DE3686399T2 - Herstellung von thrombin-inhibitoren. - Google Patents

Herstellung von thrombin-inhibitoren.

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DE3686399T2
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Description

  • Die Erfindung gehört in den Bereich der DNA-Rekombinationstechnik, und sie betrifft eine Methode zur Herstellung des Thrombininhibitors Desulfatohirudin mit Hilfe von genetisch manipulierten Hefezellen, die genannten genetisch manipulierten Hefezellen, Hybridvektoren, die ein Gen für Desulfatohirudin tragen, und Methoden für die Herstellung der genannten Hefezellen und der genannten Hybridvektoren.
  • Hirudin ist ein Antikoagulans, das natürlich in Blutegeln (Hirudo medicinalis) vorkommt. Hirudin ist keine einzelne Proteinspezies, sondern besteht aus wenigstens drei Komponenten, die als Hirudinvariante 1 (HV1), Hirudinvariante 2 (HV2) (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 158 564) und "Des-(Val)&sub2;-Hirudin" (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 158 986) bezeichnet werden. Die Varianten unterscheiden sich in der Struktur durch eine Reihe von Aminosäuren voneinander (insbesondere ist die N-terminale Sequenz von HV1 Val-Val-Tyr, die von HV2 ist Ile-Thr-Tyr und die von "Des-(Val)&sub2;-Hirudin" ist Thr-Tyr), haben aber gemeinsam eine Akkumulation von hydrophoben Aminosäuren am N-Terminus und von polaren Aminosäuren am C-Terminus, einen als Sulfatmonoester vorhandenen Tyrosinrest (Tyr&sup6;³), drei Disulfidbrücken und die Wirkung als Antikoagulans.
  • Hirudin, mit einem Ki-Wert (Komplexdissoziationskonstante) von 6 x 10&supmin;¹¹M ist, ist der stärkste bekannte Thrombininhibitor und ist gekennzeichnet durch eine spezifische Affinität zu Thrombin. Andere Enzyme der Blutgerinnungskaskade werden nicht durch Hirudin inhibiert. Im Gegensatz zu Heparin, dem bevorzugten Antikoagulans in der konventionellen Antikoagulationstherapie, übt Hirudin seine inhibitierende Wirkung direkt auf Thrombin aus, wirkt also nicht wie das Erstgenannte durch Antithrombin III. Die einzige pharmakologisch feststellbare Wirkung von gereinigtem Hirudin ist die Unterbindung der Blutkoagulation und die Prophylaxe von Thrombose. Eine Wirkung auf den Herzschlag, die Atmung, den Blutdruck, die Thrombozytzählung, Fibrinogen und Hämoglobin konnte nicht beobachtet werden bei der intravenösen Verabreichung an Hunde, selbst bei hohen Dosen nicht. Bei Versuchen an Ratten, Schweinen und Hunden erwies sich Hirudin als wirksam bei der experimentellen Thrombose (induziert durch Stase oder die Injektion von Thrombin), beim Endotoxinschock und auch bei der DIC (disseminierte intravaskuläre Koagulation). Wenn Direktvergleichsversuche durchgeführt wurden, erwies sich Hirudin immer als dem Heparin überlegen. Außerdem hat Hirudin eine extrem geringe Toxizität, ist nicht antigen und wird über die Nieren in biologisch aktiver Form fast vollständig ausgeschieden.
  • Obwohl seit langem bekannt, hat Hirudin nicht die breite therapeutische Anwendung gefunden. die man auf Grund der ausgezeichneten biologischen Eigenschaften erwarten könnte. Seine extrem geringe Verfügbarkeit ist ein schwerwiegender Nachteil, der einer verbreiteten Anwendung in der Medizin im Wege steht. Bisher standen Hirudinpräparate im wesentlichen nur aus natürlichem Material (Blutegelextrakte) gewonnen zur Verfügung, was teuer und nur schwer erhältlich ist und die Anwendung zeitraubender und kostspieliger Isolations- und Reinigungsverfahren beinhaltet (siehe P. Walsmann u.a., Pharmazie 36, 653 (1981); europäische Patentanmeldung Nr. 158 986). Angesichts der relativ langen Sequenz von 65 Aminosäuren bietet aus wirtschaftlichen Gründen auch die herkömmliche Peptidsynthese nur wenig Hoffnung auf Erfolg. Für die Herstellung angemessener Mengen an Hirudin müssen daher neue Methoden angewendet werden, die eine detaillierte klinische Erprobung des therapeutischen Potentials und der breiten therapeutischen Anwendung in der Antikoagulationstherapie ermöglichen.
  • Solche Methoden bietet insbesondere die DNA-Rekombinationstechnik. Mit dieser Technik ist es möglich, die unterschiedlichsten physiologisch aktiven Polypeptide durch Züchtung entsprechend genetisch modifizierter Wirtsorganismen herzustellen. In diesem Zusammenhang muß erwähnt werden, daß Hirudin von den Blutegeln vermutlich über einen Desulfatohirudinvorläufer produziert wird, der post-translationell sulfatiert wird. Es wird erwartet, daß anderen Wirten als Blutegeln das spezifische Sulfatübertragungsenzymsystem fehlt und sie daher Desulfatohirudine statt Hirudine produzieren. Die biologische Aktivität wird jedoch durch das Fehlen der Sulfatgruppe nicht beeinträchtigt, wie durch das Desulfatohirudinprotein gezeigt wird, das durch enzymatische Entfernung der Sulfatgruppe aus der Phenolhydroxygruppe des Tyr&sup6;³-Restes des entsprechenden Hirudinproteins gewonnen wird (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 142 860).
  • In der kürzlich veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 158 564 wird die Herstellung von Desulfatohirudinvarianten 1 und 2 und deren Analoge mittels E.coli-Zellen, die mit Plasmiden, welche die Strukturgene für die entsprechenden Desulfatohirudine enthalten, transformiert wurden, geoffenbart. Die Antikoagulationsaktivität, die in Zellextrakten von kultivierten E.coli-Zellen gemessen wurde und als Antithrombineinheiten (ATU) gegeben wird, beläuft sich auf 3000 - 4000 ATU/OD&sub6;&sub0;&sub0;/l Kultur, was einer Konzentration von 0,2 mg Hirudin/OD/l entspricht (auf der Grundlage einer geschätzten spezifischen Aktivität von reinem Hirudin von 15 000 - 20 000 ATU/mg).
  • Vermutlich ist der geringe Ertrag an Hirudinaktivität, der von transformierten E.coli-Zellen gewonnen wird, auf eine Ansammlung des größten Teils des Hirudinproteins in einer inaktiven Form im Zytoplasma auf Grund der inkorrekten Faltung des Moleküls zurückzuführen. Die korrekte Faltung ist von der Bildung von drei Disulfidbrücken innerhalb des Hirudinmoleküls abhängig, die für die Enzymaktivität wesentlich sind (siehe P. Walsmann u.a., ebenda). Andere natürlich sekretierte Säugetierproteine, wie Rinderwachstumshormon, menschlicher Gewebeplasminogenaktivator und menschliches γ-Interferon sind ebenfalls im wesentlichen inaktiv, wenn sie im Zytoplasma von Mikroorganismen erzeugt und akkumuliert werden [siehe R.A. Smith u.a., Science 229, 1219 (1985)]. Es ist offensichtlich, daß die Sekretionsbahn die Bildung der Disulfidbindung begünstigen kann, da die meisten Proteine, welche Disulfidbrücken enthalten, extrazellulär sind. Es gibt weitere Merkmale, die eine Sekretion äußerst wünschenswert erscheinen lassen:
  • Sekretierte Proteine sind im allgemeinen leichter festzustellen und zu reinigen als intrazellulär akkumulierte Produkte; durch die Sekretion der gewünschten Produkte in das Medium wird die Notwendigkeit des Aufbrechens des Wirtsorganismus zur Gewinnung des Produktes vermieden; bestimmte heterologe Proteine können eine toxische Wirkung auf den Wirtsorganismus haben. Werden sie sekretiert, ist die Wahrscheinlichkeit der Störung der normalen Zellfunktionen geringer; sekretierte Proteine werden mit geringerer Wahrscheinlichkeit durch proteolytische Enzyme verdaut als intrazellulär akkumulierte Proteine, die von diesen Enzymen bei Auflösung der Zellen angegriffen werden.
  • Die meisten sekretierten Proteine werden auf der DNA als Präproteine mit einem Signalpeptid als angefügter Aminoterminalerweiterung der reifen Aminosäuresequenz codiert. Das Signalpeptid spielt eine wesentliche Rolle bei der cotranslationalen Insertion des Proteins in die Membranen des endoplasmatischen Retikulums (ER). Eine Signalpeptidase spaltet das Signalpeptid früh auf der Luminalseite des ER. Der Weitertransport zur äußeren Zellmembran involviert Golgi- und sekretorische Bläschen. Das Protein wird entweder in den periplasmatischen Raum (z.B. saure Phosphatase, Invertase) oder in das Kulturmedium (z.B. α-Faktor, Killertoxin) sekretiert.
  • Da alle Eukaryoten die Mechanismen für die Expression der genetischen Information und für die Sortierung der exprimierten Proteine zu teilen scheinen, erfolgt die Expression von eukaryotischen Genen mit größerer Effektivität in einem eukaryotischen Wirt als in E.coli. Am leichtesten zu kultivieren und zu handhaben ist von den eukaryotischen Organismen die Hefe. Eine Reihe heterologer Proteine wurde erfolgreich in Hefe exprimiert. Es war bisher jedoch noch nicht möglich, wesentliche Merkmale eines Proteins - mit Ausnahme eines angefügten Signalpeptids - zu definieren, welche die wirksame Sekretion in das Medium erlauben würden. Es ist daher nicht möglich, zuverlässige Vorhersagen dahingehend zu machen, ob ein Protein sekretiert wird oder nicht. Während 90% der gesamten Glukoamylase, die von transformierter Hefe erzeugt wird (welche die genetische Information für Präglukoamylase enthält), in das Medium sekretiert werden (PCT-Patentanmeldung Nr. 84/2921) und hohe Titer des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) in dem Medium von kultivierter Hefe gefunden werden, welche das EGF-Gen mit dem angefügten α-Faktor-Signalpeptid enthält (europäische Patentanmeldung Nr. 116 201), sind nur geringe Mengen oder Spuren von β-Endorphin (α-Faktor-Signalpeptid, PCT-Patentanmeldung Nr. 84/4330), Leukozyten-Interferon A (Invertase-Signalpeptid, europäische Patentanmeldung Nr. 127 304), Human-γ-Interferon, Humanserumalbumin, Rinderinterferonen α1 und α2, Gewebeplasminogenaktivator, Rennin und humaninsulinähnlichem Wachstumsfaktor (α-Faktor-Signalpeptid, europäische Patentanmeldung Nr. 123 544), Leukozyten-Interferonen D und A, γ-Interferon und menschlichem Wachstumshormon (MGH) (Interferon- bzw. MG H-Signalpeptide, europäische Patentanmeldung Nr. 88 632) im Medium feststellbar, und es wird keine Sekretion von Pseudomonas- Carboxypeptidase G&sub2;(CPG&sub2;) [G&sub2;(CPG&sub2;)-Signalpeptid, europäische Patentanmeldung Nr. 121 352] und Gewebeplasminogenaktivator (PHO5-Signalpeptid, europäische Patentanmeldung Nr. 143 081) durch tranformierte Hefe in das Medium beobachtet.
  • Folglich kann nicht vorhergesagt werden, ob ein gegebenes Protein mit einem angefügten Signalpeptid durch die Hefe sekretiert wird oder nicht, wobei die Sekretion vor allem vom gewählten Protein abhängig ist. Es war folglich ungewiß, ob ein gewähltes Protein, beispielsweise Hirudin, mit einem angefügten Signalpeptid sekretiert würde, wenigstens zu einem gewissen Grad, durch transformierte Hefe-Wirtszellen.
  • Überraschenderweise wurde nun festgestellt, daß Proteine mit Hirudinaktivität durch Hefe- Wirtszellen in das Medium sekretiert werden, welche eine DNA enthalten, die eine DNA-Sequenz aufweist, die für ein bestimmtes Signalpeptid codiert, stromaufwärts vom und im Leserahmen mit dem Strukturgen für Desulfatohirudin.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Methode für die Herstellung und Sekretion von Proteinen mit Hirudinaktivität in Hefe-Wirtszellen zu bieten. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Hybridvektoren zu schaffen, die eine DNA-Sequenz aufweisen, welche für ein Signalpeptid codiert, stromaufwärts vom und im Leserahmen mit dem Strukturgen für Desulfatohirudin, und Hefe-Wirtszellen, die mit den genannten Hybridvektoren transformiert werden.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung: 1. Verfahren für die Herstellung von Desulfatohirudin:
  • Die Erfindung betrifft eine Methode für die Herstellung von Desulfatohirudin, und sie besteht darin, unter entsprechenden Nährstoffbedingungen Hefe-Wirtszellen, die mit einem Hybridvektor transformiert wurden, welcher ein oder mehrere DNA-Inserts hat, jeweils umfassend eine Hefe-Expressionskontrollsequenz, ein DNA-Segment bestehend aus einer ersten DNA-Sequenz, die für das Hefe-PHO5- oder Invertase-Signalpeptid codiert, stromaufwärts (upstream) von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die codiert für reifes Desulfatohirudin, wobei das DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollsequenz ist, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält, zu kultivieren und Desulfatohirudin aus dem dem Kulturmedium zu isolieren.
  • Der Begriff "für reifes Disulfatohirudin codierende DNA-Sequenz" soll alle Strukturgene einschließen, die für reife Proteine codieren, welche Hirudinaktivität haben, deren Existenz im Blutegel-Genom bekannt ist und/oder die aus dem Blutegel-Genom isoliert werden können, wie die Strukturgene für die reifen Disulfatohirudinvarianten HV1, HV2, PA und für Des-(Val&sub2;)- Desulphatohirudin (wenn letzteres nicht nur ein Artefakt der Expression des HV1-Gens ist). Der Begriff "reifes Disulfatohirudin" bezieht sich auf Desulphatohirudine, die frei von jeden Prä- und Prosequenzen sind.
  • Unter "Proteinen mit Hirudinaktivität" sind die Proteine zu verstehen, die von den sekretierenden Wirtszellen gewonnen werden, die eine thrombininhibitierende Wirkung und eine positive Reaktion mit Antihirudinantikörpern haben und die die Primärstruktur eines Desulphatohirudins haben, sowie deren modifizierte, beispielsweise sulfatierte, Derivate, z.B. die entsprechenden Hirudine, und deren verkürzte Derivate, beispielsweise Desulphatohirudine, denen eine bis sieben Aminosäuren am C-Terminus fehlen.
  • Solche Proteine sind vor allem die mit den Formeln
  • worin X den Dipeptidrest Val-Val- (HV1) oder Thr (Des-(Val)&sub2;-Hirudin) darstellt und R die phenolische Hydroxygruppe von Tyr oder eine Gruppe mit der Formel -O-SO&sub3;H darstellt, und die Derivate, denen die C-terminale Aminosäure Gln, das C-terminale Dipeptid-Leu-Gln, das C-terminale Tripeptid-Tyr(R)-Leu-Gln oder das C-terminale Tetrapeptid -Glu-Tyr(R)-Leu-Gln fehlt, oder
  • (HV2), worin R die oben genannten Bedeutungen hat, oder eine andere Hirudinvariante mit der Bezeichnung Hirudin PA, die von Blutegeln erzeugt wird (J.Dodt, Dissertation, Universität München, BRD, 1984) und folgende Formel hat
  • (PA), worin R die oben genannten Bedeutungen hat.
  • Das bevorzugte Protein mit Hirudinaktivität ist das der Formel I, worin X den Rest Val-Val- und R die phenolische Hydroxygruppe von Tyr darstellen, und deren Derivate, die am C-Terminus um eine bis sieben, insbesondere eine bis vier, Aminosäuren verkürzt sind.
  • Geeignete Hefe-Wirtszellen sind speziell Zellen von Saccharomyces cerevisiae.
  • Die Hefe-Wirtszellen, die die oben genannten DNA-Sequenzen enthalten, werden unter Anwendung bekannter Methoden kultiviert.
  • So werden transformierte Hefezellen gemäß der Erfindung in einem flüssigen Medium gezüchtet, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.
  • Es können verschiedene Kohlenstoffquellen genutzt werden. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlehydrate, wie Glucose, Maltose, Mannitol oder Lactose, oder ein Acetat, wie Natriumacetat, die entweder allein oder in geeigneten Gemischen eingesetzt werden können. Zu den geeigneten Stickstoffquellen gehören beispielsweise Aminosäuren, wie Casaminosäuren, Peptide und Proteine und deren Abbauprodukte, wie Trypton, Pepton, oder Fleischextrakte, außerdem Hefeextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, dazu Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, -sulfat oder -nitrat, die entweder allein oder in geeigneten Mischungen eingesetzt werden können. Anorganische Salze, die verwendet werden können, sind unter anderen beispielsweise Sulfate, Chloride, Phosphate und Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium. Zusätzlich kann das Nährmedium auch wachstumsfördernde Substanzen enthalten. Zu den wachstumfördernden Substanzen gehören beispielsweise Spurenelemente wie Eisen, Zink, Mangan und ähnliche oder einzelne Aminosäuren.
  • Hefezellen, die mit autonom replizierenden Plasmiden, beispielsweise Plasmiden, die Hefe- 2µ-Plasmid-DNA (infra) enthalten, transformiert wurden, tendieren im unterschiedlichen Maße dazu, das eingeführte Hybridplasmid zu verlieren. Aus diesem Grund müssen solche Hefezellen unter selektiven Bedingungen gezüchtet werden, d.h., Bedingungen, welche die Expression eines Plasmid-codierten Gens für das Wachstum erfordern. Die meisten selektiven Marker, die gegenwärtig genutzt werden und die in den erfindungsgemäßen Hybridvektoren vorhanden sind (infra), sind Gene, die für Enzyme der Aminosäure- oder Purinbiosynthese codieren. Dadurch wird es notwendig, synthetische Minimalmedien zu verwenden, denen die entsprechende Aminosäure oder Purinbase fehlt. Verwendet werden können aber auch Gene, die Resistenz gegen ein entsprechendes Biozid verleihen (z.B. Gene, die Resistenz gegen Cycloheximid, das Aminoglykosid G 418, ein Schwermetall oder ähnliches verleihen). Hefezellen, die mit Vektoren transformiert wurden, die antibiotische Resistenzgene enthalten, werden in komplexen Medien gezüchtet, die das entsprechende Antiobiotikum enthalten, wodurch größere Wachstumsraten und höhere Zelldichten erreicht werden.
  • Hefezellen, die mit DNA transformiert wurden, die in ein Chromosom integriert, erfordern keine selektiven Wachstumsbedingungen. Diese transformierten Zellen sind ausreichend stabil, um das Wachstum ohne selektiven Druck zu ermöglichen. Diese Zellen werden vorteilhaft in komplexen Medien gezüchtet.
  • Hefezellen, die Hybridplasmide mit einem konstitutiven Promotor (z.B. ADHI, GAPDH) enthalten, exprimieren das Disulfatohirudin-Gen kontrolliert durch den Promotor ohne Induktion. Wenn das Disulfatohirudin-Gen aber unter der Kontrolle eines regulierten Promotors ist (z.B. PGK oder PHO5), muß die Zusammensetzung des Wachstumsmediums angepaßt werden, um maximale Niveaus von mRNA-Transcripten zu erreichen, d.h., wenn der PHO5-Promotor eingesetzt wird, muß das Wachstumsmedium eine geringe Konzentration von anorganischem Phosphat zur Derepression dieses Promotors enthalten.
  • Die Kultivierung erfolgt unter Anwendung herkömmlicher Methoden. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit, werden so ausgewählt, daß maximale Mengen Desulphatohirudin erzeugt werden. Ein gewählter Hefestamm wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen in Submerskultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 25º bis 35ºC, vorzugsweise etwa 30ºC, bei einem pH-Wert zwischen 4 und 8, beispielsweise einem pH-Wert von etwa 7, und für die Dauer von 4 bis 20 Stunden, vorzugsweise bis zum Erreichen der Maximalausbeute an Proteinen, gezüchtet.
  • Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß unabhängig vom eingesetzten Hefewirt und spezifizierten Signalpeptid der größte Teil der erzeugten Hirudinverbindungen in das Kulturmedium sekretiert wird, während nur ein geringer Teil der Zelle zugeordnet bleibt. Das genaue Verhältnis (sekretierte Verbindungen/zellenassoziierte Verbindungen) ist von den Fermentationsbedingungen und dem angewendeten Gewinnungsverfahren abhängig. Im allgemeinen beläuft es sich auf etwa 9:1 oder mehr. Dementsprechend ist sekretiertes Hirudin immer stark vorherrschend.
  • Die Hirudinverbindungen können durch herkömmliche Mittel aus dem Kulturmedium isoliert werden. Beispielsweise besteht der erste Schritt in der Regel darin, die Zellen durch Zentrifugieren vom Kultur-Fluid zu trennen. Der resultierende Überstand kann an Hirudinverbindungen angereichert werden durch Behandlung mit Polyethylenimin, um den größten Teil des nicht-proteinhaltigen Materials zu entfernen, und Ausfällung der Proteine durch Sättigung der Lösung mit Ammoniumsulfat oder durch Trichloressigsäure. Soweit Wirtsproteine vorhanden sind, können sie auch Ansäuerung mit Essigsäure (z.B. 0,1%, pH-Wert 4-5) ausgefällt werden. Eine weitere Anreicherung der Hirudinverbindungen kann durch Extraktion des Essigsäure-Überstands mit n-Butanol erreicht werden. Weitere Reinigungsschritte schließen beispielsweise die Entsalzung, chromatographische Verfahren, wie die Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Verteilungschromatographie, HPLC, Umkehrphasen-HPLC und ähnliche ein. Die Trennung der Bestandteile des Gemischs erfolgt auch durch Dialyse, der Ladung entsprechend durch Gelelektrophorese oder trägerfreie Elektrophorese, der Molekülgröße entsprechend durch eine geeignete Sephadex-Säule, durch Affinitätschromatographie, beispielsweise mit Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikörpern, oder mit Thrombin, das an einen geeigneten Träger für die Affinitätschromatographie gekoppelt ist, oder durch andere Prozesse, insbesondere die aus der Fachliteratur bekannten.
  • Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß neben den Desulfatohirudinverbindungen, die der "DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatochirudin codiert" entsprechen, einige andere Desulfatohirudinverbindungen aus der Kulturbrühe isoliert werden können, die sich von den erwarteten Verbindungen durch das Fehlen von ein bis vier Aminosäuren am C-Terminus unterscheiden. So ergibt die Kultivierung von Hefezellen, die das für die Desulfatohirudinvariante HV1 codierende Gen tragen, diese Variante sowie, in geringeren Mengen, Desulfatohirudinverbindungen, denen die C-terminale Aminosäure Gln [Des-(Gln&sup6;&sup5;)-Desulfatohirudin], der C-terminale Dipeptidrest -Leu-Gln [Des-(Leu&sup6;&sup4;, Gln&sup6;&sup5;)-Desulfatohirudin], der C-terminale Tripeptidrest-Tyr-Leu-Gln [Des-(Tyr&sup6;³, Leu&sup6;&sup4;, Gln&sup6;&sup5;)-Desulfatohirudin] bzw. der C-terminale Tetrapeptidrest -Glu-Tyr-Leu-Gln [Des-(Glu&sup6;², Tyr&sup6;³, Leu&sup6;&sup4;, Gln&sup6;&sup5;)-Desulfatohirudin] fehlen. Diese Verbindungen können durch (partiellen) proteolytischen Abbau des primären Expressionsproduktes Desulfatohirudin gebildet worden sein und wurden in allen Kulturbrühen identifiziert, ungeachtet des verwendeten Hefewirts und der angewendeten Fermentationsbedingungen.
  • Zur Feststellung der Hirudinaktivität können der Test mit Antihirudin- oder Antidesulfatohirudinantikörpern (beispielsweise monoklonale Antikörper, die aus Hydridomzellen gewonnen werden können), der Thrombintest (M.U. Bergmeyer (Hsg.), Methods in Enzymatic Analysis, Vol. II, S. 314-316, Verlag Chemie, Weinheim (BRD) 1983) oder der Blutgerinnungstest (F. Markwardt u. a., Thromb. Haemost. 47, 226 (1982)) angewendet werden.
  • Die transformierten Hefe-Wirtszellen gemäß dieser Erfindung können durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden, die folgende Schritte umfassen:
  • - Schaffung eines DNA-Konstrukts, enthaltend eine Hefe-Expressionskontrollsequenz, ein DNA- Segment, bestehend aus einer ersten DNA-Sequenz, codierend für das Hefe-PHO5- oder -Invertase-Signalpeptid, stromaufwärts (upstream) von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, wobei das DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollsequenz steht, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält,
  • - Schaffung eines Hybridvektors, der das genannte DNA-Konstrukt einschließt,
  • - Transformation geeigneter Hefe-Wirtszellen mit dem geschaffenen Hybridvektor,
  • - Selektion transformierter Wirtszellen von untranformierten Wirtszellen.
    • 2. DNA-Konstrukte, welche die codierenden Regionen eines Signalpeptids und von Desulfatohirudin aufweisen:
  • Die Erfindung betrifft ein DNA-Konstrukt, das enthält eine Hefe-Expressionskontrollsequenz, ein DNA-Segment bestehend aus einer ersten DNA-Sequenz, die für das Hefe- PHO5- oder Invertase-Signalpeptid codiert, stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, wobei das DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollsequenz ist, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält.
  • Für die Regulierung der Expression der DNA-Sequenzen, die für das Signalpeptid und Desulfatohirudin codieren, können verschiedene Hefe-Expressionskontrollsequenzen verwendet werden. Insbesondere werden Expressionskontrollsequenzen von überexprimierten (highly expressed) Hefe-Genen verwendet.
  • Expressionskontrollsequenzen für Hefe werden abgeleitet von der genomischen DNA von Hefe, insbesondere von Saccharomyces cerevisiae. Vorzugsweise wird die Expressionskontrollsequenz eines überexprimierten Hefegens für die Expression von Desulfatohirudin verwendet. So kann der Promotor von TRP1-Gen, ADHI- oder ADHII-Gen, saure Phosphatase(PHO5-)-Gen, Isocytochrom-c-Gen oder ein Promotor von Enolase-, Glyzerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase- (GAPDH), 3-Phosphoglyceratkinase- (PGK), Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofruktokinase-, Glucose-6-phosphatisomerase-, 3-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase-Genen oder ein Promotor der Hefepaarungspheromon-Gene, die für den a- oder α-Faktor codieren, eingesetzt werden.
  • Möglich ist es auch, Hybridpromotoren zu verwenden, die aus Upstream-Akivierungssequenzen (UAS) eines Hefegens und Downstream-Promotorelementen einschließlich einer funktionellen TATA-Box eines anderen Hefegens bestehen, beispielsweise einen Hybridpromoter mit den UAS(s) des Hefe-PHO5-Gens und Downstream-Promotorelementen einschließlich einer funktionellen TATA-Box des Hefe-GAPDH-Gens. Bevorzugte Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten Promotoren mit Transcriptionskontrolle. Promotoren dieses Typs, z.B. der Promotor des PHO5-Gens und PHO5-GAPDH-Hybridpromotoren, können durch Änderung der Wachstumsbedingungen ein- und ausgeschaltet werden. Beispielsweise kann der PHO5-Promotor willkürlich reprimiert oder dereprimiert werden, einfach durch Erhöhung oder Verringerung der Konzentration des anorganischen Phosphats im Medium. Ein weiterer bevorzugter Promotor gemäß der Erfindung ist der Promotor des GAPDH-Gens, insbesondere dessen funktionelles Fragment, beginnend bei Nucleotid -300 bis -1800, vorzugsweise bei Nucleotid -263 oder -119, und bei Nucleotid -5 des GAPDH-Gens endend.
  • Die erfindungsgemäßen Signalsequenzen sind die vom Hefe-PHO5-Gen, codierend für ein Signalpeptid mit der Formel:
  • Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala
  • und vom Hefe-Invertase-Gen, codierend für ein Signalpeptid mit der Formel:
  • Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys Ile Ser Ala
  • Die DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, wird speziell aus den oben spezifizierten Strukturgenen für Desulfatohirudine ausgewählt. Die bevorzugte DNA-Sequenz codiert für Desulfatohirudin-Variante 1 (HV 1) und hat die Formel
  • Eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transkriptionsterminationssignale enthält, ist vorzugsweise die 3'-flankierende Sequenz eines Hefegens, das entsprechende Signale für die Transcriptionstermination und Polyadenylierung enthält. Geeignete 3'-flankierende Sequenzen sind beispielsweise die des Gens, die natürlich mit der verwendeten Expressionskontrollsequenz verbunden sind. Die bevorzugten flankierenden Sequenzen sind die des Hefe-PHO5-Gens. Vorzugsweise ist das DNA-Konstrukt nach der vorliegenden Erfindung an beiden Enden mit synthetischen Desoxynucleotid-Linkern versehen, welche die Insertion und Klonierung des Konstrukts in einem Klonierungsvektor gestatten.
  • Die Hefe-Expressionskontrollsequenz, die DNA-Sequenz, die für das Signalpeptid codiert, die DNA-Sequenz, die für reifes Disulfatohirudin codiert, und die Hefe-Transcriptionsterminationssignale sind operativ miteinander verkettet, d.h., sie sind so aneinander gelagert, daß ihre normalen Funktionen aufrechterhalten werden. Folglich ist die Anordnung so, daß die Expressionskontrollsequenz die richtige Expression des Signalpeptid-Desulfatohirudin-Gen-Komplexes bewirkt die Transcriptionsterminationssignale die richtige Termination von Transcription und Polyadenylierung bewirken, und die Signalsequenz so mit dem Desulfatohirudingen verknüpft ist, daß die Sekretion des Desulfatohirudins erfolgt. Wenn demzufolge die Expressionskontrollsequenz und die Signalsequenz von verschiedenen Genen abgeleitet werden, wird die Expressionskontrollsequenz vorzugsweise mit der Signalsequenz zwischen dem mRNA-Hauptstart und dem ATG des Gens verbunden, das natürlich mit der Expressionskontrollsequenz verkettet ist. Die Signalsequenz sollte ihr eigenes ATG für die Translationsinitiation haben. Die Verbindung dieser Sequenzen geschieht vorzugsweise durch synthetische Oligodesoxynucleotid-Linker, welche die Erkennungssequenz einer Endonuclease tragen können. Andererseits ist der letzte Codon der Signalsequenz direkt mit dem ersten Codon des Gens für Desulfatohirudin verkettet.
  • Die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte können nach Methoden hergestellt werden, die in Fachkreisen bekannt sind, beispielsweise durch Verknüpfen einer Hefe-Expressionskontrollsequenz eines DNA-Segments, bestehend aus einer ersten DNA-Sequenz, codierend für das Hefe-PHO5- oder -Invertase-Signalpeptid, stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für Desulfatohirudin codiert, und einer DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält, in der vorbestimmten Reihenfolge.
  • Die Verbindung der verschiedenen DNA-Sequenzen zur Schaffung der DNA-Konstrukte gemäß der Erfindung kann durch Ligation stumpfer Enden oder über geeignete gemeinsame Restriktionsstellen oder synthetische Linkermoleküle erfolgen, wobei besonders auf eine richtige Verbindung zu achten ist, so daß die normalen Funktionen dieser DNA-Sequenzen aufrechternalten werden. So können die Signalsequenz und das Desulfatohirudin-Gen durch Ligation stumpfer Enden verbunden werden. Eine andere Möglichkeit zur Herstellung der richtigen Verbindung von Signalsequenz und Desulfatohirudin-Gen ist, wenn möglich, die Restriktion der Signalsequenz nahe ihres 3'-Terminus und des Desulfatohirudins nahe des 5'-Terminus, so daß jeder Sequenz eine festgelegte Zahl von Basenpaaren fehlt. Ein synthetischer Oligodesoxynucleotid-Linker kann dann so aufgebaut werden, daß bei der Verbindung der restringierten Signalsequenz und des restringierten Desulfatohirudin-Gens durch das verbindende Oligodesoxynucleotid die fehlenden Basenpaare wiederhergestellt werden und das Desulfatohirudin-Gen im richtigen Leserahmen im Verhältnis zur Signalsequenz ist.
  • Die DNA-Sequenz, die für Desulfatohirudin codiert, kann aus genomischer Blutegel-DNA isoliert werden, oder eine komplementäre doppelsträngige Desulfatohirudin-DNA (Desulfatohirudin-ds-cDNA) wird aus Desulfatohirudin-mRNA erzeugt oder es wird ein Gen, das für die Aminosäuresequenz von Desulfatohirudin codiert, durch chemische und enzymatische Prozesse erzeugt.
  • Genomische Desulfatohirudin-DNA und Desulfatohirudin-ds cDNA werden beispielsweise nach Methoden gewonnen, die allgemein in Fachkreisen bekannt sind. Beispielsweise wird genomische Desulfatohirudin-DNA von einer Blutegel-Genbank gewonnen, die das Desulfatohirudin-Gen enthält, durch Klonierung der Blutegel-DNA-Fragmente in einem Mikroorganismus und Identifizierung von Klonen, die Desulfatohirudin-DNA enthalten, beispielsweise durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung eines radioaktiv markierten, Desulfatohirudin-DNA-spezifischen Oligodesoxynucleotids, das mindestens 15, vorzugsweise 15 bis 30 Desoxynucleotide enthält. Die resultierenden DNA-Fragmente enthalten in der Regel neben dem Desulfatohirudin-Gen andere unerwünschte DNA-Bestandteile, die durch Behandlung mit geeigneten Exo- oder Endonucleasen entfernt werden können.
  • Doppelsträngige Desulfatohirudin-cDNA kann beispielsweise durch Isolierung von mRNA aus geeigneten Blutegelzellen gebildet werden, die vorzugsweise zur Hirudinbildung angeregt werden, Anreicherung der Desulfatohirudin-mRNA im resultierenden mRNA-Gemisch auf bekannte Weise, Verwendung dieser mRNA als Matrize für die Herstellung von einsträngiger cDNA, Synthetisieren von ds-cDNA aus dieser mit Hilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase und Klonierung in einen geeigneten Vektor. Klone, die Desulfatohirudin-cDNA enthalten, werden beispielsweise auf die oben beschriebene Weise durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung eines radioaktiv markierten, Desulfatohirudin-DNA-spezifischen Oligodesoxynucleotids identifiziert.
  • Das Desulfatohirudin-Gen kann auch durch chemische Synthese hergestellt werden. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß Segmente des codierenden und des komplementären Stranges des genannten Gens chemisch synthetisiert werden und die resultierenden Segmente enzymatisch in ein Strukturgen für Desulfatohirudin umgewandelt werden.
  • Die chemische Synthese von DNA ist in Fachkreisen allgemein bekannt und nutzt herkömmliche Verfahren. Geeignete Verfahren wurden von S.A. Narang (Tetrahedron 39, 3 (1983)) zusammengestellt. Insbesondere können die Methoden angewendet werden, die in der europäischen Patentanmeldung Nr. 146 785 beschrieben werden und die hier durch Bezugnahme zum Inhalt gemacht werden.
  • Auf analoge Weise kann die Signalsequenz durch chemische Synthese hergestellt oder aus Chromosomen-DNA von Hefe isoliert werden.
    • 3. Hybridvektoren, welche die DNA-Konstrukte mit den codierenden Regionen eines Signalpeptids und von Desulfatohirudin enthalten:
  • Erfindungsgemäß wird weiter ein Hybridvektor geschaffen, der ein oder mehrere (multiple) DNA-Inserts hat, jeweils bestehend aus einer Hefe-Expressionskontrollsequenz, einem DNA-Segment aus einer ersten DNA-Sequenz, codierend für ein Hefe- PHO5- oder -Invertase-Signalpeptid, stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, wobei das DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollsequenz steht, und einer DNA-Sequenz mit Hefe-Transcriptions-terminationssignalen.
  • Die Erfindung betrifft auch insbesondere Hybridplasmide, die neben der Expressionskontrollsequenz, dem oben genannten DNA-Segment und der Sequenz mit den Transcriptionsterminationssignalen zusätzliche DNA-Sequenzen enthalten, die nicht essentiell oder weniger wichtig für die Funktion des Promotors sind, d.h., für die Expression des Desulfatohirudin-Gens, die aber wichtige Funktionen, beispielsweise bei der Vermehrung der mit den genannten Hybridplasmiden transformierten Zellen, ausüben. Die zusätzlichen DNA-Sequenzen können von prokaryotischen und/oder Hefezellen abgeleitet werden und können chromosomale und/oder extrachromosomale DNA-Sequenzen einschließen.
  • Beispielsweise können die zusätzlichen DNA-Sequenzen herkommen von (oder bestehen aus) Plasmid-DNA, wie bakterieller oder Hefe-Plasmid-DNA, Viren-DNA und/oder chromosomaler DNA, wie bakterieller oder Hefe-chromosomaler DNA. Bevorzugte Hybridplasmide enthalten zusätzliche DNA-Sequenzen, die von bakteriellen Plasmiden abgeleitet sind, insbesondere Escherichia coli- Plasmid pBR322 oder verwandten Plasmiden, Bakteriophage λ, Hefe-2µ-Plasmid und/oder Hefe- chromosomalen-DNA.
  • Bei den bevorzugten erfindungsgemäßen Hybridplasmiden tragen die zusätzlichen DNA-Sequenzen einen Hefe-Replikationsursprung und einen selektiven genetischen Marker für Hefe. Hybridplasmide, die einen Hefe-Replikationsursprung enthalten, z.B. autonom replizierendes Segment (ars), werden nach der Transformation extrachromosomal innerhalb der Hefezellen erhalten und werden nach Mitosis autonom repliziert. Hybridplasmide, die der Hefe-2µ-Plasmid-DNA homologe Sequenzen enthalten, können ebenso eingesetzt werden. Diese Hybridplasmide werden durch Rekombination in die bereits innerhalb der Zelle vorhandenen 2µ-Plasmide integriert oder replizieren autonom.
  • Als selektiver Genmarker für Hefe kann jedes Marker-Gen verwendet werden, das die Selektion von Transformanten auf Grund der phänotypischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker für Hefe sind vor allem die, die antibiotische Resistenz exprimieren oder, bei auxotrophen Hefemutanten, Gene, die Wirtsläsionen komplementieren. Entsprechende Gene verleihen beispielsweise Resistenz gegen das Antibiotikum Cycloheximid oder sorgen für Prototrophie bei einer auxotrophen Hefemutante, beispielsweise die Gene URA1, URA3, ARG4, LEU2, HIS4, HIS3, TRP5 oder TRP1.
  • Vorteilhaft ist es, wenn die zusätzlichen DNA-Sequenzen, die in den erfindungsgemäßen Hybridplasmiden vorhanden sind, auch einen Replikationsursprung und einen selektiven genetischen Marker für einen bakteriellen Wirt, insbesondere Escherichia coli einschließen. Mit dem Vorhandensein eines E.coli-Replikationsursprungs und eines E.coli-Markers in einem Hefehybridplasmid verbinden sich bestimmte vorteilhatte Merkmale. Erstens können große Mengen an Hybridplasmid-DNA durch Wachstum und Amplifikation in E.coli gewonnen werden, und zweitens erfolgt die Konstruktion von Hybridplasmiden vorteilhaft in E.coli, wobei das gesamte Repertoire der Klonierungstechnik auf der Grundlage von E.coli genutzt werden kann. E.coli-Plasmide, wie pBR322 und ähnliche, enthalten sowohl den E.coli-Replikationsursprung als auch E.coli-genetische Marker, die Resistenz gegen Antibiotika verleihen, beispielsweise Tetracycline und Ampicillin, und sie werden vorteilhaft als Teil der Hefehybridvektoren eingesetzt.
  • Die zusätzlichen DNA-Sequenzen, die beispielsweise Replikationsursprung und genetische Marker für Hefe und einen bakteriellen Wirt (siehe oben) enthalten, werden nachstehend als "Vektor-DNA" bezeichnet, die zusammen mit dem oben genannten DNA-Konstrukt, das u.a. die Expressionskontrollsequenz und das Desulfatohirudin-Gen enthält, ein erfindungsgemäßes Hybridplasmid bildet.
  • Die erfindungsgemäßen Hybridvektoren können ein oder mehrere DNA-Inserts enthalten, die jedes u.a. die Hefe-Expressionskontrollsequenz, die DNA-Sequenz, die für das Signalpeptid codiert, und die DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, umfassen. Wenn die Hybridvektoren mehrere DNA-Inserts enthalten, vorzugsweise 2 bis 4 DNA-Inserts, können diese in einer Tandemregion oder an verschiedenen Stellen des Hybridvektors vorhanden sein. Bevorzugte Hybridvektoren enthalten ein DNA-Insert oder DNA-Inserts in einer Tandem-Anordnung. Die DNA-Inserts sind speziell Kopf-an-Schwanz angeordnet.
  • Die erfindungsgemäßen Hybridplasmide werden nach den in Fachkreisen bekannten Methoden hergestellt. Das Verfahren für die Herstellung von Hybridvektoren umfaßt das Einführen eines oder mehrerer DNA-Konstrukte, welche enthalten eine Hefe-Expressionskontrollsequenz, ein DNA-Segment bestehend aus einer ersten DNA-Sequenz, welche für das Hefe-PHO5- oder -Invertase-Signalpeptid codiert, stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, wobei das DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollsequenz steht, und eine DNA-Sequenz mit Hefe-Transcriptions-terminationssignalen, als solcher oder das Einführen der Komponenten der genannten DNA-Konstrukte nacheinander in einer festgelegten Reihenfolge in eine Vektor-DNA.
  • Die Konstruktion der Hybridplasmide gemäß der Erfindung wird unter Anwendung herkömmlicher Ligationsmethoden ausgeführt. Die Komponenten der Plasmide werden durch gemeinsame Restriktionsstellen und/oder durch synthetische Linker-Moleküle und/oder durch Ligation stumpfer Enden miteinander verbunden.
  • Die linearen DNA-Vektoren gemäß der Erfindung entsprechen im wesentlichen den DNA-Konstrukten, die im Abschnitt 2 spezifiziert wurden, und werden auf analoge Weise hergestellt.
    • 4. Transformierte Hefe-Wirtszellen:
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung beeinhaltet Hefe-Wirtszellen, die mit einem Hybridvektor transformiert wurden, welcher ein oder mehrere DNA-Inserts hat, jeweils umfassend eine Hefe-Expressionskontrollsequenz, ein DNA-Segment aus einer ersten DNA-Sequenz, codierend für das Hefe-PHO5 oder -Invertase-Signalpeptid, upstream von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, codierend für reifes Desulfatohirudin, wobei das DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollsequenz ist, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält.
  • Geeignete Hefe-Wirtszellen sind unter anderen Spezies der Gattungen Kluyveromyces, Candida, Pichia, Yarrowia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis und verwandter Gattungen (siehe J. Lodder, The Yeasts, Amsterdam, 1971), insbesondere Stämme von Saccharomyces cerevisiae.
  • Das Verfahren zur Herstellung der genannten transformierten Hefe-Wirtszellen umfaßt das Transformieren von Hefe-Wirtszellen mit einem Hybridvektor, der ein oder mehrere DNA-Inserts hat, jedes bestehend aus einer Hefe-Expressionskontrollsequenz, einem DNA-Segment aus einer ersten DNA-Sequenz, die für das Hefe-PHO5- oder -Invertase-Signalpeptid codiert, stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, wobei das DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollsequenz steht, und einer DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält.
