DD255170A5

DD255170A5 - Verfahren zur Herstellung von proteinen mit Hirudinaktivität

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Publication number: DD255170A5
Authority: DD
Publication date: 1988-03-23

Abstract

Erfindungsgemaess werden Proteine mit Hirudinaktivitaet hergestellt durch Kultivierung eines eukaryotischen Wirtsorganismus unter geeigneten Naehrbedingungen, welcher mit einem Hybridvektor transformiert wurde, der eine oder mehrere DNA-Einfuegungen hat, die jeweils bestehen aus einer eukaryotischen Expressionssteuerungsfolge, einem DNA-Segment aus einer ersten DNA-Folge, die ein Signalpeptid oberhalb eines und in einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folgekodierung fuer reifes Desulphatohirudin kodiert, wobei das DNA-Segment unter der Transkriptionssteuerung der genannten Expressionssteuerungsfolge steht, und einer zweiten DNA-Folge, welche eukaryotische Transkriptionsendsignale enthaelt, und die Isolierung der Proteine mit Hirudinaktivitaet aus dem Kulturmedium und, wenn das gewuenscht wird, die wahlweise Isolierung zusaetzlichen Proteins mit Hirudinaktivitaet, das zellenassoziiert ist, aus dem Zellinneren und, wenn das gewuenscht wird, die Umwandlung eines resultierenden Proteins mit Hirundinaktivitaet in ein anderes Protein mit Hirudinaktivitaet.

Description

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Hirudin ist ein Antikoagulans, das natürlich in Blutegeln (Hirudo medicinalis) vorkommt. Hirudin ist keine einzelne Proteinspezies, sondern besteht aus wenigstens drei Komponenten, die als Hirudinvariante 1 (HV 1), Hirudinvariante 2 (HV2) (siehe EP-Patentanmeldung Nr. 158564) und „des-(Val)₂-Hirudin" (siehe EP-Patentanmeldung Nr. 158986) bezeichnet werden. Die Varianten unterscheiden sich in der Struktur durch eine Reihe von Aminosäuren voneinander (insbesondere die N-Terminalfolge von HV1, die Val-Val-Tyr ist, die von HV2, die lle-THr-Tyrist, und die von „des-(Val)₂-Hirudin", dieThr-Tyr ist), haben aber gemeinsam eine Akkumulation von hydrophoben Aminosäuren am N-Terminus und von polaren Aminosäuren am C-Terminus, einen als Sulfatmonoester vorhandenen Tyrosinrest (Tyr⁶³), drei Disulfidbrücken und die Wirkung als Antikoagulans.

Hirudin, mit einem K_rWert (Komplexdissoziationskonstante) von 6 χ 1CT¹¹IvI, ist der stärkste bekannte Thrombininhibitor und ist gekennzeichnet durch eine spezifische Affinität zu Thrombin. Andere Enzyme der Blutkoagulationskaskade werden nicht durch Hirudin inhibiert. Im Gegensatz zu Heparin, dem bevorzugten Antikoagulans in der konventionellen Antikoagutionstherapie, übt Hirudin seine inhibitierende Wirkung direkt auf Th rombin aus, wirkt also nicht wie das Erstgenannte durch Antithrombin III. Die einzige pharmakologisch feststellbare Wirkung von gereinigtem Hirudin ist die Unterbringung der Blutkoagulation und die Prophylaxe von Thrombose. Eine Wirkung auf dem Herzschlag, die Atmung, den Blutdruck, die Thrombozytzählung, Fibrinogen und Hämoglobin konnte nicht beobachtet werden bei der intravenösen Verabreichung an Hunde, selbst bei hohen Dosen nicht. Bei Versuchen an Ratten, Schweinen und Hunden erwies sich Hirudin als wirksam bei der experimentellen Thrombose (induziert durch Stase oder die Injektion von Thrombin), beim Endotoxinschock und auch bei der DIC (disseminierte intravaskuläre Koagulation). Wenn Direktvergleichsversuche durchgeführt wurden, erwies sich Hirudin immer als dem Heparin überlegen. Außerdem hat Hirudin eine extrem geringe Toxizität, ist nicht antigen und wird über die Nieren in biologisch aktiver Form fast vollständig ausgeschieden.

Obwohl seit langem bekannt, hat Hirudin nicht die breite therapeutische Anwendung gefunden, die man auf Grund der ausgezeichneten biologischen Eigenschaften erwarten könnte. Seine extrem geringe Verfügbarkeit ist ein schwerwiegender Nachteil, der einer verbreiteten Anwendung in der Medizin im Wege steht. Bisher standen Hirudinpräparate im wesentlichen nur aus natürlichem Material (Blutegelextrakte) gewonnen zur Verfügung, was teuer und nur schwer erhältlich ist und die Anwendung zeitraubender und kostspieliger Isolations- und Reinigungsverfahren beinhaltet (siehe P. Walsmann u. a., Pharmazie 36,653 [1981]; EP-OS Nr. 158986). Angesichts der relativ langen Folge von 65 Aminosäuren bietet aus wirtschaftlichen Gründen auch die herkömmliche Peptidsynthese nur wenig Hoffnung und Erfolg. Für die Herstellung angemessener Mengen an Hirudin müssen daher neue Verfahren angewendet werden, die eine detaillierte klinische Erprobung ihres therapeutischen Potentials und der breiten therapeutischen Anwendung in der Antikoagulatiönstherapie ermöglichen.

Solche Verfahren bietet insbesondere die DNA-Rekombinanttechnik. Mit dieser Technik ist es möglich, die unterschiedlichsten physiologisch aktiven Polypeptide durch Züchtung entsprechend genetisch modifizierter Wirtsorganismen herzustellen. In diesem Zusammenhang muß erwähnt werden, daß Hirudin von den Blutegeln vermutlich über einen Dusolphatohirudinvorläufer produziert wird, der post-translationell sulfatiert wird. Es wird erwartet, daß anderen Wirten als Blutegeln das spezifische Sulfatübertragungsenzymsystem fehlt und sie daher Desulphatohirudine statt Hirudine produzieren. Die biologische Aktivität wird jedoch durch das Fehlen der Sulfatgruppe nicht beeinträchtigt, wie durch das Desulphatohirudinprotein gezeigt wird, das durch enzymatische Entfernung der Sulfatgruppe aus der Phenolhydroxygruppe des Tyr^-Restes des entsprechenden Hirudinproteins gewonnen wird (siehe EP-OS Nr. 142860).

In der kürzlich veröffentlichten EP-OS Nr. 158564 wird die Herstellung von Desulphatohirudinvarianten 1 und 2 und deren Anlage mittels E.colli-Zellen, die mit Plasmiden, welche die strukturellen Gene für die entsprechenden Desulphatohirudine enthalten, transformiert wurden, beschrieben. Die Antikoagulationsaktivität, die in Zellextrakten von gezüchteten E.colli-Zellen gemessen wurden und in Begriffen von Antithrombineinheiten (ATU) gegeben wird, beläuft sich auf 3000-4000 ATU/OD₆₀₀/1 -Kultur, was einer Konzentration von 0,2 mg Hirudin/OD/1 entspricht (auf der Grundlage einer geschätzten spezifischen Aktivität von reinem Hirudin von 15000-20000 ATU/mg).

Vermutlich ist der geringe Ertrag an Hirudinaktivität, der von transformierten E.colli-Zellen gewonnen wird, auf eine Ansammlung des größten Teils des Hirudinproteins in einer inaktiven Form im Zytoplasma auf Grund der inkorrekten Faltung des Moleküls zurückzuführen. Die korrekte Faltung ist von der Bildung von drei Disulfidbrücken innerhalb des Hirudinmoleküls abhängig, die für die Enzymaktivität wesentlich sind (siehe P. Walsmann u.a., ebenda). Andere natürlich sekretierte Säuretierproteine, wie Rinderwachstumshormon, menschlicher Gewebeplasmogenaktivator und menschliches y-lnterferon sind ebenfalls im wesentlichen inaktiv, wenn sie im Zvtolplasma von Mikroorganismen erzeugt und akkumuliert werden (siehe R.A.Smith u.a., Science229,1219 [1985]). Es ist offensichtlich, daß die Sekretionsbahn die Bildung der Disulfidbindung begünstigen kann, da die meisten Proteine, welche Disulfidbrücken enthalten, extrazellulär sind. Es gibt weitere Merkmale, die eine Sekretion äußerst wünschenswert erscheinen lassen:

Sekretierte Proteine sind im allgemeinen leichter festzustellen und zu reinigen als intrazellulär akkumulierte Produkte; durch die Sekretion der gewünschten Produkte in das Medium wird die Notwendigkeit des Aufspaltens der Wirtsorganismen zur Gewinnung der Produkte vermieden; bestimmte heterologe Proteine können eine toxische Wirkung auf den Wirtsorganismus haben. Werden sie sekretiert, ist die Wahrscheinlichkeit der Interferenz mit den normalen Zellfunktionen geringer; sektretierte Proteine werden mit geringerer Wahrscheinlichkeit durch proteolytische Enzyme verdaut als intrazellulär akkumulierte Proteine, die von diesen Enzymen bei Auflösung der Zellen angegriffen werden.

Die meisten sekretierten Proteine werden auf der DNA als Vorproteine mit einem Signalpeptid als angefügter Aminoterminalerweiterung der reifen Aminosäurefolge kodiert. Das Signalpeptid spielt eine wesentliche Rolle bei der kotranslationalen Einfügung der Proteine in die Membranen des endoplasmatischen Retikulums. (ER). Eine Signalpeptidase spaltet das Signalpeptid in ein frühes Ereignis auf der Luminalseite des ER. Der Weitertransport zur äußeren Zellmembran schließt Golgi- und sekretorische Bläschen ein. Das Protein wid entweder in den periplasmischen Raum (z. B. Säurephosphatase, Invertase) oder in das Kulturmedium (z. B. α-Faktor, Killertoxin) sekretiert.

Da alle Eukaryote die Mechanismen für die Expression der genetischen Information und für die Sortierung der ausgedrückten Proteine zu teilen scheinen, erfolgt die Expression von eukaryotischen Genen mit größerer Effektivität in einem eukaryotischen Wirt als in E.colli. Am leichtesten zu züchten und zu handhaben ist von den eukaryotischen Organismen die Hefe. Eine Reihe heterologer Proteine wurde erfolgreich in Hefe zur Expression gebracht. Es war bisher jedoch noch nicht möglich, wesentliche Merkmaleeines Proteins—mit Ausnahme des angefügten Signalpeptids—zu definieren, welche die wirksame Sekretion in das Medium erlauben würden. Es ist daher nicht möglich, zuverlässige Vorhersagen dahingehend zu machen, ob ein Protein sekretiert wird oder nicht. Während so 90% der gesamten Glukoamylse, die von transformierter Hefe erzeugt wird (welche die genetische Information für Vorglukoamylase enthält), und hohe Titers des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) in dem Medium der gezüchteten Hefe gefunden werden, welche das EGF-Gen mit dem angefügten a-Faktorsignalpeptid enthält (EPOS Nr. 116201), sind nur geringe Mengen oder Spuren von/3-Endorphin (a-Faktorsignalpeptid, PCT-Patentanmeldung Nr.84/ 4330), Leukozytinterferon Aflnvertasesignalpeptid, EP-Patentanmeldung Nr. 127304), Human-y-lnterferon, Humanserumalbumin, Rinderinterferonen al und al, Gewebeplasminogenaktivator, Renin und humaninsulinähnlichem Wachstumsfaktor (a-Faktorsignalpeptid, EP-Patentanmeldung Nr. 123544), Leukozytinterferonen D und A, γ-lnterferon und menschliches Wachstumshormon (MGH) (Interferon- bzw. MGH-Signalpeptide, EP-Patentanmeldung Nr.88632) im Medium feststellbar und wird keine Sekretion von Pseudomonaskarboxypeptidas G₂(CPGa) (G₂(CPG₂)-Signalpeptid, europäische Patentanmeldung Nr. 121352) und Gewebeplasminogenaktivator (PHO5-Signalpeptid, EP-Patentanmeldung Nr. 143081) durch transformierte Hefe in das Medium beobachtet.

Folglich kann nicht vorhergesagt werden, ob ein gegebenes Protein mit einem angefügten Signalpeptid durch die Hefe sekretiert wird oder nicht, wobei die Sekretion vor allem vom gewählten Protein abhängig ist. Es warfolglich ungewiß, ob ein gewähltes Protein, beispielsweise Hirudin, mit einem angefügten Signalpeptid sekretiert würde, wenigstens zu einem gewissen Grad, durch transformierte WirtsorganiSmen wie Hefe.

Überraschenderweise wurde nun festgestellt, daß Proteine mit Hirudinaktivität durch eukaryotische Wirtsorganismen, welche eine DNA enthalten, die eine DNA-Folge aufweist, die ein Signalpeptid oberhalb eines und in einem Leserahmen mit dem strukturellen Gen für Desulphatohirudin kodiert, in das Medium sekretiert werden kann.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und wirtschaftlichen Verfahrens, mit dem Hirudin in ausreichender Menge hergestellt werden kann.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren für die Herstellung und Sekretion von Proteinen mit Hirudinaktivität in einem eukaryotischen Wirtsorganismus zur Verfügung zu stellen, sowie Hybridvektoren zu schaffen, die eine DNA-Folge aufweisen, welche ein Signalpeptid oberhalb eins und in einem Leserahmen mit dem strukturellen Gen für Desulphatohirudin kodiert, und eukaryotische Wirtsorganismen, die mit den genannten Hybridvektoren transformiert werden. 1. Verfahren für die Herstellung von Desulphatohirudin

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Herstellung von Proteinen mit Hirudinaktivität zur Verfügung gestellt. Es besteht darin, unter entsprechenden Nährstoffbedingungen einen eukaryotischen Wirtsorganismus zu züchten, der mit einem Hybridvektor transformiert wurde, welcher eine oder mehrere DNA-Einfügungen hat, die jede eine eukaryotische Expressionssteuerfolge, welche aus einer ersten DNA-Folge zur Kodierung eines Signalpeptids oberhalb eines und in einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin besteht, wobei das DNA-Segment unter Transkriptionssteuerung der genannten Expressionssteuerungsfolge ist, und eine DNA-Folge aufweisen, die eukaryotische Transkriptionsabschlußsignale enthält, und die Proteine mit Hirudinaktivität aus dem Kulturmedium zu isolieren und, wenn das gewünscht wird, wahlweise zusätzliches Protein mit Hirudinaktivität zu isolieren, das zeilassoziiert ist, aus dem Zelleninneren und, wenn das gewünscht wird, ein resultierendes Protein mit Hirudinaktivität in ein anderes Protein mit Hirudinaktivität umzuwandeln.

Der Begriff „für reifes Desulphatohirudin kodierte DNA-Folge" soll alle strukturellen Gene einschließen, die eine Kodierung für reife Proteine enthalten, welche Hirudinaktivität haben, deren Existenz im Blutegelgenom bekannt ist und/oder die aus diesem isoliert werden können, wie die strukturellen Gene für die reifen Desulphatohirudinvarianten HV1, HV2, PA und für des-(Val₂)-Desulphatohirudin (wenn letzteres nicht nur ein Artefakt für die Expression des HV1-Gens ist). Der Begriff „reifes Desulphatohirudin" bezieht sich auf Desulphatohirudine, die frei von jeden Prä- und Profolgen sind.

Unter „Proteinen mit Hirudinaktivität" sind die Proteine zu verstehen, die von den sekretierenden Wirtszellen gewonnen werden, die eine thrombininhibitierende Wirkung und eine positive Reaktion mit Antihirudinantikörpem haben und die die Primärstruktur eines Desulphatohirudins haben, sowie deren modifizierte, beispielsweise sulfatierte, Derivate, z. B. die entsprechenden Hirudine, und deren verkürzte Derivate, beispielsweise Desulphatohirudine, denen eins bis sieben Aminosäuren am C-Ende fehlen.

Solche Proteine sind vor allem die mit den Formeln

XTyrThrAspCysThrGlu SerGly GIn Asn Leu Cys Leu CysGlu GlySerAsn VaI CysGly Gin GIy Asn LysCyslle Leu GIy SerAsp GIy GIu Lys Asn GIn Cys VaI Thr GIy GIu GIy Ihr Pro Lys Pro GIn Ser His Asn Asp GIy Asp Phe GIuGIu lie Pro GIuGIu TvrLeuGln_t (I)

in denen X den Dipeptidrest VaI-VaI-(HVI Joder Thr (des-(Val)2-Hirudin) darstellen und R die Phenolhydroxygruppe von Tyr oder eine Gruppe mit der Formel -0-SO₃H und die Derivate darstellt, denen die C-Endaminosäure GIn, Das C-Enddipeptid -Leu-Gin, Das C-Endtripeptid -Tyr(R)-Leu-Gln oder das C-Endtetrapeptid -Glu-Tyr(R)-Leu-Gln fehlen, oder He Thr Tyr Thr Asp Cys Thr GIu Ser GIy GIn Asn Leu Cys Leu Cys GIu GlySerAsn VaI Cys GIy Lys GIy Asn LysCyslle Leu GIy Ser Asn GIy Lys GIy Asn GIn Cys VaI Thr GIy GIu GIy Thr Pro Asn Pro GIu Ser His Asn Asn GIy Asp Phe GIu GIu lie Pro GIu GIu TvrLeuGln (II)

(HV2), worin R die oben genannten Bedeutungen hat, oder jede andere Hirudinvariante mit der Bezeichnung Hirudin PA, die von Blutegeln erzeugt wird (J. Dodt, Dissertation, Universität München, BRD, 1984) und folgende Formel hat He Thr Tyr Thr Asp Cys Thr GIu SerGly GIn Asn Leu Cys Leu Cys GIu GIy Ser Asn VaI Cys GIy Lys GIy Asn Lys Cys Ue Leu GIy Ser Gin GIy Lys Asp Asn GIn Cys VaI Thr GIy GIu GIy Thr Pro-Lys Pro GIn Ser His Asn GIy Gin Asp Phe GIu Pro He Pro GIu Asp AIa Tyr Asp GIu ' ' - (III)

(PA), worin R die oben genannten Bedeutungen hat.

Das bevorzugte Protein mit Hirudinaktivität ist das der Formel I, in denen X den Rest VaI-VaI-und R die Phenolhydroxygruppe von Tyr darstellen, und deren Derivate, die am C-Ende durch eins bis sieben, insbesondere eins bis vier, Aminosäuren verkürzt sind. Geeignete eukaryotische Wirtsorganismen sind Zellen höherer Organismen, insbesondere von Säugetieren, besonders menschliche oder tierische Zellstämme, wie VERO- oder HeLa-Zellen, der Zellstamm des Eierstocks des chinesischen Hamsters (CHO), und Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae. Der bevorzugte Wirtsorganismus nach der Erfindung ist Hefe, besonders die Stämme von Saccharomyes cerevisiae.

Der eukaryotische Wirtsorganismus, insbesondere Hefe, der die oben genannten DNA-Folgen enthält, wird unter Anwendung bekannter Methoden gezüchtet.

So werden transformierte Hefestämme nach der Erfindung in einem flüssigen Medium gezüchtet, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze.enthält.

Es können verschiedene Kohlenstoffquellen genutzt werden. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlehydrate, wie Glukose, Maltose, Mannitol oder Laktose, oder ein Azetat, wie Natriumazetat, das entweder allein oder in geeigneten Gemischen eingesetzt werden kann. Zu den geeigneten Stickstoffquellen gehören beispielsweise Aminosäuren, wie Kasaminosäuren, Peptide und Proteine und deren Abbauprodukte, wie Trypton, Pepton, öder Fleischextrakte, außerdem Hefeextrakt, Malzextrakt, Getreideeinweichlauge, dazu Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, -sulfat oder -nitrat, die entweder allein oder in geeigneten Mischungen eingesetzt werden können. Zu den anorganischen Salzen, die eingesetzt werden können, gehören beispielsweise Sulfate, Chloride, Phosphate und Karbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Kalzium. Zusätzlich kann das Nährmedium auch wachstumsfördernde Substanzen enthalten. Zu den wachstumsfördernden Substanzen gehören beispielsweise Spurenelemente wie Eisen, Zink, Mangan und ähnliche oder einzelne Aminosäuren. Hefezellen, die mit autonom replizierenden Plasmiden, beispielsweise Plasmiden mit dem Hefe-2ii-Plasmid DNA (infra), transformiert wurden, tendieren im unterschiedlichen Maße dazu, das eingeführte Hybridplasmid zu verlieren. Aus diesem Grund müssen solche Hefezellen unter selektiven Bedingungen gezüchtet werden, d.h.. Bedingungen, welche die Expression eines plasmidkodierten Gens für das Wachstum erfordern. Die selektivsten Marker, die gegenwärtig genutzt werden und die in den Hybridvektoren nach der Erfindung vorhanden sind (infra), sind Gene, die für Enzyme von Aminosäure oder Purinbiosynthese kodieren. Dadurch wird es notwendig, synthetische Mihimalmedien zu verwenden, denen die entsprechende Aminosäure oder Purinbasis fehlt. Verwendet werden können aber auch Gene, die Resistenz auf ein entsprechendes Biozid übertragen (z.B. Gene, die Resistenz auf Zykloheximid, auf dasAminoglykosid G418, auf ein Schwermetall oder ähnliches übertragen). Hefezellen, die mit Vektoren transformiert wurden, die antibiotische Resistenzgene enthalten, werden in komplexen Medien gezüchtet, die das entsprechende Antibiotikum enthalten, wodurch größere Wachstumsraten und höhere Zelldichten erreicht werden.

Hefezellen, die mit einer DNA transformiert wurden, die in ein Chromosom integriert, brauchen keine selektiven Wachstumsbedingungen. Diese transformierten Zellen sind ausreichend stabil, um das Wachstum ohne selektiven Druck zu

ermöglichen. Diese Zellen werden vorteilhaft in komplexen Medien gezüchtet. _. _ -...'.

Hefezeilen, die Hybridplasmiden mit einem konstitutiven Promoter (z. B. ADHI, GÄPDH) enthalten, bringen das Desulphatohirudingen, gesteuert durch den Promoter, ohne Induktion zur Expression. Wenn das Desulphatohirudingen aber durch einen regulierten Promoter (z. B. PGK oder PHO5) gesteuert wird, muß die Zusammensetzung des Wachstumsmediums angepaßt werden, um maximale Werte der mRNA-Transkripte zu erreichen, d.h., wenn der PHO5-Promoter eingesetzt wird, muß das Wachstumsmedium eine geringe Konzentration von anorganischem Phosphat zur Derepression dieses Promoters enthalten.

Die Züchtung erfolgt unter Anwendung herkömmlicher Methoden. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentierungszeit, werden so ausgewählt, daß ein maximaler Wert an Desulphatohirudin erzeugt wird. Ein gewählter Hefestamm wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen in Tauchkultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 25⁰C bis 35⁰C, vorzugsweise von etwa 30⁰C, bei einem pH-Wert zwischen 4 und 8, beispielsweise einem pH-Wert von etwa 7, und für die Dauer von 4 bis 20 Stunden, vorzugsweise bis zum Erreichen der Maximalausbeute an Proteinen, gezüchtet.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß unabhängig vom eingesetzten Wirtsorganismus und Signalpeptid der größte Teil der erzeugten Hirudinverbindungen in das Kulturmedium sekretiert wird, während nur ein geringer Teil der Zelle zugeordnet bleibt. Das genaue Verhältnis (sekretierte Verbindungen/zellenassoziierte Verbindungen) ist von den Fermentierungsbedingungen und dem angewendeten Gewinnungsverfahren abhängig. Im allgemeinen beläuft es sich auf 9:1 oder mehr. Dementsprechend ist sekretiertes Hirudin immer stark vorherrschend.

Die Hirudinverbindungen können nach herkömmlichen Mitteln aus dem Kulturmedium isoliert werden. Beispielsweise besteht der erste Schritt in der Regel darin, die Zellen durch Zentrifugieren vom Kultur-Fluid zu trennen. Die resultierende obenauf schwimmende Schicht kann durch Behandlung mit Polyethylenimin nach Hirudinverbindungen angereichert werden, um den größten Teil des nicht-proteinhaltigen Materials zu entfernen, und Ausfällung der Proteine durch Sättigung der Lösung mit Ammoniumsulfat oder durch Trichloressigsäure. Soweit Wirtsproteine vorhanden sind, können sie auch durch Ansäuerung mit Essigsäure (z.B. 0,1%, pH-Wert 4-5) ausgefällt werden. Eine weitere Anreicherung der Hirudinverbindungen kann durch Extraktion der obenauf schwimmenden Essigsäureschicht mit n-Butanol erreicht werden. Weitere Reinigungsschritte schließen beispielsweise die Entsalzung, chromatografische Verfahren, wie die lonenaustauschchromatografie, Gelfiltrationschromatografie, HPLC, Umkehrphasen-HPCL und ähnliche ein. DieTrennung der Bestandteile des Gemischs erfolgt auch durch Dialyse, der Ladung entsprechend durch Gelelektrophorese oder trägerfreie Elektrophorese, der Moleküigröße entsprechend durch eine geeignete Sephadex-Kolonne, durch Affinitätschromatografie, beispielsweise mit Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikörpern, oder mit Thrombin, das mit einem geeigneten Träger für die Affinitätschromatografie gekoppelt ist, oder durch andere Prozesse, insbesondere die aus der Fachliteratur bekannten.

Wenn es gewünscht wird, zusätzliche Hirudinverbindungen zu isolieren, die zellassoziiert sind, d.h., die intrazellulär oder im periplasmischen Raum akkumuliert wurden, sind einige ergänzende Reinigungsschritte erforderlich. So besteht, wenn sich die Hirudinproteine in den Zellen angesammelt haben, der erste Schritt zur Gewinnung der gewünschten Proteine darin, die Proteine aus dem Zellinneren freizusetzen. Bei den meisten Verfahren wird zuerst die Zellwand durch enzymatischen Abbau mit Glukosidasen (infra) entfernt. Anschließend werden die resultierenden Speroplaste mit Reinigungsmittel, beispielsweise Triton, behandelt. Als Alternative dazu sind mechanische Kräfte, beispielsweise Scherkräfte (z. B. X-Presse, französische Presse), oder das Schütteln mit Glasperlen zum Aufbrechen der Zellen geeignet. Wenn die Hirudinverbindungen durch den Wirt, insbesondere Hefe, in den periplasmischen Raum sekretiert werden, kann nach einem vereinfachten Verfahren gearbeitet werden: Das Protein wird ohne Zellauflösung durch enzymatische Entfernung der Zellwand oder durch Behandlung mit chemischen Mitteln, z. B. Thiolreagentien oder EDTA, welche zu Zellwandschäden führen, die eine Freisetzung des erzeugten Proteins ermöglichen, gewonnen.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß neben den Desulphatohirudinverbindungen, die der „DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin" entsprechen, einige andere Desulphatohirudinverbindungen aus der Kulturbrühe isoliert werden können, die sich von den erwarteten Verbindungen durch das Fehlen der ein bis vier Aminosäuren am C-Ende unterscheiden. So ergibt die Kultivierung von Hefezellen, die die Genkodierung fürdieDesulphatohirudinvariante HV1 tragen, die Variante sowie, in geringeren Mengen, Desulphatohirudinverbindungen, denen die C-Endaminosäure GIn [Des-(Gln⁶⁵)-Desulphatohirudin], der C-End-Dipeptidrest -Leu-Gin [Des-fLeu^Gln^-Desulphatohirudin], der C-End-Tripeptidrest -Tyr-Leu-Gln [Des-fTyr^Leu⁶⁴, Gln⁶⁵)-Desulphatohirudin] und der C-Endtetrapeptidrest -Glu-Tyr-Leu-Gln [Des-iGlu^Tyr^Leu^Gln^-Desulphatochirudin] fehlen. Diese Verbindungen können durch (partiellen) proteolytischen Abbau des primären Expressionsproduktes Desulphatohirudin gebildet worden sein und wurden in allen Kulturbrühen identifiziert, ungeachtet des verwendeten Hefewirts und der angewendeten Fermentationsbedingungen.

Des-(Gln^S5)-desu!phatohirudin, Des-(Tyr^ra,Leu^M,Gln⁶⁵)-desulphatohirudin und Des-fGlu^Tyr^Leu⁶⁴, Gln⁶⁵)-desulphatohirudin sind neuartig und sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Zur Feststellung der Hirudinaktivität können der Test mit Antihirudin- oder Antidesulphatohirudinantikörpern (beispielsweise monoklonale Antikörper, die aus Hydridomazellen gewonnen werden können), der Thrombintest (M. U. Bergmeyer [Hsg.], Methods in Enzymatic Analysis [Methoden in der enzymatischen Analyse], Bd. H, S. 314-316, Verlag Chemie, Weinheim [BRD] 1983) oder der Blutkoagulationstest (F. Markwardt u. a., Thromb. Haemost. 47,226 [1982]) angewendet werden. Hirudinverbindungen, die nach dem Verfahren der Erfindung gewonnen werden können, können auf bekannte Weise in verschiedene Hirudinverbindungen umgewandelt werden.

So können beispielsweise Verbindungen mit der Formel I bis III, in denen R die Phenolhydroxygruppe von Tyr dargestellt, umgewandelt werden durch Reaktion mit einem Sulfat, wie Dinatriumsulfat, und eine Tyrosinsulfotransferase, die beispielsweise aus Blutegelzellen gewonnen werden kann, in Verbindungen mit der Formel I bis III, in denen R eine Gruppe mit der Formel -OSO₃H darstellt.

Möglich ist es auch, eine Desulfatohirudinverbindung, beispielsweise eine gewonnene Desulfatohirudinvariante HV1, in ein Derivat umzuwandeln, dem ein bis sieben Aminosäuren am C-Ende fehlen, beispielsweise durch die Wirkung einer geeigneten Karboxypeptidase, wie Karboxypeptidase Y.

Die transformierten eukaryotischen Wirtsorganismen nach der Erfindung können durch DNA-Rekombinanttechniken hergestellt werden, die folgende Schritte umfassen:

— Schaffung eines DNA-Gebildes, das eine eukaryotische Expressionssteuerungsfolge, ein DNA-Segment, das aus einer ersten DNA-Folge zur Kodierung eines Signalpeptids oberhalb eines und in einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin besteht, wobei das DNA-Segment unterderTranskriptionskontrolle der genannten Expressionssteuerungsfolge steht, und eine DNA-Folge, die eukaryotische Transkriptionsbeendigungssignale enthält, aufweist,

— Schaffung eines Hybridvektors, der das genannte DNA-Gebilde einschließt,

— Transformation eines geeigneten eukaryotischen Wirtsorganismus mit dem geschaffenen Hybridvektor,

— Auswahl von transformierten Wirtszellen von untransformierten Wirtszellen.

