédé est effectué selon la procédure de l'exemple 1 d) , si ce n'est que le gel LRP-1 est équilibré avec une lo solution à 10 % de méthanol dans de l'acide acétique à 20 %. L'élution est réalisée avec un système à gradient linéraire de méthanol-20% d'acide acétique (10 à 25 % de méthanol, 150-150 ml), puis poursuivie avec un système à gradient linéaire 2o contenant 25 à 40 % de méthanol (150-150 ml de chaque) . Les fractions contenant le peptide pur sont collectées et évaporées. Rendement ; 448 mg (38 %).
R* = 0,12, Rj| = 0,7, R^ = 0,24, R^ = 0,87.
Analyse des amino acides : 25 Ser 0,87, Glu 2,05, Pro 1,03, Gly 2,13, Tyr 0,92, Phe 1,00, His 0,95, Trp 0,81.
Point de fusion : 182°C.
Exemple 5 30 Préparation de la Phe7, Leu8-gonadolibërine M: 1172 a) Synthèse
On fait gonfler 0,62 g (0,5 mmole) de résine benzhy-drylamine, HCl (0,8 meq/g) dans du CH2C12 pendant deux heures, 35 puis selon la procédure de l'exemple la), on synthétise 1,33g i 13 de résine portant Glp-His(Tos)-Tro-Ser(BOzl)-Tyr(OBzl)-Gly--Phe-Leu-Pro-Gly-peptide.
ΔΡ: 695 mg (92 %) (Mpeptide protégé : 1506)
b) Séparation par HF
5 Le peptide protégé est traité par du HF selon la procédure de l’exemple 1 b). On obtient ainsi 510 ml (87 %) du décapeptide brut.
c) Filtration sur gel
Le décapeptide amide obtenu dans l'étape b) est 10 chargé sur une colonne de Sephadex G-25 dans de l'acide acétique 2M et purifié selon la procédure de l'exemple 1 c).
Rendement : 363 mg (62 %) . ·’ d) Chromatographie sur gel de silice
Le peptide est à nouveau purifié sur une colonne de 15 Kieselgel 60 (2 x 100 cm) dans un mélange 1:1:1:1 de n-butanol : acide acétique : eau : acétate d'éthyle. Le contenu des frac-~ tions est suivi à 280 nm et par CCM. On obtient ainsi 299 mg (51 %) du décapeptide amide pur.
R* = 0,55 ; R? = 0,39 ; = 0,62 ; Rl = 0,73.
20 1 1 X 1 Analyse des aminoacides :
Ser 0,91, Glu 0,97, Pro 1,07, Gly 2,12, Leu 1,00, Tyr, 1,03, Phe 0,94, His 1,05.
Exemple 6 25 Préparation du D-Phe^, Gln^, desGly^^ gonadolibërine éthylamide M : 1198
Boc-His(DNP)-Trp-OMe M : 623
*· 30 On dissout 21,12 g (50 mmoles) de Boc-His(DNP)-OH
Q- dans 100 ml de DMF et l'on refroidit la solution à 0°C. Ensuite, on ajoute tout en agitant, 10,32 g (50 mmoles) de DCCI et 7,66 g (50 mmoles) de N-hydroxy-benztriazole. Le mélange est * agité à 0°C pendant 10 minutes et la dicyclohexyl-urée prëci-35 pitëe est séparée par filtration. , 14
On dissout 12,74 g (50 mmoles)de H-Trp-OMe,HCl dans 70 ml de DMF et l'on refroidit la solution à 0°C. Tout en agitant, on introduit 693 ml (50 mmoles) de triéthylanâne et - après une période de 5 minutes, on sépare le chlorhydrate de 5 triëthylamine précipité en le filtrant.
Les deux solutions sont combinées et agitées à 0°C pendant une nuit. Ensuite, on sépare par filtration la DCU précipitée et on évapore la solution à siccité. Le résidu huileux est dissous dans 500 ml d'acétate d'éthyle et on la 10 secoue avec trois portions de 100 ml d'une solution KHSO^ IM refroidie par de la glace, cinq portions de 100 ml d'une solution saturée de NaHCO^ et enfin deu3$ portions de 100 ml d'une solution de NaCl à 10 %. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée à siccité. La 15 substance huileuse obtenue est pulvérisée avec de l’éther de pétrole, filtrée et séchée. Le produit cristallin obtenu peut 1 être recristallisé à partir de l'acétate d'éthyle avec de l'éther de pétrole. Rendement : 27,7 g (89 %).