  • Die Transformation der Hefe-Wirtszellen erfolgt nach Methoden, die in Fachkreisen bekannt sind. Beispielsweise kann die Transformation von Hefe mit den Hybridvektoren nach der Methode ausgeführt werden, die von Hinnen u.a. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)) beschrieben wird. Diese Methode kann in drei Schritte unterteilt werden: (1) Beseitigung der Hefezellwand oder von Teilen davon unter Verwendung verschiedener Zubereitungen von Glucosidasen, wie Schneckenverdauungssäfte (z.B. Glusulase oder Helicase ) oder Enzymgemischen, die von Mikroorganismen gewonnen wurden (z.B. Zymolyse ) in osmotisch stabilisierten Lösungen (z.B. 1M-Sorbitol). (2) Behandlung der "nackten" Hefezellen (Sphäroplaste) mit dem DNA-Vektor in Gegenwart von PEG (Polyethylenglycol) und Ca²&spplus;-Ionen. (3) Regeneration der Zellwand und Selektion der transformierten Zellen in einer festen Agar-Schicht. Diese Regeneration erfolgt geeignet durch Einbetten der Sphäroplaste in Agar. Beispielsweise wird geschmolzener Agar (etwa 50ºC) mit den Sphäroplasten gemischt. Beim Abkühlen der Lösung auf Hefewachstumstemperatur (etwa 30ºC) erhält man eine feste Schicht. Diese Agar-Schicht dient dazu, die schnelle Diffusion und den Verlust essentieller Makromoleküle aus den Sphäroplasten zu verhindern und erleichtert dadurch die Regeneration der Zellwand. Eine Zellwandregeneration ist jedoch auch (wenn auch mit geringerer Effektivität) durch Plattieren der Sphäroplaste auf die Oberfläche von vorgeformten Agar-Schichten möglich.
  • Vorzugsweise wird der Regenerations-Agar so hergestellt, daß die Regeneration und die Selektion von transformierten Zellen gleichzeitig möglich sind. Da im allgemeinen als selektive Marker (supra) Hefegene verwendet werden, die für Enzyme von Aminosäure-Biosynthesewegen codieren, erfolgt die Erzeugung vorzugsweise in Hefe-Minimalmedium-Agar. Wenn eine sehr hohe Effektivität der Regeneration erfolgen muß ist das nachstehende zweistufige Verfahren vorteilhaft: (1) Regeneration der Zellwand in einem reichen Komplexmedium und (2) Selektion der transformierten Zellen durch Replika-Plattierung der Zellschicht auf selektive Agar-Platten.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere DNA-Konstrukte, umfassend das Desulfatohirudin-Gen, die Hybridvektoren, die transformierten Hefe-Wirtszellen und die Verfahren zu deren Herstellung sowie das Verfahren für die Produktion von Desulfatohirudin, wie in den Beispielen beschrieben.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
  • Im anschließenden experimentellen Teil werden verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen Fig. 1 und 2 schematische Darstellungen sind, welche die Konstruktion der Plasmide pML300 bzw. pML305 zeigen, Fig. 3 die Konstruktion von Plasmid pHRi148 zeigt, das den trp-Promotor enthält, Fig. 4 die Konstruktion von Expressionsplasmid pML310 zeigt, Fig. 5 eine schematische Darstellung ist, welche die Isolierung eines DNA-Fragments zeigt, das für reifes Desulfatohirudin codiert, Fig. 6 schematisch die Konstruktion eines Expressionsplasmids für die Sekretion von Desulfatohirudin zeigt, Fig. 7 schematisch die Konstruktion eines Expressionsplasmids für die intrazelluläre Expression von Desulfatohirudin zeigt, Fig. 8 die DNA-Sequenz des BamHI-SalI-Restriktionsfragmentes von PHO5 zeigt, einschließlich der PHO5-Promotorregion, Fig. 9 die DNA-Sequenz der Promotorregion des GAPDH-Gens zeigt, Fig. 10 eine schematische Darstellung ist, die die Konstruktion des Plasmids pGAPDH-EL zeigt Fig. 11 die Sequenzen der GAPDH-Promotorfragmente zeigt, die in den Plasmiden pGAPDH-FL und pGAPDH-EL vorhanden sind, Fig. 12 die Konstruktion von Plasmid pJDB207/PHO5(Eco)-HIR zeigt, Fig. 13 die Konstruktion von Plasmid pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1- UAS2) zeigt, Fig. 14 die Konstruktion von Plasmid pJDB207/[GAPEL-HIR]D zeigt, Fig. 15 eine schematische Darstellung ist, die die Konstruktion des Plasmids PJDB2O7/GAPFL-I-HIR zeigt.
  • In den Fig. werden folgende Abkürzungen verwendet: p - Promotor, SS - Signalsequenz, t-Terminator, L-Linker.
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, sollten aber nicht als deren Einschränkung betrachtet werden.
    • Experimenteller Teil:
  • Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutung: TNE: Lösung, die 100 mM NaCl, 50 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, und 5 mM EDTA enthält; SDS: Natriumdodecylsulfat; EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure; DTT: 1,4-Dithiothreitol (1,4-Dimercapto-2,3-butandiol); BSA: Rinderserumalbumin; EtBr: Ethidiumbromid; Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan; Tris. HCl: Tris-Monohydrochlorid. Beispiel 1: Herstellung von geschütztem Nucleosid-Polystyrolharz:
  • 750 mg Bernsteinsäureanhydrid und 910 mg 4-Dimethylaminopyridin werden 2,57 g (5 mMol) 5'- (4-Methoxytrityl)-thymidin (MMT-O-T-OH) in 20 ml absolutem Pyridin zugesetzt und das Ganze bei Raumtemperatur 16 Stunden stehengelassen. Nach dem Konzentrieren der Pyridinlösung wird diese in 200 ml Ethylacetat aufgenommen, durch zweimaliges Schütteln mit 200 ml 0,1 M Phosphatpuffer unter Zusatz von 10 ml gesättigter Natriumchloridlösung extrahiert, wieder mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, getrocknet, konzentriert, und anschließend wird tropfenweise Hexan zugesetzt. Das ausgefällte Produkt wird abgetrennt und zweimal mit Ether trituriert, dann in 300 ml Ethylacetat aufgelöst und durch Schütteln mit 180 ml 0,1M Kaliumbisulfat mit einem pH-Wert von 2,5 bei 0ºC extrahiert. Nach zweimaligem Waschen mit Wasser wird die Ethylacetatlösung mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert, es werden 0,5 ml Pyridin zugesetzt und das Ganze wird konzentriert und durch den tropfenweisen Zusatz von Hexan verdünnt. Das ausgefällte Bernsteinsäurederivat wird durch Filtration entfernt.
  • 1,0 g dieser Verbindung werden zusammen mit 190 mg N-Hydroxysuccinimid in 4 ml Ethylacetat und 2 ml Dimethylformamid aufgelöst, und bei 0ºC werden 370 mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt. Nachdem man das Ganze über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen hat, wird der ausgefällte N,N'-Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Filtrat wird mit Ethylacetat verdünnt, mit kaltem 0,1 M Natriumbicarbonat und Wasser extrahiert, getrocknet und durch Verdampfung in vacuo zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit Ethylacetat auf Silicagel chromatographiert. TLC: Rf 0,45 in Dichlormethan/Methanol (9:1).
  • 100 mg dieses N-Succinimidoylbernsteinsäureesters werden 20 h mit 1 g Aminomethylpolystyrol (Amingehalt 110 µMol/g) in 2 ml Dichlormethan und 4 ml Dimethylformamid gerührt. Das Polymerharz wird abfiltriert und durch Waschen mit Dimethylformamid, Methanol, Dichlormethan und Methanol extrahiert. Nach dem Trocknen werden die Amingruppen, die nicht umgesetzt sind, durch Rühren des Harzes in 6 ml Pyridin mit 1 ml Essigsäureanhydrid und 100 mg 4-Dimethylaminopyridin für die Dauer von 30 min acetyliert. Das Polymerharz wird durch Waschen mit Dichlormethan, Dimethylformamid, Methanol und Dichlormethan extrahiert und getrocknet, bis ein konstantes Gewicht erreicht ist. Die spektroskopische Methoxytritylbestimmung (MMT-Bestimmung) ergibt eine Ladung von 57 µMol/g. Beispiel 2: Folgendes geschütztes Nucleosid/Polystyrolharz wird analog zu Beispiel 1 hergestellt:
  • aus 5'-(4-Methoxytrityl)-N-isobutyryldesoxyguanosin, Beladung 32 µMol/g. Beispiel 3: Synthese des Trinucleotids:
    • a) Synthese des Dinucleotids:
  • 7,73 g (15 mMol) 5'-(4-Methoxytrityl)-thymidin (MMT-O-T-OH) werden zweimal durch Eindampfen mit absolutem Pyridin konzentriert. Der Rückstand wird in 20 ml absolutem Tetrahydrofuran aufgelöst und tropfenweise zu 80 ml einer 0,2M-Lösung von 2- Chlorphenyldi-(1-benzotriazolyl)-phosphat in Tetrahydrofuran unter Rühren und unter Ausschluß von Feuchtigkeit zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung von 2-Chlorphenyl-1-benzotriazolyl-5'-(4-methoxytrityl)- thymidin-3'-phosphat wird in 3 Portionen aufgeteilt.
  • α) Hydrolyse zu Triethylammonium-2-chlorphenyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat: 100 ml 0,5M Triethylammoniumbicarbonat werden einem Drittel der obigen Lösung von 2-Chlorphenyl-1-benzotriazolyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat unter Kühlung zugesetzt. Nach 15 min erfolgt die Extraktion mit Dichlormethan. Die Dichlormethanlösung wird mit Wasser gewaschen, konzentriert, und es wird tropfenweise Petrolether zugesetzt. Der resultierende Niederschlag wird abgesaugt, durch Waschen mit Ether/Petrolether 1:1 extrahiert und in vacuo getrocknet. TLC: Rf 0,35 in Dichlormethan/Methanol/Wasser (75:22:3).
  • β) Veresterung zu 2-Cyanoethyl-2-chlorphenyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat und Entfernung der 4-Methoxytrityl-Schutzgruppe: 1,3 ml 2-Cyanoethanol und 2 ml Pyridin werden einem Drittel der Lösung von 2-Chlorphenyl-1-benzotriazolyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'- phosphat zugesetzt. Man läßt das Gemisch bei Raumtemperatur über Nacht stehen. Die Lösungsmittel werden in vacuo abdestilliert, und der Rückstand wird in Ethylacetat aufgelöst und wiederholt durch Schütteln mit 0,1M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 und Wasser extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet, konzentriert und tropfenweise Hexan zugesetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, in 50 ml Dichlormethanol/Methanol 7:3 aufgelöst und bei 0ºC eine Lösung von 3,8 g P-Toluolsulfonsäuremonohydrat in 75 ml Dichlormethan/Methanol 7:3 zugesetzt. Nach 2 Stunden wird die Reaktionslösung mit Dichlormethan verdünnt und durch Schütteln mit einer kalten Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die organische Phase wird konzentriert, und es wird Hexan zugesetzt. Das ausgefällte 2-Cyanoethyl-2-chlorphenylthymidin-3'-phosphat wird auf Silicagel mit Dichlormethan/Methanol 96 : 4 chromatographiert. TLC: Rf von 0,45 in Dichlormethan/Methanol (9:1).
  • γ) Kondensation zu dem 5'-(4-Methoxytrityl)-3'-cyanoethyl-bis-thymidindinucleotid: 2,2 g von 2-Cyanoethyl-2-chlorphenyl-thymidin-3'-phosphat werden durch zweimaliges Konzentrieren durch Eindampfen mit absolutem Pyridin dehydratisiert, und das Produkt wird in 20 ml absolutem Tetrahydrofuran aufgelöst und dem restlichen Drittel der Lösung von 2-Chlorphenyl-1-benzotriazolyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat zugesetzt. Nach 18 Stunden bei Raumtemperatur werden 10 ml Wasser und 200 ml Ethylacetat der Reaktionslösung unter Kühlen mit Eis zugesetzt. Die organische Phase wird wiederholt mit Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und auf ein geringes Volumen konzentriert. Das Dinucleotid, geschützt in der Phosphateinheit und am 5'- und 3'-Ende, wird durch den tropfenweisen Zusatz zu Ether/Hexan 1:1 ausgefällt. TLC: Rf 0,48 in Dichlormethan/Methanol (9:1).
    • b) Synthese des Trinucleotids:
  • 1,17g (1 mMol) des oben beschriebenen, voll geschütztem Dinucleotids werden in 30 ml Dichlormethan/Methanol, 7:3, aufgelöst, und unter Kühlen mit Eis wird eine Lösung von 1,9 g p-Toluolsulfonsäuremonohydrat in 20 ml Dichlormethan/Methanol, 7: 3, zugesetzt. Nach 2 Stunden wird eiskalte Natriumbicarbonatlösung zugesetzt, und die Extraktion wird mit Dichlormethan vorgenommen. Die organische Phase wird getrocknet, konzentriert und tropfenweise zu Hexan zugesetzt. Das ausgefällte Roh-Dinucleotid mit einer freien 5'-Hydroxygruppe wird auf Silicagel mit einem Gradienten von 2 - 8% Methanol in Dichlormethan chromatographiert. TLC: Rf 0,33 in Dichlormethan/Methanol (9:1).
  • 850 mg dieses 5'-Hydroxy-Dinucleotids und 1,06 g von Triethylammonium-2-chlorphenyl-5'-(methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat [siehe Abschnitt a)α)] werden zweimal durch Eindampfen mit Pyridin konzentriert, dann in 10 ml absolutem Pyridin aufgelöst, und es werden 560 mg 1-Mesitylensulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazol (MSNT) zugesetzt. Nach 2h werden 2 ml eiskaltes Wasser zugesetzt, und nach einer weiteren Stunde wird die Extraktion mit Dichlormethan ausgeführt. Die organische Phase wird mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet, konzentriert, und es wird Ether zugesetzt. Das ausgefällte Trinucleotid wird durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt. Rf 0,45 in Dichlormethan/Methanol (9:1). Beispiel 4: Analog zu Beispiel 3 werden die folgenden geschützten Trinucleotide mit der allgemeinen Formel
  • abgekürzt mit B¹B²B³, hergestellt. Für die Nucleoside B¹,B²,B³ werden folgende Abkürzungen verwendet: A = N-Benzoyldesoxyadenosin, C = N-Benzoyldesoxycytidin, G = N-Isobutyryldesoxyguanosin, T = Thymidin. Verbindung a) Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel in Dichlormethan/Methanol, 9:1.
    • Beispiel 5: Synthese des DNA-Fragments von einer Länge von 67 Basen von Base Nr.: 96 bis Base Nr.: 162 des DNA-Stranges 96/97: a) Entfernung der 2-Cyanoethyl-Schutzgruppe von den Trinucleotiden:
  • 10 µMol der Trinucleotide aus Beispiel 3 oder 4 werden unter Feuchtigkeitsausschuß in 60 µl Pyridin/Acetonitril/Triethylamin, 1:1:1, aufgelöst. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur werden 0,7 ml peroxidfreier Ether tropfenweise zugegeben und der Niederschlag durch Zentrifugieren entfemt. Das Roh-Triethylammoniumsalz wird in 50 µl Pyridin aufgelöst und wieder mit 0,5 ml Ether ausgefällt, abzentrifugiert und dann im Hochvakuum 15 Stunden getrocknet.
    • b) Kopplung der partiell geschützen Trinucleotide mit der an Polystyrolharz gebundenen Oligonucleotidkette:
  • Alle Operationen werden unter Ausschuß von Feuchtigkeit in einem Reaktionsgefäß von 220 µl Fassungsvermögen unter mikroprozessorgesteuertem Zusatz von Lösungsmittel und Reagens ausgeführt. 13 mg (0,74µMol) des Thymidin/Polystyrolharzes (Beispiel 1) werden in das Reaktionsgefäß gegeben und folgenden Operationen unterzogen: 1. Methylenchlorid, 2 ml/min., 4 min.; 2. Methylenchlorid/Isopropanol (85:15), 2 ml/min., 2 min.; 3. Zinkbromid 1M und 1,2,4-Triazol 0,020 M in Methylenchlorid/Isopropanol (85:15), 2 ml/min., 2 - 3,5 min.; 4. Methylenchlorid/Isopropanol (85:15), 2 ml/min., 4 min.; 5. Triethylammoniumacetat 0,5M in DMF, 2 ml/min., 5 min.; 6. Molekularsiebgetrocknetes Pyridin, 2 ml/min., 3 min.; 7. Tetrahydrofuran (peroxidfrei, molekularsiebgetrocknet), 2 ml/min., 3 min.; 8. Stickstoffstrom, 10 min.; 9. Einspritzung von 10 µMol des Trinucleotids GTC (Trimethylammoniumsalz aus Abschnitt a)) und 8,9 mg (30 µMol) 1-Mesitylensulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazol (MSNT), aufgelöst in 150 µl Pyridin; 10. 45ºC, 20 min; 11. Pyridin, 2 ml/min., 4 min.; 12. Essigsäureanhydrid, 5 % und 4-Dimethylaminopyridin, 2,5 %, in Pyridin, 2 ml/min., 4 min.; 13. Pyridin, 2 ml/min., 4 min.; 14. Pyridin/Isopropanol (1:1), 2 ml/min., 3 min.
  • Alle 14 Operationen werden 21 Mal wiederholt, aber in der 9. Operation werden anstelle von GTC die folgenden Trinucleotide in Form ihrer Triethylammoniumsalze (Abschnitt a)) in der angegebenen Reihenfolge eingesetzt: GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG, TGA, CGC, TAC, CGT, GTG, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA, TTC, GGG, CCT, CAT. Die mittlere Kopplungsausbeute beträgt 97 %. Das Endprodukt hat folgende Struktur:
    • c) Entfernung des DNA-Fragments vom Träger und Entfernung der Schutzgruppen:
  • 40,0 mg (etwa 0,60 µMol) des DNA-Syntheseharzes 96/97 werden 3 Stunden bei 50ºC gehalten und 12 Stunden bei Raumtemperatur mit 66 mg (0,40 mMol) o-Nitrobenzaldoxim und 50 µl (0,40 mMol) 1,1,3,3-Tetramethylguanidin in 400 µl 95 %igem Pyridin. Nach dem Abblasen des Pyridins mit Stickstoff werden dem Rückstand 1,6 in wäßriges Ammoniak (33 %) zugesetzt und das Ganze bei 50ºC 24 h in einem geschlossenen Gefäß gehalten.
  • Die abgetrennte flüssige Phase wird im vacuo von Ammoniak befreit und dreimal mit 3 ml peroxidfreiem Diethylether jeweils gewaschen. Nach der Entfernung der niedermolekularen Bestandteile auf einer Biogel-P6-Säule (100-200 mesh, 3 x 66 cm, 0,01 molares Trimethylammoniumbicarbonat, pH-Wert 7,5,1,5 ml/min), werden 285 ODs (260 nm) DNA isoliert.
  • Insgesamt 60 ODs werden auf eine HPLC-Säule (PRP-1/Hamilton, 250 x 4,6 mm) abgetrennt. Gradient (Lösung A: 0,05M Triethylammoniumacetat, pH-Wert 7,0; Lösung B: Lösung A: Azetonitril 1:1): 30 % B in A, 60% Bin A in 20 min bei 50ºC und 2 ml/min. Der lipophile Haupt-Peak (Retentionszeit ca. 14 min) wird aufgefangen, über eine DE52-Cellulose-Säule (Whatman) konzentriert, eluiert und mit Ethanol ausgefällt. Um die 4-Methoxytrityl-Schutzgruppe zu entfernen, wird der Niederschlag in 50µl Essigsäure/H&sub2;O (4:1) aufgelöst und 45 min bei Raumtemperatur gehalten. Das Reaktionsprodukt wird lyophilisiert, mit Ethanol ausgefällt und zur Reinigung elektrophoretisch auf einem 8%igen Polyacrylamidgel (7M Harnstoff) getrennt. Die der gewünschten DNA-Größe entsprechende Bande wird ausgeschnitten, und das Produkt wird elektroeluiert, über DE52-Cellulose konzentriert, und die DNA 96/97 der folgenden Struktur:
  • wird mit Ethanol ausgefällt. Beispiel 6: Folgende DNA-Fragmente (5' - 3') werden analog zu Beispiel 5 hergestellt: 46/64 komplementär 154/64 komplementär
    • Beispiel 7: Phosphorylierung der Fragmente 1/58, 46/64 komplementär, 96/97 und 154/65 komplementär:
  • Die Phosphorylierung und die radioaktive Markierung an den 5'-Enden erfolgt mit [γ&supmin;³²P] ATP und T&sub4;-Polynucleotidkinase (Boehringer), wie das in Molecular Cloning, A laboratory Manual (Hrg. T. Maniatis u.a.), Cold Spring Harbor Lab., 1982, S. 125, beschrieben wird.
    • Beispiel 8: Polymerisation zu Duplex II (Fragment F&sub2; des Desulfatohirudin-HV1-Gens
  • Jeweils 50 pMol des kinasierten Fragmentes 96/67 und des kinasierten Fragmentes 154/64 werden in 24 µl Wasser aufgelöst, die Lösung wird für 3 min. auf 90ºC erhitzt und innerhalb einer Zeitspanne von 5 min. auf 12ºC gekühlt. Nach dem Zusatz von 4µl Endo-R-Puffer (0,1 Molar-Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 66 mM MgCl&sub2;, 66 mM β-Mercaptoethanol, 0,6M NaCl), 10 µl Desoxynucleosidtriphosphat-Gemisch (dATP, dCTP, dGTP, TTP, jeweils 2 x 10&supmin;³ molar, eingestellt mit NH&sub3; auf einen pH-Wert von 7,0) und 2µl(10 Einheiten) von DNA-Polymerase I wird bei 12ºC für die Dauer von 30 min die Klenow-Fragment-Inkubation (Boehringer) durchgeführt. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 90ºC für die Dauer von 3 min gestoppt, und das Gemisch wird bei -80ºC gelagert, bis es für die weitere Verarbeitung gebraucht wird.