2. DNA-Gefüge, welche die Kodierungsbereiche eines Signaipepiids und von Desulphatohirudin aufweisen Die Erfindung betrifft ein DNA-Gefüge, das enthält eine eukaryotische Expressionssteuerungsfolge, ein DNA-Segment, das besteht aus einer ersten DNA-Folge, die ein Signaipeptid oberhalb eines und ein einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folge zur Kodierung für reifes Desulphatohirudin enthält, wobei das DNA-Segment unter derTranskriptionskontrolle der genannten Expressionssteuerungsfolge ist, und eine DNA-Folge, die eukaryotische Transkriptionsendsignale enthält.

Für die Regulierung der Expression der DNA-Folgen zur Kodierung für Signalpeptid und Desulfatohirudin können verschiedene Expressionssteuerungsfolgen verwendet werden. Insbesondere werden Expressionssteuerungsfolgen von stark ausgeprägten Genen der zu transformierenden Wirte verwendet.

Für den Einsatz in Säugetierzellen werden die Expressionssteuerungsfolgen vorzugsweise von Viren abgeleitet. Geeignete Expressionssteuerungsfolgen für den Einsatz in Säugetierzellen sind beispielsweise die frühen und spaten Promotoren von Simian-Virus 40 (SV40), Vakzinia-Promoter, HTLV-Promoter oder von Polyoma- oder Adenovirus 2 abgeleitete Promotoren. Expressionssteuerungsfolgen für Hefe, das die am stärksten bevorzugten Wirtsorganismen nach der vorliegenden Erfindung darstellt, werden abgeleitet von der genomischen DNA von Hefe, insbesondere von Saccharomyces cerevisiae. Vorzugsweise wird die Expressionssteuerungsfolge eines stark ausgeprägten Hefegens für die Expression von Desulphatohirudin verwendet. So können der Promoter von TRP1-Gen, ADHI- oder ADHII-Gen, Säurephosphatasegen (PHO5-), Isozytochrom-c-Gen oder ein Promoter von Enolase, Glyzeradehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH), 3-Phosphoglyzeratkinase (PGK), Hexokinase, Pyriivatdekarboxylase, Phosphofruktokinase, Glukose-S-phosphatisomerase/S-Phosphoglyzeratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglukoseisomerase und Glukokinasegene oder ein Promoter der Hefepaarungspheromongene, die für den a- oder den α-Faktor kodieren, eingesetzt werden. Möglich ist es auch, Hybridpromotoren zu verwenden, die aus oberen Aktivierungsfolgen (UAS) eines Hefegens und unteren Promoterelementen einschließlich einer funktioneilen TATA-Box eines anderen Hefegens bestehen, beispielsweise einen Hybridpromoter mit den UAS(s) des PHO5-Gens der Hefe und unteren Promoterelementen einschließlich einerfunktionellen TATA-Box des GAPDH-Gens der Hefe. Bevorzugte Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten Promoter mit Transkriptionssteuerung. Promoter dieses Typs, z. B. der Promoter des PHO5-Gens und PHOB-GAPDH-Hybridpromoter, können durch Änderung der Wachstumsbedingungen ein- und ausgeschaltet werden. Beispielsweise kann der PHO5-Promoter willkürlich repressiert oder derepressiert werden, einfach durch Erhöhung oder Verringerung der Konzentration des anorganischen Phosphats im Medium. Ein weiterer bevorzugter Promoter nach der Erfindung ist der Promoter des GAPDH-Gens, insbesondere dessen funktionelles · Fragment, das bei Nukleotid -300 bis -1800 beginnt, vorzugsweise bei Nukleotid -263 oder -199, und bei Nukleotid -5 des GAPDH-Gens endet.

Die DNA-Folge, die ein Signalpeptid kodiert („Signalfolge"), wird vorzugsweise abgeleitet von eukaryotischen, beispielsweise Hefe-, Genen, die normalerweise sekretierte Polypeptide kodieren. Geeignete Signalfolgen sind beispielsweise die Hirudinsignalfolge, die von genomischen Blutegel-DNA gewonnen werden kann, Hefesignalfolgen, wie die Signal- und Präpro-Folgen der Hefeinvertase, a-Faktor, α-Faktor, Pheromonpeptidase, „Killer-Toxin" und repressible Säurephosphatasegene (PHO5-) und die Glukomylasesignalfolge von Aspergillus awamori. Alternativ dazu können verschmolzene Signalfolgen konstruiert werden durch Verbinden eines Teil der Signalfolge (soweit vorhanden) des Gens, das natürlich mit dem verwendeten Promoter verbunden ist, mit einem Teil der Hirudinsignalfolge. Begünstigt werden die Kombinationen, die eine präzise Spaltung zwischen der Signalfolge und der reifen Desulphatohirudinaminosäurefolge ermöglichen. Zusätzliche Folgen, wie Pro- oder Abstandsfolgen, die spezifische Verarbeitungssignale tragen können, aber nicht müssen, können ebenfalls in die Konstruktionen einbezogen werden, um die genaue Verarbeitung der Vorläufermoleküle zu erleichtern. Alternativ dazu können verschmolzene Proteine erzeugt werden, die interne Verarbeitungssignale enthalten, welche eine angemessene Reifung in vivo oder in vitro ermöglichen. Beispielsweise enthalten die Verarbeitungssignale einen Lys-Arg-Rest, der von einer Hefe-Endopeptidase erkannt wird,dersichindenGolgi-Membranen befindet. Die bevorzugten Signalfolgen nach der Erfindung-sind die, die vom Hefe-PHO5-Gen kommen und für ein Signalpeptid kodieren mit der Formel Met Phe Lys Ser VaI VaI Tyr Ser He Leu Ala AIa Ser Leu Ala Asn AIa und des Hefeinvertasegens mit Kodieruang für ein Signalpeptid mit der Formel Met Leu Leu Gin AIa Phe Leu Phe Leu Leu Ala GIy Phe Ala AIa Lys lie Ser AIa

Die DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin wird speziell aus den oben für Desulphatohirudine spezifizierten Genen ausgewählt. Die bevorzugte DNA-Folge kodiert für Desulphatohirudinvariante 1 (HV 1) und hat die Formel GTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT CAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTACACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA

TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTCACGGTGAAAAAAACCAG AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACI I I I I I IGGTC

TGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAA ACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTT

GAAATCCCGGAAGAATACCTGCAG CTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTC

Eine DNA-Folge, die eukaryotische Transkriptionsendsignale enthält, ist vorzugsweise die 3'-Flankierungsfolge eines eukaryotischen Gens, das entsprechende Signale für die Transkriptionsbeendigung und Polyadenylierung enthält. Geeignete 3'-Flankierungsfolgen sind beispielsweise die des Gens, das natürlich mit der verwendeten Expressionssteuerungsfolge verbunden ist. Wenn Hefe als Wirtsorganismus verwendet wird, sind die bevorzugten Flankierungsfolgen die des Hefe-PHO5-Gens. Vorzugsweise ist das DNA-Gefüge nach der vorliegenden Erfindung an beiden Enden mit synthetischen Deoxynukleotid-Verkettungselementen versehen, welche die Einfügung und Kionung des Gefüges in einem Klonungsvektor gestatten. Die eukaryotische Expressionssteuerungsfolge, die DNA-Folge-Kodierung für das Signalpeptid, die DNA-Folge-Kodierung für reifes Disulphatohirudin und die eukaryotischen Transkriptionsendsignale sind operativ miteinander verkettet, d. h., sie sind so aneinander gelagert, daß ihre normalen Funktionen aufrechterhalten werden. Folglich ist die Anordnung so aufgebaut, daß die Expressionssteuerungsfolge die richtige Expression des Signalpeptid-Desulphatohirudin-Komplexes bewirkt, die Transkriptionsendsignale die richtige Beendigung von Transkription und Polyadenylierung bewirken, und die Signalfolge ist so mit dem Desulphatohirudingen verkettet, daß die Sekretion des Desulphatohirudins erfolgt. Wenn demzufolge die Expressionssteuerungsfolge und die Signalfolge von verschiedenen Genen abgeleitet werden, wird die Expressionssteuerungsfolge mit der Signalfolge vorzugsweise zwischen dem mRNA-Hauptstart und ATG des Gens verbunden,

das natürlich mit der Expressionssteuerungsfolge verkettet ist. Die Signalfolge sollte ein eigenes ATG für die Translationseinieitung haben. Die Verbindung dieser Folgen geschieht vorzugsweise durch synthetische Oligodeoxynukleotidverkettungselemente, welche die Erkennungsfolge einer Endonuklease tragen können. Andererseits ist der letzte Kodon der Signalfolge direkt mit dem ersten Kodon des Gens für Desulphatohirudin verkettet.

Die DNA-Gefüge nach der Erfindung können nach Verfahren hergestellt werden, die in Fachkreisen bekannt sind, beispielsweise durch Verkettung einer eukaryotischen Expressionssteuerungsfolge, eines DNA-Segments, das aus einer ersten DNA-Folge zur Kodierung eines Signalpeptids oberhalb eines und in einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folge zur Kodierung für Desulphatohirudin besteht, und einer DNA-Folge, die eukaryotische Transkriptionsendsignale enthält, und das auf eine Weise, welche die richtige Expression des DNA-Segmentes und die Sekretion des erzeugten Desulphatohirudins in einem eukaryotischen Wirtssystem bewirkt.

Die Bindung der verschiedenen DNA-Folgen zur Schaffung der DNA-Gefüge nach der Erfindung kann durch Ligation der stumpfen Enden oder über geeignete gemeinsame Restriktionsstellen oder synthetische Linkermoleküle erfolgen, wobei besonders auf eine richtige Verbindung zu achten ist, so daß die normalen Funktionen dieser DNA-Folgen aufrechterhalten werden. So können die Signalfolge und das Desulphatohirudin-Gen durch Stumpfendligation verbunden werden. Eine andere Möglichkeit zur Herstellung der richtigen Verbindung von Signalfolge und Desulphatohirudin-Gen ist, wenn möglich, die Restruktion der Signalfolge nahe ihres 3'-Terminus und des Desulphatohirudins nahe des 5'-Terminus, so daß jeder Folge eine festgelegte Zahl von Basispaaren fehlt. Ein synthetischer Oligodeoxynukelotid-Linker kann dann so aufgebaut werden, daß bei der Verbindung der restriktierten Signalfolge und des restriktierten Desulphatohirudin-Gens durch das verbindende Oligodeoxynukleotid die fehlenden Basispaare wiederhergestellt werden und sich das Desulphatohirudin-Gen im richtigen Leserahmen im Verhältnis zur Signalfolge befindet.

Die DNA-Folgekodierung für Desulphatohirudin kann aus genomischer Blutegel-DNA isoliert werden, oder eine komplementäre doppelsträngige Desulphatohirudin-DNA (Desulphatohirudin-ds cDNA) wird aus Desulphatohirudin-mRNA erzeugt, oder es wird eine Genkodierung für die Aminosäurefolge von Desulphatohirudin durch chemische und enzymatische Prozesse erzeugt. .

Genomische Desulphatohirudin-DNA und Desulphatohirudin-ds cDNA werden beispielsweise nach Methoden gewonnen, die allgemein in Fachkreisen bekannt sind. Beispielsweise wird genomische Desulphatohirudin-DNA von einer Blutegel-Genbank gewonnen, die das Desulphatohirudin-Gen enthält, durch Klonung der Blutegel-DNA-Fragmente in einem Mikroorganismus und Identifizierung von Klonen, die Desulphatohirudin-DNA enthalten, beispielsweise durch Koloniehybridisierung und Verwendung eines radioaktiv markierten, desulphatohirudin-DNA-spezifischen Oligodeoxynukleotids, das mindestens 15, vorzugsweise 15 bis 30 Deoxynukleotide enthält. Die resultierenden DNA-Fragmente enthalten in der Regel neben dem Desulphatohirudin-Gen andere unerwünschte DNA-Bestandteile, die durch Behandlung mit geeigneten Exo- oder Endonukleasen entfernt werden können.

Doppelsträngige Desulphatohirudin-cDNA kann beispielsweise durch Isolierung von mRNA aus geeigneten Blutegelzellen ' gebildet werden, die vorzugsweise zur Hirudin bildung angeregt werden, Anreicherung der Desulphatohirudin-mRNA im resultierenden mRNA-Gemisch auf eine bekannte Weise, Verwendung dieser mRNA als Schablone für die Herstellung von einsträngigeer cDNA, Synthetisierung von ds CDNA aus dieser mit Hilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase und Klonung in einen geeigneten Vektor. Klone, die Desulphatohirudin-cDNA enthalten, werden beispielsweise auf die oben beschriebene Weise durch Kolonierhybridisierung unter Verwendung eines radioaktiv markierten, desulphatohirudin-DNA-spezifischen Oligodeoxynukleotids identifiziert.

Das Desulphatohirudin-Gen kann auch durch chemische Synthese hergestellt werden. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß Segmente der Kodierung und des komplementären Stranges des genannten Gens chemisch synthetisiert werden und die resultierenden Segmente enzymatisch in ein strukturelles Gen für Desulphatohirudin umgewandelt werden. Die chemische Synthese von DNA ist in Fachkreisen allgemein bekannt und nutzt herkömmliche Verfahren. Geeignete Verfahren wurden von S.A. Narang (Tetrahedron 39,3 [1983]) zusammengestellt. Insbesondere können die Methoden angewendet werden, die in der EP-Patentanmeldung No. 146785 beschrieben werden und die hier, als Bezug einbezogen werden. Auf analoge Weise kann die Signalfolge durch chemische Synthese hergestellt oder aus Chromosomen-DNA eines geeigneten eukaryotischen Organismus hergestellt werden

3. Hybridvektoren, welche die DNA-Gefüge mit den Kodierungsbereichen eines Signalpeptids und von Desulphatohirudinenthalten

Nach der vorliegenden Erfindung wird weiter ein Hybridvektor geschaffen, der eine oder mehrere DNA-Einfügungen hat, die jeweils bestehen aus einer eukaryotischen Expressionssteuerungsfolge, einem DNA-Segment aus einer ersten DNA-Folge, die ein Signalpeptid oberhalb eines und in einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin kodiert, wobei die DNA-Folge unter der Transkriptionssteuerung der genannten Expressionssteuerungsfolge steht, und einer DNA-Folge mit den eukaryotischen Transkriptionsendsignalen.

Die Hybridvektoren nach der Erfindung werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus einem Hybridplasmid und einem linearen DNA-Vektor besteht, und sie werden weiter in Abhängigkeit von den für die Transformation vorgesehenen Wirtsorganismen ausgewählt.

Die Erfindung betrifft insbesondere einen linearen DNA-Vektor mit einer oder mehreren DNA-Einfügungen, die jeweils bestehen aus einer eukaryotischen Expressionssteuerungsfolge, einem DNA-Segment aus einer ersten DNA-Folge, die ein Signalpeptid oberhalb eines und in einem Leserrahmen mit einer zweiten DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin kodiert, wobei die DNA-Folge unter der Transkriptionssteuerung der genannten Expressionssteuerungsfolge steht, und einer DNA-Folge mit den eukaryotischen Transkriptionsendsignlaen, wobei die genannte Expressionssteuerungsfolge und die genannte Folge, welche die Transkriptionsendsignale enthält, von demselben eukaryotischen Gen abgeleitet wurden. Insbesondere betrifft die Erfindung einen linearen DNA-Vektor, der aus dem Hefe-PHO5-Promoter, dem oben genannten DNA-Segment und dem 3'-Flankierungsbereich von PHO5 besteht.

Auf Grund der homologen 3'- und 5'-Flankierungsfolgen wird der gesamte lineare DNA-Vektor, einschließlich der Kodierungsbereiche für das Signalpeptid und Desulphatohirudin, stabil in das entsprechende Wirtschromosom integriert, d. h., bei dem Hefe-PHO5-Promoter und den 3'-Flankierungsfolgen des Hefe-PHO5-Gens an der PHO5-Stelle im Hefechromosom II.

Die Erfindung betrifft auch insbesondere Hybridplasmiden, die neben der Expressionssteuerungsfolge, dem oben genannten DNA-Segment und der Folge mit den Transkriptionsendsignalen zusätzliche DNA-Folgen enthalten, die unwesentlich oder weniger wichtig für die Funktion des Promoters sind, d. h., für die Expression des Desulphatohirudin-Gens, die aber wichtige Funktionen, beispielsweise bei der Vermehrung der mit den genannten Hybridplasmiden transformierten Zellen, ausüben. Die zusätzlichen DNA-Folgen können von prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen abgeleitet werden und können chromosomale und/oder extrachromosomale DNA-Folgen einschließen. Beispielsweise können die zusätzlichen DNA-Folgen herkommen von (oder bestehen aus) Plasmid-DNA, wie bakteriellen oder eukaryotischen Plasmid-DNA, Viren-DNA und/oder chromosomalen DNA, wie bakteriellen, Hefe- oder höheren eukaryotischen chromosomalen DNA. Bevorzugte Hybridplasmide enthalten zusätzliche DNA-Folgen, die¹ von bakteriellen Plasmiden abgeleitet sind, insbesonders Escherichia coli-Plasmid pBR322 oder verwandten Plasmiden, Bakteriophag λ, Hefe-2M-Plasmid und/oder Hefechromosomal-DNA. Bei den bevorzugten Hybridplasmiden nach der Erfindung tragen die zusätzlichen DNA-Folgen einen Hefereplikationsursprung und einen selektiven genetischen Markerfür Hefe. Hybridplasmide, die einen Hefereplikationsursprung enthalten, z. B. autonom replizierende Segment(ars), werden nach der Transformation extrachromosomell innerhalb der Hefezellen erhalten und werden nach Mitosis autonom repliziert. Hybridplasmide, die der Hefe-2^-Plasmid-DNA gleichartige Folgen enthalten, können ebenso eingesetzt werden. Diese Hybridplasmide werden durch Rekombination in die bereits innerhalb der Zelle vorhandenen 2μ-Plasmide integriert oder replizieren autonom.

Als selektiver Genmarker für Hefe kann jedes Marker-Gen verwendet werden, das die Auswahl von Transformanten auf Grund den phenotypen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker für Hefe sind vor allem die, die antibiotische Resistenz zur Expression bringen, oder bei auxotrophen Hefemutanten Gene, die Wirtsläsionen komplementieren. Entsprechend Gene übertragen beispielsweise Resistenz auf das antibiotische Zykloheximid oder sorgen für Prototrophie bei einem auxotrophen Hefemutanten, beispielsweise die Gene URA1, URA3, ARG4, LEU2, HIS4, HIS3, TRP5 oderTRPL Vorteilhaft ist es, wenn die zusätzlichen DNA-Folgen, die in den Hybridplasmiden nach der Erfindung vorhanden sind, auch einen Replikationsursprung und einen selektiven genetischen Marker für einen bakteriellen Wirt, insbesondere Escherichia coli einschließen. Mit dem Vorhandensein eines E. coli-Replikationsursprungs und einem E. coli-Marker in einem Hefebybridplasmid verbinden sich bestimmte vorteilhafte Merkmale. Erstens können große Mengen an Hybridplasmid-DNA und Wachstum und Vermehrung in E. coli gewonnen werden, und zweitens erfolgt die Konstruktion der Hybridplasmide vorteilhaft in E. coli, wobei das gesamte Repertoire der Klonungstechnik auf der Grundlage von E. coli genutzt werden kann. E. coli-Plasmide, wie pBR322 und ähnliche, enthalten sowohl den E. coli-Replikationsursprung als auch E. coli-genetische Marker, die Beständigkeit gegen Antibiotika übertragen, beispielsweise Tetrazyklin und Atnpillizin, und sie werden vorteilhaft als Teil der Hefehybridvektoren eingesetzt.

Die zusätzlichen DNA-Folgen, die beispielsweise Replikationsursprung und genetische Marker für Hefe und einen bakteriellen Wirt (siehe oben) enthalten, werden nachstehend als „Vektor-DNA" bezeichnet, die zusammen mit dem oben genannten DNA-Gefüge, das u. a. die Expressionssteuerungsfolge und das DesyJjShatohirudin-Gen enthält, ein Hybridplasmid nach der Erfindung bilden.

Die Hybridvektoren nach der Erfindung können eine oder mehrere DNA-Einfügungen enthalten, die u.a. die Expressionssteuerungsfolge, die DNA-Folge zur Kodierung des Signalpeptids und die DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin umfassen. Wenn die Hybridvektoren mehrere DNA-Einfügungen enthalten, vorzugsweise 2 bis 4 Einfügungen, können diese in einer Tandemanordnung oder an verschiedenen Stellen des Hybridvektors vorhanden sein. Bevorzugte Hybridvektoren enthalten eine DNA-Einfügung oder DNA-Einfügungen in einer Tandem-Anordnung. Die DNA-Einfügungen sind speziell von vorn nach hinten angeordnet.

Die Hybridplasmide nach der Erfindung werden nach den in Fachkreisen bekannten Methoden hergestellt, das Verfahren für die Herstellung von Hybridvektoren beinhaltet die Einführung eines oder mehrerer DNA-Gefüge, welche enthalten eine eukaryotische Expressionssteuerungsfolge, ein aus einer ersten DNA-Folge bestehendes DNA-Segment, welche für ein Signalpeptid oberhalb eines und in einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin kodiert, wobei das DNA-Segment unter der Transkriptionssteuerung der genannten Expressionssteuerungsfolge steht, und eine DNA-Folge mit eukaryotischen Transkriptionsendsignalen, als solcher oder die Einführung der Komponenten der genannten DNA-Gefüge nacheinander in einer festgelegten Reihenfolge in eine Vektor-DNA.

Die Konstruktion der Hybridplasmide nach der Erfindung wird unter Anwendung herkömmlicher Ligationsmethoden ausgeführt. Die Komponenten der Plasmide werden durch gemeinsame Restriktionsstellen und/oder durch synthetische Linker-Moleküle und/oder durch Stumpfendligation miteinander verbunden.

Die linearen DNA-Vektoren nach der Erfindung entsprechen im wesentlichen den DNA-Gefügen, die im Paragraphen 2 spezifiziert wurden, und werden auf analoge Weise hergestellt

4. Transformierte eukaryotische Wirtsorganismen

Ein weiterer Aspekt der Erfindung beinhaltet eukaryotische Wirtsorganismen, die mit einem Hybridvektortransformiert wurden, welcher eine oder mehrere DNA-Einfügungen hat, die jeweils besteht aus einer eukaryotischen Expressionssteuerungsfolge, einem DNA-Segment, das aus einer ersten DNA-Folge besteht, das ein Signalpeptid oberhalb eines und in einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin kodiert, wobei das DNA-Segment unter der Transkriptionssteuerüng der genannten Expressionssteuerungsfolge ist, und einer DNA-Folge, die eukaryotische Transkriptionsendsignale enthält, und deren Mutanten.

Geeignete eukaryotische Wirtsorganismen sind vor allem die oben genannten, insbesondere Hefe, einschließlich der Spezies von Kluyveromyces, Candida, Pichia, Yarrowia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis und verwandte Gattungen (siehe J. Lodder, The Yeasts [Die Hefen], Amsterdam, 1971), insbesondere Stämme von Sacchoromyces cerevisiae. Die transformierten eukaryotischen Wirtsorganismen werden aus einem eukaryotischen Wirtsorganismus ausgewählt, der mit einem Hybridplasmid mit einer oder mehreren DNA-Einfügungen transformiert wurde, welche jeweils bestehen aus einer eukaryotischen Expressionssteuerungsfolge, einem DNA-Segment, das aus einer ersten DNA-Folge besteht, die ein Signalpetid oberhalb eines und einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin kodiert, wobei das DNA-Segment unter der Transkriptionskontrolle der genannten Expressionssteuerungsfolge steht, und einer DNA-Folge, die eukaryotische Transkriptionsendsignale enthält, und einem eukaryotischen Wirtschaftsorganismus mit der (den) genannten DNA-Einfügung(en), stabil in einem Wirtschromosom integriert.

Der Prozeß für die Herstellung der genannten transformierten eukaryotischen Wirtszellen besteht in der Transformierung von eukaryotischen Wirtszeilen mit einem Hybridvektor, der eine oder mehrere DNA-Einfügungen hat, die jede bestehen aus einer eukaryotischen Expressionssteuerungsfolge, einem DNA-Segment, das aus einer ersten DNA-Folge besteht, die ein Signalpeptid oberhalb eines und in einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin kodiert, wobei das DNA-Segment unter der Transkriptionssteuerung der genannten Expressionssteuerungsfolge steht, und einer DNA-Folge, die eukaryotische Transkriptionsendsignale enthält.

Die Transformation der eukaryotischen Wirtszellen erfolgt nach Methoden, die in Fachkreisen bekannt sind. Beispielsweise kann die Transformation von Hefe mit den Hybridvektoren nach der Methode ausgeführt werden, die von Hinnen u.a. (Proc. Natl. Acad. Sei, USA 75,1929 [1978]) beschrieben wird. Diese Methode kann in drei Schritte unterteilt werden:

(1) Beseitigung der Hefezellwand oder deren Teile unter Anwendung verschiedener Glukosidasepräparate, wie Schneckenverdauungssäfte (z. B. Glusulase® oder Helicase®) oder Enzymgemischen, die von Mikroorganismen gewonnen wurden (z. B. Zymolyse') in osmotisch stabilisierten Lösungen (z. B. 1 M-Sorbitol).

(2) Behandlung der „nackten" Hefezellen (Sphäroplaste) mit dem DNA-Vektor bei Vorhandensein von PEG (Polyethyienglykol) und Ca²⁺-lonen.

(3) Regeneration der Zellwand und Selektrion der transformierten Zellen in einer festen Agar-Schicht. Diese Regeneration erfolgt am besten durch Einbetten der Sphäroplaste in Agar. Beispielsweise wird geschmolzenes Agar (50⁰C) mit den Sphäroplasten gemischt. Nach "dem Abkühlen der Lösung auf Hefewachstumstemperatur (etwa 30⁰C) erhält man eine feste Schicht. Diese Agar-Schicht dient dazu, die schnelle Diffusion und den Verlust wesentlicher Makromoleküle aus den Sphäroplasten zu verhindern und erleichtert dadurch die Regeneration der Zellwand. Eine Zeilwandregeneration ist jedoch auch (wenn auch mit geringerer Effektivität) durch Plattieren der Sphäroplaste auf die Oberfläche von vorgeformten Agar-Schichten möglich.

Vorzugsweise wird das Regenerations-Agar so hergestellt, daß die Regeneration und die Selektion von transformierten Zellen gleichzeitig möglich sind. Da im allgemeinen als selektive Marker (supra) Hefegene verwendet werden, die für Enzyme von aminosäurebiogenetischen Bahnen kodieren, erfolgt die Erzeugung vorteilhaft in Hefe-Minimalmedium-Agar. Wenn eine sehr hohe Effektivität der Regeneration erfolgen muß, ist das nachstehende zweistufige Verfahren vorteilhaft: (1) Regeneration der Zellwand in einem reichen Komplexmedium und (2) Selektion der transformierten Zellen durch Replikaplattierung der Zellschicht auf selektive Agar-Platten.

Wenn der oben genannte linear DNA-Vektor für die Transformierung von eukaryotischen Wirtszellen verwendet wird, erfolgt die Transformation vorzugsweise bei Vorhandensein eines zweiten Vektors, der einen selektiven Marker für Hefe enthält. Diese Kotransformation ermöglicht die Anreicherung derWirtszelien, die DNA aufgenommen haben, welche nicht direkt gewählt werden können. Da kompetente Zellen jeden Typ νοηΌΝΑ aufnehmen, wird ein hoher Prozentsatz der mit einem selektiven Marker transformierten Zellen auch alle zusätzlichen DNA (wie den oben genannten linearen DNA-Vektor) aufnehmen. Die transformierten eukaryotischen Wirtsorganismen, insbesondere die transformierten Hefestämme, welche die Hybridplasmide nach der Erfindung enthalten oder den linearen DNA-Vektor haben, der das Desulphatohirudin-Gen umfaßt, das stabil in ein Wirtschromosom integriert wurde, können in der Erzeugung von Desulphatohirudin durch Mutation und Selektion unter Anwendung von bekannten Methoden verbessert werden. Die Mutation kann beispielsweise durch UV-Bestrahlung oder chemische Reagenzien geeigneter Art ausgeführt werden. Besonders bevorzugt ist die Erzeugung von Mutanten, denen Protease fehlt, insbesondere Hefemutanten, um den proteolytischen Abbau des erzeugten Desulphatohirudins in den Zellen zu vermeiden. Geeignete Mutanten können auf herkömmliche Weise ausgewählt und isoliert werden.

Die Erfindung betrifft insbesondere DNA-Gefüge, welche das Desulphatohirudin-Gen enthalten, Hybridvektoren, transformierte eukaryotische Wirtsorganismen und Verfahren zu deren Herstellung sowie das Verfahren für die Erzeugung von Proteinen mit Hirudinaktivität, wie das in den Beispielen beschrieben wird.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert. In der belügenden Zeichnung zeigen:

Abbildungen 1 und 2 schematische Darstellungen sind, welche den Aufbau der Plasmide pML300 bzw. pML305 zeigen, Abb. 3 den Aufbau von Plasmid pHRil48 zeigt, das den trp-Promoter enthält, Abb. 4 den Aufbau von ExpressionsplasmispML310 zeigt,

Abb. 5 eine schematische Darstellung ist, welche die Isolierung einer DNA-Fragmentkodierung für reifes Desulphatohirudin zeigt,

Abb. 6 schematisch den Aufbau eines Expressionsplasmids für die Sekretion von Desulphatohirudin zeigt, Abb. 7 schematisch den Aufbau eines Expressionsplasmids für die intrazelluläre Expression von Desulphatohirudin zeigt, Abb. 8 die DNA-Folge des BamHI-Sall-Restriktionsfragmentes von PHO5 zeigt, einschließlich des PHO5-Promoterbereichs, Abb. 9 die DNA-Folge des Promoterbereiches des Gens GAPDH zeigt,

Abb.10 eine schematische Darstellung ist, die den Aufbau des Plasmids pGAPDH-ELzeigt, Abb. 11 die Folgen der GAPDH-Promoterfragmente zeigt, die in den Plasmiden pGAPDH-FL und pGAPDH-EL vorhanden sind, Abb. 12 den Aufbau von Plasmid pJDB207/PHO5(Eco)-HIR zeigt,

Abb.13 den Aufbau von Plasmid pJDB207/PAPEL-HIR(USA1-USA2) zeigt,

Abb. 14 den Aufbau von Plasmid pJDB207/[GAPEL-HIRJD zeigt,

Abb. 15 eine schematische Darstellung ist, die den Aufbau des Plasmids pJDB207/GAPEL-l-HIR zeigt.