Point de fusion : 119 à 122°C; fa]22 = +14,1° (c = 1, DMF).
20 R^ = 0,62.
b) H-His(DNP)-Trp-OMe,2HC1 M: 522,5 (base libre) : 595 (,2HC1)
On dissout 24,9 g (40 mmoles) du dépeptide, le 25 Boc-His (DNP) -OMe dans 100 ml de. mëthanol et l’on ajoute 100 ml d'une solution d'acide chlorhydrique méthanolique 4N. Le mélange est laissé reposer 30 minutes â la température ambiante, tandis que cristallise le chlorhydrate du dipeptide.
Les cristaux sont séparés par filtration, lavés à l'éther et ^ 30 séchés. Rendement : 21,91 g (92 %).
Point de fusion : 198 à 202°C ; £a]p2 = °»49° (c “ 1» DMF).
3 4
Rj = 0,46, R* = 0,18.
15 c) Glp-His(DNP)-Trp-OMe Μ : 634
On dissout 4,85 g (36,8 mmoles) d'acide L-pyro-glutamique, 7,85 g de dicyclohexyl-carbodiimide et 5,63 g de 5 N-hydroxy-benztriazole dans 100 ml de DMF. Le mélange est agité de 5 à 10°C pendant 10 minutes, après quoi la DCü est séparée par filtration.
On dissout 20,84 g (35 mmoles) de H-His(DNP-Trp-OMe,2HCl dans 100 ml de diméthyl formamide, puis on ajoute 10 9,72 ml (70 mmoles) de triéthylamine à la solution. Après 5 minutes d'agitation, le chlorhydrate de triéthylamine précipité est séparé par filtration. Les deux solutions sont comblé nées et agitées à la température ambiante pendant 16 heures.
On ajoute ensuite 90 ml d'acétone dans le mélange et l'on 15 sépare par filtration la matière insoluble précipitée. L’éva-s poration de la solution fournit une matière huileuse qui est triturée avec de l'acétate d'éthyle filtrée et séchée. La matière cristalline sèche est lavée avec trois portions de 25 ml d'eau, puis séchée. Le produit peut être recristallisé 20 par dissolution dans de l'acétate d'éthyle et refroidissement. Rendement ; 18,42 g (83,1 %).
Point de fusion : 148 à 151°C ; foQ^ = +5,2 (c = 1, DMF) .
= 0,53, R* = 0,38.
25 d) Glp-His-Trp-OMe M : 466
On dissout 15,84 g (25 mmoles) du tripeptide protégé le Glp-His (DNP)-Trp-OMe, dans un mélange de 100 ml de DMF et , de 40 ml d'eau. On ajoute 4 ml de mercapto-ëthanol et on 30 ajuste le pH de la solution à 8, à l'aide de triéthylamine. On 'λ laisse reposer à la température ambiante pendant 30 minutes et on évapore à siccitë sous vide. La matière huileuse est triturée avec de 1'éther,filtré et séchée. Le produit obtenu est dissous dans une petite portion de mëthanol et recristal-35 lisé par addition d'éther. Les cristaux précipités sont séparés 16 par filtration et séchés. Rendement : 10,92 g (93,6 %).
Point de fusion : 228 à 232°C ? [a]£ = +4,04° (c = 0,42, DMF) * s, = 0,30.
5 e) Glp-His-Trp-N2H2 M : 466,5
On dissout 9,33 g (20 mmoles) du tripeptide de Glp-His-Trp-OMe dans 250 ml de méthanol. On ajoute 20 ml d' 10 hydrazine hydraté à 98 % à la solution. Le mélange réactionnel est agité à 40°C pendant 3 heures et ensuite à la température ambiante pendant une nuit. La matière précipitée est alors séparée par filtration, lavée avec du méthanol froid et séchée. Rendement : 7,58 g (81,2 %) .