  • Auf analoge Weise werden die kinasierten Fragmente 1/58 und 46/64 umgesetzt um Duplex I (Fragment F&sub1; des Desulfatohirudin-Gens) zu bilden.
  • Die Duplices I und II haben folgende Strukturen: Duplex I: Duplex II:
  • Die Herstellung der Fragmente F&sub1; und F&sub2; des Desulfatohirudin-Gens wird im folgenden Schema 1 veranschaulicht: Schema 1: Herstellung der Fragmente F&sub1; und F&sub2; des Desulfatohirudin-Gens HV1 und der F&sub1;-F&sub2;-DNA: T&sub4;-Polynucleotid-Kinase Annealing DNA-Polymerase I (Klenow), dNTPs Fragment F&sub1; (Subklonierung) EcoRII Annealing T&sub4;-DNA-Ligase (Desulfatohirudin-Gen)
    • Beispiel 9: Polymerisation und Ligation der Fragmente 1/58, kinasiertes 46/64, kinasiertes 96/67 und 154/64; Herstellung des Desulfatohirudin-HV1-Gens:
  • Jeweils 50 pMol von Fragment 1/58, kinasiertem 46/64, kinasiertem 96/67 und Fragment 154/64 werden in 48 µl Wasser aufgelöst, die Lösung wird 3 min bei 90ºC erhitzt und innerhalb von 5 min auf 12ºC abgekühlt. Nach dem Zusatz von 8µl Endo-R-Puffer (siehe Beispiel 8), 20 µl Desoxynucleosidtriphosphat-Gemisch (dATP, dCTP, dGTP, TTP, jeweils 0,002 molar, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0 mit NH&sub3;) und 2 µl (10 Einheiten) von DNA-Polymerase I wird für die Dauer von 30 min bei 12ºC die Klenow-Fragment-Inkubation (Boehringer) ausgeführt. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 90ºC für die Dauer von 3 min gestoppt, und die DNA wird nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform durch Ausfällung mit Ethanol isoliert. Das resultierende DNA-Gemisch wird in 100 µl Ligase/Puffer (66 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 5 mM ATP) aufgelöst, es werden 50 Einheiten (2 µl) von T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) zugesetzt, und das Ganze wird bei 20ºC 20 h inkubiert. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 70ºC für die Dauer von 5 min gestoppt, und die DNA wird nach Extraktion mit Phenol/Chloroform durch Ausfällung mit Ethanol isoliert. Nach der Trennung des Gemischs durch Elektrophorese auf einem 8%igen Polyacrylamid- Gel (Denaturierung), wird das Ligationsprodukt mit 217 Basenpaaren elektroeluiert, auf einer DE52-Cellulose-Säule konzentriert und nach der Eluierung durch Ausfällung mit Ethanol isoliert.
  • Das Desulfatohirudin-Gen hat folgende Struktur:
  • Die Herstellung des Desulfatohirudin-Gens aus den vier Fragmenten wird im folgenden Schema 2 veranschaulicht: Schema 2: Herstellung des Hirudin-Gens aus den vier synthetischen Fragmenten: T&sub4;-Polynucleotid-Kinase Annealing DNA-Polymerase I (Klenow) dNTPs T&sub4;-DNA-Ligase F&sub1;-F&sub2;-DNA (Desulfatohirudin-Gen)
    • Beispiel 10: Konstruktion des Plasmids pML 300, das die F&sub1;-DNA des Desulfatohirudin-HV1-Gens enthält (Fig. 1): a) Herstellung des linearisierten Vektors pBR322/EcoRI/PvuII:
  • 5 µg der pBR322-Plasmid-DNA werden mit 5 Einheiten von PvuII-Restriktionsendonuclease (Biolabs) in 200 ml einer Lösung von 100 µg/ml Gelatine für eine Stunde bei 37ºC verdaut. Anschließend wird diese Lösung eingestellt auf 100 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,5), 50 mM NaCl, und die DNA wird mit 30 Einheiten von EcoRI-Restriktionsendonuclease (Biolabs) für die Dauer von 2 h bei 37ºC verdaut. Die Lösung wird dann auf 50 mM Tris.HCl, pH-Wert 8, eingestellt bei einer DNA-Konzentration von 10 µg/µl, mit 2 Einheiten alkalischer Kalbsdarmphosphatase (Boehringer) für 30 min bei 37ºC inkubiert. Das Enzym wurd durch Erhitzen der Lösung auf 65ºC für die Dauer von 60 min inaktiviert. Dann wird die Lösung mit TNE standardisiert, mit 1 Volumen Phenol und Chloroform extrahiert und die verdaute DNA mit 2 Volumina Alkohol bei -20ºC über Nacht ausgefällt.
  • Der aus der pBR322-DNA exzidierte Vektor (pBR322/EcoRI/PvuII, 2297 Basenpaare) wird von dem kleinen DNA-Fragment (2067 Basenpaare) durch Gel-Elektrophorese auf 1%iger niedrigschmelzender Agarose (Biorad) in Tris-Acetat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8, getrennt. Nachdem die DNA im Agarose-Gel mit EtBr gefärbt wurde, wird die Fläche des Gels, die das DNA-Band des pBR322/- EcoRI/PvuII-Vektors (= 2297 Basenpaare) enthält, aus dem Gel herausgeschnitten und 10 min bei 65ºC verflüssigt. Dieser DNA-Lösung werden 20 Volumina TNE zugesetzt, die DNA wird nach Mueller u.a. [J. Mol Biol. 124 343 (1978)] durch DE-52-Chromatographie gereinigt, mit Phenol/Chloroform extrahiert, und die DNA wird mit Alkohol bei -20ºC über Nacht ausgefällt. Der DNA-Niederschlag wird in 50 µl 0,01M Tris.HCl (pH-Wert 8), 0,1 mM EDTA aufgelöst und bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert. Man erhält 1,4 µg DNA (= 3,2 pMol Enden).
    • b) Herstellung von F&sub1;-DNA/EcoRI:
  • 24 ng (=1,3 pMol Enden) der chemisch synthetisierten F&sub1;-DNA (siehe Beispiel 8) werden mit 5 Einheiten EcoRI-Restriktionsendonuclease (Biolabs) in 50 µl von 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 50 mM NaCl und 100 µg/ml Gelatine für 30 min bei 37ºC verdaut. Anschließend werden der Lösung 0,06 µg (= 0,14 pMol Enden) des linearisierten Vektors pBR322/EcoRI/PvuII (Beispiel 10a) zugesetzt. Das Enzym wird dann durch Erhitzen auf 65ºC nach 10 min inaktiviert, und die Lösung wird mit TNE standardisiert und mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die DNA wird mit Alkohol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wird unter Alkohol bei -20ºC bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.
    • c) Ligation der pBR322/EcoRI/PvuII-Vektor-DNA mit F&sub1;-DNA/EcoRI und Konstruktion von Plasmid pML300:
  • Der im Beispiel 10b gewonnene DNA-Niederschlag, der die beiden erwähnten DNA-Fragmente enthält, wird in 20 µl einer Lösung von 50 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,8), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP und 100 µg/l Gelatine aufgelöst und mit 25 Einheiten/µl T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) bei 15ºC für 3 Stunden behandelt. Auf diese Weise wird das rekombinante Plasmid pML300, das die F&sub1;-DNA enthält, in der Lösung gewonnen.
    • d) Transformation von E.coli HB101 mit Plasmid pML300:
  • Die mit Calcium vorbehandelten E.coli-HB101-Zellen, die für die Transformation erforderlich sind, werden so hergestellt, wie das von Mandel u.a. [J. Mol Biol 53 159 (1970)] beschrieben wurde.
  • Die in c) gewonnene Lösung, die das rekombinante Plasmid pML300 enthält, wird bei 65ºC für 10 min erhitzt um die T&sub4;-DNA-Ligase zu inaktivieren, wird dann auf 37ºC abgekühlt. 10 µl dieses Reaktionsgemischs werden zu 150 µl der calciumbehandelten E.coli-HB101-Zellen in 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,5) in einem Gesamtvolumen von 200 µl zugesetzt.
  • Anschließend wird dieses Gemisch in Eis 30 min abgekühlt, für 2 min auf 42ºC erhitzt und dann für 50 min in 1 ml L-Medium (siehe Beispiel 18) bei 37ºC stehengelassen. Das Gemisch wird dann in Aliquoten von 0,2 ml auf 5 Agar-Platten (McConkey-Agar, Difco) aufgestrichen, die 60 µg/ml Ampicillin (Serva) enthalten. Die Agar-Platten werden dann bei 37ºC 16 bis 18 Stunden gehalten. Man erhält 484 ampicillinresistente Kolonien der transformierten E.coli HB101.
    • e) Screening der F&sub1;-DNA enthaltenden Kolonien:
  • 470 transformierte Kolonien (Beispiel 10d) werden auf Nitrocellulosefilter B85 (Schleicher und Schull) abgepreßt. Nach M. Grunstein und D.S. Hogness [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1979)] werden die Kolonien aufgelöst, und ihre denaturierte DNA wird auf dem Filter fixiert. Anschließend wird die Prähybridisiernng der Filter in 20 ml (je Filter) von 4 x SET [= Lösung von 30 mM Tris.HCl (pH-Wert 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA], 0,1 % (w/v) Ficoll 400 (Pharmacia), 0,5% SDS, 50 µl/ml denaturierter Kalbsthymus-DNA für 4 h bei 64ºC durchgeführt. Dann werden die Nitrocellulosefilter in 20 ml (je Filter) von 5 x SET (w/v) Ficoll 400, 0,2 % SDS und 50 µl/ml denaturierter Kalbsthymus- DNA für 16 Stunden bei 64ºC mit der 32p-radioaktiv markierten Sonde (etwa 10³ - 10&sup4; Cerencov-cpm je Filter) behandelt. Als Sonde wird das Oligonucleotid, 46/64 komplementär (siehe Beispiel 6), verwendet.
  • Anschließend werden die Filter zweimal in 2 x SET, 0,2 % SDS bei Raumtemperatur gewaschen, dann zweimal in 2 x SET, 0,5 % SDS bei 60ºC (zuerst für 30 min, dann für 60 min). Die Filter werden dann zwischen 3 MM-Papier (Whatman) getrocknet und bei -80ºC auf einen Röntgenfilm (Fuji) mit einer Verstärkerfolie (Ilford) für 1 bis 2 Tage gegeben.
  • Das resultierende Autoradiogramm zeigt 71 positive Kolonien (Klone), die für die weitere Verarbeitung verwendet werden können, von denen eine die Bezeichnung pML300 erhielt.
    • Beispiel 11: Konstruktion von Plasmid pML305, das die F&sub2;-DNA des Desulfatohirudin-HV1-Gens enthält (Fig. 2): a) Herstellung des linearisierten Vektors pBR322/BamHl/NruI:
  • 5 µg der pBR322-Plasmid-DNA werden mit 30 Einheiten von BamHI-Restriktionsendonuclease für 30 min bei 37ºC in einer Lösung von 100 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,9), 6 mM MgCl&sub2; und 100µg/ml Gelatine verdaut. Dann werden der Lösung 15 Einheiten PvuII-Restriktionsendonuclease zugesetzt, und die Lösung wird zwei Stunden bei 37ºC verdaut.
  • Das Reaktionsgemisch wird bei 70ºC für 10 min erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Anschließend werden die beiden DNA-Fragmente durch Gel-Elektrophorese auf 1%iger niedrigschmelzenderAgarose in Tris-Acetat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8, getrennt (siehe Beispiel 10a).
  • Die DNA-Bande des pBR322-BamHI/PvuII-Vektors (= 2672 Basenpaare) wird herausgeschnitten, verflüssigt und nach Mueller u.a. (siehe oben) durch DE-52-Chromatographie gereinigt. Man erhält 0,75 µg (= 1,5 pMol Enden) DNA.
    • b) Herstellung von F&sub2;-DNA/BamHI:
  • 25 µg (= 1,3 pMol Enden) chemisch synthetisierte F&sub2;-DNA (Beispiel 8) werden mit 16 Einheiten der BamHI-Restriktionsendonuclease (Biolabs) in 20 µl 150 mM NaCl, 6 mM Tris. HCl (pH-Wert 7,9), 6 mM MgCl&sub2; und 100 µg/ml Gelatine für 30 Minuten bei 37ºC verdaut. Dann werden der Lösung 60 ng (= 96 nMol Enden) des linearisierten Vektors pBR322/BamHI/PvuII (Beispiel 11a) zugesetzt, die ganze Lösung wird mit TNE standardisiert und mit Phenol/Chloroform extrahiert, und die DNA wird mit 2 Volumen Alkohol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wird unter Alkohol bei -20ºC gelagert, bis sie zur weiteren Verarbeitung gebraucht wird.
    • c) Ligation der pBR322/BamHI/PvuII-Vektor-DNA mit F&sub2;-DNA/BamHI und Konstruktion von Plasmid pML305:
  • Der in Beispiel 11b gewonnene DNA-Niederschlag, der die beiden genannten DNA-Fragmente enthält, wird in 20 µl einer Lösung von 50 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,8), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP und 100 µg/ml Gelatine aufgelöst und mit 15 Einheiten/µl T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) bei 15ºC für die Dauer von drei Stunden behandelt. Auf diese Weise wird das rekombinante Plasmid pML305, das F&sub2;-DNA enthält, in der Lösung gewonnen.
    • d) Transformation von E.coli HB101 mit Plasmid pML305:
  • Die Transformation der calciumbehandelten E.coli-HB101-Zellen erfolgt wie im Beispiel 10d. Es werden 10 µl des in Beispiel 11c gewonnenen Reaktionsgemischs eingesetzt. Man erhält 313 ampicillinresistente Kolonien.
    • e) Screening der F&sub2;-DNA enthaltenden Kolonien:
  • 65 transformierte Kolonien (Beispiel 11d) werden auf die in Beispiel 10e beschriebene Art und Weise auf F&sub2;-DNA überprüft. Als radioaktive Sonde wird das Oligonucleotid, 154/64 komplementär (siehe Beispiel 6), verwendet. Im Autoradiogramm werden zwei positive Kolonien ermittelt, von denen eine mit pML305 bezeichnet wird.
    • Beispiel 12: Charakterisierung der Klone pML300 und pML305:
  • Die DNA der rekombinanten Plasmide pML300 und pML305 werden nach Ish-Horowitz [Molecular Cloning, A laboratory Manual (Hrg. T. Maniatis u.a.), Cold Spring Harbor Lab., 1982, S. 368] isoliert. Die Nucleotidsequenzen der F&sub1;-DNA- und F&sub2;-DNA-Inserts werden nach Maxam und Gilbert bestätigt [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977); siehe auch Meth. Enzym. 65, 499 (1980)].
  • Zu diesem Zweck werden jeweils 10 µg der Plasmid-DNA von pML300 mit EcoRI-Restriktionsendonuclease gespalten, und 10 µg der Plasmid-DNA von pML305 werden mit BamHI-Restriktionsnuclease gespalten, und die linearisierten DNAs werden durch Gel-Eluierung aus Agarose-Gel (siehe Beispiel 10a) isoliert. Anschließend werden die isolierten DNAs mit alkalischer Phosphatase verdaut und über DE-52 (siehe Beispiel 11a) chromatographiert. Dann werden die DNA am 5'-Ende mit [γ-32P]ATP (spezifische Aktivität 5000 Ci/mMol, Amersham) und T&sub4;-Polynucleotidkinase (P-L-Biochemicals) radioaktiv markiert.
  • Die radioaktiv markierten DNA werden dann mit einer zweiten Restriktionsendonuclease (EcoRII) gespalten. Die resultierenden DNA-Fragmente werden durch Gel-Elution aus Agarose isoliert. Bei pML300 wird die Nucleotidsequenz der F&sub1;-DNA dann aus dem EcoRII-EcoRI*-Fragment (etwa 109 Basenpaare) bestimmt, und im Fall von pML300 wird die der F&sub2;-DNA im EcoRII-BamHI*- Fragment (etwa 122 Basenpaare) bestimmt.
  • (*bezeichnet das DNA-Ende, das radioaktiv markiert ist.)
  • Die Nucleotidsequenzen, die für F&sub1;-DNA und F&sub2;-DNA bestimmt werden, sind den im Beispiel 8 veranschaulichten identisch.
    • Beispiel 13: Konstruktion des Expressionsplasmids pML310: a) Konstruktion des linearisierten Vektors pHRi148/EcoRI/BamHI, der den trp-Promotor-Operator enthält (Fig.3 und 4): A. Konstruktion von Plasmid p159:
  • 10 µg von Plasmid pBRHtrp [DE-OS 3 111 405] werden mit 50 Einheiten von EcoRI (Biolabs) für 60 min bei 37ºC gespalten, und das Verdauungsgemisch wird nach Phenolextraktion auf einem Saccharosedichtegradienten (5-23 %) in 50 mM Tris.HCl (pH-Wert 8,0), 1 mM EDTA in einem TST41-Rotor (Kontron AG) fraktioniert. Das Zentrifugieren dauert bei 40 000 U/min und 15ºC 14 Stunden. 0,3 ml-Fraktionen werden mit einem ISCO-Gradientenkollektor bei 1 ml/min gesammelt. Die Fraktionen, die das kleinere Fragment enthalten, werden vereinigt, die Lösung wird mit TNE standardisiert und mit 2 Volumina Ethanol bei -20ºC ausgefällt. Nach dem Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge wird die DNA in 100 µl von 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 0,5 mM EDTA aufgelöst. 5 µg dieses DNA-Fragments werden mit 5 Einheiten Bg1 II (Biolabs) für 60 min bei 37ºC gespalten. Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol und Chloroform extrahiert, und die DNA wird mit 2 Volumina Ethanol bei -80ºC für 10 min inkubiert; die DNA wird durch Zentrifugieren gesammelt und erneut in 50 µl von 50 mM Tris.HCl (pH-Wert 8,0) aufgelöst. 2 µl dieser Lösung werden entfernt (0,2 µg DNA) und bei einer DNA-Konzentration von 10 ng/µl in 50 mM Tris.HCl (pH-Wert 8,0) mit einer Einheit von alkalischen Kalbsdarmphosphatase (Boehringer) für 30 min bei 37ºC inkubiert. Das Enzym wird durch Erhitzen der Lösung auf 65ºC für 60 min inaktiviert. 0,04 µg der DNA werden entfernt und 5'-terminal mit 10 µCi [γ&supmin;³²P]-ATP (5000 Ci/mMol, Amersham) und 5 Einheiten von T&sub4;-Polynucleotidkinase (P-L-Biochemicals) in 20 µl Reaktionsvolumen in 50 mM Tris.HCl (pH-Wert 9,5), 10 mM MgCl&sub2; und 5 mM DTT für 30 min bei 37ºC inkubiert. Die radioaktive Probe wird mit der unmarkierten Probe (siehe oben) gemischt, und die DNA-Fragmente werden durch einen Saccharosedichtegradienten (5 bis 23 %) in 50 mM Tris.HCl (pH-Wert 8,0), 1 mM EDTA in einem TST60-Rotor fraktioniert. Das Zentrifugieren wird über 5 h bei 60 000 U/min und 15ºC ausgeführt. Es werden 0,2 ml-Fraktionen gesammelt. Die Radioaktivität jeder Fraktion wird durch Messung der Cerencov-Strahlung bestimmt, und dadurch werden die Fragmente identifiziert. Die gewünschten Fraktionen, die das kleine DNA-Fragment enthalten, werden vereinigt die DNA wird mit zwei Volumina Ethanol ausgefällt und nach dem Zentrifugieren erneut in 20 µl von 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 0,5 mM EDTA aufgelöst.
  • Das³²P-markierte EcoRI-Bg1 II-DNA-Fragment wird partiell mit 0,2 Einheiten von TaqI (Biolabs) in 50 µl Volumen für 10 min bei 37ºC gespalten. Das Reaktionsgemisch wird auf 0,2 % SDS, 10 % Glyzerin, 10 mM EDTA, 0,05 % Bromophenol-Blau eingestellt, und die DNA-Fragmente werden auf einem 6%igen Polyacrylamidgel in Tris-Borat-EDTA getrennt [A.C. Peacock u.a., Biochemistry 6, 1818 (1967)]. Die Bande, welche das gewünschte EcoRI-TaqI (das größte partielle Fragment) enthält, wird auf dem Autoradiogramm identifiziert. Dieses Fragment (L. siehe Fig. 3) wird aus dem Gel extrahiert und gereinigt [W. Mueller u.a., oben] und in 10 µl von 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5 1 mM EDTA aufgelöst.
  • Als Akzeptorplasmid wird pBR322 verwendet, das mit ClaI und EcoRI gespalten wird: 2 µg von pBR322 werden mit 4 Einheiten ClaI (Biolabs) in 20 µl Reaktionsvolumen für 60 min bei 37ºC verdaut. Das Protein wird mit Phenol extrahiert, und die DNA wird dann mit zwei Volumina Ethanol bei -80ºC für 10 Minuten ausgefällt. Die DNA wird durch Zentrifugieren gewonnen und dann mit 10 Einheiten EcoRI (Biolabs) 30 min bei 37ºC in 20 µl Reaktionsvolumen verdaut. Anschließend werden der Lösung 2 Volumen von 0,1 M Tris.HCl (pH-Wert 8,7) zugesetzt und das Ganze wird mit einer Einheit alkalischer Kalbsphosphatase (Boehringer) bei 37ºC 30 min inkubiert. Die Phosphatase wird dann durch Inkubation bei 65ºC für die Dauer von 60 min inaktiviert. 100 ng des Akzeptorplasmids werden mit 5 µl Fragment L-DNA in 15 µl Reaktionsvolumen in 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,8), 10 mM DTT, 0,5 mM ATP mit 30 Einheiten je µl Reaktionsvolumen von T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) für 2 h inkubiert.