In den Abbildungen werden folgende Abkürzungen verwendet:

ρ — Promoter, SS — Signalfolge, t — Terminator, L—Linker.

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, sollten aber nicht als deren Einschränkung betrachtet werden.

Experimenteller Teil'

Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutung:

TNE Lösung, die 100 mM NaCI, 50 mM tris.HCI, pH-Wert 7,5, und EDTAenthält,

SDS Natriumdodekylsulfat

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

DTT 1,4-Dithiothreitol (1,4-Dimerkapto-2,3-butandiol)

BSA Rinderserumalbumin

EtBr Ethidiumbromid

tris tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan

tris.HCI tris-Monohydrochlorid

Beispiel 1: Hersteilung von geschütztem Nukleosidpolystyrenharz

750mg Sukzinsäureanhydrid und 910mg 4-Dimethylaminopyridin werden 2,57g (5mMol) 5'-(4-Methoxytrityl)-thymidin (MMT-O-T-OH) in 20ml absolutem Pyridin zugesetzt und das Ganze bei Zimmertemperatur 16 Stunden stehengelassen. Nach dem Konzentrieren der Pyridinlösung wird diese in 20 ml Ethyiazetat aufgenommen, durch zweimaliges Schütteln mit je 200 ml 0,1 M Phosphatpuffer unter Zusatz vn 10 ml gesättigter Natriumchioridiösung extrahiert, wieder mit gesättigter Natriumchioridiösung gewaschen, getrocknet, konzentriert, und anschließend wird tropfenweise Hexan zugesetzt. Das ausgefällte Produkt wird abgetrennt und zweimal mit Ether pulverisiert, dann in 300ml Ethyiazetat aufgelöst und durch Schütteln mit 180ml 0,1 M Kaliumbisulphat mit einem pH-Wert von 2,5 bei 0°C extrahiert. Nach zweimaligem Waschen mit Wasser wird die Ethylazetatlösung mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert, es werden 0,5 ml Pyridin zugesetzt, und das Ganze wird konzentriert und durch den tropfenweisen Zusatz von Hexan verdünnt. Das ausgefällte Sukzinsäurederivat wird durch Filtern entfernt. 1,0g dieser Verbindung werden zusammen mit 190mg N-Hydroxysukzinimid in 4ml Ethyiazetat und 2 ml Dimethylformamid aufgelöst, und bei O⁰C werden 370mg N,N'-Dizyklohexylkarbodiimid zugesetzt. Nachdem man das Ganze über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen hat, wird der ausgefällte N,N'-Dizyklohexylhamstoff ausgefiltert, das Filtrat wird mit Ethyiazetat verdünnt, mit kaltem 0,1 M Natriumbikarbonat und Wasser extrahiert, getrocknet und durch Verdampfung in vacuo auf Trockenheit konzentriert. Dieser Rückstand wird mit Ethyiazetat auf Kieselsäuregel chromatografie!!. TLC: Rf 0,45 in Dichlormethan/Methanol (9:1).

100mg dieses N.-Sukzinimidoylsukzinsäureesters werden 20h mit 1 g Aminomethylpolystyren (Amingehalt HO^Mol/g) in 2ml Dichiormethan und 4ml Dimethylformamid gerührt. Das Polymerharz wird ausgefiltert und mit Dimethylformamid, Methanol, Dichiormethan und Methanol durch Waschen extrahiert. Nach dem Trocknen werden die Amingruppen, die nicht reagiert sind, durch Rühren des Harzes in 6ml Pyridin mit 1 ml Essigsäureanhydrid und 100 mg 4-Dimethylaminopyridin für die Dauer von 30min azetyliert. Das Poiymerharz wird durch Waschen mit Dichloromethan, Dimethylformamid, Methanol und Dichiormethan extrahiert und getrocknet, bis ein konstantes Gewicht erreicht ist. Die spektroskopische Methoxytrityibestimmung (MMT-Bestimmung) ergibt eine Ladung von 57/LtMol/g.

Beispiel 2:

Folgendes geschütztes Nukleosid/Polystyrenharz wird analog zu Beispiel 1 hergestellt:

von 5'-(4-Methoxytrityl)-N-isobutyryldeoxyguanosin, Charge 32yu,Mol/g.

Beispiel 3: Synthese des Trinukleotids

0 it

-P-

0-

ci

¹ 3

a) Synthese des Dinukleotids

7,73g(15mMol) 5'-(4-Methoxytrityl)-thymidin (MMT-H-T-OH) werden zweimal durch Verdampfen mit absolutem Pyridin konzentriert. Der Rückstand wird in 20 ml absolutem Tetrahydrofuran aufgelöst und tropfenweise 80 ml einer 0,2 M-Lösung von 2-Chlorophenyldi-(1-benzotriazolyl)-phosphat in Tetrahydrofuran unter Rühren und unter Ausschluß von Feuchtigkeit zugesetzt,

und das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt. Die resultierende Lösung von 2-Chlorophenyl-1-benzotriazolyl-5'-(4-methoxytrityl)-thimidin-3'-phosphat wird in 3 Portionen aufgeteilt.

a) Hydrolyse von Triethylammonium-2-chlorophenyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat

100ml von 0,5 Μ Tr.iethy!ammoniumbikarbonat werden einem Drittel der obigen Lösung von 2-Chloropheny 1-1-benzotriazolyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat unter Kühlung zugesetzt. Nach 15min erfolgt die Extraktion mit Dichloromethan. Die Dichloromethanlösung wird mit Wasser gewaschen, konzentriert, und es wird tropfenweise Petrolether zugesetzt. Der resultierende Niederschlag wird unter Sog ausgefiltert, durch Waschen mit Ether/Petrolether 1:1 extrahiert und in vacuo getrocknet. TLC: R_f 0,35 in Dichloromethan/Methanol/Wasser (75:22:3)

ß) Veresterung zu 2-Zyanoethyl-2-chlorophenyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphatund Entfernung der4-Methoxytritylschutzgruppe

1,3ml 2-Zyanoethanol und 2ml Pyridin werden einem Drittel der Lösung von 2-Chlorophenyl-1-benzotriazolyl-5'-(4-methoxytrityl)- thymidin-3'-phosphat zugesetzt. Man läßt das Gemisch bei Zimmertemperatur über Nacht stehen. Die Lösungsmittel werden in vacuo destilliert, und der Rückstand wird in Ethylazetat aufgelöst und wiederholt durch Schütteln mit 0,1 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 und Wasser extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet, konzentriert und tropfenweise Hexan zugesetzt. Der Niederschlag wird ausgefiltert, in 50ml Dichloromethan/Methanol 7:3 aufgelöst und bei 0⁰C eine Lösung von 3,8g p-Tpluensulfonsäuremonohydrat in 75ml Dichloromethan/Methanol 7:3 zugesetzt. Nach 2 Stunden wird die Reaktionslösung mit Dichloromethan verdünnt und durch Schütteln mit einer kalten Natriumbikarbonatlösung extrahiert. Die organische Phase wird konzentriert, und es wird Hexan zugesetzt. Das ausgefällte 2-Zyanoethyl-2-chlorophenylthyidin-3'-phosphat wird auf Kieselsäuregel mit Dichloromethan/Methanol 96:4 chromatografie!!. TLC: R_fvon 0,45 in Dichloromethan/ Methanol (9:1).

y) Kondensation zu 5'-(4-Methoxytrityl)-3'-zyanoethyl-bis-thymidindinukleotid 2,2g von 2-Zyanoethyl-2-chlorophenyl-thymidin-3'-phosphat werden durch zweimaliges Konzentrieren durch Verdampfung mit absolutem Pyridin dehydriert, und das Produkt wird in 20 ml absolutem Tetrahydrofuran aufgelöst und dem restlichen Drittel der Lösung von 2-Chlorophenyl-1-benzotriazolyl-5'-(4-methoxytrityl)-thyrnidin-3'-phosphat zugesetzt. Nach 18 Stunden bei Zimmertemperatur werden .1OmI Wasser und 200 ml Ethylazetat der Reaktionslösung unter Kühlen mit Eis zugesetzt. Die organische Phase wird wiederholt mit Natriumbikarbonat und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und auf ein geringes Volumen konzentriert. Das Dinukleotid, geschützt in der Phosphatkomponente und am 5'- und 3'-Ende, wird durch den tropfenweisen Zusatz zu Ether/Hexan 1:1 ausgefällt. TLC: Rf 0,48 in Dichloromethan/Methanol (9:1).

b) Synthese des Trinukleotids

1,17g (1 mMol) des oben beschriebenen, voll geschützten Dinukleotids werden in 30ml Dichloromethan/Methanol, 7:3, aufgelöst, und unter Kühlen mit Eis wird eine Lösung von 1,9g p-Toluensulfonsäuremonohydrat in 20ml Dichloromethan/ Methanol, 7:3, zugesetzt. Nach 2 Stunden wird eiskalte Natriumbikarbonatlösung zugesetzt, und die Extraktion wird mit Dichloromethan vorgenommen. Die organische Phase wird getrocknet, konzentriert und tropfenweise Hexan zugesetzt. Die ausgefällte Roh-Dinukleotidsubstanz mit einerfreien 5'-Hydroxygruppe wird auf Kieselsäuregel mit einem Gradienten von 2-8% Methanol in Dichloromethan chromatografie!!. TLC: R 0,33 in Dichloromethan/Methanol (9:1).

850mg dieses 5'-Hydroxy-Dinukleotids und 1,06g von Triethylammonium-2-chlorophenyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat (siehe Paragraph a) a)) werden zweimal durch Verdampfen mit Pyridin konzentriert, dann in 10ml absolutem Pyridin aufgelöst, und es werden 560 mg 1-Mesitylensulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazol (MSNT) zugesetzt. Nach 2 h werden 2 ml eiskaltes Wasser zugesetzt, und nach einer weiteren Stunde wird die Extraktion mit Dichloromethan ausgeführt. Die organische Phase wird mit gesättigter Natriumbikarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet, konzentriert, und es wird Ether zugesetzt. Das ausgefällte Trinukleotid wird durch Chromatographie auf Kieselsäuregel gereinigt. Rf 0,45 in Dichloromethan/Methanol (9:1).

Beispiel 4:

Analog zu Beispiel 3 wurden die folgenden geschützten Trinukleotide hergestellt mitder^llgemeinen Formel

0 0 0

MMT-O-B¹-O-P~0-B²-0-P-O-B³-0-?-0GH₂CH₂CI .

Cl Ci

abgekürzt mit B¹B²B³. Für die Nukleotide B¹, B², B³ werden folgende Abkürzungen verwendet:

A = N-Benzoyldeoxyadenosin

C = N-Benzoyldeoxyzytidin

G = N-Isobutyryldeoxyguanosin

T = Thymidin

Verbindung	Rf^a)	Verbindung	R,^al
TTT	0,45	ATG	0,48
TTC	0,55	ACT	0,53
TCT	0,46	ACC	0,48
TAC	0,56	ATT	0,55
TGC	0,44	ACA	0,53

Verbindung	R_f ^al .	.,	Verbindung	R_f ^a'
TAG	0,60	AAC	0,46
TGT	0,42	AAA	0,51
TGA	0,44	AGT	0,45
CTT	0,53	AGG	• 0,38
CTG	0,46	GTT	0,45
CCT	0,45	GTC	0,44
CCC	0,59	GTG	0,35
CCG	. 0,47	GCA	0,49
CCA	0,51	GCG	0,48
CAT	0,55	GAT	0,44
CAC	. 0,51	GAC	0,48
CGC	0,46	GAG	0,48
CGA	0,38	GAA	0,50
CAG	0,44	GGC	0,42
CGG	0,38	GGT	0,46
CGT	0,49	GGG	0,35
	GGA	0,44

a) Dünnschichtchromatogramm auf Kieselsäuregel in Dichloromethan/Methanol,9:1.

Beispiel 5: Synthese des DNA-Fragments von einer Länge von 67 Basen von Base Nr. 96 bis Base Nr. 162 des DNA-Stranges 96/97

a) Entfernung der 2-Zyanoethylschutzgruppe von den Trinukleotiden

ΙΟμ,ΜοΙ derTrinukleotide aus Beispiel 3 oder4werden unter Feuchtigkeitsausschluß in 60μ,Ι Pyridin/Aeztonitril/Triethylamin, 1:1:1, aufgelöst. Nach einer Stunde bei Zimmertemperatur werden 0,7 ml peroxidfreier Ether tropfenweise zugegeben und der Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt.

Das Roh-Triethylammoniumsalz wird in 50μΙ Pyridin aufgelöst und wieder mit 0,5 ml Ether ausgefällt, zentrifugiert und dann im Hochvakuum 15 Stunden getrocknet.

b) Kopplung der partiell geschützten Trinukleotide mit der an Polystyrenharz gebundenen Oligonukleotidkette

Alle Operationen werden unter Ausschluß von Feuchtigkeit in einem Reaktionsgefäß von 220μ,Ι Fassungsvermögen unter mikroprozessorgesteuertem Zusatz von Lösungsmittel und Reagens ausgeführt. 13mg (0,74μ,ΜοΙ) des Thymidin/ Polystyrenharzes (Beispiel 1) werden in das Reaktionsgefäß gegeben und folgenden Operationen unterzogen:

1. Methylenchlorid, 2ml/min., 4min.

2. Methylenchlorid/Isopropanol (85:15), 2ml/min.,2min.

3. Zinkbromid 1 M und 1,2,4-Triazol 0,020IVl in Methylenchlorid/Isopropanol (85:15), 2ml/min., 2-3,5min.

4. Methylenchlorid/Isopropanol (85:15), 2ml/min.,4min.

5. Triethylammoniumazetat, 0,5M in DMF, 2ml/min., 5min.

6. Molekuiarsiebgetrocknetes Pyridin, 2ml/min., 3 min.

7. Tetrahydrofuran (peroxidfrei, molekuiarsiebgetrocknet), 2 ml/min., 3min.

8. Stickstoffstrom, 10 min.

9. Einspritzung von 10/aMoI desTrinukleotids GTC (Trimethylammoniumsalz aus Paragraph a)) und 8,9 mg (30μΜοΙ) 1-Mesitylensulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazol (MSNT), aufgelöst in 150μΜοΙ Pyridin.

10. 45°C, 20 min. . .

11. Pyridin, 2ml/min.,4min.

12. Essigsäureanhyrid, 5%und4-Dimethylaminpyridin,2,5%, in Pyridin, 2ml/min.,4min.

13. Pyridin,2ml/min.,4min.

14. Pyridin/Isopropanol (1:1), 2ml/min., 3min.

Alle 14 Operationen werden 21 Mal wiederholt, aber in der 9. Operation werden anstelle von GTC die folgenden Trinukleoride in der Form ihrer Triethylammoniumsalze (Paragraph a)) in der angegebenen Reihenfolge eingesetzt: GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG, TGA, CGC, TAC, CGT, GTG, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA, TTC, GGG, CCT, CAT. Die mittlere Kopplungsausbeute beträgt 97%. Das Endprodukt hat folgende Struktur: MMT-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCT-Porystyren.

c) Entfernung des DNA-Fragments aus dem Träger und Entfernung der Schutzgruppen

40,0mg (etwa 0,60μΜοΙ) des DNA-Syntheseharzes 96/97 werden 3 Stunden bei 50^cC gehalten und 12 Stunden bei Zimmertemperatur mit 66mg (0,4OmMoI) 1,1,3,3-Tetramethylguanidin ίη400μΙ 95%igem Pyridin. Nach dem Wegblasen des Pyridine mit Stickstoff werden dem Rückstand 1,6 ml wässriges Ammoniak (33%) zugesetzt und das Ganze bei 50 ⁰C 24h in einem geschlossenen Gefäß gehalten.

Die abgetrennte flüssige Phase wird in vacuo von Ammoniak befreit und dreimal mit 3 ml peroxidfreiem Diethylether jeweils gewaschen. Nach der Entfernung der niedermolekularen Bestandteile auf einer Biogel-P6-Kolonne (100-200 Maschen, 3 x 66cm, 0,01 molares Trimethylammoniumbikarbonat, pH-Wert 7,5,1,5ml/min), werden 285ODs (260nm) DNA isoliert. Insgesamt 60ODs werden auf eine HPLC-Kolonne(PRP-1/Hamilton, 250 χ 4,6mm) abgetrennt. Gradient (Lösung A: 0,05 M Triethylammoniumazetat,pH-Wert7,0; Lösung B: Lösung A: Azetonitril 1:1): 30% B in A,60% Bin Ain20min bei 5O⁰Cund 2 ml/min. Die lipophile Hauptspitze (Verweilzeit ca. 14min) wird aufgefangen, über eine DE52-Zellulose-Kolonne (Whatman) konzentriert, eluiert und mit Ethanol ausgefällt. Um die 4-Methoxytritylschutzgruppe zu entfernen, wird der Niederschlag ίηδΟμΙ Essigsäure/H₂O(4:1) aufgelöst und 45 min bei Zimmertemperatur gehalten. Das Reaktionsprodukt wird lyophilisiert, mit Ethanol ausgefällt und zur Reinigung elektrophoretisch auf einem 8%igen Polyakrylamidgel (7 M Harnstoff) angetrennt. Das der gewünschten DNA-Größe entsprechende Band wird ausgeschnitten, und das Produkt wird elektroeluiert, über DE52-Zellulose konzentriert, und die DNA 96/97 hat folgende Struktur:

5'-CATCCTGGGTTCTGACGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCt-S' und wird mit Ethanol ausgefällt.

Duplex I:

Beispiel 6:

Folgende DNA-Fragmente (5'-3') werden analog zu Beispiel 5 hergestellt:

1/58 '

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGT 46/64 komplementär

CAGGATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCGTTGTGAGACTGCGG 154/64 komplementär

ACGGATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCGTTGTGAGACTGCGG

Beispiel 7: Phosphorylierung der Fragmente 1/58,46/64 komplementär, 96/97 und 154/65 komplementär

Die Phosphorylierung und die radioaktive Markierung an den 5'-Enden erfolgt mit [γ~³²Ρ] ATP und T₄-Polynukleotidkinase (Boehringer),wiedasin Molecular Cloning, A laboratory Manual (Molekulärklonung. Ein Laborhandbuch) (H rg. T. Man iatis u.a.), Cold Spring Harbor Lab., 1982, S. 125, beschrieben wird.

Beispiel 8: Polymerisation zu Duplex Il (Fragment F₂ des Desulphatohirudin-HV1-Gens

Jeweils 50 pMol des kinasierten Fragmentes 96/97 und des kinasierten Fragmentes 154/64 werden in 24μΙ Wasser aufgelöst, die Lösung wird für 3 min auf 90°C erhitzt und innerhalb einer Zeitspanne von 5 min auf 12°C gekühlt. Nach dem Zusatz von 4μΙ Endo-R-Puffer (0,1 Molar-tris.HCI,pH-Wert7,5,66mM MgCI₂,66mM /3-Merkaptoethanol, 0,6M NaCI), 10μΙ Deoxynukleosidtriphosphatgemisch (dATP, dCTP, dGTP, TTP, jeweils 2 χ 10~³ molar, abgestimmt mit NH₃ auf einen pH-Wert von 7,0) und 2μ\ (10 Einheiten) von DNY-Polymerase I wird bei 12°C für die Dauer von 30 min die Klenow-Fragmentinkubation (Boehririger) durchgeführt. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 90⁰C für die Dauer von 3 min gestoppt, und das Gemisch wird bei -80°C gelagert, bis es für die weitere Verarbeitung gebracht wird.

Auf analoge Weise werden die kinasierten Fragmente 1/58 und 46/64 reagiert, um Duplex I (Fragment Fi des Desulphatohirudin-Gens) zu bilden.

Die Duplex I und Il haben folgende Strukturen:

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTG GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACAC

CGAAGGTTCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTG GCTTCCAAGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC Duplex II:

CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAAC GTAGGACCCAAGACTGCCACI I I I I I IGGTCACGCAATGGCCACTTCCÄTGGGGCTTTG

cgcagtctcacaacgacggtgacttcgaagaaatcccggaagaatacctgcagtaggatcctg gcgtcagagtgttgctgccactgaagcttctttagggccttcttatgcacgtcatcctaggac

Die Herstellung der Fragmente F₁ und F₂ des Desuiphatohirudin-Gens wird im folgenden Schema 1 veranschaulicht:

Schema 1: Herstellung der Fragmente F₁ und F₂ des Desuiphatohirudin-Gens HV1 und der F₁-F₂-DNA Polynucleotide-kinase

annealing — Glühen der Polynukleotidkinase j

Subcloning — Subkloning

(Orig.-S.42)

Beispiel 9: Polymerisation und Ligation der Fragmente 1/58, kinasiertes 46/64, kinasiertes 96/97 und 154/64; Herstellung des Desulphatohirudin-HVI-Gens

Jeweils 5OpMoI des Fragmentes 1758, kinasierten Fragmentes46/64, kinasiertes Fragmentes 96/97 und des Fragmentes 154/64 werden ϊη48μ.Ι Wasser aufgelöst, die Lösung wird 3min bei 90°C erhitzt und innerhalb von 5min auf 12°C abgekühlt. Nach dem Zusatzvon 8μ.Ι Endo-R-Puffer (siehe Beispiel 8), 20 μΙ Deoxynukleosidtriphosphatgemisch (dATP, dCTP, DGTP, TTP, jeweils 0,002 molar, abgestimmt auf einen pH-Wert von 7,0 mit NH₃) und 2μΙ (10 Einheiten) von DNA-Polymerase I wird für die Dauer von 30min bei 12°Cdie Klenow-Fragmentinkubation (Boehringer) ausgeführt. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 90⁰C für die Dauervon 3min gestoppt, und die DNA wird nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform durch Ausfällung mit Ethanol isoliert. Das resultierende DNA-Gemisch wird in 100μΙ Ligase/Puffer (66mM tris.HCI, pH-Wert 7,5 6,6mM MgCI₂,1OmM Dithiothreitol, 5mM ATP) ausgelöst, es werden 50 Einheiten (2μΙ) von T₄-DNA-Ligase (Biolabs) zugesetzt, und das Ganze wird bei 20°C 20 h inkubiert. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 70°C für die Dauervon 5 min gestoppt, und die DNA wird nach Extraktion mit Phenol/Chloroform durch Ausfällung mit Ethanol isoliert. Nach der Trennung des Gemischs durch Elektrophorese auf einem 8%igen Polyakrylamid-Gel (Denaturierung), wird das Ligationsprodukt mit 217 Basispaaren elektroeluiert, auf einer DE52-Zellulosekolonne konzentriert und nach der Eluierung durch Ausfällung mit Ethanol isoliert. Das Desulphatohirudin-Gen hat folgende Struktur:

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGC GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACG GAAGGTTCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAA CTTCCAAGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACI I I I I

AACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTC TTGGTCACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAG

GAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG CTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAG

Die Herstellung des Desulphatohirudin-Gens aus den vier Fragmenten wird im folgenden Schema 2 veranschaulicht: Schema 2: Herstellung des Hirudin-Gens aus den vier synthetischen Fragmenten

Polynucleotide kinase an- Glühen der Polynukleotidkinase

Beispiel 10: Konstruktion des Plasmids pML 300, das die F₁-DNA des Desulphatohirudin-HVI-Gens enthält (Abb. 1)

a) Herstellung des linearisierten Vektors pBR322/EcoRI/Pvull

5/xg der pBR322-Plasmid-DNA werden mit 5 Einheiten von Pvull-Restriktionsendonuklease (Biolabs) in 200ml einer Lösung von 100/xg/ml Gelatine für eine Stunde bei 37°C digeriert. Anschließend wird diese Lösung auf 10OmM tris.HCI (pH-Wert 7,5) abgestimmt, 5OmM NaCI und die DNA wird mit 30 Einheiten von EcoRI-Restriktionsendonuklease (Biolabs) für die Dauer von 2 h bei 37°C digeriert. Die Lösung wird dann auf 5OmM tris.HCI, pH-Wert 8, abgestimmt und bei einer DNA-Konzentration von 10μg/μ.l mit 2 Einheiten alkalischer Kalbsdarmphosphatase (Boehringer) für 30min bei 37⁰C inkubiert. Das Enzym wird durch Erhitzen der Lösung auf 65°Cfürdie Dauer von 60 min inaktiviert. Dann wird die Lösung mit TNE standardisiert, mit 1 Volumen Phenol und Chloroform extrahiert und die digerierte DNA mit 2 Volumen Alkohol bei -20°C über Nacht ausgefällt. Der aus der pBR322-DNA exzessierte Vektor (pBR322-DNA exzessierte Vektor (pBR322/EcoRI/Pvull, 2297 Basispaare) wird von dem kleinen DNA-Fragment (2067 Basispaare) durch Gel-Elektrophorese auf 1 % niedrigschmelzender Agarose (Biorad) in tris-Azetat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8, getrennt. Nachdem die DNA im Agarose-Gel mit EtBr gefärbt wurde, wird die Fläche des Gels, die das DNA-Band des pBR322/EcoRI/Pvull-Vektors (= 2297 Basispaare) enthält, aus dem Gel herausgeschnitten und für 10 min bei 65°C verflüssigt. Dieser DNA-Lösung werden 20 Volumen TNE zugesetzt, die DNA wird nach Mueller u.a. (J. Mol.Biol. 124,343 [1978]) durch DE-52-Chromatografie gereinigt, mit Phenol/Chloroform extrahiert, und die DNA wird mit Alkohol bei -20⁰C über Nacht ausgefällt. Der DNA-Niederschlag wird in 50μ\ 0,01 M tris.HCI (pH-Wert 8), 0,1 mM EDTA aufgelöst und bei -20°C bis zur Verwendung gelagert. Man erhält 1,4^g (= 3,2pMol der Enden ) der DNA.

b) Herstellung von F_rDNA/EcoRI

24ng (= 1,3pMol der Enden) der chemisch synthetisierten Ρί-DNA (siehe Beispiel 8) werden mit 5 Einheiten EcoRI-Restriktionsendonuklease (Biolabs) in 50μ\ von 100mMtris-HCI (pH-Wert7,5), 5OmM NaCI und 100Mg/ml Gelatinefür30min bei 37°C digeriert. Anschließend werden der Lösung 0,06^g (= 0,14pMol der Enden) des linearisierten Vektors pBR322/EcoRI/Pvull (Beispiel 10a) zugesetzt. Das Enzym wird dann durch Erhitzen auf 65°C nach 10min inaktiviert, und die Lösung wird mit TNE standardisiert und mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die DNA wird mit Alkohol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wird unter Alkohol bei -20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.

c) Ligation der pBR322/EcoRI/Pvull-Vektor-DNA mit FtDNA/EcoRI und Konstruktion von Plasmid pML300

Der im Beispiel 10b gewonnene DNA-Niederschlag, der die beiden DNA-Fragmente enthält, wird in 200μΙ einer Lösung von 5OmM tris.HCI (pH-Wert 7,8), 1OmM MgCI₂,1OmM DTT, 0,5 mM ATP und 100/xg/1 Gelatine aufgelöst und mit 25 Einheiten μ\ T₄-DNA-Ligase (Biolabs) bei 15°C für 3 Stunden behandelt. Auf diese Weise wird das Rekombinantplasmid pML300, das die F,-DNA enthält, in der Lösung gewonnen.

d) Transformation von E. coli HN101 mit Plasmid pML300

Die E. coli-HBI 01-Zellen werden mit Kalzium vorbehandelt, das für die Transformation erforderlich ist, sie werden so hergestellt, wie das von Mandel u.a. (J. Mol. Biol. 53,159 [1970]) beschrieben wurde.

Die in c) gewonnene Lösung, die das Rekombinantplasmid pML300 enthält, wird bei 65°Cfür 10min erhitzt, um die T₄-DNA-Ligasezu inaktivieren, wird dann auf 37°C abgekühlt. 10μ.Ι dieses Reaktionsgemische werden 150μΙ der kalziumbehandelten E. coli-HBIOI-Zellen in 1OmM MgCI₂ Und 1OmM tris.HCI (pH-Wert-7,5) in einem Gesamtvolumen von 200μ,Ι zugesetzt. Anschließend wird dieses Gemisch in Eis 30 min gekühlt, für 2 min auf 42⁰C erhitzt und dann für 50 min in 1 ml L-Medium (siehe Beispiel 18) bei 37°Cstehengelassen. Das Gemisch wird dann in Aliquoten von 0,2ml auföAgar-PlatteniMc-Conkey-Agar, Difco) aufgestrichen, die60^g/ml Ampizillin (Serva) enthalten. Die Agar-Platten werden dann bei 37⁰C16 bis 18 Stunden gehalten. Man erhält 484 ampizillinresistente Kolonien der transformierten E. coli HB101.

e) Aussieben der F₁-DNA enthaltenden Kolonien

470 transformierte Kolonien (Beispiel 10d) werden auf Nitrozellulosefilter B 85 (Schleicherund Schull) ausgedrückt. Nach

M. Grunstein und D. S. Hogness (Proc. Natl. Acad. Sei. USA72,3961 [1979]) werden die Kolonien aufgelöst, und ihre denaturierte DNA wird auf dem Filter fixiert. Anschließend wird die Prähybridisation der Filter in 20 ml (je Filter) von 4 χ SET(= Lösung von 3OmM tris.HCI [pH-Wert 8], 15OmM NaCI, 1 mM EDTA), 0,1 % (Gew./Vol.) Ficoll 400 (Pharmacia), 0,5% SDS, öO/ig/ml denaturierter Kalbsthymus-DNA für 4h bei 64⁰C durchgeführt. Dann werden die Nitrozellulosefilter in 200 ml (je Filter) von 5 χ SET (Gew./Vol.) Ficoll 400,0,2% SDS und 50^g/ml denaturierter Kalbsthymus-DNA für 16 Stunden bei 64°C mit der radioaktiv markierten ³²P-Sonde (etwa 10³-10⁴Cerencov-cpm je Filter) behandelt. Als Sonde wird das Oligonukleotid 46/64 komplementär (siehe Beispiel 6) verwendet.

Anschließend werden die Filter zweimal in 2 x SET, 0,2% SDS bei Zimmertemperatur gewaschen, dann zweimal in 2 x SET, 0,5% SDS bei 60⁰C (zuerst für 30 min, dann für 60 min). Die Filter werden dann zwischen 3 MM-Papier (Whatman) getrocknet und bei -80⁰C auf einen Röntgenfilm (Fuji) mit einem Intensivierungssieb (llford) für 1 bis 2 Tage gegeben.