O O
15 Point de fusion : 166 à 169°C ; JVJD = -22,3 (c = 0,5 , DMF).
R* = 0,50, Rf = 0,14.
s e) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe M: 717 2q On dissout 7,0 g (15 mmoles) du Glp-His-Trp-ü^H^ obtenu dans l'étape e) dans 60 ml de DMF. La solution est refroidie^ à 0°C et 7,5 ml (45 mmoles) d'une solution d'HCl 6N sont ajoutés sous agitation. Ensuite, on introduit goutte-à-goutte 1,035 g (15 mmolés) de NaN02 dans le mélange sous forme d’une 22 solution aqueuse concentrée et l'on agite le mélange à 0°C pendant 15 minutes supplémentaires; Une solution de 4,78 g (15 mmoles) de H-Ser-Tyr-OMe, HCl dans 15 ml de DMF est ajoutée au mélange réactionnel. Le pH est ajusté à la neutralité avec 6,25 ml (45 mmoles) de triéthylamine et l'on agite ^ 20 mélange à 0-40°C pendant une nuit. Le jour suivant, il est évaporé à siccitë sous vide et le produit huileux est trituré .'i avec de l'éther.
On recueille 12,1 g (100 %) du composé recherché contenant une petite quantité d'impuretés. Ce produit peut être converti en hydrazide sans purification et l'hydrazide obtenu i 17 peut être facilement cristallisé.
Propriétés physiques d'un échantillon témoin recris--* tallisé à partir du mëthanol :
Point de fusion : 188 à 190°C ; [a}22 = -3,48° (c= 1, DMF) ; 5 R* = 0,58, R2 = 0,26.
g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 M : 717 » 10 On dissout 12 g de l'ester de pentapeptide brut en poudre, le Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe dans 200 ml de mëthanol et l'on ajoute 10 ml d’hyrazine hydratée à 98%. Le mélange est agité à 40°C pendant 3 heures, puis une nuit â la température ambiante, après quoi les cristaux précipités sont séparés par filtra-15 tion et séchés dans un dissiccateur sur de l'acide sulfurique concentré. La matière cristalline sèche est dissoute dans 250 ml d'une solution 0,5 N d'acide chlorhydrique. Le pH de ? la solution est ajusté à 8 avec une solution saturée de carbo nate de sodium. Après repos à 0°C pendant 2 heures, les cris-20 taux précipités sont filtrés, lavés avec de l'eau glacée et séchés.
Rendement : 6,12 g (56,9 %, calculé pour les deux étapes).
Point de fusion : 205 à 206°C ; jYj22 = -21,51° (c = 1, DMF).
R* =0,39, R2 =0,14.
25 r 1
Azote d'hydrazine : trouvé : 3,79 %, 3,76 % calculé: 3,91 % h) Z-Gln-Pro-NHEt M : 405 . 30 On dissout 3,242 g de proline ëthylamide (obtenue à partir de 22,8 mmoles de Z-Pro-NHEt par hydrogênolyse) dans 70 ml de tétrahydrofuranne (THF) , puis on ajoute 5,6 g (20 mmoles) de Z-Gln-OH et 1,034 g de N-hydroxy-benztriazole à la solution. Le mélange réactionnel est refroidi à 0°C et la 35 solution de 5,34 g (25,9 mmoles) de dicyclohexylcarbodiimide 18 dans du THF est versée dans le mélange réactionnel agité. L'agitation est poursuivie à 0°C pendant 5 heures, puis pendant 20 heures à la température ambiante. Le précipité est filtré, lavé avec du THF, puis le filtrat est évaporé sous 5 vide et le résidu est dissous dans du chloroforme. La solution est secouée avec trois portions de 35 ml d'un mélange de NH^OH et d'eau (1:5), deux portions de 20 ml d'eau, trois portions de 35 ml d'une solution de HCl 0,1 N et enfin deux portions de 20 ml d'eau. La phase organique est séchée sur du 10 sulfate de sodium anhydre, filtrée, lavée avec du chloroforme et évaporée. Le résidu huileux obtenu est dissous dans un mélange de 35 ml de THF et de 50 ml d'acétate d'éthyle, puis filtré. La solution est évaporée et le résidu est trituré avec de l'éther. Le produit solide obtenu est filtré, lavé 15 à l'éther et séché sous vide.
Rendement : 7,68 g (95 %).