  • 5µl dieser Lösung werden einem Gemisch zugesetzt, das 150 ml E.coli HB101-Zellen enthält, die mit Calciumchlorid (siehe oben) behandelt wurden, in 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM CaCl&sub2; und 10 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,5) in einem Gesamtvolumen von 200 µl. Das Gemisch wird 20 Minuten in Eis gekühlt, eine Minute auf 42ºC erhitzt und 10 min bei 20ºC inkubiert. Es wird 1 ml Tryptonmedium [Tryptonmedium enthält 10 g Bacto-Tryptone (Difco); 1 g Hefeextrakt (Difco); 1 g Glucose, 8 g NaCl und 294 mg CaCl&sub2;.2H&sub2;0 in 1 l destilliertem Wasser] zugesetzt, und das Gemisch wird 30 min bei 37ºC unter Rühren mit 300 U/min inkubiert. Das Gemisch wird auf zwei Agar- Platten (McConkey Agar, Difco; 0,6 ml/Platte) plattiert, ergänzt mit 50 µg/ml Ampicillin (Sigma). Die Platten werden bei 37ºC zwischen 12 und 17 Stunden inkubiert.
  • Die Plasmid-DNA von 10 verschiedenen Kolonien wird folgendermaßen isoliert: Die Kolonien werden wie oben für die Inokulation von 10 ml von Tryptonmedium, ergänzt durch 50 µg/ml Ampicillin, in einem 25 ml-Erlenmeyerkolben verwendet. Die Kulturen werden 15 bis 18 Stunden bei 37ºC und 300 U/min gerührt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet (Sorval, HS-4-Rotor, 10 min bei 4000 U/min, 4ºC). Es werden etwa 0,1 g Zellen erhalten, und diese werden wieder in 1 ml von 50 mM Tris.HCl (pH-Wert 8,0) suspendiert. Es werden 0,25 ml Lysozymlösung [10 mg/ml in 50 mM Tris.HCl (pH-Wert 8,0); Lysozym wird von Sigma verkauft] zugesetzt, und nach einer Inkubation bei 0ºC für die Dauer von 10 min werden 0,15 ml 0,5 mM EDTA (pH-Wert 7,5) zugesetzt. Nach weiteren 10 min bei 0ºC werden 60 µl von 2 % Triton X-100 (Merck) zugesetzt. Nach 30 min bei 0ºC wird die Probe 30 Minuten lang mit 15 000 U/min und bei 4ºC in einem Sorval SA-600-Rotor zentrifugiert. Der Überstand wird mit 1 Volumen Phenol (mit TNE gesättigt) deproteiniert. Die Phasen werden durch Zentrifugieren (Sorval HB-4-Rotor) für die Dauer von 10 min bei 5000 U/min und 4ºC getrennt. Die obere Phase wird zweimal mit 1 Volumen Chloroform extrahiert. Pankreatische RNAse A (Sigma; 10 mg/ml in TNE, 10 min bei 85ºC vorgewärmt) wird zugesetzt, bis eine Endkonzentration von 25 µg/ml erreicht ist, und das Gemisch wird bei 37ºC 40 min inkubiert. Dann wird die Lösung mit 1M NaCl und 10% Polyethylenglycol 6000 (Fluka, 20 min bei 120ºC in einem Autoklaven behandelt) eingestellt und 2 h bei -10ºC inkubiert. Der Niederschlag wird in einem Sorval HB-4-Rotor (20 min bei 10 000 U/min, 0ºC) aufgefangen und erneut in 100 µl TNE aufgelöst. Die DNA-Lösung wird mit 1 Volumen Phenol extrahiert, und die DNA wird mit 2 Volumen Ethanol für die Dauer von 10 min bei -80ºC ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge gesammelt, und die DNA wird erneut in 20 µl von 10 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,5) und 0,5 mM EDTA aufgelöst. Aus einer 10 ml-Kultur erhält man 8 bis 1µg Plasmid-DNA.
  • Die Plasmid-DNAs werden nach Verdauung mit den folgenden Restriktionsenzymen analysiert: Jeweils 0,5 µg der Plasmid-DNA werden gespalten mit Hpal (Biolabs) und mit Hpal (Biolabs) und EcoRI (Biolabs) mit ClaI (Biolabs) nach den Standardanweisungen, entsprechend der Anweisungen der Enzymhersteller. Die DNAs werden auf einem 1 %igen Agarose-Gel in 40 mM Tris.Acetat (pH-Wert 7,8), 1 mM EDTA und 0,5 µg/ml Ethidiumbromid fraktioniert. Die gewünschten Plasmide enthalten eine HpaI-Stelle und ergeben nach dreimaliger Verdauung neben dem großen DNA-Fragment 2 kleinere Fragmente, die größer als das kleine EcoRI-ClaI-Fragment von pBR322 sind. Eines dieser Plasmide wird mit p159 bezeichnet (siehe Fig. 3).
    • B. Konstruktion von Plasmid pHRi145:
  • 2 µg p159-DNAwerden mit 10 Einheiten von EcoRI (Biolabs) 30 min bei 37ºC verdaut. Die DNA wird mit Phenol extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und nach dem Zentrifugieren in 10 µl von 10 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,5), 0,5 mM EDTA aufgelöst. Die mit EcoRI verdaute DNA wird weiter mit 5 Einheiten DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) (Boehringer) in 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM β-Mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 0,1 mM dATP (P & L Biochemicals), 0,1 mM dTTP (P & L Biochemicals) für 15 min bei 12ºC behandelt. Die Polymerase wird dann durch Inkubation für die Dauer von 5 min bei 85ºC inaktiviert. Das Reaktionsgemisch wird in 20 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,8), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP (Sigma) um einen Faktor von 10 verdünnt und mit 30 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase je µl des Reaktionsgemischs für 1 h bei 15ºC inkubiert.
  • 50 ng der DNA werden in E.coli (auf die oben beschriebene Weise) transformiert und auf McConkey-Agar-Platten, ergänzt durch 50 µg/ml Ampicillin, plattiert.
  • Die Plasmid-DNAs von 10 verschiedenen Kolonien werden auf die oben beschriebene Weise isoliert. Die Plasmid-DNAs werden durch Verdauung mit EcoRI analysiert. Die gewünschten Plasmide sind EcoRI-resistent. Die Analyse wird in der oben beschriebenen Weise ausgeführt. Eines der gewünschten Plasmide wird HRi145 bezeichnet (Fig. 3).
    • C. Konstruktion des Plasmids pHRi148:
  • 2 ug von pHRi145-DNA werden mit 5 Einheiten von ClaI (Boehringer) für 60 min bei 37ºC behandelt, anschließend durch Phenolextraktion deproteiniert. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt und dann in 20 µl von 10 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,5), 0,5 mM EDTA aufgelöst. Die vorstehenden Enden werden, wie oben beschrieben, mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) versehen, allerdings werden dATP und dTTP durch dCTP (P & L Biochemicals) und dGTP (P & L Biochemicals) ersetzt. Die Polymerase wird durch Inkubation für die Dauer von 5 min bei 85ºC inaktiviert. 2 Volumen von 0,1 M Tris.HCl (pH-Wert 8,7) werden dem Reaktionsgemisch zugesetzt welches mit 0,5 Einheiten Kalbsphosphatase (Boehringer) für 30 min bei 37ºC inkubiert wird. Das Reaktionsgemisch wird durch Extraktion mit Phenol deproteiniert. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt und in 8 µl von 10 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,5), 0,5 mM EDTA aufgelöst.
  • Ein chemisch synthetisierter DNA-Linker mit der Formel 5'-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3' wird am 5'-Ende phosphoryliert durch Inkubation von 8 pMol des Linkers mit 5 µCi [γ&supmin;³²P]-ATP (5500 Ci.mMol&supmin;¹, Amersham) in 8 µl Reaktionsvolumen, das 0,1 mMol rATP (Sigma, 50 mM Tris.HCl (pH-Wert 9,5), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2 Einheiten von T&sub4;-Polynucleotidkinase (P & L Biochemicals) enthält, für die Dauer von 30 min bei 37ºC. Die Reaktion wird dann durch Gefrieren bei -80ºC gestoppt.
  • Der radioaktiv markierte Linker wird dann mit 1 µg ClaI und Phosphatase behandelt und mit pHRi145-DNA (siehe oben) in 20µl Reaktionsvolumen ligiert, das 0,5 mM rATP (Sigma), 10 mM DTT (Calbiochem), 20 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,8), 1 mM MgCl&sub2; und 800 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) enthält. Die Inkubation wird für 2 Stunden bei 15ºC durchgeführt. Die Ligase wird durch Inkubation für 10 min bei 85ºC inaktiviert. Anschließend werden 2 Volumen Wasser Zugesetzt, die Natriumchloridkonzentration wird auf 10 mM eingestellt, und über 30 min werden bei 37ºC 20 Einheiten von KpnI (Biolabs) zugesetzt. Nach Extraktion mit Phenol und Chloroform wird das Gemisch durch 0,9%iges niedrigschmelzendes Agarose-Gel (Biorad) in 40 mM Tris.Acetat (pH-Wert 7,8), 1 mM EDTA und 0,5 µg/ml Ethidiumbromid fraktioniert. Die Bande, sichtbar durch UV-Strahlung, welche die gleiche Beweglichkeit wie eine Marker-DNA derselben Größe aufweist, wird mit einem Skalpell herausgeschnitten. Der Teil des Gels wird 5 min. bei 65ºC geschmolzen und dann auf 37ºC abgekühlt. Man erhält ein Volumen von etwa 20 µl. Dieser Lösung werden 5µl entnommen und 12 Stunden bei 15ºC mit 400 Einheiten T&sub4;-Ligase (Biolabs) in 10 µl Reaktionsvolumen inkubiert, das auf 0,5 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,8) eingestellt worden war. 1/10 Volumen einer Lösung mit 100 mM Tris.HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM CaCl&sub2; und 100 mM MgCl&sub2; werden dem Ligasegemisch (bei 15ºC verfestigt) zugesetzt und das Ganze wird 5 min bei 65ºC inkubiert. Die Lösung wird dann zur Transformation von calciumbehandelten E.coli HB 101-Zellen in der oben beschriebenen Weise verwendet. Es erfolgt Ausplattieren auf McConkey-Agar-Platten, die mit 50 µg/ml Ampicillin ergänzt wurden.
  • Die Plasmid-DNAs von 10 verschiedenen Kolonien werden auf die oben beschriebene Weise isoliert, und die DNA wird der folgenden Restriktionsenzymanalyse unterzogen: Jeweils 0,5 µg Plasmid-DNA werden nacheinander mit KpnI (Biolabs), NcoI (Biolabs) und EcoRI (Biolabs) nach den Anweisungen der Enzymhersteller gespalten. Die Spaltprodukte werden auf 1%igem Agarose- Gel in 40 mM Tris.Acetat (pH-Wert 7,8), 1 mM EDTA, 0,5 µg/ml Ethidiumbromid fraktioniert. Alle Plasmide weisen wie gewünscht jeweils eine dieser Enzymspaltstellen auf. Eines erhält die Bezeichnung HRi148.
  • Das Plasmid HRi148 enthält einen Tryptophan-Promotor-Operator und eine ribosomale Bindestelle bis zu und einschließlich ATG. Hirudin und auch andere heterologe Gene können direkt durch die EcoRI-, NcoI-, KpnI-Stellen, die einmal im Plasmid auftreten, gekoppelt werden. Außerdem ermöglicht es diese Konstruktion, heterologe Gene direkt zu koppeln und Zu exprimieren, ohne daß das ATG, das für die lnitiation der Translation erforderlich ist, an dem entsprechenden Gen vorhanden sein muß. Das kann leicht durch Spalten mit NcoI und Auffüllen vorstehenden Enden mit DNA-Polymerase I in der beschriebenen Weise oder durch Spalten mit KpnI und Entfernen der vorstehenden Enden durch Nuclease S&sub1; erreicht werden. Das Plasmid HRi148 ist also ein Expressionsplasmid mit breiter Anwendbarkeit.
    • D. Herstellung des linearisierten Vektors pHRi148/EcoRI/BamHI:
  • 5 µg der Plasmid-DNA von pHRi148 werden mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI verdaut. Der exzidierte Vektor pHRi148/EcoRI/BamHI wird durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert.
    • b) Herstellung von F&sub1;-DNA/EcoRI/EcoRII und F&sub2;-DNA/BamHI/EcoRII: I. Herstellung von F&sub1;-DNA/EcoRI/EcoRII:
  • 5 µg Plasmid-DNA von pML300 werden Zuerst mit 10 Einheiten EcoRI-Restriktionsendonuclease in 50 µl einer Lösung von 100 mM Tris-HCl (PH-Wert 7,5), 50 mM NaCl und 100 µg/ml Gelatine für die Dauer von einer Stunde bei 37ºC verdaut. Ein Aliquot (0,5 µg) dieser linearisierten Plasmid-DNA/EcoRI wird durch Gel-Elution aus einem Agarose-Gel (siehe Beispiel 10a) isoliert und mit [γ&supmin;³²P]ATP (siehe Beispiel 12) radioaktiv markiert. Die Hauptmenge der Plasmid-DNA/EcoRI wird dann mit dieser radioaktiv markierten DNA gemischt, mit EcoRII-Restriktionsendonuclease verdaut, und das EcoRII-EcoRI*-DNA-Fragment (109 Basenpaare) wird durch Gel-Elektrophorese auf 8%igem Polyacrylamid abgetrennt. 200 µg F&sub1;-DNA/EcoRI*/EcoRII werden durch Gel-Elution isoliert.
    • II. Herstellung von F&sub2;-DNA/BamHI/EcoRII:
  • 5 µg Plasmid-DNA von pML305 werden mit 10 Einheiten BamHI-Restriktionsendonuclease gespalten. Ein Aliquot (0,5 µg) dieser linearisierten Plasmid-DNA/BamHI wird durch Gel-Elution aus einem Agarose-Gel (siehe Beispiel 10a) isoliert und mit [γ&supmin;³²P] (siehe Beispiel 12) radioaktiv markiert. Die Hauptmenge der Plasmid-DNA/BamHI wird dann mit dieser radioaktiv markierten DNA gemischt, mit EcoRII-Restriktionsendonuclease verdaut, und das EcoRII-BamHI*-DNA-Fragment (122 Basenpaare) wird durch Gel-Elektrophorese auf 8%igem Polyacrylamid abgetrennt. Es werden 250 µg F&sub2;-DNA/BamHI*/EcoRII isoliert.
    • c) Ligation von F&sub1;-DNA mit F&sub2;-DNA und Konstruktion des Expressionsplasmids pML310:
  • 10 ng (= 473 nMol Enden) von F&sub1;-DNA/EcoRI/EcoRII und 9 ng (= 495 nMol Enden) von F&sub2;-DNA/BamHI/EcoRII werden in einem Volumen von 20 µl mit T&sub4;-DNA-Ligase auf die bereits im Beispiel 10c beschriebene Weise behandelt. Anschließend wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert, und die DNA wird mit Alkohol ausgefällt. Der DNA-Niederschlag wird dann wie im Beispiel 10c aufgelöst und mit EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonuclease verdaut. Anschließend wird die Lösung mit TNE standardisiert, und es werden 30 ng (= 50 nMol Enden) Vektor DNA-pHRi148/EcoRI/BamHI (siehe Beispiel 13aD) Zugegeben. Anschließend wird die Lösung wieder mit Phenol/Chloroform extrahiert, und die DNA wird mit Alkohol ausgefällt. Das ausgefällte DNA-Gemisch wird wie im Beispiel 10c mit T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) behandelt. Auf diese Weise wird in der Lösung ein rekombinantes Plasmid erzeugt, das als Insert F&sub1;-F&sub2;-DNA (Desulfatohirudin-Gen) enthält.
    • d) Transformation von E.coli HB101 mit Plasmid pML310:
  • Die Transformation von E.coli HB101-Zellen, die mit Calcium behandelt wurden, erfolgt auf die im Beispiel 10d beschriebene Art und Weise. 10 µl des in Beispiel 13c gewonnenen Reaktionsgemischs werden eingesetzt. Man erhält 420 ampicillinresistente Kolonien.
    • e) Screening der Kolonien, die F&sub1;-F&sub2;-DNA enthalten:
  • Auf die im Beispiel 10e beschriebene Art und Weise werden 18 transformierte Kolonien (Beispiel 13d) auf ihren Gehalt an F&sub1;-F&sub2;-DNA untersucht. Als radioaktive Sonde wird ein Gemisch der in den Beispielen 5 und 6 beschriebenen Oligodesoxynucleotide verwendet. Im Autoradiogramm erhält man 12 positive Kolonien, von denen fünf die folgenden Bezeichnungen erhalten: pML310, pML311, pML312, pML313, pML314.
    • Beispiel 14: Charakterisierung von Klon pML310:
  • Die Charakterisierung der F&sub1;-F&sub2;-DNA-Sequenz im rekombinanten Plasmid pML310 erfolgt durch Sequenzierung der F&sub1;-F&sub2;-DNA nach Maxam und Gilbert (siehe oben) auf die im Beispiel 12 beschriebene Art und Weise. 10 µg Plasmid-DNA werden untersucht. Die Nucleotidsequenz der F&sub1;-F&sub2;-DNA ist identisch mit der für das synthetische Desulfatohirudin-Gen.
    • Beispiel 15: Expression von Desulfatohirudin-HV1 in Hefe:
  • Das chemisch synthetisierte Gen für Hirudin wird als 206 bp-EcoRI-BamHI-Insert in Plasmid pML310 (siehe Beispiel 14) ampliflziert. Das Gen wid aus dem Plasmid herausgeschnitten und in Hefe unter der Kontrolle des reprimierbaren PHO5-Promotors exprimiert. Die Konstruktion schließt die 541 bp-PHO5- Promotorsequenz und die komplette PHO5-Signalsequenz (51 Nucleotide, die für 17 Aminosäuren codieren) ein, wie das in der europäischen Patentanmeldung Nr. 143 081 beschrieben wird. Diese Sequenz wird im Rahmen mit der reifen codierenden Sequenz von Hirudin fusioniert, die mit dem Codon für Valin als der NH&sub2;-terminalen Aminosäure von natürlichem reifem Hirudin beginnt. Das Hirudin-Gen wird an seinem 3'-Ende durch ein DNA-Fragment flankiert, welches die PHO5-Transcriptionsterminationssignale bietet. Der Vektorteil des Expressionsplasmids enthält Hefe-2µ-Sequenzen, das Hefe-LEU2-Gen für die Selektion in Hefe und das Ampicillinresistenzgen und den E.coli-Ursprung der Replikation für Selektion und Amplifikation in E.coli. Das Verfahren wird in den Fig. 5, 6 und 7 veranschaulicht.
    • Abstimmung der Nukleotidsequenz am 5'-Ende des Desulfatohirudin-Gens:
  • Die Nucleotidsequenz, die für Desulfatohirudin codiert, beginnt bei GTT, was für das NH&sub2;-terminale Valin im Genendprodukt steht. Zur geeigneten Subklonierung und Expression in E.coli wurde die codierende Sequenz am 5'-Ende durch acht Nucleotide erweitert, einschließlich einer EcoRI-Restriktionsstelle und eines ATG-Initiationscodons. Für die exakte Im-Rahmen-Fusion der Hirudin codierenden Sequenz mit der Sequenz, die für das PHO5-Signalpeptid codiert, müssen diese zusätzlichen Nucleotide entfemt werden. Das erreicht man durch Umwandlung der EcoRI-Restriktionsstelle zu einer stumpfendigen Stelle und Anfügen eines synthetischen Oligonucleotids mit einer HgaI-Erkennungsstelle in solcher Position, daß nachfolgende Spaltung mit HgaI unmittelbar stromaufwärts des GTT-Codons erfolgt.
    • Einführung einer HgaI-Restriktionsstelle vor dem Desulfatohirudin-Gen (siehe Fig. 5):
  • 8 µg Plasmid pML310 (siehe Beispiel 13c) werden vollständig mit Restriktionsendonuclease EcoRI verdaut. Die DNA (pML310/EcoRI) wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Überhängende 5'-Enden werden durch Nuclease S&sub1; entfernt. 4 µg pML310/EcoRI-DNA werden in 100 µl von 250 mM NaCl, 1 mM ZnSO&sub4;, 30 mM Natriumacetat, pH-Wert 4,6, und 20 U/ml Nuclease S&sub1; (Sigma) 45 min lang bei 37ºC verdaut.
  • Die DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und durch Ethanol ausgefällt. Die DNA (pML310/- EcoRI/S&sub1;) wird erneut in 10µl von 50 mM Tris.HCl, pH-Wert 8,0, suspendiert und mit 2 Einheiten von alkalischer Kalbsdarmphosphatase (CIAP, Boehringer) eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Das Enzym wird durch Behandlung bei 65ºC über 1 1/2 Stunden inaktiviert.
  • Die NaCl-Konzentration im Inkubationsgemisch wird auf 150 mM eingestellt. Die dephosphorylierte DNA (pML310/EcoRI/S&sub1;/CIAP) wird durch Adsorption an eine DE52-Ionenaustauschsäule (Whatman) in einem Puffer mit geringem Salzgehalt (150 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA) gereinigt und dann mit einer Pufferlösung mit hohem Salzgehalt (1,5 M NaCl), 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA) eluiert. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt und mit einer Konzentration von 0,8 mg/ml in H&sub2;O wieder suspendiert.
  • Ein Oligonucleotid mit der Formel 5'-AGCGTCGACGCT-3' wird nach der Phosphotriestermethode [Itakura u.a., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981)] synthetisiert. Die Sequenz des Oligonucleotids ist selbstkomplementär, enthält die Erkennungsstelle -GACGC- für die Restriktionsendonuclease HgaI. Annealing der beiden einzelnen Stränge führt zu einem doppelsträngigen DNA-Linkervon 12 Basenpaaren.