Die resultierenden Autoradiogramme zeigen 71 positive Kolonien (Klone), die für die weiters Verarbeitung verwendet werden können, von denen eine die Bezeichnung pML300 erhielt.

Beispiel 11: Konstruktion von Plasmid pML305, das die F₂-DNA des Desulphatohirudin-HVI-Gens enthält (Abb.2)

a) Herstellung des linearisierten Vektors pBR322/BamHI/Nrul

5/ig der pBR322-Plasmid-DNA werden mit 30 Einheiten von BamHI-RestriktionsendonukleasefürSOmin bei 37⁰C in einer Lösung von 10OmM NaCI, 6mM tris.HCI (pH-Wert 7,9), 6mM MgCI₂ und 100,u.g/ml Gelatine digeriert. Dann werden der Lösung 15 Einheiten Pvull-Restriktionsendonuklease zugesetzt, und die Lösung wird zwei Stunden bei 37 °C digeriert. Das Reaktionsgemisch wird bei 70⁰C für 10 min erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Anschließend werden die beiden DNA-Fragmente durch Gel-Elektrophorese auf 1 % niedrigschmelzender Agarose in tris-Azetat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8, getrennt (siehe Beispiel 10a).

Das DNA-Band des pBR322-BamHI/Pvull-Vektors (= 2 672 Basispaare) wird herausgeschnitten, verflüssigt und nach Mueller u. a. (siehe oben) durch DE-52-Chromatografie gereinigt. Man erhält 0,75/xg (= 1,5pMol der Enden) der DNA.

b) Herstellung des F₂-DNA/BamHI-Fragmentes

25/xg (= 1,3pMol der Enden) der chemisch synthetisierten F₂-DNA (Beispiel 8) werden mit 16 Einheiten der BamHI-Restriktionsendonuklease (Biolabs) in 20μ115OmM NaCI, 6mM tris.HCI (pH-Wert 7,9), 6 mM MgCI₂ und 100μg/ml Gelatine für 30 Minuten bei 37°C digeriert. Dann werden der Lösung 60 ng (= 96 nMol der Enden) des linearisierten Vektors pBR322/BamHI/Pvull (Beispiel 11 a) zugesetzt, die ganze Lösung wird mit TNE standardisiert und mit Phenol/Chloroform extrahiert, und die DNA wird mit 2 Volumen Alkohol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wird unter Alkohol bei -2O⁰C gelagert, bis sie zur weiteren Verarbeitung gebraucht wird.

ex) Ligation der Pbr322/BamHI/Pvull-Vektor-DNA mit F₂-DNA/BamHI und Konstruktion von Plasmid pML305 Der in Beispiel 11 b gewonnene DNA-Niederschlag, der die beiden genannten DNA-Fragmente enthält, wird in 20 μΙ einer Lösung von 5OmM tris.HCI (pH-Wert 7,8), 1OmM MgCI₂,1OmM DTT, 0,5 mM ATP und ΙΟΟμς/ηηΙ Gelatine aufgelöst und mit 15 Einheiten/ μΙ T₄-DNA-Ligase (Biolabs) bei 15°Cfürdie Dauer von drei Stunden behandelt. Auf diese Weise wird das Rekombinantplasmid pML305, das die Fe₂-DNA enthält, in der Lösung gewonnen.

d) Transformation von E. coli HB101 mit Plasmid pML305

Die Transformation der kalziumbehandelten E. coli-HB101-Zellen erfolgt wie im Beispiel 10d. Es werden ΙΟμΜββίη Beispiel 11 c gewonnenen Reaktionsgemische eingesetzt. Man erhält 313 ampizillinresistente Kolonien.

e) Aussieben der die F₂-DNA enthaltenden Kolonien

65 transformierte Kolonien (Beispiel 11 d) werden auf die in Beispiel 10e beschriebene Art und Weise auf F₂-DNA überprüft. Als radioaktive Sonde wird das Oligonukleotid 154/64 komplementär (siehe Beispiel 6) verwendet. Im Autoradiogramm werden zwei positive Kolonien ermittelt, von denen^xeine mit pML305 bezeichnet wird.

Beispiel 12: Charakterisierung der Klone pML300 und pML305

Die DNAderRekombinantplasmide pML300undpML305 werden nach Ish-Horowitz (Molekular Cloning, A laboratory Manual (Molekularklonung, Ein Laborhandbuch) (Hrg. Maniatis u.a.), Cold Spring Harbor Lab., 1982, S.368] isoliert. Die Nukleotidfolgen der F₁-DNA-und F₂-DNA-Einfügungen werden nach Maxam und Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560 [1977]) bestätigt (siehe auch Meth. Enzym. 65,499 [1980]).

Zu diesem Zweck werden jeweils 10μg der Plasmid-DNA von pML300 mit EcoRI-Restriktionsendonuklease gespalten, und 10μg der Plasmid-DNA von pML305 werden mit BamHI-Restriktionsnukleare gespalten, und die linearisierten DNA werden durch Gel-Eluierung aus Agarose-Gel (siehe Beispiel 10a) isoliert. Anschließend werden die isolierten DNA mit alkalischer Phosphatase digeriert und über DE-52 (siehe Beispiel 11a) chromatografie!!. Dann werden die DNA an dem 5'-Ende mit [γ~³²Ρ] ATP (spezifische Aktivität öOOOCi/mMol, Amersham) und T₄-Polynukleotidkinase (P-L-Biochemicals) radioaktiv markiert.

Die radioaktiv markierten DNA werden dann mit einer zweiten Restriktionsendonuklease (EcoRII) gespalten. Die resultierenden DNA-Fragmente werden durch Gel-Eluierung von Agarose isoliert. Bei pML300 wird die Nukleotidfolge der F₁-DNA dann aus dem EcoRII-EcoRl^x-Fragment (etwa 109 Basispaare) bestimmt und im Fall von pML300 wird die der F₂-DNA im EcoRII-BamHI*- Fragment (etwa 122 Basispaare) bestimmt.

(^x bezeichnet das DNA-Ende, das radioaktiv markiert ist.)

Die Nukleotidfolgen, die für F₁-DNA und F₂-DNA bestimmt werden, sind den im Beispiel 8 veranschaulichten identisch.

Beispiel 13: Konstruktion des ExpressionsplasmidspML310

a) Konstruktion des linearisierten Vektors pHRI148/EcoRI/BamHI, der den trp-Promoteroperator enthält (Abbildungen 3 und 4)

A. Konstruktion von Plasmid p159

10μg von Plasmid pBRH_trp [DE-OS 3111 405] werden mit 50 Einheiten von EcoRI (Biolabs) für 60 min bei 37⁰C gespalten, und.das Digestionsgemisch wird nach der Phenolextraktion auf eine Saccharosedichtegradienten (5-23%) in 5OmM tris.HCI (pH-Wert 8,0), 1mM EDTA in einem TST41-Rotor (Kontron AG) fraktioniert. Das Zentrifugieren dauert bei 40OOOU/min und 15°C14 Stunden. 0,3ml-Fraktionen werden mit einem ISCO-Gradientenkoilektorbei 1 ml/min entnommen. Die Fraktionen, die das kleinere Fragment enthalten, werden kombiniert, die Lösung wird mit TNE standardisiert und mit 2 Volumen Ethanol bei -20⁰C ausgefällt. Nach dem Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge wird die DNA in 100μΙ von 1OmM tris.HCI, pH-Wert 7,5, 0,5 mM EDTA aufgelöst. 5μg dieses DNA-Fragments werden mit 5 Einheiten BgIII (Biolabs) für 60 min bei 37°C gespalten. Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol und Chloroform extrahiert, und die DNA wird mit 2 Volumen Ethanol bei -8O⁰CfUr 10 min inkubiert; die DNA wird durch Zentrifugieren aufgefangen und erneut in 50 ml von 5OmM tris.HCI (pH-Wert 8,0) aufgelöst. 2μΙ dieser Lösung werden entfernt (0,2ßg der DNA) und bei einer DNA-Konzentration von 10ng/μΙ in 5OmM tris.HCI (pH-Wert 8,0) mit einer Einheit von alkalischer Kalbsdarmphosphatase (Boehringer) für 30 min bei 37⁰C inkubiert. Das Enzym wird durch Erhitzen der Lösung auf 65°Cfür60min inaktiviert. 0,04μ9 der DNA werden entfernt und 5'-terminal mit 10μΟ [γ~³²Ρ]-ΑΤΡ (5000Ci/mMol, Amersham) und 5 Einheiten vonT4-Polynukleotidkinase (P-L-Biochemicals) in 20μΙ Reaktionsvolumen in 5OmM tris.HCI (pH-Wert 9,5), 1OmM MgCI₂ und 5mM DDT für 30min bei 37⁰C inkubiert. Die radioaktive Probe wird mit der unmarkierten Probe (siehe oben) gemischt, und die DNA-Fragmente werden durch einen Saccharosedichtgradienten (5 bis 23%) in 5OmM tris.HCI (pH-Wert 8,0), 1mM EDTA in einem TST60-Rotorfraktioniert. Das Zentrifugieren wird über 5 h bei 60000 U/min und 15°C ausgeführt. Es werden 0,2 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Radioaktivität jeder Fraktion wird durch Messung der

Cerencov-Strahlung bestimmt, und dadurch werden die Fragmente identifiziert. Die gewünschten Fraktionen, die das kleine DNA-Fragment enthalten, werden kombiniert, die DNA wird mit zwei Volumen Ethanol ausgefällt und nach dem Zentrifugieren erneut in 20/xl von 1OmM tris.HCI, pH-Wert 7,5, 0,5mM EDTA aufgelöst.

Das³²P-markierte EcoRI-Bgill-DNA-Fragment wird partiell mit 0,2 Einheiten von Tagl (Biolabs) in 50 μ.Ι Volumen für 10min bei 37°C gespalten. Das Reaktionsgemisch wird auf 0,2% SDS, 10% Glyzerin, 1OmM EDTA, 0,05% Bromophenol-Blau abgestimmt, und die DNA-Fragmente werden auf einem 6%igen Polyakrylamidgel in tris-Borat-EDTA getrennt (A. C. Peacock u.a., Biochemistry 6,181 [1967]). Das Band, welches das gewünschte EcoRI-Taql (das größte partielle Fragment) enthält, wird auf dem Autoradiogramm identifiziert. Dieses Fragment (L. Siehe Abb. 3) wird aus dem Gel extrahiert und gereinigt (W. Müller u. a., oben) und in 10μΙ von 1OmM tris.HCI, pH-Wert 7,5,1mM EDTA aufgelöst.

Als Akzeptorplasmid wird pBR322 verwendet, das mit CIaI und EcoRI gespalten wird: 2μς von pBR322 werden mit 4 Einheiten CIaI (Biolabs) in 20μΙ des Reaktionsvolumens für 60 min bei 37⁰C digeriert. Das Protein wird mit Phenol extrahiert, und die DNA wird dann mit zwei Volumen Ethanol bei -8O⁰CfUr 10 Minuten ausgefällt. Die DNA wird durch Zentrifugieren gewonnen und dann mit 10 Einheiten EcoRI (Biolabs) für30 min bei 37⁰C in 20μΙ Reaktionsvolumen digeriert. Anschließend werden der Lösung 2 Volumen von 0,1 M tris.HCI (pH-Wert 8,7) zugesetzt, und das Ganze wird mit Einheit alkalischer Kalbsphosphatase (Boehringer) bei 37⁰C für 30min inkubiert.

Die Phosphatase wird dann durch Inkubation bei 65°Cfürdie Dauer von 60 min inaktiviert. 100 ng des Akzeptorplasmids werden mit 5μΙ des Fragments L-DNA in 15μΙ Reaktionsvolumen in 1OmM MgCI₂,2OmM tris.HCI (pH-Wert7,8), 1OmM DTT, 0,5mM ATP mit 30 Einheiten je μΙ des Reaktionsvolumens von T₄-DNA-Ligase (Biolabs) für 2 h inkubiert.

5μΙ dieser Lösung werden einem Gemisch zugesetzt, das 150 ml E. coli HB101 -Zellen enthält, die mit Kalziumchlorid (siehe oben) behandelt wurden, in 1OmM MgCI₂,1OmM CaCI₂ und 1OmM tris.HCI (pH-Wert 7,5) in einem Gesamtvolumen von 200μΙ. Das Gemisch wird 20 Minuten in Eisgekühlt, eine Minute auf 42⁰C erhitzt und 10 min bei 2O⁰C inkubiert. Es wird 1 ml Tryptonmedium (Tryptonmedium enthält 10kg Bacto-Tryptone [Difco]; 1 g Hefeextrakt (Difco); 1 g Glukose,8g NaCI und 294mg CaCI₂ · 2H₂O in 11 destilliertem Wasser) zugesetzt, und das Gemisch wird 30min bei 37⁰C unter Rühren mit 300 U/min inkubiert. Das Gemisch wird auf zwei Agar-Platten (McConkeyAgar, Difco; 0,6 ml/Platte) gebracht, ergänzt mit 50/xg/ml Ampizillin (Sigma). Die Platten werden bei 37°C zwischen 12 und 17 Stunden inkubiert

Die Plasmid-DNA von 10 verschiedenen Kolonien wird folgendermaßen isoliert:

Die Kolonien werden wie oben für die Inokkulation von 10ml von Tryptonmedien, ergänzt durch 50μg/ml Ampizillin, in einem 25ml-Erlenmeyerkolben verwendet. Die Kulturen werden 15 bis 18 Stunden bei 37⁰C und 300U/min gerührt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet (Sorval, HS-4-Rotor, 10 min bei 4000 U/min, 4⁰C); es werden etwa 0,1 g Zellen gewonnen, und diese werden wieder in 1 ml von 5OmM tris.HCI (pH-Wert 8,0) zur Suspension gebracht. Es werden 0,25 ml Lysozymlösung (10 mg/ml in 5OmM tris.HCI [pH-Wert 8,0]; Sigma bringt Lysozym auf den Markt) zugesetzt, und nach einer Inkubation bei 0⁰C für die Dauer von 10 min werden 0,15 ml 0,5 mM EDTA (pH-Wert 7,5) zugesetzt. Nach weiteren 10 min bei 0⁰C werden 60μΙ von 2% Triton X-100 (Merck) zugesetzt. Nach 30 min bei O⁰C wird die Probe 30 Minuten lang mit 15000 U/min und bei 4⁰C in einem Sorval SA-600-Rotor zentrifugiert. Die obenaufschwimmende Schicht wird mit 1 Volumen Phenol (mit TNE gesättigt) deproteiniert. Die Phasen werden durch Zentrifugieren (Sorval HB-4-Rotor)fürdie Dauer von 10 min bei 5000 U/min und 4°C getrennt. Die obere Phase wird zweimal mit 1 Volumen Chloroform extrahiert. Pankreatische RNAse A(Signma; 10 mg/ml in TNE, 10 min bei 85⁰C vorgewärmt) wird zugesetzt, bis eine Endkonzentration von 25^g/ml erreicht ist, und das Gemisch wird bei 37°C 40 min inkubiert. Dann wird die Lösung mit 1 M NaCI und 10% Polyethylenglykol 6000 (Fluka,20min bei 12O⁰C in einem Autoklaven behandelt) abgestimmt und 2 h bei -10⁰C inkubiert. Der Niederschlag wird in einem Sorval HB-4-Rotor (20min bei 10000 U/min, 0⁰C) aufgefangen und erneut in 100μΙ TNE aufgelöst. Die DNA-Lösung wird mit 1 Volumen Phenol extrahiert, und die DNA wird mit 2 Volumen Ethanol für die Dauer von 10 min bei —80⁰C ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge aufgefangen, und die DNA wird erneut in 20μΙ von 10 mM tris.HCI (pH-Wert 7,5) und 0,5 mM EDTA aufgelöst. Aus einer lOml-Kultur erhält man 8 bis 10/*g der Plasmid-DNA.

Die Plasmid-DNA werden nach dem Digerieren mit den folgenden Restriktionsenzymen analysiert: Jeweils 0,5^g der Plasmid-DNA werden gespalten mit HPaI (Biolabs) und mit Hpal (Biolabs) und EcoRI (Biolabs) und CIaI (Biolabs) nach den Standardanweisungen, entsprechend der Anweisungen der Enzymhersteller. Die DNA werden auf einem 1%igenAgarose-Gel in 40 mMtris.Azetat (pH-Wert7,8), 1 mM EDTA und 0,5|ug/mlEthidiumbromid fraktioniert. Die gewünschten Plasmide enthalten eine Hpaj-Stelle und ergeben nach dreimaligem Digerieren neben dem großen DNA-Fragment 2 kleinere Fragmente, die größer als das kleine EcoRI-Clal-Fragment von pBR322 sind. Eines dieser Plasmide wird mit p159 bezeichnet (siehe Abb.3).

B. Konstruktion von Plasmid pHRi145

2μg der p159-DNA werden mit 10 Einheiten von EcoRI (Biolabs) 30 min bei 37⁰C digeriert. Die DNA wird mit Phenol extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und nach dem Zentrifugieren in 10μΙ von 1OmM tris.HCI (pH-Wert 7,5) 0,5mM EDTA aufgelöst. Die mit EcoRI digerierte DNA wird weiter mit 5 Einheiten DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) (Boehringer) in 1OmM MgCI₂,1OmM ß-Merkaptoethanol,50mM NaCI, 0,1 mM dATP(P& L Biochemicals), 0,1 mM dTTP (P & L Biochemicals)für 15min bei 12°C behandelt. Die Polymerase wird dann durch Inkubation für die Dauer von 5 min bei 85°C inaktiviert. Das Reaktionsgemisch wird in 2OmM tris.HCI (pH-Wert 7,8), 1OmM MgCI₂IOmM DTT, 0,5 mM ATP (Sigma) um einen Faktor von 10 verdünnt und mit 30 Einheiten T₄-DNA-Ligase je μ,Ι des Reaktionsgemische für 1 h bei 15°C inkubiert.

50 ng der DNA werden in E. coli (auf die oben beschriebene Weise) transformiert und auf McConkey-Agar-Platten aufgebracht, ergänzt durch 50ju.g/ml Ampizillin.

Die Plasmid-DNA von 10 verschiedenen Kolonien werden auf die oben beschriebene Weise isoliert. Die Plasmid-DNA werden durch Digestion mit EcoRI analysiert. Die gewünschten Plasmide sind EcoRI-resistent. Die Analyse wird in der oben beschriebenen Weise ausgeführt. Eines der gewünschten Plasmide wird HRi145 bezeichnet (Abb.3).

C. Konstruktion des Plasmids pHRi148

2/*g von pHRi145-DNA werden mit 5 Einheiten von CIaI (Boehringer) für60min bei 37⁰C behandelt, anschließend durch Phenolextraktion deproteiniert. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt und dann ίη20μΙ von 1OmM tris.HCI (pH-Wert 7,5), 0,5 mM EDTA aufgelöst. Die vorstehenden Enden werden, wie oben beschrieben, mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) versehen, allerdings werden dATP und dTTP durch dCTP (P & L Biochemicals) bzw. dGTP (P & Biochemicals) ersetzt. Die Polymerase wird durch Inkubation für die Dauer von 5 min bei 85°C inaktiviert. Dem Reaktionsgemisch werden 2 Volumen von 0,1 M tris.HCI (pH-Wert 8,7) zugesetzt, welches mitO,5Einheiten Kalbsphosphatase (Boehringer) für 30 min bei 37⁰C inkubiert wird. Das

Reaktionsgemisch wird durch Extraktion mit Phenol deproteiniert. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt und in 8μ\ von 1OmM tris.HCI (pH-Wert7,5), 0,5mM EDTAaufgelöst.

Ein chemisch synthetisiertes DNA-Linker mit der Formel 5'-GAATTCCATGGTACCATGGAaTTC-S' wird am 5'-Endephosphorylisiert durch Inkubation von 8pMol des Linkers mit 5mCi [y~³²P]-ATP(5500Ci.mMor¹,Amersham)in 8μΙ Reaktionsvolumen, das 0,1 mMol rATP (Sigma, 5OmM) tris.HCI (pH-Wert 9,5), 1OmM MgCI₂, 5mM DTT und 2 Einheiten von T₄-Polynukleotidkinase (P & L Biochemical) enthält, für die Dauer von 30 min bei 37°C. Die Reaktion wird dann durch Gefrieren bei-8O⁰C gestoppt.

Der radioaktiv markierte Linker wird dann mit 1 ,ag von CIaI und Phosphatase behandelt und mit pHRi145-DNA (siehe oben) in 20μΙ Reaktionsvolumen verbunden, das 0,5mM rATP (Sigma), 1OmM DTT (Calbiochem), 2OmM tris.HCI (pH-Wert 7,8), 1 mM MgCI₂ und 800 Einheiten von T₄-DNA-Ligase (Biolabs) enthält. Die Inkubation wird über 2 Stunden bei 15°C durchgeführt. Die Ligase wird durch Inkubation für 10 min bei 85°C inaktiviert. Anschließend werden 2 Volumen Wasser zugesetzt, die Natriumchloridkonzentration wird auf 1OmM abgestimmt, und über 30min werden bei 37°C20 Einheiten von Kpnl (Biolabs) zugesetzt. Nach der Extraktion mit Phenol und Chloroform wird das Gemisch durch 0,9% niedrigschmelzendes Agarose-Gel (Biorad) in 4OmM tris.Azetat (pH-Wert 7,8), 1 mM EDTA und 0,5^g/ml Ethidiumbromid fraktioniert. Das Band, sichtbar durch UV-Strahlung, welches die gleiche Beweglichkeit wie eine Marker-DNA derselben Größe aufweist, wird mit einem Skalpell herausgeschnitten. Man erhält ein Volumen von etwa 20μ. I. Dieser Lösung werden 5μΙ entnommen und für 12 Stunden bei 15°C mit 400 Einheiten der T₄-Ligase (Biolabs) in 10μ.Ι des Reaktionsvolumens inkubiert, das auf 0,5mM ATP, 1OmM DTT, 1OmM MgCI₂,2OmM tris.HCI (pH-Wert 7,8) abgestimmt worden war. 1/10. Volumen einer Lösung mit 10OmM tris.HCI (pH-Wert 7,5), 10OmM CaCI₂ und 10OmM MgCI₂ werden dem Ligasegemisch (bei 15⁰C verfestigt) zugesetzt, und das Ganze wird 5 min bei 65°C inkubiert. Die Lösung wird dann zur Transformation von kalziumbehandelten E. coli HB101-Zellen in der oben beschriebenen Weise verwendet. Es erfolgt die Ausbringung auf McConkey-Agar-Platten, die mit 50Mg/ml Ampizillin ergänzt wurden. Die Plasmid-DNAvon 10 verschiedenen Kolonien werden auf die oben beschriebene Weise isoliert, und die DNA wird der folgenden Restriktionsenzymanalyse unterzogen: Jeweils 0,5/ng der Plasmid-DNA werden nacheinander mit Kpnl (Biolabs), Ncol (Biolabs) und EcoRI (Biolabs) nach den Anweisungen der Enzymhersteller gespalten. Die Spaltprodukte werden auf 1 % Agarose-Gel in 4OmM tris.Azetat (pH-Wert 7,8), 1 mM EDTA, 0,5/xg/ml Ethiodiumbromid fraktioniert. Alle Plasmide weisen wie gewünscht jeweils eine dieser Enzymspaltstellen auf. Eines erhält die Bezeichnung HRM48.

Das Plasmid HRi148 enthält einen Trytophan-Promoteroperator und eine ribosomale Bindungsstelle bis zu und einschließlich ATG. Hirudin und auch andere heterologe Gene können direkt durch die EcoRi-, Ncol-, Kpnl-Stellen, die einmal im Plasmid auftreten, gekoppelt werden. Außerdem ermöglicht es diese Konstruktion, heterologe Gene direkt zu koppeln und zum Ausdruck zu bringen, ohne daß ATG, für die Einleitung der Translation erforderlich, an dem entsprechenden Gen vorhanden sein muß. Das kann leicht durch Spalten mit Ncol und Bildung der vorstehenden Enden mit DNA-Polymerase I in der beschriebenen Weise oder durch Spalten mit Kpnl und Entfernen der vorstehenden Enden durch Nuklease S₁ erreicht werden. Das Plasmid HRi 148 ist also ein Expressionsplasmid mit breiter Anwendbarkeit

D. Herstellung des linearisierten Vektors pHRi^e/EcoRI/BamHI

5Mg der Plasmid-DNAvon pHRi148 werden mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI digeriert. Der exzissierte Vektor pHRi148/EcoRI/BamHI wird durch Dichtegradientenzentrifugieren isoliert.

b) Herstellung von FrDNA/EcoRI/EcoRII und F₂-DNA/BamHl/EcoRII I.) Herstellung von FrDNA/EcoRI/EcoRII

5Mg Plasmid-DNAvon pML300 werden zuerst mit 10 Einheiten EcoRI-Restriktionsendonuklease in 50 μ\ einer Lösung von lOOmMtris. HCl (pH-Wert 7,5), 5OmM NaCI und 100 ,ug/ml Gelatinefür die Dauer von einer Stunde bei 37 ⁰C digeriert. Ein Aliquot (0,5Mg) dieser linearisierten Plasmid-DNA/EcoRI wird durch Gel-Eluierung aus einem Agarose-Gel (siehe Beispiel 10a) isoliert und mit [γ~³²Ρ] ATP (siehe Beispiel 12) radioaktiv markiert. Die Hauptmenge der Plasmid-DNA/EcoRI wird dann mit dieser radioaktiv markierten DNA gemischt, mit EcoRII-Restriktionsendonuklease digeriert, und das EcoRII-EcoRl^x-DNA-Fragment (109 Basispaare) wird durch Gel-Elektrophorese auf 8% Polyakrylamid abgetrennt. 200/xg von FrDNA/EcoRIVEcoRII werden durch Gel-Eluierung isoliert

II) Herstellung von F_rDNA/BamH!/EcoRII

5Mg Plasmid-DNAvon pML305 werden mit 10 Einheiten BamHI-Restriktionsendohuklease gespalten. Ein Aliquot (0,5 Mg) dieser linearisierten Plasmid-DNA/BamHI wird durch Gel-Eluierung aus einem Agarose-Gel (siehe Beispiel 10a) isoliert und radioaktiv mit [γ~³²Ρ] (siehe Beispiel 12) markiert. Die Hauptmenge der Plasmid-DNA/BamHI wird dann mit dieser radioaktiv markierten DNA gemischt, mit EcoRII-Restriktionsendonuklease digeriert, und das EcoRII-BamHl^x-DNA-Fragment (122 Basispaare) wird durch Gel-Elektrophorese auf 8% Polyakrylamid abgetrennt. Es werden 250Mg von F₂-DNA/BamHl^x/EcoRII isoliert.

c) Ligation von F₁-DNA mit F₂-DNA und Konstruktion des Expressionsplasmids pML310

10ng (= 473nMol der Enden) von FrDNA/EcoRI/EcoRII und 9ng (= 495nMol der Enden) von FrDNA/BamHI/EcoRII werden in einem Volumen von 20μΙ mit T₄-DNA-Ligase auf die bereits im Beispiel 10c beschriebene Weise behandelt. Anschließend wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA wird mit Alkohol ausgefällt. Der DNA-Niederschlag wird dann wie im Beispiel 10c aufgelöst und mit EcoRI- und BamHI-Restriktiorisendonuklease digeriert. Anschließend wird die Lösung mit TNE standardisiert, und es werden 30 ng (= 5OnMoI der Enden) des Vektors DNA-pHRi148/EcoRI/BamHI (siehe Beispiel 13a D) zugegeben. Anschließend wird die Lösung wieder mit Phenol/Chloroform extrahiert, und die DNA wird mit Alkohol ausgefällt. Das ausgefällte DNA-Gemisch wird wie im Beispiel 10cmitT₄-DNA-Ligase (Biolabs) behandelt. Auf diese Weise wird in der Lösung ein Rekombinantplasmid erzeugt, das als Einfügung FrF₂-DNA (Desulphatohirudin-Gen) enthält.

d) Transformation von E. coli HB101 mit Plasmid pML310

Die Transformation von E. coli H B101 -Zellen, die mit Kalzium behandelt wurden, erfolgt auf die im Beispiel 10d beschriebene Art und Weise. 10μΙ des in Beispiel 13c gewonnenen Reaktionsgemische werden eingesetzt. Man erhält 420 ampizillinresistente Kolonien.

e) Aussiebender Kolonien, die FrF₂-DNA enthalten

Auf die im Beispiel 10e beschriebene Art und Weise werden 18 transformierte Kolonien (Beispiel 13d) auf ihren Gehaltan F₁-F₂-DNA untersucht. Als radioaktive Sonde wird ein Gemisch der in den Beispielen 5 und 6 beschriebenen Oligodeoxynukleotide verwendet. Im Autoradiogramm erhält man 12 positive Kolonien, von denen fünf die folgenden Bezeichnungen erhalten: pML310, pML311, pML312, pML313, pML314.

Beispiel 14: Charakterisierung von Klon pML310

Die Charakterisierung von Fi-F₂-DNA-Folge im Rekombinantplasmid pML310 erfolgt durch Sequenzbehandlung der F₁-F₂-DNA nach Maxam und Gilber (siehe oben) auf die im Beispiel 12 beschriebenen Art und Weise. Die Nukleotidfolge der F₁-F₂-DNA ist identisch mit der für das synthetische Desulphatohirudin-Gen.