R* = 0,73, Rf = 0,45.
i) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt 20 M : 518,6
On dissout 4,5 g (11 mmoles) de Z-Gln-Pro-NHEt dans 30 ml d'acide acétique glacial et on ajoute 55 ml d'acide bromhydrique 4N, dans de l'acide ..acétique glacial, à la solution. Le mélange réactionnel est maintenu à la tempéra-25 ture ambiante pendant 90 minutes, puis additionné de 250 ml d'éther anhydre et le mélange est maintenu pendant 60 minutes à la température ambiante. Le surnageant est décanté, 100 ml d'éther sont ajoutés au résidu et 15 minutes plus tard, il est filtré et lavé à l'éther. Le résidu solide est séché 30 sous vide sur du pentoxyde de phosphore et de 1'hydroxyde V de sodium. Rendement : 49 g (hygroscopique).
On met en suspension 3,8 g (11 mmoles) du dipeptide éthylamide, HBr obtenu dans 150 ml de chloroforme et on ajoute 7 ml de trithylamine à cette suspension. On ajoute 35 6,4 g d'ester pentachlorophënylique de carbobenzoxy-leucyle i 19 r dans 65 ml de chloroforme. Le mélange réactionnel est agité pendant une nuit à la température ambiante. Le jour suivant, il est lavé avec de l'acide chlorhydrique IN, une solution de chlorure de sodium saturée, une solution d'hydroxyde 5 d'ammonium 2N et à plusieurs reprises,avec une solution de chlorure de sodium saturée, La phase chloroformique est séchée sur du sulfate de sodium anhydre et évaporée sous vide. Le résidu est trituré avec de l'éther, filtré, lavé à l'éther et séché sous vide. Rendement : 4,6 g (81 %).
10 j) H-Leu-Gln-Pro-NHEt,HBr M : 465,5
Le produit brut préparé dans l'étape i) est dissous dans 10 ml d'un acide acétique glacial et agité pendant 60 minutes à la température ambiante, puis la solution est 15 diluée avec 100 ml d'éther anhydre. Le précipité est filtré et séché sous vide.
Rendement : 3,54 % (76 %) .
R^ = 0,1, Rf = 0,55, R^ = 0,13, R® = 0,77.
20 Analyse des aminoacides :
Glu 1,05, Pro 1,19, Leu 1,00.
k) Boc-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt M : 631,7
On dissout 2,33 g (5 mmoles) de H-Leu-Gln-Pro-NHEt, 25 HBr dans 5 ml de DMF et l'on refroidit à 0°C puis on ajoute 0,7 ml (5 mmoles) de triéthylamine et 2,57 g (5 mmoles) d1 ester pentachlorophénylique ter.-butyloxycarbonyl-D--phênylalanyle dans 10 ml de DMF à la solution. Le pH est ajusté à une valeur entre 7 et 8, puis le mélange réactionnel - 30 est agité pendant 48 heures à la température ambiante, pen dant lesquelles le pH est ajusté de temps en temps à la .. " neutralité, à l'aide de trithylamine. Après évaporation du mélange réactionnel, la substance restante est triturée avec de l'éther, puis filtrée et séchée. Le produit brut obtenu 35 est soumis à une déprotection sans purification préalable.
i 20
Rendement : 2f81 g (89 %).
l) H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHET.TFA M : 645,6
On dissout 1,26 g (2mmoles) de Boc-D-Phe-Leu-Gln-: 5 Pro-NHEt dans 10 ml d'acide trifluoro-acétique et l'on agite pendant 20 minutes à la température ambiante. L'acide trifluo-roacëtique est évaporé sous vide et le résidu est trituré avec de l'éther, filtré et séché. Le résidu est soumis à une chromatographie sur une colonne de gel de silice avec un 10 mélange 4:1:1 de n-butanol : acide acétique : eau. Les fractions appropriées sont collectées et évaporées sous vide. Le résidu est dissous dans quelques ml-d'eau, puis lyophilisé. Rendement : 880 mg (68 %).
R l = 0,25, R^ = 0,35.
15 1 1
Point de fusion : 142°C ; fa]^° = “66° (c = 0,1, DMF) .
m) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt M : 1199
On dissout 286 mg (0,4 mmole) du pentapeptide 20 hydrazine, le Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Njl^ préparé dans l'étape g) dans 10 ml de diméthyl formamide. La solution est refroidie à -10°C, puis, sous agitation, additionnée goutte-à-goutte de 0,27 ml d'acide chlorhydrique 6N, puis d'une solution aqueuse concentrée de 30,2 mg de nitrite de sodium. Cinq 25 minutes plus tard, on y ajoute la solution du sel trifluoro-acétique de 258 mg (0,4 mmole) du tétrapeptide H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt préparé dans 1 ml de diméthyl formamide avec 0,27 ml de triéthylamine à -10°C. Si cela est nécessaire, on ajuste le pH du mélange réactionnel à la neutralité à 30 l'aide du triéthylamine, puis le mélange est agité pendant 1 heure à une température de -5°C,pendant 1 heure à 0°C et pendant 12 heures à la température ambiante.