  • 1,2 µg des synthetischen, einsträngigen Oligodesoxynucleotids werden in 10 µl von 60 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 30 µCi [γ&supmin;³²P]ATP (3000 Ci.mMol&supmin;¹, Amersham) und 6 Einheiten von T&sub4;-Polynucleotidkinase (Boehringer) für die Dauer von 30 min bei 37ºC phosphoryliert, gefolgt von einer 15 minütigen Behandlung (chase) bei 37ºC in Gegenwart von 0,5 mM ATP. Das Gemisch wird dann weitere 10 min bei 75ºC inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren, und wird dann für Annealing auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.
  • 0,6 µg (170 pMol) der ³²P-markierten Linker-DNA werden mit 2,4 ug (1,75 pMol Enden) von pML310/EcoRI/S&sub1;/CIAP gemischt und in 20 µl von 60 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP, 800 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) 20 h bei 15ºC ligiert. Die Ligase wird durch 10 Minuten bei 85ºC inaktiviert, und der Überschuß an Linker-Molekülen wird durch Ausfällen der DNA in Gegenwart von 10 mM EDTA, pH-Wert 7,5, 300 mM Natriumacetat, pH-Wert 6,0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt. Nach 30 min bei Raumtemperatur wird die DNA pelletiert, in 45 µl Ligationsgemisch (oben spezifiziert) wieder suspendiert und 6 Stunden lang bei 15ºC ligiert, um circuläre DNA zu bilden.
  • Aliquote von 1 µl und 3 µl des Ligationsgemischs werden 100 µl calciumbehandelten, transformationskompetenten E.coli HB101-Zellen zugesetzt [hergestellt nach der Methode von D. Hanahan, J. Bio. Chem. 166, 557 (1983)]. Die Zellen bleiben 30 min auf Eis, werden dann 3 min bei 42ºC inkubiert, 2 min auf Eis gekühlt und dann eine Stunde bei 37ºC in 400 ul SOC-Medium inkubiert. Die Zellen werden jeweils in 100 µl konzentriert und auf LB-Agar-Platten, die 50 µg/ml Ampicillin enthalten, plattiert.
  • In LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält, werden einzeln 12 transformierte, ampR-Kolonien gezüchtet. Plasmid-DNA wird nach der Methode von D.S. Holmes u.a. [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)] hergestellt. Das Vorhandensein des synthetischen Oligonucleotid-Linkers wird durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung eines einzelsträngigen DNA-Fragmentes als Primer nachgewiesen, das mit dem codierenden Strang von Hirudin hybridisiert. Ein Klon, das die Linker-DNA in der richtigen Position vor dem Hirudin-Gen enthält, wird als pML310L bezeichnet.
    • Beispiel 16: Fusion der PHO5-Signalsequenz und des Desulfatohirudin-Strukturgens: a) Isolierung des 0,2 kb-Desulfatohirudinfragmentes (Fig. 5):
  • 12 µg Plasmid pML310L werden vollständig mit den Restriktionsendonucleasen BamHI und PvuI verdaut. Nach der Extraktion der DNA mit Phenol/Chloroform und der Ethanolfällung werden die beiden Restriktionsfragmente auf einem 1,2%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das mit Ethidiumbromid gefärbte 0,84-kb-PvuI-BamHI-Fragment wird in einer Gelscheibe isoliert. Die DNA wird in einem Dialysebad, das mit 3 ml 0,2 x TBE-Puffer gefüllt ist, elektroeluiert. Der geschlossene Beutel wird in TBE-Puffer (pH-Wert 8,3) (90 mM Tris-Base, 90 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA) eingetaucht. Nach 30 min bei 100 mA wird die Polarität des Stromes für 45 s umgekehrt, um die DNA von der Dialysemembran abzustoßen. Der Puffer, der die Gelscheibe im Dialysebeutel umschließt, wird aufgenommen, auf 150 mM NaCl eingestellt und durch eine DE52-Ionenaustauschsäule (Whatman) geführt. Die DNA wird in einem Puffer mit hohem Salzgehalt (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA) eluiert, mit Ethanol ausgefällt und mit einer Konzentration van 0,1 mg/ml wieder in H&sub2;O aufgelöst.
  • Das 0,84 kb-PvuI-BamHI-Fragment von pML310L wird weiter mit der Restriktionsendonuclease HgaI verdaut. Diese Verdauung generiert ein 198 bp-HgaI-BamHI-Fragment das die komplette codierende Sequenz für reifes Desulfatohirudin enthält. Eine zusätzliche AluI-Verdauung berührt das 198 bp-HgaI-BamHI-Fragment nicht, eliminiert aber ein anderes HgaI-Fragment ähnlicher Größe.
  • Das 0,2 kb-HgaI-BamHI-Fragment wird von anderen Fragmenten auf einem 1,5%igem Agarose-Gel in TBE-Puffer getrennt und durch Elektroeluierung (wie oben beschrieben) isoliert. Die DNA wird gereinigt durch DE52-Ionenaustauschchromatographie gereinigt und Ethanolfällung. Die DNA wird mit einer Konzentration von 30 µg/ml (0,2 pMol/µl) in H&sub2;O wieder suspendiert.
    • b) Isolierung der PHO5-Promotorregion mit einem Teil der PHO5-Signalsequenz (Fig. 6):
  • In Plasmid p31/PHO5-TPA18 (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 143081) sind PHO5-Promotor und PHO5-Signalsequenz im Rahmen zu einem fremden Strukturgen (t-PA) fusioniert. Ein 584 bp-BamHI-BalI-Fragment enthält den PHO5-Promotor und die gesamte PHO5-Signalsequenz mit Ausnahme von acht Nucleotiden am 3'-Ende.
  • 8µg von p31/PHO5-TPA18-DNA werden mit der Restriktionsendonuclease BalI (16 Stunden bei 37ºC) verdaut. Die DNA wird durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt. Die DNA wird mit einer Konzentration von 0,7 mg/ml wieder in H&sub2;O suspendiert.
  • Die korrekte Verbindung zwischen der PHO5-Signalsequenz und der codierenden Region für Desulfatohirudin wird gewährleistet durch einen synthetischen Linker mit der Formel
  • (1) 5'- CCAATGCA-3'
  • (2) 3'- GGTTACGTCAACA-5'
  • Acht Nucleotide am 5'-Ende des Linkers (5'-CCAATGCA) stellen einen Teil der PHO5-Signalsequenz von der BalI-Stelle zur Processing-Stelle dar. Die 5'-überhängenden fünf Nucleotide von Oligonucleotid (2) passen in die HgaI-Spaltstellen am 5'-Ende der Desulfatohirudin codierenden Sequenz.
  • Die einzelnen, einzelsträngigen Oligonucleotide (1) und (2) werden durch die Phosphotriestermethode (Itakura u.a., oben) synthetisiert. 1,1 µg bzw. 1,8 µg der Oligonucleotide (i) bzw. (2) werden einzeln an ihren 5'-Enden phosphoryliert, in äquimolaren Mengen gemischt und wie im Beispiel 15 hybridisiert (annealed).
  • 1,3 µg (200 pMol) der phosphorylierten, doppelsträngigen Linker-DNA werden mit 7 µg (1,8 pMol) BalI-gespaltenem p31/PHO5-TPA18 in 40µl von 60 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT und 1400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) bei 15ºC 16 Stunden ligiert. Die Ligase wird 10 min bei 85ºC inaktiviert. Der Überschuß an Linkem wird durch Ausfällung der DNA in Gegenwart von 10 mM EDTA, 300 mM Natriumacetat, pH-Wert 6.0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt. Die DNA wird wieder suspendiert und weiter mit Restriktionsendonuklease BamHI verdaut. Nach der Extraktion der DNA durch Phenol/Chloroform und Ethanolfällung werden die beiden Restriktionsfragmente auf einem 1 ,2%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 0,6 kb-Fragment wird aus dem Gel isoliert. Die DNA wird elektroeluiert und weiter durch DE52-Ionenaustauschchromatographie und Ethanolfällung gereinigt. Das 0,6 kb-BamHI-HgaI-DNA-Fragment wird mit einer Konzentration von 40 µg/ml in H&sub2;O wieder suspendiert.
    • c) Isolierung eines pJDB207-Hefevektorfragmentes (Fig. 6):
  • 9 µg Plasmid pJDB207R/PHO5-TPA- (12-2)-DNA (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 143081) werden mit der Restriktionsendonuclease BamHI verdaut. Nach der vollständigen Verdauung wird die DNA durch Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wird mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml wieder in 50 mM Tris.HCl, pH-Wert 8,0, suspendiert und mit 7 Einheiten alkalischer Kalbsdarmphosphatase eine Stunde bei 37ºC verdaut. Die Phosphatase wird 1,5 Stunden bei 65ºC inaktiviert, und die DNA wird durch DE52-Ionenaustauschchromatographie (siehe Beispiel 15) und Ethanolfällung gereinigt. Das 6,8 kb-große BamHI-Fragment wird auf einem 1,2%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, abgetrennt. Die DNA wird elektroeluiert und durch DE52-Ionenaustauschchromatographie und Ethanolfällung gereinigt. Die DNA wird in H&sub2;O zu einer Konzentration von 0,4 mg/ml (0,1 pMol/µl) aufgelöst.
    • d) Ligation des PHO5-Promotorfragmentes und des Desulfatohirudin-Strukturgens zu dem pJDB207-Hefevektorfragment (Fig. 6):
  • Der pJDB207-Hefevektor, das PHO5-Promotorfragment mit der PHO5-Signalsequenz und das Desulfatohirudin-Strukturgen werden alle als DNA-Fragmente isoliert (siehe Beispiel 16 a bis c), die zur Bildung eines Expressionsplasmids ligiert werden.
  • 0,3 pMol des 0,6 kb-BamHI-HgaI-Fragmentes von p31/PHO5-TPA18 und 0,3 pMol des 0,2 kb-HgaI- BamHI-Fragmentes von pML310L werden mit 0,1 pMol eines 6,8 kb-BamHI-Fragmentes von pJDB207R/PHO5-TPA (12-2) in 10µl von 60 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 400 Einheiten von T&sub4;-DNA-Ligase 20 Stunden bei 15ºC ligiert.
  • Ein 1 µl-Aliquot des Ligationsgemischs wird zu 100µl von transformationskompetenten E. coli HB101-Zellen zugesetzt, die nach Hanahan (oben) hergestellt wurden. Aus dieser Publikation wird auch das Transformationsprotokoll entnommen. Die Zellen werden auf LB-Agar-Platten plattiert, die 50 µg/ml Ampicillin enthalten.
  • In LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin werden einzeln 24 ampR-Kolonien gezüchtet. Die Plasmid-DNA wird auf Größe und Orientierung des Inserts durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease PstI analysiert. Ein einzelner Klon mit der korrekten Orientierung des Inserts wird als pJDB207/PHO5-HIR bezeichnet.
    • Beispiel 17: Transformation des Saccharomyces cerevisiae-Stammes GRF18:
  • Plasmid pJDB207/PHO5-HIR wird in den Stamm Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (α, his3-11 his3-15, leu2-3, leu2-112, canR) unter Anwendung des von Hinnen u. a. (oben) beschriebenen Transformationsprotokolls eingeführt. 5 µg der Plasmid-DNA werden 100 µl einer Sphäroplastsuspension zugefügt. und das Gemisch wird mit Polyethylenglycol behandelt. Die Sphäroplasten werden mit 10 ml Regenerations-Agar behandelt und auf Hefe-Minimalmediumplatten ohne Leucin plattiert.
  • Eine einzelne transformierte Hefekolonie wird herausgegriffen und in Hefe-Minimalmedium ohne Leucin gezüchtet. Die Kolonie wird bezeichnet als Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/- PHO5-HIR.
    • Beispiel 18: Kultivierung von S. cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-HIR:
  • Zellen von S. cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-HIR werden in 20 ml Hefeminimalmedium ("Difco Yeast Nitrogen Base" ohne Aminosäuren unter Zusatz von 2% Glucose und 20 mg/l L-Histidin) bei 30ºC gerührt und auf eine Zelldichte von 3x10&sup7; Zellen/ml kultiviert. Die Zellen werden in 0,9%igem NaCl gewaschen und dann zum Inokulieren von 50 ml-Kulturen in Minimalmedium mit geringem Pi-Gehalt verwendet. Das Minimalmedium mit geringem Pi-Gehalt wird entsprechend der Zusammensetzung des "Difco Yeast Nitrogen Base"-Mediums (ohne Aminosäuren) hergestellt, enthält aber 0,03 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 1 g/l KCl und 10 g/l L-Asparagin anstelle von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2% Glucose und 1 g/l L-Histidin. Die Kulturen werden bis zu einer Zelldichte von 4 x 10&sup6; Zellen/ml inokuliert und bei 30ºC bis zu 42 Stunden bei 200 U/min gerührt.
    • Beispiel 19: Isolierung der Desulfatohirudinverbindungen aus S. cerevisiae GRF18/pJDB207/- PHO5-HIR: a) Isolierung der Desulfatohirudinverbindungen aus dem Kulturmedium A. Anreicherung von Hirudinverbindungen auf einer RP-C18-Säule:
  • Nach einer Fermentationszeit von 18 h, 26 h bzw. 42 h werden zehn Proben zu jeweils 10 ml dem Kulturmedium entnommen und durch Entsalzen und Konzentration auf einer Bond Elut-C-18-Säule (1 ml, Analytichem International) auf Proteine angereichert. Wenn die Proben auf die Säule gebracht worden sind und die Flüssigkeit im Vakuum entfernt wurde, wird die Säule zweimal mit 1,5 ml Wasser-Acetonitril (9:1)-0,1%iger Trifluoressigsäure (9:1) gewaschen. Hirudinverbindungen werden aus der Säule mit Wasser-Acetonitril-0.1%iger Trifluoressigsäure (6:4) eluiert. 2 ml Eluat werden mit einem Speed Vac-Konzentrator (Savant) auf ein Endvolumen von 400 µl konzentriert. Die Hirudinverbindungen werden durch HPLC-Analyse, durch Vergleich mit authentischem Desulfatohirudin und durch den Thrombininhibitionsassay identifiziert. In den Proben sind etwa 0,2 bis 2 µg/ml Hirudinverbindungen enthalten.
    • B. Ionenaustauschchromatographie auf einer DEAE-Cellulose-Säule:
  • 1 l Kulturmedium wird nach einer Fermentationszeit von 42 h geerntet und zentrifugiert. Der Überstand wird einer Anionenaustauschsäule mit DE53-Cellulose (Whatman) bei einem pH-Wert von 7,5 zugeführt. (Bedingungen: Säule 2,5 x 15,5 cm (76 ml); Eluierungspuffer A: 20 mM Ammoniumacetat, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,5; Eluierungspuffer B: 20 mM Ammoniumacetat, 4M NaCl, pH-Wert 5,0; Fluß 66 ml/h). Die Säule wird mit 228 ml Puffer A gewaschen und dann mit einem linearen Salzgradienten von jeweils 228 ml von Puffer A bzw. Puffer B eluiert. Es werden Fraktionen zu 22 ml gesammelt. Hirudinverbindungen werden in Fraktionen 71 bis 74 (88 ml) eluiert und durch den Thrombininhibitionsassay identifiziert. Die aktiven Fraktionen werden über Nacht bei 4ºC gegen 20 mM Ammoniumacetat dialysiert. Anschließend werden Aliquote zweimal lyophilisiert. Die Lyophilisate enthalten Desulfatohirudinverbindungen, wie durch Umkehrphasen-HPLC nachgewiesen wurde.
    • C. Gelfiltration auf Sephadex G-50 und abschließende Reinigung durch HPLC:
  • Die Hauptfraktion (80 ml Eluat), die im Thrombininhibitionstest aktiv ist, wird über Nacht bei 4ºC gegen 20 mM Ammoniumacetat, pH-Wert 7,5, dialysiert und dann unter Verwendung eines Rotationsverdampfers bei 35ºC auf ein Endvolumen von 5 ml konzentriert.
  • Die resultierende klare, wäßrige Lösung wird einer Sephadex G-50-Feinsäule (Pharmacia) mit einem Bettvolumen von 160 ml zugeführt, wobei die Säule (2,5 x 64 cm, Biorad) mit 5%iger Essigsäure voräquilibriert wurde. Die in 50 ml Eluat enthaltene Hauptaktivität (Fraktionen 5 - 7, Fluß 50 ml/h, 25 min/Fraktion) wird unter Verwendung eines Rotationsverdampfers konzentriert und dann einer Umkehrphasen-HPLC-Trennung unterzogen. Ein Aliquot (500 µl) der einzelnen Fraktionen wird 1:10 unter Verwendung eines "Speed Vac"-Konzentrators (Savant) konzentriert und mittels der Umkehrphasen-HPLC-Analyse auf den Gehalt an Desulfatohirudinverbindungen untersucht. Die Lösungen enthalten Desulfatohirudinverbindungen. Fraktion 6 (18 ml) enthält den geringsten prozentuellen Anteil an Sekundärkomponenten und wird nach der semipräparativen Umkehrphasen-HPLC weiter gereinigt.
  • Experimentelle Bedingungen: Vydac 218 TP 510 RP-HPLC-Säule, 10 x 250 mm; Aliquotanteile der Fraktion 6 (200 µl konzentriert 1:10) je Trennung; AUFS 0,5 bei 200 nm; Fließgeschwindigkeit: 2 ml/min. Eluierungsmittel: A: 0,1%ige Trifluoressigsäure, B: Acetonitril/Wasser 8:2 + 0,07% Trifluoressigsäure, 1 min 16% B, dann im Verlauf von 40 min Erhöhung auf 64% B. Die resultierenden Fraktionen werden 1:1 mit Wasserverdünnt und lyophilisiert. Der Rückstand besteht aus reinen Desulfatohirudinverbindungen.
    • b) Isolierung von Desulfatohirudinverbindungen aus dem Zellextrakt von S. cerevisiae GRF18/- pJDB207/PHO5-HIR:
  • Die Zellen werden wie üblich desintegriert (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 100561). Der Überstand, der mit 2%iger Essigsäure behandelt wurde, wird zentrifugiert (10ºC, 12 000 U/min). Ammoniak wird bis zu einem abschließenden pH-Wert von 7,5 zugesetzt, und die leicht undurchsichtige Lösung (50 ml) wird wie oben weiter behandelt (siehe Beispiel 19a). Hirudinverbindungen werden wie oben identifiziert, d.h., mit dem Thrombininhibitionsassay und mittels Umkehrphasen-HPLC.
    • Beispiel 20: Analyse des Produktgemischs von der Fermentation von S. cerevisiae GRF18/- pJDB207/PHO5-HIR:
  • a) Ein Aliquot von 2 ml Überstand, der wie oben hergestellt wurde (siehe Beispiel 19b), wird im Hochvakuum auf einem "Speed Vac"-Konzentrator getrocknet. Die Proben werden einzeln in 100 µl Wasser aufgelöst und der HPLC-Analyse unterzogen (experimentelle Bedingungen Nr. 1, siehe unten). Es wird die Thrombininhibition der einzelnen Fraktionen getestet. Die Fraktionen mit einer Retentionszeit von 16,5 min und 17,7 min weisen Thrombininhibition auf. Das Verhältnis (Expressionsausbeute) dieser beiden Fraktionen beträgt etwa 4:1. Nach der Aminosäurezusammensetzung sind diese Fraktionen Desulfatohirudine.
  • b) Die im Thrombininhibitionstest aktiven Fraktionen, die wie im Beispiel 19a gewonnen wurden, werden der HPLC-Analyse unter zwei unterschiedlichen Sätzen von Bedingungen unterzogen.
    • - Experimentelle Bedingungen Nr. 1:
  • Nucleosil (MN) C18, 5um-RP-HPLC-Säule, 4,6 x 120 mm: 50 µl Hirudinverbindungen je Trennung, "att." 6 bei 214 nm; Fließgeschwindigkeit 1,2 ml/min; Eluierungsmittel: A: 0,1% Trifluoressigsäure, B: Acetonitril/Wasser, 8:2, mit 0,08% Trifluoressigsäure, 2 min 16% B, dann im Verlauf von 50 min Anstieg auf 64% B. Gegendruck 66 bar.
    • - Experimentelle Bedingungen Nr. 2:
  • wie oben, ausgenommen: Gradient 2 min 20% B, dann im Verlauf von 40 min Erhöhung auf 80% B.
  • Fraktionen werden in Intervallen von 1 min (insgesamt 45) genommen und der Thrombininhibitionsprüfung unterzogen. Die Fraktionen 17 - 19 erweisen sich als aktiv. Außerdem werden die Aminosäurezusammensetzung, der N-Terminus und die N-terminale Sequenz für die aktiven Hirudinverbindungen der Fraktionen 17 und 18 bestimmt. Eine Fraktion (Nr. 17) wird außerdem mit authentischem Desulfatohirudin verglichen, das durch Reaktion natürlichen Hirudins von Blutegeln mit der Enzymarylsulfatase gewonnen wird. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt: Tabelle 1: Fraktion Retentionszeit (min) Bedingungen Thrombininhibition (%) Authentisches Desulfatohirudin
  • Das Verhältnis der Ausbeute der Fraktionen 17 und 18 beträgt wieder etwa 4:1.
  • c) 200 ml-Aliquote des Überstands, der wie oben hergestellt wurde (siehe Beispiel 19a), werden der HPLC-Analyse (Bedingungen Nr. 3, siehe unten) und der FPLC-Trennung (Bedingungen Nr. 4) unterzogen. Es wird die Thrombininhibition der einzelnen Fraktionen geprüft. Die Fraktionen mit einer Retentionszeit von 8,0 min (Peak 1), 11,1 min (Peak 2) und 12,1 (Peak 3) haben eine starke Thrombininhibition. Das Verhältnis (Expressionsausbeute) dieser drei Verbindungen beträgt etwa 1:4:1. Gemäß HPLC-Analyse sind die Verbindungen, die den Peaks 2 und 3 entsprechen, mit den im Beispiel 20b beschriebenen Hirudinverbindungen identisch (Fraktionen 17 und 18). Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 zusammengefaßt: Tabelle 2: Fraktion Retentionszeit (min) Bedingungen Peak
    • - Experimentelle Bedingungen Nr. 3:
  • Vydac 218 TP-B5 RP-HPLC-Säule, 4,0 x 120 mm, 15 µg Hirudinverbindung je Trennung, "att." 7 bei 214 nm, Fließgeschwindigkeit 1,2 ml/min; Eluierungsmittel A: 0,1%ige Trifluoressigsäure, B: Acetonitril mit 0,08% Trifluoressigsäure, 2 min 16% B, dann im Verlauf von 20 min Steigerung auf 40% B; Gegendruck 80 bar.