Beispiel 15: Expression von Desulphatohirudin-HV1 in Hefe

Das chemisch synthetisierte Gen für Hirudin wird als EcoRI-BamHl-Einfügung zu 206 Basispaaren (bp) in Plasmid pML310 (siehe Beispiel 14) vermehrt. Das Gen wird aus dem Plasmid herausgeschnitten und in Hefe unter der Kontrolle des repressiblen PHO5-Promoters zur Expression gebracht. Die Konstruktion schließt die 541 bp-PHO5-Promoterfolge und die komplette PHO5-Signalfolge (51 Nukleotide, die für 17 Aminosäuren kodieren) ein, wie das in der europäischen Patentanmeldung Nr. 143081 beschrieben wird. Diese Folge wird im Rahmen mit der reifen Kodierungsfolge von Hirudin verschmolzen, die mit dem Kodoin für Valin als der NH₂-Endaminosäure des natürlichen reifen Hirudins beginnt. Das Hirudin-Gen wird an seinem 3'-Ende durch ein DNA-Fragment flankiert, welches die PHO5-Transkriptionsendsignale einbringt. Der Vektorteil des Expressionsplasmids enthält Hefe-2u-Folgen, das Hefe-LEU2-Gen für die Selektion in Hefe und das Ampizillinresistenzgen und den E. coli-Ursprung der Replikation für Selektion und Vermehrung in E. coli. Das Verfahren wird in den Abbildungen 5, 6 und 7 veranschaulicht. Abstimmung der Nukleotidfolge am 5'-Ende des Desulphatohirudin-Gens

Der Nukleotidfolgenkode für Desulphatohirudin beginnt bei GTT, was für das NH₂-Endvalin im Genendprodukt steht. Zur Subklonung und Expression in E. coli wurde die Kodierungsfolge am 5'-Ende durch acht Nukleotide erweitert, einschließlich einer EcoRI-Restriktionsstelle und eines ATG-Initiierungskodons. Für die exakte „Im Rahmen-Verschmelzung" der Hirudinkodierungsfolge mit der Folgekodierung für das PHO5-Signalpeptid müssen diese zusätzlichen Nukleotide entfernt werden. Das wird durch Umwandlung der EcoRI-Restriktionsstelle zu einer Stelle mit bündigem Ende und Anfügen eines synthetischen Oligonukleotids mit einer Hgal-Erkennungsstelle in einer Position erreicht, durch welche die nachfolgende Spaltung mit Hgal unmittelbar oberhalb des GTT-Kodons erfolgt.

Einführung einer Hgal-Restriktionsstelle vor dem Desulphatohirudin-Gen (siehe Abb. 5)

8(U.g von Plasmid pML310 (siehe Beispiel 13c) werden vollständige mit Restriktionsendonuklease EcoRI digeriert. Die DNA (plVILSIO/EcoRI) wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Überhängende 5'-Enden werden durch Nuklease S₁ entfernt. 4/xg von pMl-310/EcoRI-DNA werden in 100μΙ von 25OmM NaCI, 1 mM ZnSCU, 3OmM Natriumazetat, pH-Wert 4,6, und20U/ml Nuklease Si (Signa) 45min lang bei 37⁰C digeriert.

Die DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und durch Ethanol ausgefällt. Die DNA (pMLSIO/EcoRI/St) wird erneut in 10μΙ von 5OmM tris.HCI, pH-Wert 8,0, zur Suspension gebracht und mit 2 Einheiten von alkalischer Kalbsdarmphosphatase (CIAP, Boehringer^eine Stunde bei 37⁰C inkubiert. Das Enzym wird durch Behandlung bei 65°C über IV2 Stunden inaktiviert. Die NaCI-Konzentration im Inkubationsgemisch wird auf 15OmM abgestimmt. Die dephosphorylierte DNA (pMLSIO/EcoRI/S·,/ CIAP) wird durch Adsorption in eine DE52-Ionenaustauschkolonne (Whatman) in einem Puffer mit geringem Salzgehalt (15OmM NaCI, 1OmM tris.HCI, pH-Wert 8,0,1 mM EDTA) gereinigt und dann mit einer Pufferlösung mit hohem Salzgehalt (1,5M NaCI, 10 mM tris.HCI, pH-Wert 8,0,1 mM EDTA) eiuiert. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt und mit einer Konzentration von 0,8 mg/ml in H₂O wieder zur Suspension gebracht

Ein Oligonukleotid mit der Formel 5'-AGCGTCGACGCt-S' ...

wird nach derPhosphotriestermethode (Itakura u.a., J. Am. Chem. Soc. 103,706 [1981]) synthetisiert. Die Folge des Oligonukleotids ist selbstkomplemeritär und enthält die Erkennungsstelle -GACGC- für die Restriktionsendonuklease HGaI. Das Glühen der beiden einzelnen Stränge führt zu einem doppelsträngigen DNA-Linker von 12 Basispaaren.

1,2yu.g des synthetischen, einsträngigen Oligodeoxynukleotids werden in 10μΙ von 10μΙ von 6OmM tris.HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂, 5mM DTT, 30/LtCi [7"³²P]ATP (3000 Ci.mMol"¹, Amersham) und 6 Einheiten von T₄-Polynukleotidkinase (Boehringer) für die Dauer von 30min bei 37°Cphsophoryliert, gefolgt von einer 15minütigen Behandlung bei 37⁰C bei Vorhandensein von 0,5mM ATP. Das Gemisch wird dann weitere 10min bei 75⁰C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren, und kann sich dann auf Zimmertemperatur zum Glühen abkühlen.

0,6^(17OpMoI) der ³²P-markierten Linker-DNA werden mit 2,4/ig(1,75 pMol Enden) von pMLSIO/EcoRI/St/CIAP gemischt und in 20/xl von 6OmM tris.HCI,pH-Wert7,5,1OmM MgCI_2r5mM DTT,3,BmM ATP,800 Einheiten von T₄-DNA-Ligase (Biolabs) für 20h bei 15⁰C ligiert. Die Ligase wird durch eine Behandlung von 10 Minuten über 85°C inaktiviert, und der Überschuß an Linker-Molekülen wird durch Ausfällen der DNA bei Vorhandensein von 1OmM EDTA, pH-Wert 7,5,30OmM Natriumazetat, pH-Wert 6,0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt. Nach 30min bei Zimmertemperatur wird die DNA pelletiert, ίη45μΙ Ligationsgemisch (oben spezifiziert) wieder zur Suspension gebracht und 6 Stundenlang bei 15⁰C ligiert, und eine runde DNA zu bilden. Aliquote von 1 μΙ und 3μΙ des Ligationsgemischs werden 100μΙ kalziumbehandelten, tranformationskompetenten E. C0MHBIOI-Zellen zugesetzt (vorbereitet nach der Methode von D. Hanahan, J. Biol. Chem. 166,557 [1983]). Die Zellen bleiben 30 min auf Eis, werden dann 3 min bei 42°C inkubiert, 2min auf Eis gekühlt und wieder eine Stunde bei 37°Cin400/xl desSOC-Mediums inkubiert. Die Zellen werden jeweils in 100μΙ konzentriert und auf LB-Agar-Platten aufgebracht, die 50μg/ml Ampizillin enthalten.

In LB-Medium,das 100μg/ml Ampizillin enthält, werden einzeln 12 transformierte, amp^R-Kolonien gezogen. Plasmid-DNAwird nach der Methode von D.S. Holmes u.a. (Anal. Biochem. 114,193 [1981]) hergestellt. Das Vorhandensein des synthetischen Oligonukleotidlinkers wird durch DNA-Folgebildung unter Verwendung eines einsträngigen DNA-Fragmentes als Ausgangsmaterial nachgewiesen, das auf den Kodierungsstrang von Hirudin hybridisiert. Ein Klon, das die Linker-DNA in der richtigen Position vordem Hirudin-Gen enthält, wird als pML310L bezeichnet.

Beispiel 16: Fusion der PHO5-Signalfolge und des strukturellen Desulphatonirudin-Gens

a) Isolierung des 0,2kb-Desulphatohirudinfragmentes (Abb. 5)

12μg von Plasmid pML310L werden vollständig mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und PVUI digeriert. Nach der Extraktion der DNA mit Phenol/Chloroform und der Ethanolausfällung werden die beiden Restriktionsfragmente auf einem

1,2%igen Agarose-Gel in tris-Bprat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das mit Ethidiumbromid gefärbte 0,84-kb-Pvul-BamHI-Fragmentwird in einer Geischeibe isoliert. Die DNA wird in einem Dialysebad, das mit 3ml 0,2 χ TBE-Puffer gefüllt ist, elektroeluiert. Der geschlossene Beutel wird in TBE-Puffer (pH-Wert 8,3) (9OmM tris-Base, 9OmM Borsäure, 2,5 mM EDTA) eingetaucht. Nach 30min bei 100 mA wird die Polarität des Stromes für 45s umgekehrt, um die DNA von der Dialysemembran abzustoßen. Der Puffer, der die Gelscheibe im Dialysebeutel umschließt, wird aufgenommen, auf 15OmM NaCI abgestimmt und durch eine DE52-Ionenaustauschkolonne (Whatman) geführt. Die DNA wird in einem Puffer mit hohem Salzgehalt (1,5M NaCI, 1OmM tris.HCI, pH-Wert 8,0,1mM EDTA) eluiert, mit Ethanol ausgefällt und mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml wieder in H₂O aufgelöst.

Das O,84kb-Pvul-BamHI-Fragment von pML31 OL wird weiter mit der Restriktidnsendonuklease Hgal digeriert. Durch dieses Digerieren entsteht ein 198 bp-Hgal-BamHI-Fragment, das die komplette Kodierungsfolge für reifes Dusulphatohirudin enthält. Eine zusätzliche Alul-Digestion berührt das 198 bp-Hgal-BamHI-Fragment nicht, schaltet aber ein anderes Hgal-Fragment von ähnlicher Größe aus.

Das 0,2kb-Hgal-BamHI-Fragment wird von anderen Fragmenten auf einem 1,5%igen Agarose-Gei in TBE-Puffer getrennt und wird durch Elektroeluierung (wie oben beschrieben) isoliert. Die DNA wird durch DE52-Ionenaustauschchromatografie gereinigt und durch Ethanolausfällung. Die DNA wird mit einer Konzentration von 30μρ/ηιΙ (0,2ρΜοΙ/μΙ) in H₂O wieder zur Suspension gebracht.

b) Isolierung des PHOö-Promoterbereiches mit einem Teil der PH05-Signalfolge (Abb. 6)

In Plasmid P31/PHO5-TPA 18 (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 143081) sind PHO5-Promoter und PHO5-Signalfolge im Rahmen zu einem strukturellen Fremdgen (t-PA) verschmolzen. Ein 584 bp-BamHI-Ball-Fragment enthält das PHO5-Promoter und die gesamte PHO5-Signalfolge mit Ausnahme von acht Nukleotiden am 3'-Ende.

8jug von p31/PHO5-TPA18-DNA werden mit der Restriktionsendonukiease Ball (16 Stunden bei 37⁰C) digeriert. Die DNA wird durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolausfällung gereinigt.

Die DNA wird mit einer Konzentration von 0,7 mg/ml in H₂O wieder zur Suspension gebracht.

Die korrekte Verbindung zwischen der PHO5-Signalfolge und dem Kodierungsbereich für Desulphatohirudin wird gewährleistet durch einen synthetischen Linker mit der Formel

(1) 5'-CCAATGCA-S'

(2) S'-GGTTACGTCAACA-ö'

Acht Nukleotide am 5'-Ende des Linkers (5'-CCAATGCA) stellen einen Teil der PHO5-Signalfolge von der Ball-Steile zur Verarbeitungsstelle dar. Die 5'-überhängenden fünf Nukleotide von Oligonukleotid (2) passen in die Hgal-Trennstelle am 5'-Ende der Desulphatohirudinkodierungsfolge.

Die einzelnen, einsträngigen Oligonukleotide (1) und (2) werden durch die Phosphotriestermethode (Itakura u.a., oben) synthetisiert. 1,1 μg bzw. 1,8^g der Oligonukleotide (1) bzw. (2) werden einzeln an ihren 5'-Enden phosphoryliert, in äquimolaren Mengen gemischt und wie im Beispiel 15 geglüht.

1,3/u.g (20OpMoI) der phosphorylierten,doppeisträngigen Linker-DNA werden mit 7^g (1,8pMol) Ball-gespaltenem p31/PHO5-TPA18 in 40μΙ von 6OmM trix.HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂, 3,5mM ATP, 5mM DTT und 1400 Einheiten T₄-DNA-Ligase (Biolabs) bei 15⁰C16 Stunden ligiert. Die Ligase wird 10 min bei 85°C inaktiviert. Der Überschuß an Linkern wird durch Ausfällung der DNA bei Vorhandensein von 1OmM EDTA, 30OmM Natriumazetat, pH-Wert 6,0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt. Die DNA wird wieder zur Suspension gebracht und weiter mit Restriktionsendonuklease BamHI digeriert. Nach der Extraktion der DNA durch Phenol/Chloroform und Ethanolausfällung werden die beiden Restriktionsfragmente auf einem 1,2%igen Agarose-Gel in tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 0,6 kb-Fragment wird vom Gel isoliert. Die DNA wird elektroeluiert und weiter durch DE52-Ionenaustauschchromatografieund Ethanolausfällung gereinigt. DasO,6kb-BamHI-HGal-DNA-Fragment wird mit einer Konzentration von 40μg/ml in H₂O wieder zur Suspension gebracht.

c) Isolierung eines pJDB207-Hefevektorfragmentes (Abb. 6)

9/ng vom Plasmid pJDB207R/PHO5-TRA (12-2)-DNA (siehe EP-Patentanmeldung Nr. 143081) werden mit der Restriktionsendonuklease BamHI digiert. Nach dem vollständigen Digerieren wird die DNA durch Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wird mit einer Konzentration von 0,1 mol/ml wieder 5OmM tris. HCL, pH-Wert 8,0, zur Suspension gebracht und mit 7 Einheiten alkalischer Kalbsdarmphosphatase für eine Stunde bei 37⁰C digeriert. Die Phosphatase wird durch eine Behandlung bei 65⁰C für die Dauer von 1Va Stunden inaktiviert, und die DNA wird durch DE 52-lonenaustauschchromatografie (siehe Beispiel 15) und Ethanolausfällung gereinigt. Das6,8kb-große BamHI-Fragment wird auf einem 1,2%igen Agarose-Gel in tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, abgetrennt. Die DNA wird durch DE52-lonenaustauschchromatografie und Ethanolausfällung gereinigt. Die DNA wird in H₂O mit einer Konzentration von 0,4mg/ml (0,1 pMol/μΙ) aufgelöst.

d) Ligation des PH05-Promoterfragmentes und des strukturellen Desulphatohirudin-Gens mit dem pJDB207-Hefevektorfragment (Abb. 6)

Der pJDB207-Hefevektor, das PHO5-Promoterfragment mit der PHO5-Signalfolge und das strukturelle Desulphatohirudin-Gen werden alle als DNA-Fragmente isoliert (siehe Beispiel 16a bisc), die zur Bildung eines Expressionsplasmids ligiert werden.

0,3pMoldesO,6kb-BamHI-Hgal-Fragementesvon p31/PHO5-TPA18 und 0,3pMol des O,2kb-Hgal-BamHI-Fragmentes von pML310L werden mit 0,1 pMol eines 6,8kb-BamHI-Fragmentes von pJDB207R/PH05-TPA (12-2) in 10μΙ von 60tris. HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂, BmM DTT, 1 mM ATP und 400 Einheiten von T₄-DNA-Ligase für 20 Stunden bei 15°C ligiert.

Ein Vl-Aliquot des Ligationsgemischs wird μ,Ι von transformationskompetenten E.coli HB 101-Zellen zugesetzt, die nach Hanahan (oben) vorbereitet wurden. Aus dieser Publikation wird auch das Transformationsprotokoll entnommen. Die Zellen werden auf LB-Agar-Platten aufgebracht, die 50iig/ml Ampizillin enthalten.

In LB-Medium mit 100^g/ml Ampizillin v/erden einzeln 24amp^R-Kolonien gezogen. Die Plasmid-DNA wird auf Größe und Orientierung der Einfügung durch Abspaltung mit der Restriktionsendonuklease Pst! analysiert. Ein einzelnes Klon mit der korrekten Orientierung der Einfügung wird als pJDB207/PHO5-HIR bezeichnet.

Beispiel 17:

Transformation des Saccharomyces cervisiae-Stammes DFR18

Plasmid pJDB207/PH05-HIR wird in den Stamm Saccharomyces cerevisiae GFR 18 (a, his3-11, his3-15, leu2-3, leu2-112, can^R) unter Anwendung des von Hinnen u.a. (oben) beschriebenen Transformationsprotokolls eingeführt. 5/xg der Plasmid-DNA

werden 100/xl einer Sphäroplastsuspension zugeführt, und das Gemisch wird mit Polyethylenglykol behandelt. Die Sphäroplast werden mit 10ml Regenerations-Agar behandelt und auf Hefeminimalmediumplatten ohne Leuzin aufgebracht.

Eine einzelne transformierte Hefekolonie wird herausgegriffen und in Hefeminimalmedium ohne Leuzin gezüchtet. Die Kolonie wird bezeichnet als Saccharomyces cerevisiae GFR 18/pJBD207/PHO5-HIR.

Beispiel 18:

Züchtung von S. cerevisiae GFR18/pJDB207/PH05-HIR

Zellen von S. cerevisiae GFR 18/pJ DB 207/PH 05-HIR werden in 20 ml Hefeminimalmedium (Difco-Hefestickstoffbasisohne Aminosäuren unter Zusatz von 2% Glukose und 20 mg/l L-Histidin) bei 30°C gerührt und auf eine Zelldichte von 3 x 10⁷ Zellen je Milliliter gezogen. Die Zellen werden in 0,9% NaCI gewaschen und dann zum Inokkultieren von 50 ml-Kulturen in Minimalmedium mit geringem P_rGehalt verwendet. Das Minimalmedium mit geringem PrGehalt wird entsprechend der Zusammensetzung des Difco-Hefestickstoffbasismediums (ohne Aminosäuren) hergestellt, enthält aber 0,03g/l KH₂PO₄,1 g/l KCI und 10g/I L-Asparagin anstelle von (NH^SO₄, 2% Glukose und 1g/l L-Histidin. Die Kulturen werden bis zu einer Zelldichte von 4 χ 10⁶ Zellen/ml inokkultiert und bei 30⁰C bis zu 42 Stunden bei 200U/min gerührt.

Beispiel 19: Isolierung der Desulphatohirudinverbindungen von S. cerevisiae GFR 18/pJDB207/PH05-HIR

a) Isolierung der Desulfatohirudinverbindungen aus dem Kulturmedium

A. Anreicherung des Hirudinverbindungen auf eine RP-C18-Kolonne

Nach einer Fermentierungszeit von 18h, 26h bzw. 42 h wurden zehn Proben zu jeweils 10ml dem Kulturmedium entnommen und durch Entsalzen und Konzentration auf einer Bond Elut-C-18-Kolonne(1 ml,Analytichem International) auf Proteine angereichert. Wenn die Proben auf die Kolonne gebracht worden sind und die Flüssigkeit in vacuo entfernt wurde, wird die Kolonne zweimal mit 1,5ml Wasser-Azetonitril (9:1)-0,1%igerTrifluoressigsäure (9:1) gewaschen. Hirudinverbindungen werden aus der Kolonne mitWasser-Azetonitril-0,1%igerTrifluoroessigsäure (6:4) eluiert. 2ml Eluat werden mit einem Speed Vac-Konzentrationsgerät (Savant) auf ein Endvolumen von 400μ,Ι konzentriert. Die Hirudinverbindungen werden durch HPLC-Analyse, durch Vergleich mit authentischem Desulphatohirudin und durch die Thrombininhibitionsuntersuchung indentifiziert. In den Proben sind etwa 0,2 bis 2/xg/ml Hirudinverbindungen enthalten.

B. lonenaustauschchromatografie auf eine DEAE-Zellulose-Kolonne

11 des Kulturmediums wird nach einer Fermentierungszeit von 42 h geerntet und zentrifugiert. Die obenaufschwimmende Schicht wird einer Anionenaustauschkolonne mit DE53-Zellulose (Whatman) bei einem pH-Wert von 7,5 zugeführt. (Bedingungen: Kolonne 2,5 x 15,5cm (76ml); Eluierungspuffer A: 2OmM Ammoniumazetat, 10OmM NaCI, pH-Wert 7,5; EluierungspufferB: 2OmM Ammoniumazetat, 4M NaCI, pH-Wert 5,0; Fluß: 66ml/h) Die Kolonne wird mit 228ml PufferA gewaschen und dann mit einem linearen Salzgradienten von jeweils 228 ml von Puffer A und Puffer B eluiert. Es werden Fraktionen zu 22ml genommen. Hirudinverbindungen werden in Fraktionen 71 und 74 (88ml) eluiert und durch die Thrombininhibitionsuntersuchung identifiziert. Die aktiven Fraktionen werden über Nacht bei 4⁰C anhand von 2OmM Ammoniumazetat dialysiert. Anschließend werden die Aliquote zweimal lyophilisiert. Die Lypohilisate enthalten Desulphatohirudinverbindungen, wie durch Umkehrphasen-HPLC nachgewiesen wurde.

C. Gelfilterung auf Sephadex G-50 und abschließende Reinigung durch HPLC

Die Hauptfraktion (80 ml Eluat), die im Thrombininhibitidnstest aktiv ist, wird über Nacht bei 4°C anhand von 2OmM Ammoniumzetat, pH-Wert 7,5, dialysiert und dann unter Verwendung eines Drehverdampfers bei 35°C auf ein Endvolumen von 5 ml konzentriert. . j

Die resultierende klare, wäßrige Lösung wird einer Sephadex G-50-Feinkolonne (Pharmacia) mit einem Bettvolumen von 160 ml |

zugeführt, wobei die Kolonne (2,5 χ 64cm, Biorad) vorher mit 5% Essigsäure geeicht wurde. Die in 50 ml Eluat enthaltene j

Hauptaktivität (Fraktionen 5-7, Fluß 50ml/h, 25min/Fraktion) wird unter Verwendung eines Drehverdampfers konzentriert und j

dann einer Umkehrphasen-HPLC-Trennung unterzogen. Ein Aliquot (500μ,Ι) der einzelnen Fraktionen wird 1:10 unter Verwendung eines „Speed Vac"-Konzentrationsgerätes (Savant) konzentriert und mittels der Umkehrphasen-HPLC-Analyse auf den Gehaltan Desulphatohirudinverbindungen untersucht. Die Lösungen enthalten Desulphatohirudinverbindungen. Fraktion 6 (18ml) enthält den geringsten Anteil an Sekundärkomponenten und wird nach dersemipräparativen Umkehrphasen-HPLC weiter gereinigt.

Experimentelle Bedingungen: Kolonne Vydac 218 TP 510 RP.HPLC, 10 x 250mm; Aliquotanteile der Fraktion 6(200μΙ j

konzentriert 1:10) je Trennung; AUFS 0,5 bei 200nm; Fiießgeschwindigkeit: 2ml/min. Eluierungsmittel: A: 0,1 % j

Trifluoressigsäure, B: Azetonitril/Wasser8:2 + 0,07%Trifluoroessigsäure, 1 min 16% B, dann im Verlauf von 40min Erhöhung ' j auf 64% B. Die resultierenden Fraktionen werden 1:1 mit Wasser verdünnt und lyophilisiert. Der Rückstand besteht aus reinen I

Desulphatohirudinverbindungen. I

b) Isolierung von Desulphatohirudinverbindungen aus dem Zellextrakt von S. cerevisiae GFR18/pJDB207/POH5-HIR j Die Zellen werden wie üblich aufgelöst (siehe EP-Patentanmeldung Nr. 100561). Die obenaufschwimmende Schicht, die mit 2% Essigsäure behandelt wurde, wird zentrifugiert (10⁰C, 12000 U/min). Ammoniak wird bis zu einem abschließenden pH-Wert von 7,5 zugesetzt, und die leicht undurchsichtige Lösung (50ml) wird wie oben weiter behandelt (siehe Beispiel 19a). . Hirudinverbindungen werden wie oben identifiziert, d. h., mit der Thrombin in hibitionsuntersuchung und mittels Umkehrphasen-HPLC.

Beispiel 20:

Analyse des Produktgemischs von der Fermentierung von S. cerevisiae GFR 18/pJDB207/PH 05-HIR

a) Ein Aliquot von 2 ml der obenaufschwimmenden Schicht, die wie oben hergestellt wurde (siehe Beispiel 19 b) wird im Hochvakuum auf einem Konzentriergerät „Speed Vac" getrocknet. Die Proben werden einzeln in 100μΙ Wasser aufgelöst und der HPLC-Analyse unterzogen (experimentelle Bedingungen Nr. 1, siehe unten). Es wird die Thrombininhibiton der einzelnen Fraktionen getestet. Die Fraktionen mit einer Verweilzeit von 16,5 min und 17,7 min weisen Thrombininhibition auf. Das Verhältnis (Expressionsertrag) dieser beiden Fragmente beträgt etwa 4:1. Nach der Aminosäurezusammensetzung sind diese Fraktionen Desulphatohirudine.

b) Die im Thrombininhibitionstest aktiven Fraktionen, die wie im Beispiel 19a gewonnen wurden, werden den HPLC-Analyse

— Experimentelle Bedingungen Nr.1: Nucleosil (MN) C18,5 um-RP-HPLC-Kolonne, 4,6 χ 120mm: 50μ\ Hirudinverbindungen je Trennung, 6 bei 214nm; Fließgeschwindigkeit 1,2 ml/min; Eluierungsmittel: A: 0,1%Trifluoroessigsäure, B: Azetonitril/ Wasser, 8:2, mit 0,08% Trifluoroessigsäure, 2 min 16% B, dann im Verlauf von 50 min auf 64% B. Gegendruck 66 Bar.

— Experimentelle Bedingungen Nr. 2: wie oben, ausgenommen: Gradient 2 min 20%, dann im Verlauf von 40 min Erhöhung auf 80% B.

Fraktionen werden in Intervallen von 1 min (insgesamt 45) genommen und derThrombininhibitionsprüfung unterzogen. Die Fraktionen 17-19 erweisen sich ais aktiv. Außerdem werden dieAminosäurezüsammensetzung, der N-Terminusund die N-Endfolgefürdie'aktiven Hirudinverbindungen der Fraktionen 17 und 18 bestimmt. Eine Fraktion (Nr. 17) wird außerdem mit authentischem Desulphatohirudin verglichen, das durch Reaktion natürlichen Hirudins von Blutegeln mit der Enzymarylsulfatase gewonnen wird. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt:

Tabelle 1:

Fraktion	Verweilzeit (min)	Verweilzeit (min)	Thrombininhi-
	Bedingungen Nr. 1	Bedingungen Nr. 2	bition (%)
Fr. 17	16,5	13,7	96
Fr. 18	18,7	14,7	86
Fr. 19	18,7	—	78
Authent.
Desulph.-
hirudin	16,5	13,6	86

Das Ertragsverhältnis der Fraktionen 17 und 18 beträgt wieder etwa 4:1.

c) 200ml-Aliqote der obenaufschwimmenden Schicht, die wie oben hergestellt wurden (siehe Beispiel 19a) werden der HPLC-Analyse (Bedingungen Nr. 3, siehe unten) und der FPLC-Trennung (Bedingungen Nr.4) unterzogen. Es wird die Thrombininhibition der einzelnen Fraktionen geprüft. Die Fraktionen mit einer Verweilzeit von 8,0 min (Spitze 1), 11,1 min (Spitze 2) und 12,1 (Spitze 3).haben eine starke Thrombininhibition. Das Verhältnis (Expressionsertrag) dieser drei Verbindungen beträgt etwa 1:4:1. Nach der HPLC-Analyse sind die Verbindungen, die den Spitzen 2 und 3 entsprechen, mit den im Beispiel 20b beschriebenen Hirudinverbindungen identisch (Fraktionen 17 und 18). Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2:

Frak	Verweilzeit	Verweilzeit	Verweilzeit	c NaCI
tion	(min) Be- „	(min) Be	(min) Be	Bedingungen Nr. 4
	dingungen Nr. 1	dingungen Nr. 2	dingungen Nr.3
Sp. 1	14,0	11;6	8,0	365 mM
Sp. 2	16,5	13,7	11,1	34OmM
Fr. 17
Sp. 3	17,7	14,7	12,1	36OmM
Fr. 18

— Experimentelle Bedingungen Nr.3: Vydac 218 TP-B5 RP-HPLC-Kolonne, 4,0 χ 120mm, 15μg Hirudinverbindurig je Trennung, 7 bei 214nm, Fließgeschwindigkeit 1,2ml/min; Eluierungsmittel A: 0,1% Trifluoroessigsäure, B: Azetonitril mit 0,08% Trifluoroessigsäure, 2 min 16% B, dann im Verlauf von 20 min Steigerung auf 40% B; Gegendruck 80 Bar.

— Experimentelle Bedingungen Nr.4: Pharmacia Mono-Q-FPLC-Anionenaustauscherkolonne, 5,0 χ 50mm, 15/xg Hirudinverbindung je Trennung, AUFS 0,01 bei 280 nm„FIießgeschwindigkeit 1,0 ml/min; Gradienteluierungspuffer A: 2OmMtHs. HCI, pH-Wert 7,5, Puffer B: Puffer A und 1m NaCI, pH-Wert 7,5,9min 15% B, dann im Verlauf von 21 min Steigerung auf 70% B.

Beispiel 21: Charakterisierung von Desulphatohirudinverbindung aus der Fermentierung des Stammes S. cerevisiae GFR 18/pJDB 207/

PHO5-HIR

Nach der HPLC-Analyse sind die Hirudinverbindungen der Fraktionen 17 (oder Spitze 1) und 18 (oder Spitze 2), die aus dem Medium isoliert werden (siehe Beispiel 20, Tabellen 1 und 2), mit den entsprechenden Verbindungen identisch, die aus den Zellextrakten (intrazellulare Hirudinverbindungen) isoliert werden. Diese Verbindungen sowie die Verbindung von Spitze 3 (siehe Tabelle 2) sind folgendermaßen charakterisiert: a. Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung

Etwa 2,5μg der reinen Hirudinverbindung werden 24 h mit 6 N HCI bei 110⁰C hydrolysiert und dann analysiert, wie das von Chang u.a. (DABS-C 1-Methode; Methods in Enzymology [Methoden in der Enzymologie] 91,41 [1983]) beschrieben wird. Das Hydrolysat hat folgende Zusammensetzung:

Spitze 1 (siehe Tabelle 2)

Aminosäure

Hydrolysat

Aminosäure

Hydrolysat

Zystin

9,2 (9) 4,1 (4)

4.0 (4) 12,4(12)

3.1 (3) 9,0(9)

3,4(4) 2,5(3)

Spitze 2 (Fraktion 17, siehe Tabellen 1 und 2)

Aminosäure

Hydrolysat

Total·

Aminosäure

2,1 (2) 3,3 (3) 1,9(2) 1,2(1) 1,0(1) 3,1 (3) 0 (0) (63)

Hydrolysat

Zystin

9,9(9)

4.0 (4) 3,9(4)

12,8(13)

3.1 (3) 9,1 (9) 3,7(4) 2,8(3)

Spitze 3 (Fraktion 18, siehe Tabellen 1 und 2)

Aminosäure

Hydrolysat

Total

Aminosäure

2,1 (2) 4,4 (4) 1,2(2) 1,2(1) 1,2(1) 2,9(3) 0 (0) (65)

Hydrolysat

Zystin

10,0(9) 3,9 4,1 (4) ,

12,5(127 3,3(3) 8,7 (9) 3,1 (4) 2,4(3)

Total

1,9(2)

3,3(4)

1,8(2)

1,1(1)

1,0(1)

2,8(3)

0(0)

(64)

b) Partielle Sequenzanalyse 18μς (2,5(TiMoI) der reinen Hirudinverbindung werden einer herkömmlichen Sequenzanalyse nach Edman unterzogen, und die N-Terminalphenylthiohydantoinaminsäuren ([PTH]-Aminosäuren) werden durch RP-HPLC bestimmt.