Le diméthylformamide est éliminé sous vide, le résidu huileux est dissous dans 5 ml d'acide acétique 0,2N 35 et la solution est soumise à une chromatographie sur une 21 colonne de Sephadex G-25 (2 x 95 cm) avec de l'acide acétique 0,2N. Les fractions appropriées sont collectées et lyophilisées. Rendement : 298 mg (62 %).
"TW
R* = 0,39, R^ = 0,13, R^ = 0,48, R^ = 0,14.
5
Analyse des aminoacides :
Ser 0,89, Glu 1,98, Pro 0,97, Leu 1,00, Tyr 1,03, Phe 0,99, His 1,01, Trp 0,91.
Exemple 7 7 8 10 10 Préparation du Trp , Gin , desGly -gonadolibérine éthylamide H : 1220 a) Boc-Gln-Pro-NHEt M : 370 15 On dissout 1,0 g (7 mmoles) de proline éthylamide dans 15 ml de dimêthyl formamide et l'on ajuste le Ph à 8 avec de la triéthylamine, puis on ajoute à la solution, 3,2g r (8,4 mmoles) de l'ester p-nitro-phénylique de ter.-butyloxy- carbonyl-glutaminyle dans 15 ml de dimêthyl formamide. Le 20 mélange réactionnel est agité pendant 48 heures à la température ambiante, tandis que le pH est ajusté de temps en temps à 8, à l'aide de triéthylamine. Après évaporation du mélange réactionnel, le résidu huileux est dissous dans de l'eau, lavé à l'éther et la phase aqueuse séparée est évapo-25 rée sous vide et séchée. Rendement : 1^93 g (74,5 %).
Rf = 0,76.
b) H-Gln-Pro-NHEt,TFA
M : 270 (base libre) M: 367 (sel d'acide TFA) i 30 On dissout 1,9 g (7,2 mmoles) de Boc-Gln-Pro-NHEt ï, dans 10 ml d'acide trifluoro-acétique et on agite pendant 20 minutes à la température ambiante. La -solution est évaporée sous vide, le résidu est trituré avec de l'éther, filtré et séché sous vide.
22 R* = 0,45, *J = 0,45, =0,25, R^° = 0,30.
20
Substance hydroscopique ; [a]D = -34,8° (c = 1, MeOH).
V U
*· c) Boc-Trp-Gln-NHEt 5 M : 557
On dissout 500 ml (1,85 mmoles) de H-Gln-Pro-NHEt dans 10 ml de dimëthyl formamide. Le pH est ajusté à 8 avec de la triéthylamine, puis on ajoute 608 mg (2 mmoles de ter .butyloxy-carbonyl-tryptophane dans 10 ml de diméthyl 10 formamide et 620 μΐ (4 mmoles) de N,N'-diisopropyl carbodi-imide. Le mélange réactionnel est agité pendant 48 heures à la température ambiante, puis évaporé sous vide. Le résidu est dissous dans l'acétate d'éthyle et dilué avec de l'éther.
Le Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt précipité est filtré, lavé à l'éther 15 et séché. Rendement : 740 mg (72 %) .
R^ = 0,75, Rj = 0,38.
r, d) H-Trp-Gln-Pro-NHEt, TFA
M : 456,5 (base libre) M: 554 (Sel d'acide TFA) 20 On dissout 700 mg (1,25 mmoles) de Boc-Trp-Gln- NHEt dans 15 ml d'un mélange 1:1 d'acide trifluoro-acêtique et de CH2C12 et on agite pendant 20 minutes à la température ambiante. Puis, la solution est évaporée sous vide et le résidu est trituré avec de l'éther. Le résidu solide est 25 filtré et séché. Le produit brut ainsi obtenu (environ 500mg) est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice dans un mélange 47:20:6:11 d'acétate d'éthyle : puridine : acide acétique : eau. Les fractions appropriées sont collectées, évaporées à siccité sous vide et le résidu est trituré 30 avec de l'éther.. On obtient ainsi 360 mg (52 %) d'une poudre blanche.