    • - Experimentelle Bedingungen Nr. 4:
  • Pharmacia Mono-Q-FPLC-Anionenaustauschersäule, 5,0 x 50 mm, 15 µg Hirudinverbindung je Trennung, AUFS 0,01 bei 280 nm, Fließgeschwindigkeit 1,0 ml/min; Gradienteluierungspuffer A: 20 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, Puffer B: Puffer A und 1 M NaCl, pH-Wert 7,5, 9 min 15% B, dann im Verlauf von 21 min Steigerung auf 70% B.
    • Beispiel 21: Charakterisierung von Desulfatohirudinverbindungen aus der Fermentation des Stammes S. cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-HIR:
  • Gemäß HPLC-Analyse sind die Hirudinverbindungen der Fraktionen 17 (oder Peak 1) und 18 (oder Peak 2), die aus dem Medium isoliert werden (siehe Beispiel 20, Tabellen 1 und 2), mit den entsprechenden Verbindungen identisch, die aus den Zellextrakten (intrazelluläre Hirudinverbindungen) isoliert werden. Diese Verbindungen sowie die Verbindung von Peak 3 (siehe Tabelle 2) sind folgendermaßen charakterisiert:
    • a. Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung:
  • Etwa 2,5 µg der reinen Hirudinverbindung werden 24 h mit 6N HCl bei 110ºC hydrolysiert und dann analysiert, wie das von Chang u. a. [DABS-C1-Methode; Methods in Enzymology 91, 41(1983)] beschrieben wird. Das Hydrolysat hat folgende Zusammensetzung: Peak 1 (siehe Tabelle 2) Aminosäure Hydrolysat Peak 2 (Fraktion 17, siehe Tabellen 1 und 2) Aminosäure Hydrolysat Peak 3 (Fraktion 18, siehe Tabellen 1 und 2) Aminosäure Hydrolysat
    • b) Partielle Sequenzanalyse:
  • 18 µg (2,5 nMol) der reinen Hirudinverbindung werden einer herkömmlichen Sequenzanalyse nach Edman unterzogen, und die N-terminalen Phenylthiohydantoin (PTH)-Aminosäuren werden durch RP-HPLC bestimmt. Ergebnisse Peak 2 (Fraktion 17, siehe Tabellen 1 und 2) Zyklus Aminosäure Zyklus Aminosäure (n.d. = nicht bestimmt)
    • Peak 1 (siehe Tabelle 2)
  • Sequenz von Zyklus 1 bis Zyklus 29 wie oben.
    • Peak 3 (Fraktion 18, siehe Tabellen 1 und 2)
  • Sequenz von Zyklus 1 bis Zyklus 27 wie oben.
  • Die N-terminalen Sequenzen der untersuchten biosynthetischen Hirudinverbindungen sind mit denen von authentischem Hirudin identisch.
    • C. C-terminale Analyse:
  • Die Hirudinverbindungen werden mit Carboxypeptidase Y verdaut und die freigesetzten Aminosäuren im Aminosäurenanalysator bestimmt (siehe J.Y. Chang, R. Knedel, D. G. Braun, Biochem. J. 199, 547).
    • Ergebnisse Peak 1 (siehe Tabelle 2)
  • C-terminale Aminosäuren: -Glu-Tyr
    • Peak 2 (Fraktion 17, siehe Tabellen 1 und 2)
  • C-terminale Aminosäuren: -Glu-Tyr-Leu-Gln
    • Peak 3 (Fraktion 18, siehe Tabellen 1 und 2)
  • C-terminale Aminosäuren: -Glu-Tyr-Leu
    • d) Scheinbares Molekulargewicht:
  • Die Desulfatohirudinverbindungen (30 µg) werden auf einem SDS-Harnstoffgel (SUDS-Gel; siehe Kyte u. a., Anal. Biochem. 133, 515 (1983)) analysiert. Vor der Färbung mit Coomassie-Blau erfolgt mit 12% Trifluoressigsäure eine Fixierung. Beobachtet wird eine einzelne Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht zwischen 6000 und 7000 Dalton.
    • e) Molekulargewichtsbestimmung durch FAB-MS:
  • Die Desulfatohirudinverbindungen werden einer "fast atom bombardment"-Massenspektrometrie positiver Ionen (FAB-MS) unterzogen. Instrument: ZAB-HF-Massenspektrometer von VG-Analytical, Ltd., Manchester; Matrix: Thioglycerol; Xenon-Ionisierung; Ionenenergie 10 keV; externe Eichung: Cs&sub2;&sub6;J&sub2;&sub5; (Molekulargewicht 6887,9) und Cs&sub2;&sub8;J&sub2;&sub7; (7147,76).
    • Ergebnisse Peak 1 (siehe Tabelle 2):
  • Empirische Formel: C&sub2;&sub7;&sub6;H&sub4;&sub2;&sub1;N&sub7;&sub7;O&sub1;&sub0;&sub7;S&sub6;; Molekulargewicht (errechnet) 6722,23; Molekulargewicht (ermittelt) 6719,3
    • Peak 2 (Fraktion 17, siehe Tabellen 1 und 2):
  • Empirische Formel: C&sub2;&sub8;&sub7;H&sub4;&sub4;&sub0;N&sub8;&sub0;O&sub1;&sub1;&sub0;S&sub6;; Molekulargewicht (errechnet) 6963,518; Molekulargewicht (ermittelt) 6963,44 Das Molekulargewicht wird als Mittelwert von zwei Messungen bestimmt.
    • Peak 3 (Fraktion 18, siehe Tabellen 1 und 2):
  • Empirische Formel: C&sub2;&sub8;&sub2;H&sub4;&sub3;&sub2;N&sub7;&sub8;O&sub1;&sub0;&sub8;S&sub6;; Molekulargewicht (errechnet) 6835,39; Molekulargewicht (ermittelt) 6832,9
  • Auf der Grundlage der vorgelegten Daten ist die Verbindung von Peak 1 Desulfatohirudin (1 - 63), die Verbindung von Peak 2 identisch mit authentischem Desulfatohirudin (1 - 65) und die Verbindung von Peak 3 neuartiges Desulfatohirudin (1 - 64).
    • f) Human-Thrombin-Hirudin-Dissoziationskonstanten:
  • Die Dissoziationskonstanten KD der Human-Thrombin-Desulfatohirudin-Komplexe werden nach der Methode von S. R. Stone und J. Hofsteenge (Biochemistry, 25, 4622 - 4628 (1986)) bestimmt und sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt worden. Die Tabelle enthält auch die spezifischen Aktivitäten (ausgedrückt in ATU/mg) der drei gewonnenen Desulfatohirudinspezies. Spezifische Aktivität [ATU/mg] Hefe-Desulfatohirudin
    • g) Weitere Desulfatohirudinverbindungen, die von transformierter Hefe gewonnen wurden:
  • Das Gemisch von Desulfatohirudinverbindungen, das wie im Beispiel 19 beschrieben fermentiert und gereinigt wurde, wird weiter getrennt und im Detail charakterisiert.
  • Die semipräparative Trennung auf der RP-HPLC-Säule Vydac 218 TP 510 ergibt neben den oben beschriebenen Desulfatohirudinverbindungen (siehe Beispiel 21e) desulfatohirudinähnliche Verbindungen, die bei einer Retentionszeit von 8,1 min aus der Säule eluiert werden.
  • Dieses Material wird durch "fast atom bombardment"-Massenspektrometrie (FAB-MS) und Aminosäurenanalyse, partielle Sequenzierung und C-terminale Analyse charakterisiert.
  • FAB-MS zeigt, daß das Material ein Gemisch aus zwei Komponenten mit einem Molekulargewicht von 6429,5 bzw. 6556,8 ist.
  • Die Aminosäurezusammensetzung ist wie folgt: Aminosäure Hydrolysat Partielle Sequenzanalyse (N-Terminus): Zyklus C-terminale Analyse (siehe Beispiel 21c) C-terminale Aminosäuren
  • Ausgehend von diesen Daten, besteht das Gemisch aus Desulfatohirudin (1 - 61) und Desulfatohirudin (1 - 62).
    • Beispiel 22: Expression von Desulfatohirudinverbindungen in Hefe, die ein Desulfatohirudin-Gen ohne Signalsequenz beherbergt (Fig. 7): a) Isolierung des pJDB207-Vektorfragmentes:
  • 6µg des Plasmids pJDB207R/IF(α-3) (EP 100 561) werden vollständig mit der Restriktionsendonuclease BamHI verdaut. Die resultierenden DNA-Fragmente (6,85 kb und 1,15 kb) werden mit Ethanol ausgefällt und in 400µl 50 mM Tris.HCl, pH-Wert 8,0, aufgenommen. Es werden 4,5 Einheiten von Kalbsdarmphosphatase (Boehringer, Mannheim) zugesetzt. Das Gemisch wird für 1 h bei 37ºC inkubiert, dann wird die Phosphatase bei 65ºC 1,5 Stunden inaktiviert. Die Lösung wird auf 150 mM NaCl eingestellt, und sie wird dann einer DE52-Anionenaustauschsäule (Whatman) (100 µl Volumen) zugeführt, die vorher mit 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA äquilibriert wurde. Nach einem Waschvorgang mit dem gleichen Puffer wird die DNA mit 400µl von 1,5M NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA eluiert und mit Ethanol ausgefällt. Das große 6,85 kb-BamHI-Fragment wird vom kleinen Fragment auf einem 1,2%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt.
    • b) Isolierung des 534 bp-PHO5-Promotorfragmentes:
  • 6µg des Plasmids p31/R (EP 100 561) werden mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI verdaut. Die resultierenden 3 DNA-Fragmente werden auf einem 1,2%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 534 bp-BamHI-EcoRI-Fragment wird isoliert. Es enthält den PHO5-Promotor einschließlich der Transcriptionsstartstellen.
    • c) Isolierung eines 206 bp-DNA-Fragmentes mit der für Desulfatohirudin codierenden Sequenz:
  • 9 µg des Plasmids pML310 (siehe Beispiel 13c) werden vollständig mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI verdaut. Die beiden resultierenden DNA-Fragmente werden auf einem 1,2%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Es wird das 206 bp-EcoRI-BamHI-Fragment isoliert.
    • d) Ligation der DNA-Fragmente:
  • Die in Abschnitt a - c (siehe oben) genannten drei DNA- Fragmente werden durch Elektroeluierung aus Agarose-Gel-Blöcken gewonnen, über DE52-Anionenaustauschern (Whatman) gereinigt, mit Ethanol ausgefällt und in H&sub2;O wieder suspendiert.
  • 0,1 pMol (0,45µg) des 6,85 kb-BamHI-Vektorfragmentes, 0,3 pMol (0,1 µg) des 534 bp-BamHI- EcoRI-PHO5-Promotorfragmentes und 0,25 pMol (34 ng) des 206 bp-EcoRI-BamHI-Fragmentes von pML310 werden in 15µl von 60 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP mit 600 Einheiten von T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) bei 15ºC 16 Stunden ligiert.
  • 24 transformierte ampR Kolonien werden getrennt in LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin kultiviert. Plasmid-DNA wird nach der Methode von Holmes u. a. (siehe oben) isoliert und durch eine HindIII-EcoRI-Doppelverdauung analysiert. Das Auftreten von einem ungefähr 600 bp großen EcoRI-HindIII-Fragment zeigt, daß sich in dem betreffenden Klon das PHO5-Promotor- Hirudin-DNA-Fragment in der richtigen Orientierung zu den Transcriptionsstopsignalen auf dem Vektor befindet. wie erwartet, haben etwa 50% der Klone die korrekte Orientierung des Inserts. Einer dieser Klone wird als pJDB207R/PHO5-HIR bezeichnet.
    • e) Transformation von Saccharomyces cerevisiae GRF18:
  • Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm GRF18 (α, his3-11, his3-15, leu2-3 leu 2-112, canR) wird mit dem Plasmid pJDB207R/- PHO5-HIR nach dem Protokoll von Hinnen u. a. (siehe oben) transformiert. Die Selektion der transformierten Hefezellen erfolgt auf Agar-Platten mit Hefe-Minimalmedium ohne Leucin. Es wird eine transformierte Hefekolonie isoliert und als Saccharomyces cerevisiae GRF18/- pJDB207R/PHO5-HIR bezeichnet.
    • f) Kultivierung von S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHO5-HIR:
  • Zellen von S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHO5-HIR werden in 20 ml Hefe-Minimalmedium ("Difco Yeast Nitrogen Base" ohne Aminosäuren mit dem Zusatz von 2 % Glucose und 20 mg/l L-Histidin) bei 30ºC gerührt und auf eine Zelldichte von 3 x 10&sup7; Zellen/ml kultiviert. Die Zellen werden in 0,9%igem NaCl gewaschen und dann zum Inokulieren von 50 ml-Kulturen in Minimalmedium mit geringem Pi-Gehalt verwendet. Minimalmedium mit geringem Pi-Gehalt wird nach der Zusammensetzung des "Difco Yeast Nitrogen Base"-Mediums (ohne Aminosäuren) hergestellt, enthält aber 0,03 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 1 g/l KCl und 10 g/l L-Asparagin anstelle von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 % Glucose und 1 g/l L-Histidin. Die Kulturen werden bis zu einer Zelldichte von 4 x 10&sup6; Zellen/l inokuliert und bei 30ºC 42 Stunden mit 200 U/min bewegt.
    • g) Analyse des Produktgemischs aus der Fermentation von S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/- PHO5-HIR:
  • Die Zellen (siehe Beispiel 22f) werden wie üblich desintegriert (siehe beispielsweise europäische Patentanmeldung Nr. 100 561). Der mit 1,5%iger Essigsäure behandelte Überstand wird zentrifugiert und jeweils 2 ml der klaren Lösung werden auf einem "Speed Vac"-Konzentrator und im Hochvakuum getrocknet. Die Proben werden individuell in 100 µl Wasser aufgelöst und der HPLC-Analyse (Bedingungen wie im Beispiel 20) unterzogen. Es wird die Thrombininhibition der einzelnen Fraktionen getestet. Die Fraktion mit einer Retentionszeit von 16,5 min hat Thrombininhibitionsaktivität. Gemäß der Aminosäurenzusammensetzung ist diese Fraktion Desulfatohirudin. Auf der Grundlage der HPLC-Analyse ist der Titer etwa 10µg/l Kulturbrühe. Im Medium ist keine Hirudinaktivitätfeststellbar.
  • Die Ausbeuten der intrazellulären und extrazellulären Hirudinaktivität, die von Hefestämmen gewonnen wurden, welche das Desulfatohirudin-Gen mit oder ohne angefügte Signalsequenz beherbergen, werden in Tabelle 3 zusammengefaßt. Die Hirudinaktivität wird durch den Thrombininhibitionsassay gemessen. Tabelle 3: S. cerevisiae GRF18/Plasmid PHO5-Signalsequenz Hirudinaktivität (µg/l) Kulturmedium Zellextrakt Total nicht feststellbar
    • Beispiel 23: Konstruktion von PHO5-Promotordeletionen: a) Bal31-Verdauung:
  • Rekombinanter Phage M13mp9/PHO5 Bam-Sal, das BamHI-SalI-Fragment von PHO5 enthaltend, dargestellt in Fig. 8, wird als Quelle für den PHO5-Promotor verwendet (siehe europäische Patentanmeldung Nr.143081).
  • 20 µg der Phagen-DNA (RF: replikative Form) werden mit der Restriktionsendonuclease SalI verdaut, was eine lineare DNA von etwa 9 kb ergibt. Nach Extraktion mit Phenol/Chloroform wird die DNA mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wird in 10 mM Tris, pH-Wert 8,0, bei einer Konzentration von 0,5 µg/ml wieder suspendiert. 16 µg von SalI-gespaltener DNA werden mit 2 Einheiten Exonuclease Bal31 (BRL) in 100µl 20 mM Tris, pH-Wert 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl&sub2;, 12 mM CaCl&sub2; und 1 mM EDTA verdaut. Aliquote von 2 µg DNA jeweils werden nach 1, 2, 3, 4, 5 und 6 min Inkubation bei 30ºC entnommen und sofort mit 50 µl Phenol und 60 µl TNE gemischt. Nach Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ethanolfällung wird die DNA wieder in 10 mM Tris, pH-Wert 8,0, bei einer Konzentration von 100 µg/ml suspendiert. Um das Ausmaß der exonucleolytischen Spaltung durch Bal31 zu analysieren, werden 0,5 µg der DNA von jedem Zeitpunkt mit der Endonuclease BamHI verdaut und auf 1,5%igem Agarose-Gel in Tris-Boratpuffer, pH-Wert 8,3 (90 mM Tris.HCl, pH-Wert 8,3, 90 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA) analysiert. Im Durchschnitt werden von jedem Ende des Fragmentes je 1 min Bal31-Verdauung 100 bp entfernt.
    • b) Hinzufügen von EcoRI-Linkem zur Bal31-behandelten DNA:
  • Zwei A&sub2;&sub6;&sub0;-Einheiten von EcoRI- Linkem (5'-GGAATTCC-3', BRL) werden in 250 µl von 10 mM Tris, pH-Wert 8,1 mM EDTA wieder suspendiert. Zwei Mikrogramm der EcoRI-Linker werden in 75 µl von 60 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 15 mM DDT, 10 µm ATP und 33 U T&sub4;-Polynucleotidkinase (Boehringer) kinasiert. Nach einer Stunde bei 37ºC läßt man das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen und bewahrt es dann bei -20ºC auf.
  • Die hybridisierten (annealed), doppelsträngigen EcoRI-Linker werden mit ihren stumpfen Enden mit den Bal31-behandelten DNA-Fragmenten ligiert. 0,5 µg der Bal31-behandelten DNA (siehe Beispiel 23a) werden 16 Stunden bei Raumtemperatur mit einem fünfzigfachen Überschuß an kinasierten EcoRI-Linkern in 20µl von 60 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 4 mM ATP und 600 Einheiten von T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) inkubiert. Nach der Inaktivierung der T&sub4;-DNA-Ligase (10 min bei 65ºC) werden die überschüssigen EcoRI-Linker durch 50 Einheiten von EcoRI (Boehringer) in einem Volumen von 50 µl gespalten. Die DNA wird mit Phenol/Chloroform extrahiert, durch Ethanol ausgefällt und wieder in 10 mM Tris, 1 mM EDTA (=TE) suspendiert. Dann wird die DNA mit 5 Einheiten BamHI (Biolabs) gespalten, und das Gemisch wird auf 1,5%iges niedrigschmelzendes Agarose-Gel (Sigma) in Tris-Boratpuffer (siehe oben) aufgebracht. Die Banden werden mit Ethidiumbromid gefärbt und unter langwelligem UV-Licht bei 366 nm sichtbar gemacht. Die breiten, diffusen Bandenmuster zwischen etwa 100 bp und 600 bp werden aus dem Gel herausgeschnitten, und die DNA wird folgendermaßen extrahiert: Ein Stück Agarose wird bei 65ºC verflüssigt, auf 500 mM NaCl eingestellt und bei 65ºC 20 min lang inkubiert. Es wird ein Volumen Phenol (äquilibriert mit 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl) zugesetzt. Die wäßrige Phase wird zweimal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert. Die DNA wird mit 2,5 Volumen kaltem, absolutem Ethanol ausgefällt und durch Zentrifugieren gesammelt. Das DNA-Pellet wird mit kaltem, 80%igem Ethanol gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Die DNA wird in 10µl TE wieder suspendiert.
    • c) Ligation in M13mp9:
  • 3 µg RF von M13mp9 werden mit 15 Einheiten EcoRI (Biolabs) und 15 Einheiten BamHI (Boehringer) in einem Volumen von 50µl verdaut. Nach Phenolextraktion und der Ethanolfällung wird die DNA in 50 µl TE erneut suspendiert. 5 µl der geschnittenen Vektor-DNA (etwa 200 ng) werden mit 10 µl der oben genannten Proben (DNA-Fragmente von den verschiedenen Bal31-Verdauungen, wie in Beispiel 23b beschrieben) gemischt und in einem Gesamtvolumen von 20 µl in Gegenwart von 60 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP und 200 Einheiten von T&sub4;-DNA-Ligase 15 Stunden lang ligiert. Die Transduction von kompetenten Zellen des Stammes E. coli JM101 erfolgt nach dem Manual "M13 cloning and sequencing system", das von den New England Biolabs veröffentlicht wurde. Phagen von einer Reihe weißer Plaques werden gezüchtet und auf die Größe ihrer DNA-Inserts durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI analysiert.