Ergebnisse Spitze 2 (Fraktion 17, siehe Tabellen 1 und 2)

Zyklus 15

Aminosäure VaI VaI Tar Thr Asp n. d. Thr GIu Ser GIy

Zyklus 11 15

Aminosäure GIn Asn Leu n. d. GIu GIy Ser

Zyklus 20 25

Aminosäure Asn VaI n.d. GIy n.d. GIy Asn Lysn.d.

Zyklus 29 35

Aminosäure He Leu GIy Ser Asp GIy GIu Lys Asn

Zyklus 38 40

Aminosäure n.d. n.d. VaI Thr GIy GIu GIy Thr Pro Lys ι

Zyklus 48 50

Aminosäure Pro n.d. Ser n.d.

(n.d. = nicht bestimmt)

Spitzel (sieheTabelle2)

Sequenz von Zyklus 1 bis Zyklus 29 wie oben.

Spitze 3 (Fraktion 18, siehe Tabellen 1 und 2)

Sequenz von Zyklus 1 bis Zyklus 27 wie oben.

Die N-Terminalsequenzen der untersuchten biosynthetischen Hirudinverbindungen sind mit denen von authentischen Hirudin identisch.

C. C-Terminalanalyse:

Die Hirudinverbindungen werden mit Karboxypeptidase Y und den freigesetzten Aminosäuren, die in der Aminosäurenanalyse bestimmt wurden, digeriert (siehe J.-Y. Chang, R. Knedel, D.G.Braun, Biochem. J. 199,547).

Ergebnisse

Spitzel (sieheTabelle2) C-Terminal-Aminosäuren: -Glu-Tyr

Spitze 2 (Fraktion 17, siehe Tabelle 1 und 2)

C-Terminal-Aminosäuren: -Glu-Tyr-Leu-Gln Spitze 3 (Fraktion 18, siehe Tabellen 1 und 2) C-Terminal-Aminosäuren: -Glu-Tyr-Leu

d) Scheinbares Molekulargewicht

Die Desulphatohirudinverbindungen (30^g) werden auf einem SDS-Harnstoffgel (SUDS-GeI; siehe Kyte u.a., Anal. Biochem. 133,515 [1983]) analysiert. Vor der Färbung mit Coomassie-Blau erfolgt mit 12%Trifluoroessigsäure eine Fixierung. Beobachtet wird ein einzelnes Band mit einem scheinbaren Molekulargewicht zwischen 6000 und 7000 Dalton.

e) Molekulargewichtsbestimmung durch FAB-MS:

Die Desulphatohirudinverbindungen werden einen positiven lonenmassenspektrometrie mit schnellem Atombombardement (FAB-MS) unterzogen. Instrument: ZAB-HF-Massenspektrometer von VG-Analytical, LTd., Manchester; Matrix: Thioglyzerol; Xenon-Bombardement; Ionenenergie 10keV; externe Eichung: Cs₂₆J25 (Molekulargewicht 6887,9) und CS28J27 (7147,76).

Ergebnisse Spitze 1 (siehe Tabelle 2)

Empirische Formel: C276H42iN77O₁₀₇S₆ Molekulargewicht (errechnet) 6722,23 Molekulargewicht (ermittelt) 6719,3

Spitze 2 (Fraktion 17, siehe Tabellen 1 und 2)

Empirische Formel: C287H440N80O110S6 Molekulargewicht (errechnet) 6963,518 Molekulargewicht (ermittelt) 6963,44

Das Molekulargewicht wird als Mittelwert von zwei Messungen bestimmt.

Spitze 3 (Fraktion 18, siehe Tabelle 1 und 2)

Empirische Formel: C282H432N78O108S6 Molekulargewicht (errechnet) 6835,39 Molekulargewicht (ermittelt) 6832,9

Auf der Grundlage der vorgelegten Daten ist die Verbindung von Spitzel Desulphatohirudin (1-63), die Verbindung von Spitze 2 identisch mit authentischem Desulphatohirudin und die Verbindung von Spitze 3 neuartiges Desulphatohirudin (1-64).

f) Menschliche Thrombin-Hirudin-Dissoziationskonstanten

Die Dissoziationskonstanten K₀ der menschlichen Thrombin-Desulphatohirudinkomplexe werden nach der Methode von S. R. Stone und J.Hofsteenge (Biochemistry, 25,4622-4628 [1986]) bestimmt und sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt worden. Die Tabelle enthält auch die spezifischen Aktivitäten (ausgedrückt in ATU/mg) der drei gewonnenen Desulphatohirudinspezies.

K₀[M]

Hefe-Desulphatohirudin (1-65)2,9 χ 10"¹³ Hefe-Desulphatohirudin (1-64)3,9 χ ΙΟ"¹³ Hefe-Desulphatohirudin (1-63) 3,0 x 10~¹²

Spezifische Aktivität [ATU/mg] 11000 9600 8900

g) Weitere Desulphatohirudinverbindungen, die von transformierter Hefe gewonnen wurden Das Gemisch aus Desulphatohirudinverbindungen, das wie im Beispiel 19 beschrieben fermentiert und gereinigt wurde, wird

weiter getrennt und im Detail charakterisiert.

Die semipräparative Trennung auf der RP-HPLC-Kolonne Vydac 218 TP510 ergibt neben den oben beschriebenen Desulphatohirudinverbindungen (siehe Beispiel 21 e) desulphatohirudinähnliche Verbindungen, die bei einer Verweilzeit von

8,1 min aus der Kolonne eluiert werden. .

Dieses Material wird durch Massenspektrometrie mit schnellem Atom-Bombardement (FAB-MS) und Aminosäurenanalyse, partielle Sequenzbehandlung und C-Terminalanalyse charakterisiert.

FAB-MS zeigt, daß das Material ein Gemisch aus zwei Komponenten mit einem Molekulargewicht von 6492,5 bzw. 6556,8 ist.

Die Aminosäuren haben folgende Zusammensetzung:

Aminosäure	Hydrolysat	Aminosäure	Hydrolysat
ASX	8,9(9)	Me	2,1(2)
Th r	3,7(4)	Leu	3,6 (3)
Ser	4,1(4) r	Tyr	0,9(1)
GIx	10,7(11)	Phe	1,1(1)
Pro	3,2(3) SV :	" - His ·;:	1,2(1)
GIy	9,7(9)	Lys	3,2 (3)
VaI	3,3(4)	Met	0 (0)
Zystin	3,3(3)	Total	(61)

Partielle Sequenzanalyse (N-Terminals) Zyklus 12 3

Aminosäure VaI VaI Tyr C-Terminalanalyse (siehe Beispiel 21c)

59 60 61 62

C-Terminal-Aminosäuren -lle-Pro-Glu-(Glu) Ausgehend von diesen Daten, besteht das Gemisch aus Desulphatohirudin (1-61) und Desulphatohirudin (1-62).

Beispiel 22: Expression von Desulphatohirudinverbindungen in Hefe, die ein Desulphatohirudin-Gen ohne Signalfolge aufnimmt (Abb. 7)

a) Isolierung des pJDB 207-Vektorfragmentes

6ag des Plasmids pJDB207 R/lF (μ.-3) (EP 100561) werden vollständig mit der Restriktionsendonuklease BamHI digeriert. Die resultierenden DNA-Fragmente (6,85 kb und 1,15kb) weren mit Ethanol ausgefällt und ίη400μ,Ι 5OmM tris. HCI, pH-Wert 8,0, aufgenommen. Es werden 4,5 Einheiten von Kalbsdarmphosphatase (Boehringer, Mannheim) zugesetzt. Das Gemisch wird für 1 h bei 37⁰C inkubiert, dann wird die Phosphatase bei 65°C über die Dauer von 1,5 Stunden inaktiviert. Die Lösung wird auf 15OmM NaCI abgestimmt, und sie wird dann einen DE 51-Anionenaustauschkolonne (Whatman) (100μΙ Volumen) zugeführt, die vorher mit 1OmM tris. HCI, pH-Wert 7,5,15OmM NaCI, 1 mM EDTA geeicht wurde. Nach einem Waschvorgang mit dem gleichen Puffer wird die DNA mit 400μΙ von 1,5 M NaCI, 1OmM tris. HCI, pH-Wert 7,5,1 mM EDTA eluieit und mit Ethanol ausgefällt. Das große 6,85 kb-BamHI-Fragment wird vom kleinen Fragment auf einem 1,2%Agarose-Gel in tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt.

b) Isolierung des 534bp-PHO5-Promoterfragmentes

6jU.g des Plasmids p31 /R (EP 100561) werden mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI digeriert. Die resultierenden 3 DNA-Fragmente werden auf einem 1,2% Agarose-Gel in tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 534bp-BamHI-EcoRI-Fragmentwird isoliert. Es enthält das PH05-Promoter einschließlich der Transkriptionsanfangsstellen.

c) Isolierung eines 206bp-DNA-Fragmentes mit der Folgekodierung für Desulphatohirudin

9μg des Plasmids pML310 (siehe Beispiel 13c) werden vollständig mit den Restriktipnsenzymen BamHI und EcoRI digeriert. Die beiden resultierenden DNA-Fragmente werden auf einem 1,2% Agarose-Gel in tris-Borat-EDTA-Puffer getrennt, pH-Wert des Puffers 8,3. Es wird das 206bp-EcoRI-BamHI-Fragment isoliert.

c) Ligation der DNA-Fragmente

Die in den Abschnitten a-c (siehe oben) genannten drei DNA-Fragmente werden durch Elektroeluierung aus Agarose-Gel-Blöcken gewonnen, über DE52-Anionenaustauschern (Whatman) gereinigt, mit Ethanol ausgefällt und in H₂O wieder zur Suspension gebracht.

0,1 pMol (0,45/ng) des 6,85kb-BamHI-Vektorfragmentes, 0,3pMol (0,1/u.g) des 534bp-BamHI-EcoRI-PH05-Promoterfragmentes und 0,25pMol (34ng) des 206 bp-EcoRI-BamHI-Fragmentes von pML310 werden in 15μ\ von 60 mM tris. HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,1OmM DTT, 1 mM ATP mit 600 Einheiten von T₄-DNA-Ligase (Biolabs) bei 15⁰CfUr 16 Stunden ligiert.

24 transformierte amp" Kolonien werden getrennt mit 100/xg/ml Ampizillin in LB-Medium gezüchtet. Plasmid-DNA wird nach der Methode von Holmes u.a. (siehe oben) isoliert und durch eine Hindlll-EcoRI-Doppeldigestion analysiert. Das Auftreten von einem großen EcoRI-Hindlll-Fragmentzu etwa 600bp zeigt, daß sich in dem gewünschten Klon dasPHO5-Promoter-Hirudin-DNA-Fragment in der richtigen Orientierung zu den Transkriptionsendsignalen auf dem Vektor befindet. Wie erwartet, haben etwa 50% der Klone die korrekte Orientierung der Einfügung. Eines dieser Klone wird als hJDB207R/PHO5-HIR bezeichnet.

e) Transformation von Saccharomyces cerevisiae GFR18

Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm GFR18(a, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, can^R) wird mt dem Plasmid pJDB 207 R/ PHÖ5-HIR nachdem Protokoll von Hinnen u.a. (siehe oben) transformiert: Die Selektion der transformierten Hefezellen erfolgt auf Agar-Platten mit Hefe-Minimalmedium ohne Leuzin. Es wird eine transformierte Hefekolonie isoliert und als Saccharomyces cerevisiae GFR 18/pJDB207R/PHO5-HIR bezeichnet.

f) Kultivierung von S. cerevisiae GFR18/pJDB207R/PHO5-HIR

Zellen von S. cerevisiae GFR18/pJDB207R/PHO5-HIR werden in 20ml Hefe-Minimalmedium (Difco-Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren mit dem Zusatz von 24 Glukose und 20mg/l L-Histidin) bei 30⁰C gerührt und auf eine Zelldichte von 3 χ 10⁷ Zellen/ml gezüchtet. Die Zellen werden in 0,9%igem NaCI gewaschen und dann zum inokkulieren von 5OmI-KuItUren in Minimalmedium mit geringem P_rGehalt verwendet. Minimalmedium mit geringem Ρ,-Gehaltwird nach der Zusammensetzung des Difco-Hefestickstoffbasismediums (ohne Aminosäuren) hergestellt, enthält aber 0,03g/l KH₂PO₄,1 g/l KCI und 10g/l L-Aspargin anstelle von (NH₄J₂SO₄,24 Glukose und 1 g/l L-Histidin. Die Kulturen werden bis zu einer Zelldichte von 4 χ 10⁶ Zellen/l inokkuliert und bei 3O⁰C 42 Stunden mit 200U/min gerührt.

g) Analyse des Produktgemischs aus der Fermentierung von S. cerevisiae GFR 18/pJDB207 R/PHO5-HIR

Die Zellen (siehe Beispiel 22f) werden wir üblich zersetzt (siehe beispielsweise EP-Patentanmeldung Nr. 100561). Die mit 1,5% Essigsäure behandelte obenaufschwimmende Schicht wird zentrifugiert und jeweils 2 ml der klaren Lösung werden auf einem Konzentrationsgerät „Speed Vac" und im Hochvakuum getrocknet. Die Proben werden einzeln in 100μ.Ι Wasser aufgelöst und der HPLC-Analyse (Bedingungen wie im Beispiel 20) unterzogen. Es wird die Thrombininhibition der einzelnen Fraktionen getestet. Die Fraktion mit einer Verweilzeit von 16,5min hatThrombininhibitionsaktivität. Nach der Aminosäurenzusammensetzung ist diese Fraktion Desulphatohirudin. Auf der Grundlage der HPLC-Analyse ist das Titer etwa 10^g je I Kulturbrühe. Im Medium ist keine Hirudinaktivität feststellbar.

Die Erträge der intrazellulären und extrazellulären Hirudinaktivität, die von Hefestämmen gewonnen wurde, welche das Desulphatohirudin-Gen mit oder ohne angefügte Signaifolge aufnehmen, werden in Tabelle 3 zusammengefaßt. Die Hirudinaktivität wird durch die Thrombininhibitionsuntersuchung gemessen.

Tabelle 3	PHO5-Signal- folge	Hirudinaktivität (ug/l) Kulturmedium	Zellextrakt	Total
S. cerevisiae GFR18/Plasmid	+	6x10³ nicht feststellbar	1x10³ 10	7 x 10³ 10
PJDB207/PHO5 HIR PÜDB207R/ PHOB-HIR

Beispiel 23 Konstruktion von PH05-Promoterdeletionen

a) Bal31-Digestion

Rekombinantphag N 13mp9/PHO5 Bam-Sal, das das BamHI-Sal I-Fragment von PHO5 enthält, dargestellt in Abb. 8, wird als Quelle für das PHO5-Promoter verwendet (siehe EP-Patentanmeldung Ä 143081).

20>g der Phag-DNA(RF: replikative Form) werden mit der RestriktionsendonukleaseSall digeriert, was eine lineare DNA von etwa 9 kb ergibt. Nach der Extraktion mit Phenol/Chlo-roform wird die DNA mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wird in 1OmM tris, pH-Wert 8,0, bei einer Konzentration von 0,5^g jeMilliliter wieder zur Suspension gebracht. 16/xg von Sall-gespaltener DNA werden mit 2 Einheiten Exonuklease Bai31 (BRL) in 100μΙ 2OmMTris,pH-Wert8,0,199mM NaCI, 12mM MgCI₂,12mM CaCI₂ und 1 mM EDTA digeriert. Aliquote von 2μg DNA jeweils werden nach 1,2,3,4,5 und 6min Inkubation bei 30⁰C entnommen und sofort mit 50/xl Phenol und 60 μΙ TNE gemischt. Nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform und der Ethanolausfällung wird die DNA wieder in 1OmM Tris, ph-Wert 8,0, bei einer Konzentration von 100//,g/ml zur Suspension gebracht. Um das Ausmaß der exonukleolytischen Spaltung durch BaI 31 zu analysieren, werden 0,5p.g der DNA von jedem Zeitpunkt mit der Endonuklease BamHI digeriert und auf 1,5% Agarose-Gel in tris-Boratpuffer, pH-Wert 8,3 (9OmM Tris. HCI, pH-Wert 8,3,9OmM Borsäure, 2,5mM EDTA) analysiert. Im Durchschnitt werden von jedem Ende des Fragmentes je 1 min Bal31-Digestion 100 Basispaare entfernt.

b) Hinzufügen von EcoRI-Linkem zur BaI 31-behandelten DNA

Zwei A₂₆o-Einheiten von EcoRI-Linkem (5'-GGAATTCC-S', BRL) werden in 250μΙ von 1OmM Tris, pH-Wert 8,1 mM EDTA wieder zur Suspension gebracht. Zwei Mikrogramm der EcoRI-Linker werden in 75μΙ von 6OmM Tris, pH-Wert 7,5, einer Kinasebehandlung unterzogen, 1OmM MgCI₂,15mM DDT, 10μΜ ATP und 33 Einheiten T₄-Polynukleotidkinase (Boehringer). Nach einer Stunde 37°C läßt man das Gemisch auf Zimmertemperatur abkühlen und bewahrt es dann bei -2O⁰C auf. Die geglühten, doppelsträngigen ECORI-Linkerwerden mit ihren stumpfen Enden mit den Bal31-behandelten DNA-Fragmenten ligiert. Ο,δμ,ς der BaI 31-behandelten DNA (siehe Beispiel 23a) werden 16 Stunden bei Zimmertemperatur mit einem fünfzigfachen Überschuß an kinasierten EcoRI-Linkem in 20μΙ von 6OmM Tris, pH-Wert7,5,1OmM MgCI₂JOmM DTT, 4mM ATP und 600 Einheiten von T₄-DNA-Ligase (Biolabs) inkubiert. Nach der Inaktivierung derT₄-DNA-Ligase (10 min bei 65°C) werden die überschüssigen EcoRI-Linker durch 50 Einheiten von EcoRI (Boehringer) in einem Volumen von 50 μΙ gespalten. Die DNA wird mit Phenol (Chloroform extrahiert), durch Ethanol ausgefällt und wieder in 10mM Tris, 1mM EDTA (TE) zur Suspension gebracht. Dann wird die DNA mit 5 Einheiten BamHI (Biolabs) gespalten, und das Gemisch wird auf 1,5% niedrigschmelzendes Agarose-Gel (Sigma) in tris-Boratpuffer (siehe oben) aufgebracht. Die Bänder werden mit Ethidiumbromid gefärbt und unter langwelligem UV-Licht bei 366 nm sichtbar gemacht. Die breiten, diffusen Bandmuster zwischen etwa lOObpund 600 bp werden aus dem Gel herausgeschnitten, und die DNA wird folgendermaßen extrahiert: Ein Stück Agarose wird bei 65°C verflüssigt, auf 50OmM NaCI _ abgestimmt un9 bei 65°C 20 min lang inkubiert. Es wird ein Volumen Phenol (äquilibriert mit 1OmM tris. HCI, pH-Wert 7,5,1 mM EDTA, 50OmM NaCI) zugesetzt. Die wäßrige Phase wird zweimal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert. Die DNA wird mit 2,5 Volumen kaltem, absoluten Ethanol ausgefällt und durch Zentrifugieren aufgefangen. Das DNA-Pellet wird mit kaltem, 80%igen Ethanol gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Die DNA wird in 10μΙ TE wieder zur Suspension gebracht.

c) Ligation in M13mp9 ·

3μg RF von M 13mp9 werden mit 15 Einheiten EcoRI (Biolabs) und 15 Einheiten BAmHI (Boehringer) in einem Volumen von 50μ digeriert. Nach der Phenolextraktion und der Ethanolausfällung wird die DNA in 50μΙ TE erneut zur Suspension gebracht. 5 μΐ der Schnittvektor-DNA (etwa 200ng) werden mit 10μΙ der oben genannten Proben (DNA-Fragmente von den verschiedenen Ba 131-Digestionen, wie sie in Beispiel 23 b beschrieben wurden) gemischt und in einem Gesamtvolumen von 20μΙ bei Vorhandensein von 6OmM Tris/HCI, pH-Wert 7,5, 6mM MgCI₂,1OmM DTT, 1 mM ATP und 200 Einheiten von T4-DNA-Ligase 15 Stunden lang ligiert. Die Übertragung von kompetenten Zellen des Stammes E. coii JM101 erfolgt nach der Anleitung „M13 cloning and sequencing system", die von den New England Biolabs veröffentlicht wurden. Phagevon einer Reihe weißer Platten werden gezüchtet und auf die Größe ihrer DNA-Einfügung durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI analysiert.

d) Bestimmung der Bal31-Deletionsendpunkte durch Sanger-Folgebildung (Deletionen von der Sall-Stelle) Sequenzierung erfolgt durch das Dideoxy-DNA-Sequenzierungssystem von Sanger u.a. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 5463 [1977]), wie das im oben genannten Anleitungsbuch beschrieben wird. Nachstehend werden die Deletionsendpunkte gegeben:

Klon	Position des letzten Nukleotids der PHO5-Folge (Abb. 8)
A	-502
B	-471
C	-422 .
D	-400
E	-392
F	-369
G	-350
Klori	Position des letzten Nukleotids der PHO5-Folge
H	-328
I	-300
K	-283
L	-255
M	-226
N	-211
O	-187
P	-111
Q	-88
R	-57
S	-33

e) Bestimmung der Bal31-Deletionsendpunkte nach der Sanger-Folgebildung (Deletionen von der BamHI-Stelle) Es erfolgt ein gleicher Satz von BaI 31-Deletionen wie unter a-c, aber durch BamH! wird M 13mρ9 PHO5Bam-Sal geschnitten. Die BaI 31-digerierten Moleküle werden durch EcoRI und Sail geschnitten, und die erzeugten Fragmente werden in M 13mp9, dasmit EcoRI und Sail digeriert ist, geklont. Nachstehend werden die Eletionsendpunkte gegeben:

Klon	Position des letzten Nukleotids der PHO 5-Folge (siehe Abb. 8)
A'	-24
B'	-35
C	-41
D'	-48
E'	-74
F'	-89
G'	-93
H'	-97
I'	-124
K'	-162
L'	-174
Klon	Position des letzten Nukleotids der PHO 5-Folge
M'	-262
N'	-277
O'	-306
P'	-322
Q'	-346
R'	-361
S'	-382
T'	-393

f) Aufbau von inneren PHO 5-Promoterdeletionen

Der unter d) beschriebene Bal31-Deletionssatz ergibt ein „linksarmiges" PHO5-Promoterfragment, das mit einer EcoRI-Stelle endet, und der untere) beschriebene Bal31-Delektionssatz ergibt ein „rechtsarmiges" PHO5-Promoterfragment, das mit einer EcoRI-Stelle endet. Durch die Kombination von „linken Armen" und „rechten Armen" von verschiedenen Positionen werden innere Deletionen geschaffen, die ein EcoRI-Linkersegment an der Stelle der deletierten DNA enthalten. Die einzelnen inneren Deletionen werden durch Schneiden der „linken Arme" und der „rechten Arme" aus den Μ 13mp9-Derivaten durch die Endonukleasen EcoRI und BamHI (linke Arme) oderEcoRI und Salt (rechte Arme) und Isolierung der entsprechenden Fragmente über welche Agarose-Gel-Elektrophorese, wie sie unter b) beschrieben wurde, aufgebaut. Äquimolare Mengen von „linken Armen" und „rechten Armen" und 200ng BamHI- und Sall-digerierte M13mp9-Vektor-DNAwerden wie untere) beschrieben ligiert. Nach der Übertragung auf E. coli JM101 werden weiße Platten aufgenommen, RF wird produziert und durch Restriktionsanalyse analysiert (BamHI, Sail, EcoRI). Folgende Arme werden kombiniert, um spezifische innere Deletionen zu schaffen (Nummerierung der Nucleotide siehe Abb.8):

„linker	„rechter	Del«
Arm"	Arm"
A	T	Δ 7
B	T	Δ 8
C	T	Δ 9
D	(j)	Δ10
E	R'	Δ11
F	Q'	Δ12
G	P'	Δ13
H	O'	Δ14
I	N'	Δ15
K	M'	Δ16
L	L'	Δ17
M	L'	Δ18
N	L'	Δ19
O	L'	Δ20
O	K'	Δ21
O	I'	Δ22
O	H'	Δ23
P	H'	Δ24
P	G'	Δ25
P	U-	Δ26
Q	E'	Δ27
R	D'	Δ28
R	C	Δ29
R	B'	Δ30
S	A'	Δ31

von — bis	Anzahl der deletierten
	Nukleotide
-501 bis -394	108
-470 bis-394	77
-421 bis-394	28
-399 bis-383	17
-391 bis-362	30
-368 bis-347	22
-349 bis-333	17
-327 bis-307	21
-299 bis-278	22
-282 bis-263	20
-254 bis-175	80
-225 bis-175	51
-210bis-175	36
-186bis-175	12
-186bis-163	24
-186bis-125	62
-186bis-98	13
-110bis-98	13
-110bis-94	17
-HObis-90	21
-87 bis-75	13
-56 bis-49	8
-56 bis-42	15
-56 bis-36	21
-32 bis-25	8

g) In vivo-Analyse der internen Deletionen des PH05-Promoters

Die verschiedenen Deletionen, die im Beispiel 23f beschrieben wurden, werden in Plasmid pJDB207/PHO5 geklont

(R. Hagenauer-Tsapis und A. Hinnen, Molecular and Cellular Biology, 4,2668 bis 2675 [1984]) durch Ersetzen des Wildtyp-PHO5-Bam-Sal-Fragmentes durch die deletierte Version. Nach der Transformation des Hefestammes S. cerevisiae AH 216 (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 143081) wird dieSäurephosphataseaktvität bestimmt, wie das von Toh-e u.a. (J. Bacteriol.

113,727 [1973]) beschrieben wurde. Die Deletionen Δ11 und Δ12 weisen eine etwa 10fache Verringerung der PHO5-Aktivität auf und definieren einen oberen Bereich („obere Aktivierungsstelle", UAS), der wesentlich für die PHO5-Expression ist. Eine ähnliche Wirkung unterhalb wird für die Deletion Δ17 (etwa 5fache Verringerung) undfürdieTATA-Box-Deletionen A23bis Δ26 (etwa 30fache Verringerung) beobachtet. Alle anderen Deletionen haben eine Aktivität, die etwa der des Wildtyps entspricht. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß sich drei Bereiche von wesentlicher Information für die PHO5-Expression an folgenden Positionen befinden:

1: Zwischen den Positionen -349 und -383 (UAS 1)

2. Zwischen den Positionen-225 und-263 (UAS2)

3. Zwischen den Positionen -87 und -125 (TATA-Box)

DNA-Fragmente, die UAS1 oder UAS2 oder UAS1 und USA2 von PHO5 enthalten, können aus dem Rekombinant-Phag M13mp9/PHO5 Bam-Sal (siehe oben) durch Spaltung mit entsprechenden Restriktionsendonukleasen hergestellt werden. USA1 ist in einem 268bp-BamHI-Clai-Fragment mit folgender Formel enthalten:

GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCAT CTTATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAA ACGAAGGTAAAAGGTTCATCGCGC Ulli CTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAA ATTAGCACGTTTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCAAAAAAAGTAAAAGTGATTA AAAGAGTTAATTGAATAGGCAATCTCTAAATGAAT,

UAS2 ist in einem lOObp'Clal-BstEH-Fragment mit folgender Formel enthalten:

cgatacaaggttggcactcacacgtgggactagcacagactaaatttatgattctggtc cctgttttcgaagagatcgcacatgccaaattatcaaattg

und beide, UAS1 und UAS2, sind in dem seebp-BamHI-BstEIII-Fragment mit folgender Formel enthalten:

GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATC TTATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAAC GAAGGTAAAAGGTTCATCGCGCI I I I I CTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATT AGCACGTTTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAA GAGTTAATTGAATAGGCAATGTGTAAATGAATCGATACAACCTTGGCACTCACACGTGG GACTAGCACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCC AAATTATCAAATTG.