Rf = 0,46, R^ = -0,18.
Point de fusion : 119 à 123°C; [aj^ = 4,8° (c = 0,1,
35 HCl 0,1 n). A
! 23 e) Boc-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt Μ : 613,7 ~ On dissout 350 mg (0,76 mmole) de H-Trp-Gln-Pro- NHEt dans du dimëthyl formamide et on le couple avec 104 mg ' 5 (0,8 mmole) de Boc-Gly selon la procédure de l'étape c) de l'exemple 7. On obtient ainsi 375 mg (81 %) d'une substance cristalline.
R^ = 0,88, = 0,82, R^ = 0,61.
10 f) H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt, TFA
M : 609,6
On déprotège 375 mg (0,6 mmole) de Boc-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt et on le purifie selon la procédure de l'étape d) de l’exemple 7. On obtient ainsi 285 mg (76,6 %) d’une 15 poudre blanche.
Rf = 0,08, R^ = 0,16, Rf = 0,67, R^ = 0,28.
g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt I- M : 1216,4 20 On couple 286 mg (0,4 mmole) du pentapeptide hydra- zide Glp-His-Trp-Ser-Tyr-l^Hg avec 243,8 mg (0,4 mmole) de H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt,TFA obtenu selon la procédure de l'étape m) de l'exemple 6. On recueille ainsi 252,9 mg (52 %) d'une substance pure.
25 1 5
Rf = 0,26, R^ = 0,32.
Analyse des aminoacides :
Ser 0,87, Glu 2,02, Pro 0,91, Gly 1,00, Tyr 1,12, His 1,05, Trp 1,80.
30 Exemple 8 ς Préparation d'injections pour l'administration par voie intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse.
a) Le dérivé de gonadolibérine de formule (I) est dissous dans de l'eau distillée, une solution saline 35 physiologique ou une solution aqueuse tamponnée, à une concen- 24 tration de 1 à 10 mg/ml. La solution est filtrée en petites portions stériles contenant 50 à 500 yg de composant actif, qui sont introduites dans des ampoules et lyophilisées, puis r' les ampoules sont fermées hermétiquement. Le composant ^ 5 actif contenu dans les ampoules est dissous juste avant le traitement, par addition de 1 à 10 ml d'eau distillée et un volume correspondant à la dose désirée est administré.
b) On dissout 20 à 500 μ/ml dans une solution aqueuse contenant 0,9 % de NaCl et 0,9 % d'alcool benzylique.
10 Les portions contenant 20 à 500 μ/ml de composant actif sont introduites dans des ampoules qui sont ensuite fermées , « hermétiquement. Les solutions obtenues'peuvent être directement injectées.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'inven-15 tion ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire ,τ, toutes les variantes qui peuvent venir a l'esprit du techni cien en la matière, sans s’écarter du cadre, ni de la portée 20 de la présente invention.
-fc*'
Claims (14)
1. Dérivés de gonadolibërine caractérisés par la formule générale (I) ci-après : Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4 (I) dans laquelle : X^ est un groupe glycyle ou un D-isomère d’un quelconque groupe aminoacide naturel ou synthétique, X2 est un groupe L-aminoacide dont la chaîne latérale 10 comprend 1 à 4 atomes de carbone, un groupe L-phënylalanyle ou L-triptophyle, I * X^ est un groupe L-aminoacide ayant une chaîne latérale alcoyle en C-j ou alcanoyl (en C2^4)-amide, et X4 est un groupe glycine amide ou un groupe alcoyl (en 15 C^à4 ) amide, à la condition que dans le cas où X^ est un groupe autre que le radical glycyle et X2 est un groupe - tryptophyle, X^ ne puisse pas alors être un radical leucyle, î* et les sels d'addition formés avec des acides utilisables en 20 thérapie et les complexes de ceux-ci.
2. Composé choisi dans le groupe comprenant les Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NH2 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-NH2 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-EA
25 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Gln-Prö-Gly-NH2 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-NH2 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-EA Glp-His-Trp-Ser-T.yr-Gly-Trp-Gln-Pro-EA et les sels utilisables en thérapie et les complexes de ceux-30 ci.