Beispiet 24:

Expression von Desulphatohirudin unter der Steuerung eines verschmolzenen PHO5-GAPDH-Hybridpromoters Beispiel 23 macht einen Bereich um Position -365 [UAST(PHOS)] und einen weiteren Bereich um Position -180 [UAS2(PHO5)J des Gens PHO5 zur möglichen Kandidaten für UAS mit regulierenden Funktionen. UAS1 (PHO5) ist in einem 268 bp-BamHI-Clal-Fragment enthalten, während sowohl UAS1 (PHO5) als auch UAS2(PHO5) in einem 368-bp-BamHI-BstEII-Fragment enthalten sind. Diese beiden Fragmente werden jeweils mit zwei verschiedenen GAPDH-unteren Promoterelementen verschmolzen, welche die TATA-Box und die Trahskriptionseinleitungsstellen von GAPDH einschließen.

a) Aufbau der Hefegen-Bibliothek

30/u.g der gesamten, hochmolekulargewichtigen Hefe-DNA (M. V. Olsen u.a., J. Mol. Biol. 132,387 [1979]) des Wildtyps von Saccharomycescerevisiae-Stamm S288C werden 30min bei37°Cmit2 Einheiten EcoRI-Methylase (New England Biolabs) in 250/ilEcoRI-Methylierungspuffer inkubiert, wie das vom Lieferer empfohlen wird. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt, in 500 μ\ von 25 mM tris.HCI, pH-Wert 8,5,2 mM MgCI₂ (EcoRI*-Puffer wieder zur Suspension gebracht (H. Meyer, FEBS Lett. 90,341 [1979]) und mit EcoRI (Boehringer) digeriert, bis die Größenverteilung der DNA-Fragmente im Bereich von 30 bis 50 kb ein Maximum hat (eine Xhol-Digestion von XDNA ergibt entsprechende 33 kb-und 17kb-Marker). Die unter EcoRI*-Bedingungen digerierte Hefe-DNA wird auf einem Sukrosegradienten (5-20% Sukrose in 1OmM tris.HCI, pH-Wert 7,5,1mM EDTA) 6 Stunden bei 38 000 U/min in einem Rotor SW40 nach der Größe fraktioniert. Es werden jeweils 30 Fraktionen von 0,4ml oben vom Gradienten abgenommen. Fraktion 16 enthält DNA-Fragmente von 30 bis 40 kb Größe. Die DNA dieser Fraktion (3/*g) wird mit Ethanol ausgefällt und 16 Stunden bei 15°C in einem Gesamtvolumen von 15μ.Ι bis 1 ^g Kosmidvektor pYcl (B.Hohn u.a. in „Genetic Engineering" (Gentechnik), Bd.2, S. 169, New York 1980), linearisiert durch EcoRI, ligiert. Die Ligation erfolgt mit 300 Einheiten T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) unter Anwendung des vom Hersteiler beschriebenen Puffersystems. Die DNA wird in vitro in das Bakteriophag λ eingefügt (B. Hohn in „Methods in Enzymology" (Methoden in der Enzymologie), Bde. 68, S. 299, New York 1979), und die zusammengefügten Phage werden dazu verwendet, den E. coli Stamm HB101 (rf, mf, leu®, pro® · recA) zu übertragen. Die Effizienz der Übertragung beträgt etwa 5000 ampizillinresistente Kolonien je Mikrogramm des pYcl-Vektors. 3Ö00amp^R Kolonien werden herausgenommen und einzeln in Mikrotiter-Schalen in LB-Medium (10g Bacto-Tryptone [Difco], 5g Bacto Yeast Extract [difco], 10g NaCI), das lOO^ag/ml Ampizillin enthält, gezüchtet.

b) Isolierung des Hefe-GAPDH-Gens

Die oben beschriebene Gen-Bibliothek wird mit einem synthetischen Oligonukleotid gesiebt (Hergestellt unter Anwendung der Phosphotriester-Methode: K.Itakura u.a.J.Am. Chem. Soc.97,7327 [1975]; J.F. M. deRooij u.a., Reel.Trav. Chim. Pays-Bas98, 537 [1979]), das folgende Struktur hat: 5'-GCTCCATCTTCCAcCGCCCC-S'. 10μΙ des Oligonukleotids werden unter Verwendung von 10/xgvony-³²-P-ATP(3000Ci/mMol, 10μ£ί/μ.Ι Amersham) mitT4-Polynukleotidkinase (Boehringer) in einem

Gesamtvolumen von 50μ\ kinatisiert, wie das von Maniatis u.a. beschrieben wurde („Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., 1982, S. 125). Die Koloniehybridisierung erfolgt nach der Beschreibung desselben Autors (S. 312). Positive Klone werden durch Autoradiografie unter Verwendung von Kodak X-5-Röntgenfilm festgestellt. Durch die Plasmid-DNA-Isolierung wird ein Hybridklon erzeugt, der ein 2100bp-Hindlll-Fragment enthält, das auf GAPDH kodiert (J. P.Holland u.a., J. Biol. Chem. 254, 9839 [1979]). Der abschließende Beweis für die Authentizität der geklonten DNA kommt von einem DNA-Folgebildungsexperiment unter Verwendung des oben genannten Oligonukleotids in Kombination mit dem Dideoxy-Folgebiidungsprotokoll, wie das von G. F. Hong (Bioscience Reports 1,243 [1981]) für doppelsträngige DNA beschrieben wurde. Das geklonte GAPDH-Gen (siehe Abb.9) hat dieselbe Folge wie pgap491, das von Holland u.a. veröffentlicht wurde (J. Biol. Chem. 255, 2596 [1980]).

c) Herstellung von unteren GAPDH-Promoterelementen (siehe Abb. 10)

Das 649bp-Taql-Fragment, das die Position -27 bis -675 von ATG des GAPDH-Gens (siehe Abb. 9) einschließt, wird durch Digerieren des oben genannten Hybridplasmids mit Taql (New England Biolabs) isoliert, Trennen der DNA-Fragmente auf 1,2% weichem Agarose-Gel und Extrahieren der DNA durch heißes Phenol (siehe Beispiel 23). Die Klonung des Taql-Fragmentes erfolgt in die Clal-Stelle vo.n pBR322:1 ^g von pBR322 werden mit drei Einheiten CIaI (New England Biolabs) nach den Angaben des Herstellers gespalten. 300ng des phenolisierten und geschnittenen Vektors werden an etwa 300 ng der Einfügungs-DNA (649bp-Taq-Fragment) unter Verwendung von 200 Einheiten von T4-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 20/xl ligiert (siehe Beispiel 23 b). Die Transformation erfolgt in E. coli HB101 für Ampizillinbeständigkeit, die Plasmid-DNA wird hergestellt und durch Restriktionsanalyse analysiert [Taql, Oral]. Die Orientierung des Taql-Fragmentes wird unter Verwendung der Restriktionsendonuklease Dral in Kombination mit der BamHI-Stelle der Plasmiden geschaffen, und es wird ein Plasmid ausgewählt, bei dem die Taql-Stelle von Position -675 dicht bei der Hindlll-Stelle von pBR322 liegt. Dieses Plasmid, das als pBR322/GADPH bezeichnet wird, wird unter Verwendung von BamHI (New England Biolabs) linearisiert, und es wird eine Digestion mit Bal31 wie im Beispiel 23 mit der Ausnahme durchgeführt, daß Bglll-Linker (5'-CAGAZCZG-S', New England Biolabs) verwendet werden, und das digerierte Plasmid wird direkt bei einer Konzentration von 5/xg/ml in einem Gesamtvolumen von 20 μΙ zirkuliert. Die Größe des Bal31-verkürzten Taql-Fragmentes wird durch Restriktionsanalyse (unter Verwendung von BgIII und Hindlll) bestimmt. Es werden zwei Klone ausgewählt, die DNA-Fragmente enthalten, die jeweils etwa 200bp bzw. 265bp aufweisen, aus dem ATG oberhalb in das GAPDH-Promoter. Beide Fragmente enthalten die präsumptive TATA-Box bei etwa —140bp. Diese Klone enthalten noch den Replikationsursprung im pBR322-abgeleiteten Teil der DNA und werden mit pGADPH-F und pGADPH-E bezeichnet.

d) Kombination des unteren GAPDH-Promqterelementes mit UAS1 (PHO5) und PHO5 und dem Proteinkodierungsbereich von Desulphatohirudin

I) Das GAPDH-Element

Um das GAPDH-Promoterelement von der Taql-Stelle an Position -27 weiterzuführen zu einer Position unmittelbar an ATG von GAPDH-Gen, werden zwei synthetische komplementäre Oligonukleotide mit der folgenden Struktur synthetisiert: 5' CGAATAAACACACATAAATAAAG 3' 3' TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5'

Diese Oligonukleotide bilden die reine GAPDH-Promoterfolge von Position -26 bis Position -5 mit der Erzeugung einer Terminal-EcoRI-Stelle. Zwei Mikrogramm der Bal31-Isolate von Beispiel 24c) (Plasmide pGAPDH-E und -F) werden mit 6 Einheiten von Taql in 50/xl digeriert, und das resultierende Gemisch wird phenolisiert, mit Ethanol ausgefällt und in 10μ.Ι Wasser wieder zur Suspension gebracht. Die synthetischen Oligonukleotide werden durch Mischen von 2μ.Ι jedes einzelnen Stranges in 100/ti einer Lösung, die"1 OmM tris.HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂, 5OmM NaCI enthält, Erhitzen auf 9O⁰C für die Dauer von 3 min und langsames Abkühlen der Lösung auf Zimmertemperatur (innerhalb von 3 Stunden) geglüht. Ein Mikrogramm jedes der Taql-digerierten Plasmide wird mit einem etwa zwanzigfachen Überschuß (molar) der geglühten Oligonukleotide in einem Volumen von 20μ.Ι für etwa 18 Stunden unter Verwendung von 800 Einheiten von T4-DNA-Ligase digeriert. Das ganze Gemisch wird mit 3 Einheiten BG1 Il (New England Biolabs) digeriert, die DNA-Fragmente werden auf einem 1,5%igem weichen Agarose-Gel getrennt. Die Bglll-EcoRI-Fragmente von etwa 200 bp bzw. 265 werden aus dem Gel geschnitten, extrahiert und mit Phenol ausgefällt.

Plasmid pGAPDH-E wird mit BgIII und EcoRI digeriert, und das große Fragment (etwa 3,5 kb) wird isoliert. Dieses Fragment wird als Vektor verwendet, um die 265 bp-und 200bp-Bglll-EcoRI-Fragmente unter Anwendung der oben beschriebenen Ligations-, Transformations- und Plasmidisolierungsbedingungen zu klonen. Die erzeugten Plasmide werden als pGAPDH-EL und pGAPDH-FL bezeichnet. Die DNA-Folgen der Bglll-EcoRI-Fragmente, die in die Plasmide pGAPDH-EL und pGAPDH-FL geklont wurden, werden in der Abb. 11 dargestellt. Die genaue Größe der Fragmente ist 266 bp bzw. 201 bp.

II) Das regulatorische UAS1 (PHO5)-Element

3,ug von Plasmid p31/Y (siehe europäische Patentanmeldung No. 100561) werden mit 6 Einheiten CIaI (New England Biolabs) digeriert. Die 3'-rezessierten Enden werden unter Verwendung des Klenow-Fragmentes von E. coli-DNA-Polymerase I (Bethesda Research Laboratories) nach Maniatis (oben) gefüllt. Es werden Bglll-Linker (5'-CAGATCTG-S') hinzugefügt, wie das im Beispiel 23 beschrieben wurde. Die DNA wird mit Sail und BGII! (New England Biolabs) digeriert und auf 1 % weichem Agarose-Gel behandelt. Das 548bp-Fragment wird aus dem Gel geschnitten, phenolisiert und mit Ethanol ausgefällt, wie das oben beschrieben wurde.

III) DNA-Kodierung für Desulphatohirudin

Konstruktion von Plasmid pJDB207/PHOB(Eco)-HIR (siehe Abb. 12). Zur entsprechenden Verbindung der UAS(PHO5)-GAPDH-Hybridpromoterelemente mit dem Kodierungsbereich des Desulphatohirudins, einschließlich der PHO5-Signalfolge (sie im Plasmid pJDB207/PHO5-HIR), wird eine EcoRI-Restruktionsstelle in den 5'-nichtübertragenen Bereich zwischen den mRNA-Startstellen und ATG des Kodierungsbereiches eingeführt.

15μ9 des Plasmids pJDB207/PHO5-HIR (siehe Beispiel 16d) werden mit der Restriktionsendonuklease Dral (Boehringer) digeriert. Die resultierenden 4 Fragmente werden auf einem 0,8%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 4,2 kb-DNA-Fragment wird aus dem Gel gewonnen, elektroeluiert und durch Ethanol ausgefällt. Die DNA wird in H₂O mit einer Konzentration von 0,6mg/ml wiederzur Suspension gebracht.

Zwei synthetische Oligonukleotide mit der Formel

5'-AATTCGATTACCAATGTTt-S'

3'- GCTAATGGTTACAAA-B'

(2,3^g bzw. 2,9/xg) werden in jeweils 20μΙ 6OmM Tris, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,5mM DTT,0,5mM ATP und 20 Einheiten von T4-Polynukleotidkinase (Boehringer) kinatisiert. Nach45 min bei 37⁰C werden die beiden Reaktionsgemische kombiniert, TO min lang auf75°C erhitzt, anschließend läßt man sie auf Zimmertemperatur abkühlen. Der geglühte Oligonukleotid-Linkerwird bei -20T gelagert.

6,5/ug (2,3pMol) des 4,2kb-Dral-DNA-Fragmentes werden 16h bei 15°C mit einem 70fachen Überschuß des kinatisierten und geglühten Oligonukleotid-Linkers in 50μΙ von 6OmM Tris, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂, 5mM DTT, 3,5mM ATP und 800 Einheiten von T4-DNA-Ligase (Biolabs) inkubiert. Nach der Inaktivierung derT4-DNA-Ligase für 10 min bei 85°C werden die überschüssigen Linker durch Ausfällung der DNA bei Vorhandensein von 1OmM EDTA, 30OmM Natriumazetat, pH-Wert 6,0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt. Die DNA wird mit EcoRI und Hindill digeriert. Die resultierenden Fragmente werden auf einem 1 % Agarose-GeI in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 643bp-Fragment wird aus dem Gel durch Elektroeluieren und Ethanolausfällung gewonnen. Die DNA wird in einer Konzentration von 0,1 pMol/μΙ wieder zur Suspension gebracht. Das EcoRI-Hindlll-Fragment enthält die PHO5-Signalfolge, die Kodierungsfolge von Desulphatohirudin und den PHO5-Transkriptionsterminator.

Das 534bp-PHO5-Promoterfragmentwird aus dem Plasmid p31/R (europäische Patentanmeldung No.100561) isoliert.

10μg p31/R werden mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI digeriert. Die resultierenden 3 Fragmente werden auf einem 0,6%igen, niedrigschmelzenden Agarose-Gel η Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Es wird ein 534bp-BamHI-EcoRI-Fragment isoliert, das den PHO5-Promoter einschließlich der mRNA-Startstellen enthält.

Das Vektorfragment wird aus Plasmid pJDB207/PHO5-HIR (siehe Beispiel 16d) isoliert, 6^g dieses Plasmids werden mit BamHI und Hindlll digeriert. Das große 6,5 kb-BamHI-Hindlll-Fragment wird von dem kleinen Fragment auf einem 0,6%igen, niedrigschmelzenden Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt.

Die drei oben beschriebenen DNA-Fragmente mit den entsprechenden Haftenden werden in der folgenden Reaktion ligiert:

0,2pMol (70ng)'des534bp-BamHI-EcoRI-PHO5-Promoterfragmentes, 0,2pMol (85ng) des 643bp EcoRi-HindW-Fragments (Hirudinkodierungsfolge) und0,1pMol (0,4Mg) des 6,5kb-BamHI-Hindlll-Vektorfragmentes werden in 10μΙ von 6OmM Tris, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,5 mM DTT, 1mM ATP und 400 Einheiten von T4-DNA-Ligase 6 h beil 5°C ligiert. Ein Aliquot zu 1μΙ des Ligationsgemischs wird 100μΙ von kalziumbehandelten, transformationskompetenten E. coli HB101-Zellen zugesetzt. 12 transformierte, amp" Kolonien werden einzeln in LB-Medium, das 100μg/ml Ampiziilin enthält, gezüchtet. Plasmid-DNA wird nach der Methode von Holmes u.a. (Anal. Biochem. 114 [1981] 193) hergestellt und durch EcoRI- und BamHI-Restruktionsdigerierungen analysiert. Ein Klon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird isoliert und als pJDB207/ PHO5(Eco)-HIR bezeichnet.

IV) Ligation von UAS1(PH05)-GAPDH-Hybridpromotem mit dem Proteinkodierungsbereich von Desulphatohirudin

15Mg von Plasmid pJDB207/PHO5(Eco)-HIR (siehe Beispiel 24dlll) werden mit EcoRI und Hindlll digeriert. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 643 bp-Fragment wird aus dem Gel isoliert, elektroeluiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wird mit einer Konzentration von 0,1 pMol/μΙ in H₂O erneut zur Suspension gebracht.

6yu,g von Plasmid pJDB207/PHO5-HIR werden vollständig mit den Restriktionsendonukleasen Hindlll und Sail digeriert. Das große 6,3kb-Fragment (Vektorteil) wird durch weiche Agarose-Gel-Elektrophorese, Phenolextraktion und Ethanolausfällung isoliert. Das Vektor-DNA-Fragment wird mit einer Konzentration von 0,05ρΜοΙ/μΙ in H₂O wieder zur Suspension gebracht. 10μg von Plasmid pGADPH-EL (siehe Beispiel 24dl) werden mit BgIII und EcoRI digeriert; das 266bg-Bglll-EcoRI-Fragment wird auf einem 1,2%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt, aus dem Gel elektroeluiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wird mit einer Konzentration von 0,3ρΜοΙ/μΙ in H₂O wieder zur Suspension gebracht. 0,3pMol des 548bp-Sall-Bg!ll-Fragmentes, das auch UASKPHO5) enthält (Beispiel 24dll), 0,3pMol des 266-bp-Bglll-EcoRI-Fragmentes von pGAPDH-EL, 0,3pMol des 643bp-EcoRi-Hindlll-Fragmentes von pJDB207/PHO5(Eco)-HIR und 0,12pMol des 6,3kb-Sall-Hindlll-Vektorfragmentes werden in 20μΙ von 6OmM Tris, pH-Wert 7,5 1OmM MgCI₂,5mM DTT, 1 mM ATP und 400 Einheiten von T4-DNA-Ligase (Biolabs) für 6 h bei 15°C ligiert. Aliquote von 1μ,Ι und 3μΙ des Ligationsgemischs werden 100μΙ kalziumbehandelter E. coli HBI01-Zellen zugesetzt. Plasmidisolierung aus den amp" Kolonien und Restriktionsanalysen mit SalI, BGIII, EcoRI und Hindlll werden wie oben ausgeführt (Siehe Beispiel 24dlll). Ein positives Klon wird ausgewählt und als pJDB207/ PAPEL-HIR(UASI) bezeichnet.

Eine analoge Konstruktion erfolgt mit dem 201 bp-Bglll-EcoRI-Fragment, das aus pGAPDH-FL isoliert wurde. Ein ausgewähltes Plasmid wird als pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1) bezeichnet.

V) Ligation der UAS1 (PHO5)-UAS2(PHO5)-GAPDH-Hybridpromoter mit dem Proteinkodierungsbereich von Desulphatohirudin (siehe Beispiel 13)

3μg jedes der Piasmide pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1) und pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1) werden mit BgIII digeriert. Nach der Phenolextraktion und der Ethanolausfällung werden die rezessierten 3'-Enden der DNA nach Maniatis (siehe oben) in einer Reaktion mit E. coli-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment; Bethseda Research Laboratories) gefüllt. Das Enzym wird bei 70⁰C 10 min inaktiviert. Die DN A werden weiter mit Sail digeriert, und die großen 7,2 kb-Fragmente werden durch weiche Agarose-Gel-Elektrophorese, Phenolextraktion und Ethanolausfällung isoliert. Jedes Fragment wird mit einer Konzentration von 0,05 ρΜοΙ/μΙ wieder in H₂O zur Suspension gebracht. Die Fragmente enthalten den Hirudinkodierungsbereich,die meisten der Vektorfolgen und eines der beiden GAPDH-Promoterelemente, die aus pGAPDH-EL oder pGAPDH-FL isoliert wurden. Plasmid p31/Y (europäische Patentanmeldung No. 100561) wird mit BstEll digeriert, mit E. coli-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) inkubiert, wie das oben beschrieben wurde, und mit Sail gespalten. Das 649 bp-Fragment wird auf einem weichem Agarose-Gel getrennt und durch Phenolextraktion und Ethanolausfällung gewonnen.

0,3pMol des 649bp-Fragmentes von p31/Y, die das UAS1-UAS2(PHO5)-Promoterelement enthalten, und 0,15pMol eines der 7,2 kb-Fragmente werden ligiert und wie oben beschrieben in E. coli HB101 transformiert. Ausamp^R Kolonien werden Plasmide hergestellt und durch Restriktionsdigerierungen analysiert. Es werden einzelne Klone ausgewählt und deren Plasmid-DNA bezeichnet als pJDB207/PAPEL-HlR(UAS1 + UAS2) und

« innon-7/DADCl UID/I IAC 1 _1_ I ΙΛΟΙ

Beispiel 25: .

GAPDH-Promoterelemente, die in die Proteinkodierungsfolge von Desulphatohirudin verschmolzen sind

Zwei GAPDH-Promoterelemente von unterschiedlicher Länge (wie im Beispiel 24dl beschrieben) werden mit dem Proteinkodierungsbereich des Desulphatohirudins, einschließlich der PHO5-Signalfolge ligiert.

Die beiden Elemente (266bp bzw. 201 bp) beinhalten die GAPDH-TATΑ-Box, die mRNA-Startstellen und einen AT-reichen 5'-untranslaterierten Bereich. Die Nukleotidfolge der beiden Elemente wird in der Abb. 10 gezeigt.

Die 3'-Enden der Elemente befinden sich beide in der Position -5 von ATG des GAPDH-Gens, gefolgt von einer EcoRI-Erkennungsstelle (siehe die Oligonukleotid-Linker., die im Beispiel 24dl eingeführt wurden), die 5'-Enden sind in den Positionen -198 bzw. -263 von ATG mit an diesen Positionen angefügten Bglll-Linkem.

Die Bglll-EcoRI-Promoterfragmente werden an ein EcoRI-Hindlll-Fragment mit Folgen ligiert, die für die PHO5-Signalfolge und Desulphatohirudin kodieren, und ah ein.Hindlll-BamHI-Vektorfragment.

6/xg von Plasmid pJDB207/PHO5-HIR werden vollständig mit den Restriktionsendonukleasen Hindill und BamHI digeriert. Das große 6,5 kb-Fragment (Vektorteil) wird auf einem 0,8%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, abgetrennt, aus dem Gel elektroeluiert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die Vektor-DNA wird mit einer Konzentration von 0,05ρΜοΙ/μΙ in H₂O wieder zur Suspension gebracht.

0,3pMol des 266bp-Bglll-EcoRI-Fragmentes von pGAPDH-EL (Beispiel 24dlV), 0,3pMol des 643bp-EcoRI-Hindlll-Fragmentes von pJDB207/PHO5(Eco)-HIR (Beispiel 24dlll) und 0,1 pMol des 6,5kb-Hindlll-BamHI-Vektorfragmentes werden in 10μΙ von 6OmM Tris, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,5mM DTT, 1mM ATP und 400 Einheiten von T4-DNA-Ligase (Biolabs) für 6h bei 15°C ligiert. 1μΙ des Ligationsgemischs wird 100μ.Ι kalziumbehandelten E. coli HB101-Zellen zugesetzt. Die Plasmidisolierung von amp" Kolonien und die Restriktionsanalyse mit EcoRI werden so ausgeführt, wie das im Beispiel 24dlll beschrieben wurde. Ein positives Klon wird ausgewählt. Die Plasmid-DNA wird als pJDB207/GAPEL-HIR bezeichnet.

Eine analoge Konstruktion erfolgt mit dem 201 bp-Bglll-EcoRI-Fragment, das aus pGAPDH-FL isoliert wurde. Die Plasmid-DNA des einen ausgewählten Klons wird pJDB207/GAPFL-HIR bezeichnet.

Beispiel 26: Konstruktion von Expressionsplasmiden mit Tandemeinfügungen der Kodierungsfolge von sekretiertem Desulphatohirudin

(siehe Abb. 14)

Die folgenden Konstruktionen enthalten ein DNA-Fragment, das in einer Kopf-Schwanz-Tandemanordnung dupliziert ist. Das duplizierte Fragment weist das GAPDH-Promoter oder ein Hybrid-POH5-GAPDH-Promoter (wie in den Beispielen 24 bzw. 25 beschrieben), die POH5-Signalfolge, die Kodierungsfolge des Desulphatohirudins und den PHO5-Transkriptionsterminator auf. .

7jug des Plasmids pHDB207/GAPEL-HIR werden mit der Restriktionsendonuklease Hindlll digeriert. Die rezessierten 3'-Enden werden in einer Reaktion mit E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment; Bethesda Research Laboratories) nach Maniatis (siehe oben) gefüllt, 1,85^g von Sail-Linker 5'-GGTCGACC-S' (Biolabs) werden in 50μΙ von 6OmM Tris, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂, 5mM DTT, 0,5mM ATP und 50 Einheiten vonT4-Polynukleotidkinase (Boehringer) kinatisiert. Nach'45min bei 37°C wird das Gemisch 10min bei 75⁰C erhitzt und anschließend auf Zimmertemperatur abgekühlt. 7/zg (1,5pMol) linearisierten Plasmids pJDB207/GAPEL-HIR mit den zu stumpfen Enden umgewandelten Hindlll-Stellen (siehe oben) werden 16h bei 15°C mit einem 80fachen Überschuß an kinatisierten und geglühten Sal-Linkern in 30μ.Ι von 60mM Tris, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂, 5mM DTT, 3,5 mM ATP und 800 Einheiten von T4-DNA-Ligase (Biolabs) kinatisiert. Nach der Inaktivierung derT4-DNA-Ligase bei 75°C über 10min werden die überschüssigen Linker durch Ausfällung der DNA bei Vorhandensein von 1OmM EDTA, 30OmM Natriumazetat, pH-Wert 6,0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt. Die DNA wird mit Sail digeriert. Die resultierenden Fragmente werden auf einem 1%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 1,1 kb-Sall-Fragment wird aus dem Gel durch Elektroeluieren, Phenolextraktion und Ethanolausfällung gewonnen. Die DNA wird mit einer Konzentration von 0,1 pMol/μΙ wieder zur Suspension gebracht.

5|U.g von Plasmid pJDB207/GAPEL-HlR werden vollständig mit Sail digeriert. Nach der Phenolextraktion und der Ethanolausfällung wird die DNA in 100μ,Ι von 50 m M Tris, pH-Wert 8,0, wieder zur Suspension gebracht. Es werden 4,6 Einheiten alkalischer Kalbsdarmphosphatase (Boehringer) zugesetzt. Nach einer Stunde bei 37°C wird die Phosphatase bei Vorhandensein von 10OmM NaCI, 5 mM EDTA und 0,5% SDS über 15 min bei 68X inaktiviert. Die DNA-Lösung wird einer 100μΙ-Schicht von DE52-Anionenaustauscher (Whatman) zugesetzt, die mit 1OmM Tris, pH-Wert 7,5,15OmM NaCI und 1 mM EDTA geeicht wurde. Nachdem Auswaschen der Kolonne mit dem gleichen Puffer wird die DNA mit 400μ\ von 1,5 M NaCI, 1OmM Tris, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA eluiert und mit Ethanol ausgefällt. Linearisiertes Plasmid wird von der ungeschnittenen DNA auf einem 0,6%igen Agarose-Gel in Tris-Azetatpuffer getrennt. Das lineare 7,3kb-DNA-Fragment wird aus dem Gel gewonnen, elektroeluiert, mit Phenol extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und mit einer Konzentration von 0,1 pMol/μΙ wieder zur Suspension gebracht. 0,2 pMo! des 1,1 kb-Sali-Fragmentesund 0,1 pMol des linearisierten Vektors werden in 10μ,Ι von 6OmM Tris, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂, 5mM DTT, 1 mM ATP und 200 Einheiten von T4-DNA-Ligase über 16 Stunden bei 15°C ligiert. Ein Aliquot zu leides Ligationsgemisches wird 100μΙ kalziumbehandelten, transformationskompetenten E. coli HB 101-Zellen zugesetzt. 24 transformierte, amp" Kolonien werden einzeln in LB-Medium, das 100μg/ml Ampizillin enthält, gezogen. Die Plasmid-DNA wird nach Holmes (Anal. Biochem. 114 [1981 ] 193) hergestellt und durch EcoRI-Restriktionsdigestion analysiert. Ein Klon wird mit den erwarteten Restruktionsfragmenten isoliert und als pJDB207/[GAPEL-HIR]D bezeichnet.

Analoge Konstruktionen werden mit den Plasmiden pJDB207/GAPFL-HIR und pJDB207/PAPEL/HIR(UAS1 + UAS2) ausgeführt. Die resultierende Plasmid-DNA von jeweils einem ausgewählten Klon wird als pJDB207/[GAPEL-HIR] D und pJDB207/[PAPFL-HIR(UASI + UAS2)]D bezeichnet. ' . .

Beispie! 27:

Konstruktion eines Expressionsplasmids mit vier Einfügungen der Kodierungsfolge von sekretiertem Desulphatohirudin Vier Kopien eines DNA-Fragmentes, das ein GAPDH-Promoter, die PHO5-Signalfolge, die Kodierungsfolge von Desulphatohirudin und den PHO5-Transkriptionsterminator enthält, werden in den Hefe-Expressionsvektor in einer Kopf-Schwanz-Tandemanordnung eingefügt

10μg von Plasmid pJDB207/GAPFL-HlR D (siehe Beispiel 26) werden mit Sail digeriert. Die Haftenden des resultierenden

oben) gefüllt. 0,94μς von Hindlll-Linker [5'-CAAGCTTG-S', Biolabs] werden kinatisiert, selbstgeglüht und mit den zu stumpfen Enden umgewandelten Sall-Stellen (siehe oben) mit dem linearisierten Plasmid pJDB207/[GAPFL-HIR]D verbunden. Die Linker-Ligation und die Isopropanolausfällung erfolgen wie im Beispiel 26. Anschließend wird die DNA mit Hindill gespalten, und das resultierende 2,2kb-Fragment wird durch Elektroeluierung, Phenolextraktion und Ethanolausfällung isoliert. Die DNA wird mit einer Konzentration von 0,1 pMol/μΙ wieder zur Suspension gebracht.

5/ig des Plasmids pJDB207/ GAPFL-HIR D werden vollständig mit Hindill digeriert. Die DNA wird mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase (Boehringer) dephosphorylisiert, durch DE52-Ionenaustauschchromatografie gereinigt und aus einem 0,6%igen Agarose-Gel durch Elektroeluierung gewonnen, wie das im Beispiel 26 beschrieben wurde.

0,2pMoldes2,2kb-Hindlll-FragmentesundO,1 pMol des linearisierten Vektors werden I igiert (siehe oben). Ein Aliquot zu 1 /xldes Ligationsgemischeswird 100μΙ von kalziumbehandelten, transformationskompetenten E. coli HB101 -Zellen zugesetzt. 12 transformierte, amp" Kolonien werden in einem LB-Medium,das lOOjug/ml Ampiziilin enthält, einzeln gezogen. Es wird Plasmid-DNA hergestellt und durch Sail-, Xbal; Aval-, Xbal-Doppeldigerierungen und BamHI-Digerierungen analysiert. Ein 1,1 kb-BamHI-Verbindungsfragment zeigt an, daß die Einfügung in einer Kopf-Schwanz-Anordnung im Verhältnis zu den bereits auf dem Plasmid vorhandenen Kopien vorhanden ist. Ein Klon mit dieser Orientierung der Einfügung wird als pJDB207/[GAPFL-HIR]T bezeichnet.

Beispiel 28:

Konstruktion eines Hefeexpressionsvektors, der das PHO5-Promoter, die Invertasesignalfolge und den

Desulphatohirudinkodierungsbereich enthält A) Synthese von Oligodeoxyribonukleotiden für die Invertasesignalfolge

Vier Oligodeoxyribonukleotide, 1-1,1-2,1-3,1-4, werden durch DNA-Synthesizer (Modell 380B Applied Biosystems) synthetisiert. Nach dem Deblockieren werden die synthetischen Fragmente auf einem 12%igen Polyakrylamid-Gel,das8M Harnstoff enthält, gereinigt. Salzfreie, reine Oligodeoxyribonukleotide werden unter Verwendung von Sep. Pak (Waters Associates) gewonnen. Diese Fragmente stellen einen Duplex dar, der die Invertasesignalfolge mit den häufig genutzten Hefekodonen kodiert.

Hindill

EcoRi MetLeuLeuGlnAlaPheLeuPheLeuLeu 1-1 5'AT^CATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTt 3' I-2 3'GTACGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGACs'

AlaGlyPheAlaAlaLyslleSerAla

I-3 5'GGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCATCTTAGCGTCs-I-4 3'CAAAACGTCGGTTTTATAGACGTAGAATCGCAGAGCTs'

Hgal

Xhol

B) Subklonen der Invertasesignalfolge

a) Herstellung des Vektors

1,5ju.g von p31 R/SS-TPAA2 (europäische Patentanmeldung No. 143081) werden mit 10 Einheiten EcoRI (Boehringer) in 50/xl von 1OmM tris.HCI, pH-Wert 7,5, 6mM MgCI₂,10OmM NaCI, 6 mM Merkaptoethanoi für eine Stunde bei 37°C digeriert. Nachdem Zusetzen von 11 von 2,5M NaC! werden 10 Einheiten von Xhol (Boehringer) zugesetzt und bei 37⁰C eine Stunde lang inkubiert. Der 4,2 kb-Vektor wird auf einem 0,8%igen präparativen Agarose-Gel isoliert. Die Gel-Scheibe wird in ein Micro-Colloidor-Rohr (Sartorius GmbH) übertragen, mit 200 μΙ TE bedeckt und elektroeluiert (bei 90 mA 50min lang elektrophoretisiert); dieTE-Lösung wird aufgefangen und in 2,5 Volumen absolutem Ethanol nach dem Zusatz von 0,1 Volumen 10x TNE ausgefällt. Das DNA-Pellet wird mit kaltem, 80%igen Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die DNA wird in 6μΙΤΕ (40 pMol/μΙ) wieder zur Suspension gebracht.

b) Glühen der Oligodeoxyribonukleotide (1-1,1-2,1-3,1-4), Kinetisierung und Ligation mit Vektor

Eine Lösung, die 1OpMoI jedes der vier Deoxyribonukleotide in 10μΙ von 0,5 tris.HCI, pH-Wert 8,0, enthält, wird bei 95⁰C fünf Minuten lang auf einem Wasserbad inkubiert. Das Wasserbad wird über eine Zeitspanne von 5 Stunden langsam auf 30⁰C abgekühlt. Diesem geglühten Gemisch werden jeweils 2μΙ von 0,1 M MgCI₂,0,1 M NaCI, 3OmM DTT, 4mM ATP und 8 Einheiten (1 μΙ) von Polynukleotidkinase (Boehringer) zugesetzt, die Kinatisierung wird bei 37°C über die Dauer einer Stunde vorgenommen. Die geglühten, kinatisierten Oligodeoxyribonukleotide und 6OpMoI des EcoRI-Xhol-Schnittvektors (1,5μΙ) werden mit 400 Einheiten (1 μΙ) T4-DNA-Ligase (Biolabs) bei 14⁰CfUr 17 Stunden ligiert. Die Reaktion wird durch Inkubation bei 65⁰CfUr 10 min Dauer gestoppt. 10μΙ dieses Ligationsgemischs werden für die Transformation von E. coli HB101 Ca⁺⁺-Zellen verwendet (M. Dager und S. D. Ehrlich, Gene 56,23-28 [1979]). Die 20amp^R Kolonien werden herausgenommen. DNA wird durch das Schnell-Isolationsverfahren gewonnen (D.S.Holmes und M.Quigley, Anal. Biochem. 114,193-197 [1981]). DNA wird mit EcoRI und Xhol digeriert, am EcoRI-Ende radioaktiv markiert und auf einem 6%igen Polyakrylamidgel, das 8 M Harnstoff enthielt, unter Verwendung der radioaktiv markierten pBR322 Haelll-Schnitt-DNA als Marker analysiert. Korrekte Größenbänder werden für die DNA beobachtet, die von allen 20 Klonen gewonnen wurden. Ein Klon wird in 100 ml LB-Medium gezogen, das 100μg/ml Ampiziilin enthält. Das Plasmid-DNA wird isoliert und als p31RIT-12 bezeichnet.

c) Verbindung des GAPFL-Promoterelementes mit der Invertasesignalfolge '

5μg von Plasmid p31RlT-12 werden vollständig mit Sail und EcoRI digeriert. Das große 3,3kb-Sall-EcoRI-Fragment wird auf einem 0,6%igen Agarose-Gel inTris-Azetatpuffer, pH-Wert 8,2, isoliert. Die DNA wird aus dem Gel elektroeluiert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. 10μg von Plasmid pJDB207/GAPFL-HIR (siehe Beispiel 25) werden mit Sail und EcoRI digeriert. Das 477 bp-Sall-EcoRI-Fragment wird auf einem 0,8%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, isoliert. Die DNA wird elektroeluiert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die beiden isolierten DNA-Fragmente werden ligiert. Ein Aliquot des Ligationsgemischs wird dazu verwendet, kompetente E. coli HB101-Zellen zu transformieren. Es werden amp" Kolonien gezogen, und die Plasmid-DNA wird durch Hindlll, Sall-Doppeldigestion analysiert. Ein Plasmid mit der korrekten Einfügung wird als p31/GAPFL-IT bezeichnet.

d) Konstruktion von Plasmid pJDB207/GAPFL-l-HIR (siehe Abb. 15)

25^g von Plasmid p31/GAPFL-ITwerden vollständig mit Pstl und Sail digeriert; das resultierende 676 bp-Fragment wird auf 10% präparativem Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, isoliert. Die DNA wird elektroeluiert, durch DE52-lonenaustauschchromatografie gereinigt, mit Ethanol ausgefällt und mit einer Konzentration von 0,1 μg/μ.l wieder in dem Puffer zurSuspension gebracht, derfür Hgal-Digerierungen empfohlen wird. Das Sall-Pstl-DNA-Fragment wird bei Vorhandensein von 0,5 Einheiten/^g DNA für die Dauer von 60 min bei 37°C mit Hgal teilweise digeriert. Die Reaktion wird durch den Zusatz von EDTAzu einer Endkonzentration von 1OmM gestoppt. Das 534bp-Sall-Hgal-Fragment wird auf einem 1%igen präparativen Agarose-Gel isoliert. Die DNA wird aus dem Gel elektroeluiert, durch DE52-Chromatografie gereinigt, mit Ethanol ausgefällt und mit einer Konzentration von etwa 0,1 pMol/μΙ in H₂O wieder zur Suspension gebracht.

10Mg von Plasmid pJDB207/PHO5-HIR (siehe Beispiel 16) werden mit Ball und Hindlll digeriert. Das resultierende 587 bp-Ball-Hindlll-Fragment wird auf einem 1%igen präparativen Agarose-Gel isoliert. Die DNA wird elektroeluiert, mit Ethanol ausgefällt und weiter mit Hinfl digeriert.

1,3μρ (16OpMoI) jedes derfolgenden Oligodoxynukleotide

5'-CTGCAGTTGTTTACACCGACTGCACCg-S'

3'-CAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTa-S'

werden wie im Beispiel 24dlll beschrieben kinatisiert und geglüht. 0,6^.g (1,6pMol) des Hinfl-digerierten Ball-Hindlll-Fragmentes (siehe oben) und 16OpMoI des kinatisierten und geglühten Linkers werden 16 Stunden lang bei 15⁰C in 83μΙ von lOmMtris.HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂, 5mM DTT, 3,5mM ATP und 400 Einheiten von T4-DNA-Ligase ligiert. Nach 10 Minuten bei 85°C werden die überschüssigen Linker durch Isopropanolausfällung der DNA entfernt (siehe Beispiel 24dlll). Das584bp-Hgal-Hindlll-Fragmentwird auf einem 1%igen präparativen Agarose-Gel isoliert. Dieelektroeluierte, gereinigte und mit Ethanol ausgefüllte DNA wird mit einer Konzentration von 0,1 pMol/μ,Ι in H₂O wieder zur Suspension gebracht. 5//.g von pJDB207/PHO5-HIR werden mit Hindlll und Sail digeriert, und das große 6,2kb-Fragment wird isoliert. 0,2pMol des 534bp-Sall-Hgal-Fragment.es, 0,2pMol des 584pb-Hgal-Hindlll-Fragmentes und

0,1 pMol des 6,2kb-Sall-Hindlll-Vektorfragmenteswerden 5 Stunden bei 15°Cin 10μΙ von lOmMtris.HCI, pH-Wert7,5,1OmM MgCI₂,5 mM DTT, 1 mM ATP und 400 Einheiten von T4-DNA-Ligase ligiert. Ein Aliquot zu '] μ\ des Ligationsgemisches wird zur Transformation von kompetenten E. coli HB101-Zellen verwendet.

24 transformierte, ampizillinresistente Kolonien werden einzeln in LB-Medium, das 100^g/ml Ampizillin enthält, gezogen. Es wird Plasmid-DNA hergestellt und durch Hindlll,Sall-Doppeldigestion analysiert. Ein einzelnes Klon mit dem korrekten Restriktionsschema wird isoliert und als pJDB207/GAPFL-l-HIR bezeichnet. Die Identität der Invertasesignalfolge und die korrekte Fusion mit der Hirudinkodierungsfolge werden durch Nukleotidfolgebildung bestätigt.

Beispiel 29: *

a) Transformation von Saccharomyces cerevisiae GFR18

Der Stamm Saccharomyces cerevisiae GFR18 (α, his3-11, his3-15, leu2-3, Ieu2-112, can^R) wird transformiert mit den Plasmiden pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1),

pDJB207/PAPFLrHIR(UAS1,

pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2),

pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2),

pJDB207/GAPEL-HIR,

pJDB207/GAPFL-HIR,

pJDB207/[GAPEL-HIR]D,

pJDB207/[GAPFL-HIR]D,

pJDB207/[PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2)]D,

pJDB207/[GAPFL-HIR]T,

pJDB207/GAPFL-l-HIR

unter Anwendung des von Hinnen u.a. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75,1929 [1978]) beschriebenen Transformationsprotokolls.

Die transformierten Hefezellen werden auf Hefe-Minimalmedium-Platten ohne Leuzin ausgewählt. Es werden einzelne transformierte Hefekolonien isoliert und bezeichnet als

Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1),

Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1),

Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2),

Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2),

Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/GAPEL-HIR,

Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/GAPFL-HIR,

Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/[GAPEL-HIR]D,

Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/[GAPFL-HIR]D,

Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/[PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2)]D,

Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/[GAPFL-HIR]T,

Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/GAPFL-l-HIR.

b) Fermentierung der Transformanten

Zellen der S. cerevisiae GFR18-Transformanten werden jeweils in 10ml Hefeminimalmedium (Difco Hefe-Stickstoffbasisohne Aminosäuren, der 2% Glukose und 20mg/l L-Histidin zugesetzt werden) in einem Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 50 ml unter Schütteln für die Dauer von 24 h bei 30⁰C bis zu einer Dichte von 3 χ 10⁷ Zellen/ml gezogen. Bei Hefetransformanten, die Plasmide mit einem PHO5-GAPDH-Promoter enthalten, ist die Derepression des Promoters für die Expression von Desulphatohirudin erforderlich. Die Zellen werden in 0,9% NaCI gewaschen und dazu genutzt, 50 ml eines Minimalmediums mit niedrigem P_rWert, zu inokkulieren, das nach der Rezeptur des Difco Hefe-Stickstoffbasis-Mediums (ohne Aminosäuren) hergestellt wurde, aber0,03g/l KH₂PO₄,10 g/l L-Asparagin anstelle von (NH₄J₂SO₄,2% Glukose und 1 g/l L-Histidin enthält. Die Kulturen werden bis zu einer Zelldichte von 4 χ 10⁶ Zellen/ml inokkuliert und bei 30⁰C bis zu 24h bei200U/min gerührt. Man erhält Enddichten von 1 χ 10⁸ Zellen/ml.

Hefetransformanten, die Plasmide mit dem GAPDH-Promoter aufweisen, expressieren Desulphatohirudin konstitutiv. Zellen werden in einem Komplexmedium gezogen, das aus (g/l) Pepton (5), Hefeextrakt (10), Glukose (20), Sukrose (40), Ammoniumsulfat (3), KH₂PO₄ (2), MgSO₄ (0,5), NaCI (0,1), CaCI₂ (0,1), Biotin (10>g/l) besteht. Nach 48h Inkubationszeit bei 30⁰C und 200U/min erhält man etwa 1 x 10⁹ Zellen/ml.

Die Mengen an Desulphatohirudin (bestimmt anhand der Thrombininhibitionsanalyse), das durch einige repräsentative transformierte Hefestämme abgegeben wird, werden in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Stamm SaccharomycescerevisiaeGFR18/.

Sekretiertes Hirudin (mg/l)

Erntezeit (h)

pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1) pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2) pJDB207/GAPFL-HIR pJDB207/GAPEL-HIR pJDB207/[GAPFL-HIR]D pJDB207/[GAPEL-HIR.]D

24 24 48 48 48 48

Außerdem wird festgestellt, daß wenigstens 90% der Desulphatohirudinverbindungen, die durch die Hefetransformanten expressiert werden, in das Kulturmedium sekretiert werden. Um die Verteilung des Desulphatohirudins in der Kulturbrühe und in den Zellen als eine Funktion der Erntezeit zu bestimmen, wird die Fermentierung in einem 31-MBR-Bioreaktor (MBR Bioreactor AG, Wetzikon, Schweiz) durchgeführt. Der Stamm Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/GAPFL-HIR wird in 3I Komplexmedium (sieheoben) inokkuliert und bei 3O⁰C bei einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min und einer Lüftungsrate von 200 l/h inkubiert. Eine abschließende Dichte von 5 χ 10⁹ Zellen/ml wird reagiert. Proben werden nach 18,24 und 42 Stunden entnommen, und der Gehalt an Desulphatohirudin in der Kulturbrühe und in den Zellen (nach der Zersetzung, siehe Beispiel 22) wird durch die Thrombininhibitionsuntersuchung und durch HPLC bestimmt.

Zeit(h)

Kulturbrühe Zellinneres Kulturbrühe Zeltinneres Kulturbrühe Zellinneres

18 18 24 24 42 42

Desulphatohirudin	(mg/l)
Thrombininhibition	HPLC
60	78
7	<1
70	70
9	<1
110	105
9	<1

Beispiel 30: ' '

Kultivierung der transformanten im Umfang von 3001

a) Der Inokkulationszyklus

Eine Reihe von Agar-Koeffizienten wird aus einer tiefgefrorenen Ampulle inokkuliert, welche Zellen des Stammes Saccharomyces cerevisiae GFR18/pJDB207/GAPFL-HIR enthält. Ein oder mehrere Agar-Koeffizienten werden für 3 bis 5 Tage bei 28⁰C bis 30°C inkubiert. Der Inhalt eines einzelnen Agar-Koeffizienten wird steril in einzelne Erlenmeyer-Kolben zu 500 ml ohne Trennplatten, die 100 ml des Vorkulturmediums enthalten, inokkuliert. Die Kolben werden auf einer Drehschüttelmaschine mit 50mm Ausschlag bei 250U/min bei einer Inkubationstemperatur von 28°C geschüttelt. Nach 48 Stunden werden 2% (Vol./ Vol.) des Inhalts dieser Kolben (1. Vorkultur) steril in 2I-Erlenmeyer-Kolben inokkuliert, die 600ml Vorkulturmedium enthalten. Diese Kolben (2. Vorkultur) werden 48 Stunden lang bei 28°C auf einer Drehschüttelmaschine mit 120 U/min bei einem Ausschlag von 5Ömm geschüttelt. Der Inhalt eines der Kolben mit der 2. Vorkultur (2% Vol./Vol.) wird steril in ein 50l-Fermentiergerätaus rostfreiem Stahl eingeführt, das 301 Vorkulturmedium (Pflanzenvorkultur) enthält. Für die Pflanzenvorkultur werden folgende Fermentierungsbedingungen angewendet: 600U/min (einzelnes Turbinenrührwerk mit sechs Blättern, 115mm Durchmesser), 4 Leitplatten; Druck: 0,3 Bar, Lüftung 11 Luft je Liter Medium je Minute, Temperatur 28⁰C, 48 Stunden Dauer. Das Agar-Medium und das Vorkulturmedium sind gleich, abgesehen vom Vorhandensein bzw. Fehlen vor Agar. Für alle Vorkulturstufen wurde das gleiche Vorkulturmedium verwendet.

Zusammensetzung des Vorkulturmediums (g/l): Hefe-Stickstoffbasis (Difco) 8,4 *

L-Asparagin · H₂O 11,6

L-Histidin 1,0

Glukose (getrennt sterilisiert) 2,0

Zusammensetzung des Agar-Mediums: Wie Vorkuiturmedium plus 20g Agar/I.

b) Die Produktionsfermentierung (300I Maßstab)

5% (Vol./Vol., 151) der gezogenen Pflanzenvorkultur werden steril in ein 600-l-Fermentiergerät eingeführt, das 3001 steriles Fermentierungsproduktionsmedium enthält. Das Produktionsmedium von 3001 hat folgende Fermentierungsbedingungen: - 450U/min (einzelnes Rührwerk, sechs Blätter, Durchmesser 230mm); 4 Leitplatten, Druck0,3Bar; Luftdurchsatz0-9h, 0,25! Luft je Liter Medium je Minute, 9 Stunden-Ernte; 11 Luft je Liter Medium je Minute; Temperatur 28°C, Dauer 24-48h. OD₆₀015-20, Ertrag: 15-25mg/l (Prüfmethoden: HPLC und Thrombinprüfungen).

Zusammensetzung des Produktionsmediums (g/l):

Pepton 5

Hefeextrakt 10

Sukrose 40 .

(NHa)₂SO₄ 6

MgSO₄-7H₂O 1

NaCI 0,1

KH₂PO₄ 2

CaCI₂-2H₂O 0,013

pH-Wert vor der Sterilisation ~6,0

Schaumbildungsunterdrücker: UCON LB 625, soweit erforderlich.

Beispiel 31: Isolierung von Desulphatohirudin aus der Kulturbrühe von 300I

Die Kulturbrühe (siehe Beispiel 30) mit einem pH-Wert von 3,3 wird auf 17°C gekühlt. Die Zellen werden durch eine Entschlammungsvorrichtung Westfalia SA-14(400-600l/h) abgetrennt. Der dicke Schlamm wird weggeworfen. Eine leicht trübe, obenaufschwimmende Schicht wird durch eine Reihe von Skan-Filterkartuschen (erste: Porenbreite 5/xm, zweite: Porenbreite 1 μ,πι, dritte: Porenbreite 0,22 μ,Γη) gefiltert, mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht und einer DEAE-Anionenaustauschkolonne zugeführt. Die Kolonne wird mit Natriumazetat (2OmM, pH-Wert 4,5) gewaschen und mit Natriumazetat (2OmM, pH-Wert 3,1) eluiert. Die Lösung (151) wird mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht und auf ein Endvolumen von 1,81 in einem Umlaufverdampfer gebracht. Ein Aliquot von 11 wird einer Sephadex-G-25-Kolonne zugeführt (Schichtvolumen: 81; die Kolonne wird mit Wasser äquilibriert). Fraktionen, die Desulphatohirudin enthalten, werden durch HPLC identifiziert. Die Desulphatohirudinfraktion (2,5I) wird mit einem Gerät Rotavap im Hochvakuum auf ein Endvolumen von 200ml konzentriert und lyophilisiert.

Ein Aliquot (2 g) des Rohmaterials wird in 50 ml Wasser aufgelöst, mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht und einer Q-Sepharose-Schnellflußkolonne zugeführt (Schichtvolumen: 200 ml). Die Kolonne wird mit Ammoniumformiat (10OmM, pH-Wert 3,9) gewaschen. 25ml-Fraktionen werden entnommen und durch HPLC auf Desulphatohirudin geprüft. Fraktionen, die Desulphatohirudin (1-65) enthalten, werden zusammengefaßt (125 ml) und mit einem Gerät Rotavap im Hochvakuum auf ein Endvolumen von 10 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird einer Sephadex-G-25-Kolonne (Amicon, die Kolonne wird mit Wasser äquilibriert) zum Entsalzen zugeführt. Die gewonnene klare Lösung (25ml) wird lyophilisiert. Der resultierende Feststoff besteht aus reinem Desulphatohirudin.

Beispiel 32: Konstruktion von Plasmid pJDB207/PHO5-EGL

Die Nukleotidfolgenkodierung für Eglin C, ein Polypeptid von 70 Aminosäuren vom Blutegel, wurde in vitro synthetisiert, einer Subklonung unterzogen und in E. coli zur Expression gebracht, wie das in der europäischen Patenanmeldung No. 146785 beschrieben wird. Die exakt im Rahmen erfolgende Verschmelzung der Eglin-Kodierungsfolge mit der Folgekodierung für das PHO5-Signalpeptid wird vollständig analog zur Beschreibung von Hirudin in den Beispielen 15 und 16 erreicht. Ein einziger Klon mit der korrekten Orientierung der Einführung im Vektor wird als pJDB207/PHO5-EGL bezeichnet. Der Stamm Saccharomyces cerevisiaeGFR18 wird wie üblich transformiert. Transformanten werden wie im Beispiel 29 ausgewählt und kultiviert. In der Kulturbrühe kann kein Eglin C festgestellt werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit Hirudinaktivität, gekennzeichnet durch die Kultivierung eines eukaryotischen Wirtsorganismus unter geeigneten Nährbedingungen, welcher mit einem Hybridvektor transformiert wurden, dereine oder mehrere DNA-Einführungen hat, die jeweils bestehen aus einer eukaryotischen Expressionssteuerungsfolge, einem DNA-Segment aus einer ersten DNA-Folge, die eine Signalpeptid oberhalb eines und in einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin kodiert, wobei das DNA-Segment unter der Transkriptionssteuerung der genannten Expressionssteuerungsfolge steht, und einer zweiten DNA-Folge, welche eukaryotische Transkriptionsendsignale enthält, und die Isolierung der Proteine mit Hirudinaktivität aus dem Kulturmedium und, wenn das gewünscht wird, die wahlweise Isolierung zusätzlichen Proteins mit Hirudinaktivität, das zellenassoziiert ist, aus dem Zellinneren und, wenn das gewünscht wird, die Umwandlung eines resultierenden Proteins mit Hirundinaktivität in ein anderes Protein mit Hirudinaktivität.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte zweite DNA-Folge auf die DesulphatohirudinvarianteHVI kodiert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte zweite DNA-Folge auf die Desulphatohirudinvariante HV2 kodiert.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte zweite DNA-Folge auf des-(Val)₂-Desulphatohirudin kodiert.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte zweite DNA-Folge auf die Desulphatohirudinvariante PA kodiert.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Säugetierzellreihe und Hefe besteht.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt Hefe ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionssteuerungsfolge von einem Virus zum Einsatz in einem Säugetierwirt abgeleitet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionssteuerungsfolge von der genomischen DNA für Hefe zum Einsatz in einem Hefewirt abgeleitet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionssteuerungsfolge aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den Promotern der Hefe-Gene GAPDH und PHO5 besteht.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionssteuerungsfolge ein Hybridpromoter ist, das aus oberen Aktivierungsfolgen eines Hefe-Gens und unteren Promoterelementen, einschließlich einer funktionellen TATA-Box, eines anderen Hefe-Gens besteht.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionssteuerungsfolge ein Hybridpromoter ist, das aus oberen Aktivierungsstelle(n) des Hefe-Gens PHO5 und einem unteren Promoterelement, einschließlich der TATA-Box, des Hefe-Gens GAPDH besteht.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Folge, die ein Signalpeptid kodiert, ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus den Signalfolgen von Hefe-Invertase-, a-Faktor-, α-Faktor-, Pheromonpeptidase-, „Killer-Toxin"- und repressiblen Säurephosphotase- (PHO5)Genen und der Glukoamylasesignalfolge von Aspergillus awamori.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Folge, die ein Signalpeptid kodiert, ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus den Signalfolgen der Hefe PHO5- und Invertasegenen besteht.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Folge, welche die eukaryotischen Transkriptionsendsignale enthält, die des Gens ist, das natürlich mit der verwendeten Expressionssteuerungsfolge verbunden ist.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Hefe eingesetzt wird, die mit einem Hybridvektor transformiert wurde, der eine oder mehrere DNA-Einfügungen hat, die jeweils bestehen aus dem PHO5-Promoter, einem DNA-Segment, das besteht aus der PHO5-Signalfolge oberhalb des und im Leserahmen mit einer DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin, wobei das DNA-Segment unter der Transkriptionssteuerung des PHO5-Promoterelementes steht, und der3'-Flankierungsfolge des PHO5-Gens.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Hefe eingesetzt wird, die mit einem
Hybridvektor transformiert wurde, der eine oder mehrere DNA-Einfügungen hat, die jeweils
besteht aus dem GAPDH-Promoter, einem DNA-Segment, das besteht aus der PHO5-Signalfolge oberhalb des und im Leserahmen mit einer DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin,
wobei das DNA-Segment unter derTranskriptionssteuerung des DAPDH-Promoters steht, und der 3'-Flankierungsfolge des PHO5-Gens.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Hefe eingesetzt wird, die mit einem

Hybridvektor transformiert wurde, der eine oder mehrere DNA-Einfügungen hat, die jeweils
bestehen aus einem Hybridpromoter aus oberen Aktivierungsstelle(n) des Hefe-PHO5-Gens und einem unteren Promoterelement, einschließlich derTATA-Box, des Hefe-GAPDH-Gens, einem
DNA-Segment aus der PHO5-Signaifolge oberhalb des und im Leserahmen mit einer DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin, wobei das DNA-Segment unter der
Transkriptionssteuerung des Hybridpromoters steht, und der 3'-Flankierungsfolge des PHO5-Gens. "
19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Hefe eingesetzt wird, die mit einem
Hybridvektor transformiert wurde, der eine oder mehrere DNA-Einfügungen hat, die jeweils
besteht aus dem PHO5-Promoter, einem DNA-Segment aus der Invertase-Signalfolge oberhalb
des und im Leserahmen mit der DNA-Folgekodierung für reifes Desulphatohirudin, wobei das
DNA-Segment unter der Transkriptionssteuerung des PHO5-Promoters steht, und der 3'-Flankierungsfolge des PHO5-Gens.
20. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Hybridvektor eine DNA-Einfügung aufweist.
21. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Hybridvektor zwei bis vier
DNA-Einfügungen aufweist.
22. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Hybridvektor zwei DNA-Einfügungen in einer Tandemanordnung aufweist.
23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die des-(Leu⁶⁴, GIn⁶⁵)-Desulphatohirudinvariante HV1 mit der Formel

VaI VaI Tyr Thr Asp Cys Thr GIu Ser GIy GIn Asn Leu Cys Leu Cys GIu GIy Ser Asn VaI Cys GIy GIn GIy Asn Lys Cys lie Leu GIy Ser Asp GIy GIu Lys Asn. GIn Cys VaI Thr GIy GIu GIy Thr Pro Lys Pro GIn Ser His Asn Asp GIy Asp Phe GIu GIu lie Pro GIu GIu Tyr
hergestellt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DeS-(GIn⁶⁵)-Desulphatohirudinvariante HV1 mit der Formel

VaI VaI Tyr Thr Asp Cys Thr GIu Ser GIy GIn Asn Leu Cys Leu Cys GIu GIy Ser Asn VaI Cys GIy GIn GIy Asn Lys Cys He Leu GIy Ser Asp GIy GIu Lys Asn GIn Cys VaI Thr GIy GIu GIy Thr Pro Lys Pro GIn Ser His Asn Asp GIy Asp Phe GIu GIu lie Pro GIu GIu Tyr Leu
hergestellt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Desulphatohirudinvariante HV1 mit der Formel

VaI VaI Tyr Thr Asp Cys Thr GIu Ser GIy GIn Asn Leu Cys Leu Cys GIu GIy Ser Asn VaI Cys GIy GIn GIy Asn Lys Cys He Leu GIy Ser Asp GIy GIu Lys Asn GIn Cys VaI Thr GIy GIu GIy Thr Pro Lys Pro GIn Ser His Asn Asp GIy Asp Phe GIu GIu lie Pro GIu GIu Tyr Leu GIn
hergestellt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Desulphatohirudinvariante HV2 mit der Formel

He ThrTyrThr Asp Cys Thr GIu Ser GIy GIn Asn Leu Cys Leu Cys GIu GIy Ser Asn VaI Cys GIy Lys GIy Asn Lys Cys lie Leu GIy Ser Asn GIy Lys GIy Asn GIn Cys VaI Thr GIy GIu GIy Thr Pro Asn Pro GIu Ser His Asn Asn GIy Asp Phe GIu GIu He Pro GIu GIu Tyr Leu GIn
hergestellt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Desulphatohirudinvariante PA mit der Formel

He Thr Tyr Thr Asp Cys Thr GIu Ser GIy GIn Asn Leu Cys Leu Cys GIu GIy Ser Asn VaI Cys GIy Lys GIy Asn Lys Cys lie Leu GIy Ser Gin GIy Lys Asp Asn GIn Cys VaI Thr GIy GIu GIy Thr Pro Lys Pro GIn Ser His Asn Gin GIy Asp Phe GIu Pro lie Pro GIu Asp Ala Tyr Asp GIu
hergestellt wird. ^:
28. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß des-(Val)₂-Desulphatohirudin
hergestellt wird.
29. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine gewonnene Desulphatohirudinverbindung mit einem Sulfat und einer Tyrosinsulfotransferase reagiert wird, um die entsprechende Hirudinverbindung zu erhalten.

Hierzu 15 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit Hirudinaktivität.

Die Erfindung gehört in den Bereich der DNA-Rekombinanttechnik, und sie betrifft insbesondere Verfahren zur Hersteilung des Thrombininhibitors Desulphatohirudin mit Hilfe von genetisch manipulierten eukaryotischen Zellen, die genannten genetisch manipulierten eukaryotischen Zellen, Hybridvektoren, die ein Gen für Desulphatohirudin tragen, und Methoden für die Herstellung der genannten eukaryotischen Zellen und der genannten Hybridvektoren.