3. Procédé de préparation de dérivés de la gona- > dolibêrine de formule générale (I) ci-après : Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4 (I) | 26 X^ est un groupe glycyle ou un D-isomère, d'un quelconque groupe aminoacide naturel ou synthétique, ~ Xg est un groupe L-aminoacide dont la chaîne latérale com prend 1 à 4 atomes de carbone, un groupe L-phénylalanyle U 5 ou L-triptophyle, X3 est un groupe L-aminoacide ayant une chaîne latérale * alcoyle en C^^ou alcanoyle (en Cj^J-amide, et X4 est un groupe glycine amide ou alcoyl (en C^^)-amide, à la condition que dans le cas où X1 est un groupe autre 10 que le radical glycyl et X2 est un groupe tryptophyle, X3 ne puisse pas alors être un groupe leucyle, et les sels d’addition acides utilisables en thérapie et les complexes de ceux-ci, caractérisé en ce qu'il comprend : 15 a) l'utilisation de la méthode de synthèse peptidique en phase solide, selon laquelle on couple les aminoacides s convenablement protégés, dans la séquence requise sur un & support solide polymère à l'aide de carbodiimide ou d'un ester j; actif, et dans un cas donné, on détache le peptide terminé 20 du support par acidolyse ou aminolyse, et, si cela est désiré, on élimine les groupes protecteurs des aminoacides du peptide, pendant, avant ou après la séparation du peptide du support polymère, ou b) on construit le produit final recherché à partir 25 des aminoacides protégés convenables, en utilisant une combinaison appropriée de condensation de fragment et de synthèse par étapes, en fonction du caractère chimique des composants aminoacides variables.
4. Procédé suivant la revendication 3 a), caracté- ^ 30 risé en ce qu'une résine benzhydrylamine ou Boc-proline est ~ utilisée à titre de support solide.
5. · Procédé suivant la revendication 3 a), caractérisé en ce que le peptide protégé est détaché de la résine par traitement avec de l'acide fluorhydrique et/ou par ëthyl- 35 -ammonolyse. . li 27
6. Procédé suivant la revendication 3 b), caractérisé en ce qu'un pentapeptide azide représenté par la formule ^ (II) ci-après : Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N- (II) -, 5 est condensé avec un tétra- ou pentapeptide de formule générale (III) ci-après : X1-X2-X3-Pro-x4 (III) dans lesquelles X,, X^r X- et X. sont tels que définis dans
7. Procédé suivant la revendication 3b), caractérisé en ce qu'un hexapeptide azide représenté par la formule générale (lv) ci-après :
15 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-N3 (IV) est condensé avec un tri- ou tëtrapeptide de formule générale b (V) ci-après : i X2-X3-Pro-X4 (V) 20 dans lesquelles X^, X2, X3 et X4 sont tels que définis dans la revendication 1.
8. Procédé suivant la revendication 3 b), caractérisé en ce qu'un heptapeptide azide représenté par la formule générale (VI) ci-après :
25 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-N3 (VI) est condensé avec un di- ou tripeptide de formule générale (VII) ci-après : X.-Pro-X (VII) 30 ^ r; dans lesquelles X-^, X2, X3 et X4 sont tels que définis dans la revendication 1.
9. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend comme composant actif,'au moins un composé 35 de formule générale (I) où X^, X2, X3 et X4 sont tels que ! 28 définis dans la revendication 1, ou un sel ou complexe de celui-ci acceptable du point de vue pharmaceutique, avec un support ou un diluant.
10. Procédé de préparation d'une composition phar- 5 maceutique,.caractérisé en ce qu'un composé de formule géné rale (I) où X^, X2, X3 et X^ sont tels que définis dans la revendication 1, ou un complexe ou un sel de celui-ci accep-„ table du point de vue pharmaceutique, est mélangé à un diluant ou support acceptable du point de vue pharmaceutique.
10. Z J 4 la revendication 1.
11. Composé suivant la revendication 1 ou 2 pratiquement tel que décrit plus haut, en référence aux exemples.
12. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 3 à 8, pratiquement tel que décrit plus haut, en 15 référence aux exemples.
13. Composition suivant la revendication 9, = pratiquement telle que décrite plus haut.
* 14. Procédé suivant la revendication 10, prati quement tel que décrit plus haut. Vr
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