    • d) Bestimmung der Bal31-Deletionsendpunkte durch Sanger-Sequenzierung (Deletionen von der SalI-Stelle:
  • Sequenzierung erfolgt durch das Didesoxy-DNA-Sequenzierungssystem von Sanger u. a. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], wie das im oben genannten Manual beschrieben wird. Nachstehend werden die Deletionsendpunkte gegeben: Klon Position des letzten Nucleotids der PHO5-Sequenz (Fig. 8)
    • e) Bestimmung der Bal31-Deletionsendpunkte nach der Sanger-Sequenzierung (Deletionen von der BamHI-Stelle):
  • Es erfolgt ein gleicher Satz von Bal31-Deletionen wie unter a - c beschrieben, außer daß M13mp9 PHO5 Bam-Sal durch BamHI geschnitten wird. Die Bal31-verdauten Moleküle werden durch EcoRI und SalI geschnitten, und die erzeugten Fragmente werden in M13mp9, das mit EcoRI und SalI verdaut ist, kloniert. Nachstehend werden die Deletionsendpunkte gegeben: Klon Position des letzten Nucleotids der PHO5-Sequenz (siehe Fig. 8)
    • f) Konstruktion von internen PHO5-Promotor-Deletionen:
  • Der unter d) beschriebene Bal31-Deletionssatz ergibt ein "linksarmiges" PHO5-Promotorfragment, das mit einer EcoRI-Stelle endet, und der unter e) beschriebene Bal31-Deletionssatz ergibt ein "rechtsarmiges" PHO5- Promotorfragment, das mit einer EcoRI-Stelle endet. Durch die Kombination von "linken Armen" und "rechten Armen" von verschiedenen Positionen werden interne Deletionen geschaffen, die ein EcoRI-Linkersegment an der Stelle der deletierten DNA enthalten. Die individuellen internen Deletionen werden durch Schneiden der "linken Arme" und der "rechten Arme" von den M13mp9-Derivaten durch die Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI (linke Arme) oder EcoRI und SalI (rechte Arme) und Isolieren der entsprechenden Fragmente über Weichagarose-Gel-Elektrophorese, wie unter b) beschrieben, konstruiert. Äquimolare Mengen von "linken Armen" und "rechten Armen" und 200 ng BamHI- und SalI-verdaute M13mp9-Vektor-DNA werden wie unter c) beschrieben ligiert. Nach Transduction in E. coli JM101 werden weiße Plaques hergenommen, RF wird produziert und durch Restriktionsanalyse analysiert (BamHI, SalI, EcoRI). Folgende Arme werden kombiniert, um spezifische interne Deletionen zu schaffen (Numerierung der Nucleotide siehe Fig. 8). "linker Arm" "rechter Arm" Deletion von - bis Anzahl der deletierten Nucleotide
    • g) In vivo-Analyse der internen Deletionen des PHO5-Promotors:
  • Die verschiedenen Deletionen, die im Beispiel 23f beschrieben wurden, werden in Plasmid pJDB207/PHO5 kloniert (R. Haguenauer-Tsapis und A. Hinnen, Molecular and Cellular Biology,4, 2668 bis 2675 (1984)) durch Ersetzen des Wildtyp-PHO5-Bam-Sal-Fragmentes durch die deletierte Version. Nach der Transformation des Hefestammes S. cerivisiae AH216 (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 143 081) wird die saure Phosphatase-Aktivität bestimmt, wie das von Tohe u.a. (J. Bacteriol. 113, 727 (1973)) beschrieben wurde. Die Deletionen Δ11 und Δ12 weisen eine etwa 10fache Verringerung der PHO5-Aktivität auf und definieren eine Upstream Region ("Upstream Aktivierungsstelle", UAS), die wesentlich für die PHO5-Expression ist. Ein ähnlicher Effekt wird für die Deletion Δ17 (etwa 5fache Verringerung) und für die TATA-Box-Deletionen Δ23 bis Δ26 (etwa 30fache Verringerung) beobachtet. Alle anderen Deletionen zeigen Aktivitäten, die etwa der des Wildtyps entsprechen. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß sich drei Bereiche von wesentlicher Information für die PHO5-Expression an folgenden Positionen befinden: 1. Zwischen den Positionen -349 und -383 (UAS1); 2. Zwischen den Positionen -225 und -263 (UAS2); 3. Zwischen den Positionen -87 und -125 (TATA-Box).
  • DNA-Fragmente, die UAS1 oder UAS2 oder UAS1 und UAS2 von PHO5 enthalten, können aus dem rekombinanten Phagen M13mp9/PHO5 Bam-Sal (siehe oben) durch Spaltung mit entsprechenden Restriktionsendonucleasen hergestellt werden. UAS1 ist in einem 268 bp- BamHI-ClaI-Fragment mit folgender Formel enthalten:
  • UAS2 ist in einem 100 bp-ClaI-BstEII-Fragment mit folgender Formel enthalten:
  • und beide, UAS1 und UAS2, sind in dem 368 bp-BamHI-BstEII-Fragment mit folgender Formel enthalten:
    • Beispiel 24: Expression von Desulfatohirudin unter der Kontrolle eines fusionierten PHO5- GAPDH-Hybridpromotors:
  • Beispiel 23 macht eine Region um Position -365 [UAS1(PHO5)] und eine andere Region um Position-180 [UAS2(PHO5)] des PHO5-Gens zu möglichen Kandidaten für UAS mit regulierenden Funktionen. UAS1(PHO5) ist in einem 268 bp-BamHI-ClaI-Fragment enthalten, während sowohl UAS1 (PHO5) als auch UAS2 (PHO5) in einem 368-bp-BamHI-BstEII-Fragment enthalten sind. Diese beiden Fragmente werden jeweils mit zwei verschiedenen GAPDH-downstream-Promotorelementen verschmolzen, welche die TATA-Box und die Transcriptionsinitiationsstellen von GAPDH einschließen.
    • a) Konstruktion einer Hefegenbibliothek:
  • 30 µg der gesamten, hochmolekulargewichtigen Hefe- DNA (M. V. Olsen u.a., J. Mol. Biol. 132, 387 (1979)) des Wildtyps von Saccharomyces cerevisiae-Stamm S288C werden 30 min bei 37ºC mit 2 Einheiten EcoRI-Methylase (New England Biolabs) in 250 µl EcoRI-Methylierungspuffer inkubiert, wie das vom Lieferer empfohlen wird. Die DNA wird mit Ethanol ausgefällt, in 500 µl von 25 mM Tris.HCl, pH-Wert 8,5, 2 mM MgCl&sub2; (EcoRI*-Puffer) wieder suspendiert (H. Meyer, FEBS Lett. 90, 341(1979)) und mit EcoRI (Boehringer) verdaut, bis die Größenverteilung der DNA-Fragmente im Bereich von 30 bis 50 kb ein Maximum hat (ein XhoI-Verdau von λDNA ergibt passende 33 kb- und 17 kb-Marker). Die unter EcoRI*-Bedingungen verdaute Hefe-DNA wird auf einem Saccharosegradienten (5 - 20% Saccharose in 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA) 6 Stunden bei 38 000 U/min in einem Rotor SW 40 nach der Größe fraktioniert. Es werden 30 Fraktionen von jeweils 0,4 ml oben vom Gradienten abgenommen. Fraktion 16 enthält DNA-Fragmente von 30 bis 40 kb Größe. Die DNA dieser Fraktion (3 µg) wird mit Ethanol ausgefällt und 16 Stunden bei 15ºC in einem Gesamtvolumen von 15 µl zu 1 µg Cosmidvektor pYcl (B. Hohn u. a. in "Genetic Engineering", Bd. 2, S. 169, New York 1980), linearisiert durch EcoRI, ligiert. Die Ligation erfolgt mit 300 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (New England Biolabs) unter Anwendung des vom Hersteller beschriebenen Puffersystems. Die DNA wird in vitro im Bakteriophagen λ verpackt werden (B. Hohn in "Methods in Enzymology", Vol. 68, S. 299, New York 1979), und die zusammengefügten Phagen werden dazu verwendet, den E. coli Stamm HB101 (rk(-), mk(-), leu(-), pro(-), recA) zu transduzieren. Der Effizienz der Transduction beträgt etwa 5000 ampicillinresistente Kolonien je Mikrogramm pYcl-Vektor. 3000 ampR Kolonien werden herausgenommen und einzeln in den Vertiefungen von Mikrotiter-Schalen in LB-Medium (10 g Bacto-Tryptone (Difco), 5 g Bacto Yeast Extract (Difco), 10 g NaCl), das 100 µg/ml Ampicillin enthält, gezüchtet.
    • b) Isolierung des Hefe-GAPDH-Gens:
  • Die oben beschriebene Gen-Bibliothek wird mit einem synthetischen Oligonucleotid gescreent (hergestellt unter Anwendung der Phosphotriester- Methode: K. Itakura u. a., J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975); J. F. M. de Rooij u. a., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 98, 537 (1979)), das folgende Struktur hat: 5'-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3'. 10 µg des Oligonucleotids werden unter Verwendung von 10 µl von γ-³²P-ATP (3000 Ci/mMol, 10 µCi/µl Amersham) mit T&sub4;-Polynucleotidkinase (Boehringer) in einem Gesamtvolumen von 50 µl kinasiert, wie das von Maniatis u. a. beschrieben wurde ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab., 1982, S. 125). Die Kolonie-Hybridisierung erfolgt nach der Beschreibung desselben Autors (S. 312). Positive Klone werden durch Autoradiographie unter Verwendung von Kodak X-5-Röntgenfilm festgestellt. Die Plasmid-DNA-Isolierung produziert einen Hybridklon, der ein 2100 bp-HindIII-Fragment enthält, das für GAPDH codiert (J. F. Holland u. a., J. Biol. Chem. 254 9839 (1979)). Der abschließende Beweis für die Authentizität der klonierten DNA kommt von einem DNA-Sequenzierungsexperiment unter Verwendung des oben genannten Oligonucleotids in Kombination mit dem Didesoxy-Sequenzierungsprotokoll, wie das von G. F. Hong (Bioscience Reports 1, 243 (1981)) für doppelsträngige DNA beschrieben wurde. Das klonierte GAPDH-Gen (siehe Fig. 9) hat dieselbe Sequenz wie pgap491, das von Holland u. a. veröffentlicht wurde (J. Biol. Chem. 255, 2596 (1980)).
    • c) Herstellung von GAPDH-Downstream-Promotorelementen (siehe Fig. 10):
  • Das 649 bp-TaqI-Fragment, das die Position -27 bis -675 vom ATG des GAPDH-Gens (siehe Fig. 9) einschließt wird isoliert durch Verdauen des oben genannten Hybridplasmids mit TaqI (New England Biolabs), Trennen der DNA-Fragmente auf 1,2%igem Weichagarose-Gel und Extrahieren der DNA durch heißes Phenol (siehe Beispiel 23). Die Klonierung des TaqI-Fragmentes erfolgt in die ClaI-Stelle von pBR322: 1 µg von pBR322 werden mit drei Einheiten ClaI (New England Biolabs) nach den Angaben des Herstellers gespalten. 300 ng des phenolisierten und geschnittenen Vektors werden an etwa 300 ng der Insert-DNA (649 bp-Taq-Fragment) unter Verwendung von 200 Einheiten von T&sub4;-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 20 µl ligiert (siehe Beispiel 23b). Die Transformation erfolgt in E. coli HB101 fürAmpicillinresistenz, die Plasmid-DNA wird hergestellt und durch Restriktionsanalyse analysiert [TaqI, DraI]. Die Orientierung des TaqI-Fragmentes wird unter Verwendung der Restriktionsendonuclease DraI in Kombination mit der BamHI-Stelle der Plasmide etabliert, und es wird ein Plasmid ausgewählt, bei dem die TagI-Stelle von Position -675 dicht bei der HindIII-Stelle von pBR322 liegt. Dieses Plasmid, das als pBR322/GAPDH bezeichnet wird, wird unter Verwendung von BamHI (New England Biolabs) linearisiert, und es wird eine Verdauung mit Bal31 wie im Beispiel 23 durchgeführt, außer daß BglII-Linker (5'-CAGATCTG-3', New England Biolabs) verwendet werden, und das verdaute Plasmid wird direkt bei einer Konzentration von 5 µg/ml in einem Gesamtvolumen von 20 µl zirkularisiert. Die Größe des Bal31 -verkürzten TaqI-Fragmentes wird durch Restriktionsanalyse (unter Verwendung von BglII und HindIII) bestimmt. Es werden zwei Klone ausgewählt, die DNA-Fragmente enthalten, die sich über etwa 200 bp bzw. 265 bp erstrecken, vom ATG upstream in den GAPDH-Promotor. Beide Fragmente enthalten die präsumptive TATA-Box bei etwa -140 bp. Diese Klone enthalten noch den Replikationsursprung im pBR322-abgeleiteten Teil der DNA und werden mit pGAPDH-F und pGAPDH-E bezeichnet.
    • d) Kombination des Downstream-GAPDH-Promotorelementes mit UAS1 (PHO5) von PHO5 und der Protein codierenden Region von Desulfatohirudin: I) Das GAPDH-Element:
  • Um das GAPDH-Promotorelement von der TaqI-Stelle an Position -27 zu einer Position unmittelbar benachbart zu dem ATG des GAPDH-Gens zu erstrecken, werden zwei synthetische komplementäre Oligonucleotide mit der folgenden Struktur synthetisiert:
  • Diese Oligonucleotide bieten die genuine GAPDH-Promotorsequenz von Position -26 bis Position -5 mit der Erzeugung einer terminalen EcoRI-Stelle. Zwei Mikrogramm der Bal31-Isolate von Beispiel 24c) (Plasmide pGAPDH-E und -F) werden mit 6 Einheiten von TaqI in 50µl verdaut, und das resultierende Gemisch wird phenolisiert, mit Ethanol ausgefällt und in 10 µl Wasser wieder suspendiert. Die synthetischen Oligonucleotide werden durch Mischen von 2 µl jedes einzelnen Stranges in 100 µl einer Lösung, die 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl enthält, Erhitzen auf 90ºC für die Dauer von 3 min und langsames Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur (innerhalb von etwa 3 Stunden) hybridisiert (annealed). Ein Mikrogramm von jedem der TaqI-verdauten Plasmide wird mit einem etwa zwanzigfachen Überschuß (molar) der hybridisierten Oligonucleotide in einem Volumen von 20 µl etwa 18 Stunden unter Verwendung von 800 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase verdaut. Das ganze Gemisch wird mit 3 Einheiten BglII (New England Biolabs) verdaut, die DNA-Fragmente werden auf einem 1,5%igen Weichagarosegel getrennt. Die BglII-EcoRI-Fragmente von etwa 200 bp bzw. 265 bp werden aus dem Gel geschnitten, extrahiert und mit Ethanol ausgefällt.
  • Plasmid pGAPDH-E wird mit BglII und EcoRI verdaut, und das große Fragment (etwa 3,5 kb) wird isoliert. Dieses Fragment wird als Vektor verwendet, um die 265 bp- und 200 bp-BglII-EcoRI- Fragmente unter Anwendung der oben beschriebenen Ligations-, Transformations- und Plasmidisolierungsbedingungen zu klonieren. Die erzeugten Plasmide werden als pGAPDH-EL und pGAPDH-FL bezeichnet. Die DNA-Sequenzen der BglII-EcoRI-Fragmente, die in Plasmiden pGAPDH-EL und pGAPDH-FL kloniert wurden, werden in der Fig. 11 dargestellt. Die genaue Größe der Fragmente ist 266 bp bzw. 201 bp.
    • II) Das regulatorische UAS1 (PHO5)-Element:
  • 3 µg Plasmid p31/Y (siehe europäische Patentanmeldung Nr. 100 561) werden mit 6 Einheiten ClaI (New England Biolabs) verdaut. Die 3'-zurückgesetzten Enden werden unter Verwendung des Klenow-Fragmentes von E. coli-DNA-Polymerase I (Bethesda Research Laboratories) nach Maniatis (oben) gefüllt. Es werden BglII-Linker (5'-CAGATCTG-3') hinzugefügt wie das im Beispiel 23 beschrieben wurde. Die DNA wird mit SalI und BglII (New England Biolabs) verdaut und auf 1%igem Weichagarosegel laufen gelassen. Das 548 bp-Fragment wird aus dem Gel geschnitten, phenolisiert und mit Ethanol ausgefällt, wie das oben beschrieben wurde.
    • III) Die für Desulfatohirudin codierende DNA:
  • Konstruktion von Plasmid pJDB207/PHO5(Eco)-HIR (siehe Fig. 12). Zur entsprechenden Verbindung der UAS (PHO5)-GAPDH-Hybridpromotorelemente mit der codierenden Region von Desulfatohirudin, einschließlich der PHO5-Signalsequenz (wie im Plasmid pJDB207/PHO5-HIR), wird eine EcoRI-Restriktionsstelle in die 5'-nichttranslatierte Region zwischen den mRNA-Startstellen und ATG der codierenden Region eingeführt.
  • 15µg des Plasmids pJDB207/PHO5-HIR (siehe Beispiel 16d) werden mit der Restriktionsendonuclease DraI (Boehringer) verdaut. Die resultierenden 4 Fragmente werden auf einem 0,8%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 4,2 kb-DNA-Fragment wird aus dem Gel gewonnen, elektroeluiert und durch Ethanol ausgefällt. Die DNA wird in H&sub2;O mit einer Konzentration von 0,6 mg/ml wieder suspendiert.
  • Zwei synthetische Oligonucleotide mit der Formel
  • (2,3 µg bzw. 2,9 µg) werden jeweils in 20 µl 60 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,5 mM ATP und 20 Einheiten T&sub4;-Polynucleotidkinase (Boehringer) kinasiert. Nach 45 min bei 37ºC werden die beiden Reaktionsgemische kombiniert, 10 min lang auf 75ºC erhitzt anschließend läßt man sie auf Raumtemperatur abkühlen. Der "annealed" Oligonucleotid-Linker wird bei -20ºC gelagert.
  • 6,5 µg (2,3 pMol) des 4,2 kb-DraI-DNA-Fragmentes werden 16 h bei 15ºC mit einem 70fachen Überschuß des kinasierten und "annealed" Oligonucleotid-Linkers in 50 µl von 60 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP und 800 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) inkubiert. Nach der Inaktivierung der T&sub4;-DNA-Ligase für 10 min bei 85ºC werden die überschüssigen Linker durch Ausfällung der DNA in Gegenwart von 10 mM EDTA, 300 mM Natriumacetat, pH-Wert 6,0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt. Die DNA wird mit EcoRI und HindIII verdaut. Die resultierenden Fragmente werden auf einem 1%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 643 bp-Fragment wird aus dem Gel durch Elektroelution und Ethanolfällung gewonnen. Die DNA wird in einer Konzentration von 0,1 pMol/µl wieder suspendiert. Das EcoRI-HindIII-Fragment enthält die PHO5-Signalsequenz, die codierende Sequenz von Desulfatohirudin und den PHO5-Transcriptionsterminator.
  • Das 534 bp-PHO5-Promotorfragment wird aus dem Plasmid p31/R (europäische Patentanmeldung Nr. 100 561) isoliert.
  • 10µg p31/R werden mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI verdaut. Die resultierenden 3 Fragmente werden auf einem 0,6%igen, niedrigschmelzenden Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Es wird ein 534 bp-BamHI-EcoRI-Fragment isoliert, das den PHO5-Promotor einschließlich der mRNA-Startstellen enthält.
  • Das Vektorfragment wird aus Plasmid pJDB207/PHO5-HIR (siehe Beispiel 16d) isoliert. 6 µg dieses Plasmids werden mit BamHI und HindIII verdaut. Das große 6,5 kb-BamHI-HindIII-Fragment wird von dem kleinen Fragment auf einem 0,6%igen, niedrigschmelzenden Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt.
  • Drei oben beschriebene DNA-Fragmente mit den entsprechenden klebrigen Enden werden in der folgenden Reaktion ligiert: 0,2 pMol (70 ng) des 534 bp-BamHI-EcoRI-PHO5-Promotorfragmentes, 0,2 pMol (85 ng) des 643 bp EcoRI-HindIII-Fragmentes (Hirudin codierende Sequenz) und 0,1 pMol (0,4 µg) des 6,5 kb-BamHI-HindIII-Vektorfragmentes werden in 10 µl von 60 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase 6 h bei 15ºC ligiert. Ein 1-µl-Aliquot des Ligationsgemisches wird 100 µl von calciumbehandelten, transformationskompetenten E. coli HB101-Zellen zugesetzt. 12 transformierte, ampR Kolonien werden individuell in LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält, gezüchtet. Plasmid-DNA wird nach der Methode von Holmes u. a. (Anal. Biochem. 114 (1981) 193) hergestellt und durch EcoRI- und BamHI-Restriktionsverdaue analysiert. Ein Klon mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird isoliert und als pJDB207/PHO5(Eco)-HIR bezeichnet.
    • IV) Ligation von UAS1 (PHO5)-GAPDH-Hybridpromotoren mit der Protein codierenden Region von Desulfatohirudin:
  • 15µg von Plasmid pJDB207/PHO5(Eco)-HIR (siehe Beispiel 24dIII) werden mit EcoRI und HindIII verdaut. Die DNA-Fragmente werden auf einem 1%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 643 bp-Fragment wird aus dem Gel isoliert, elektroeluiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wird mit einer Konzentration von 0,1 pMol/µl in H&sub2;O erneut suspendiert.
  • 6 µg von Plasmid pJDB207/PHO5-HIR werden vollständig mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und SalI verdaut. Das große 6,3 kb-Fragment (Vektorteil) wird durch Weichagarosegelelektrophorese, Phenolextraktion und Ethanolfällung isoliert. Das Vektor-DNA-Fragment wird mit einer Konzentration von 0,05 pMol/µl in H&sub2;O wieder suspendiert.
  • 10 µg von Plasmid pGAPDH-EL (siehe Beispiel 24dI) werden mit BglII und EcoRI verdaut. Das 266 bp-BglII-EcoRI-Fragment wird auf einem 1,2%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt, aus dem Gel elektroeluiert und mit Ethanol ausgefällt. Die DNA wird mit einer Konzentration von 0,3 pMol/µl in H&sub2;O wieder suspendiert.
  • 0,3 pMol des 548 bp-SalI-BglII-Fragmentes, das UAS1 (PHO5) enthält (Beispiel 24dII), 0,3 pMol des 266-bp-BglII-EcoRI-Fragmentes von pGAPDH-EL, 0,3 pMol des 643 bp-EcoRI-HindIII-Fragmentes von pJDB207/PHO5(Eco)-HIR und 0,12 pMol des 6,3 kb-SalI-HindIII-Vektorfragmentes werden in 20 µl von 60 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 400 Einheiten von T&sub4;DNA-Ligase (Biolabs) 6 h bei 15ºC ligiert. Aliquote von 1 µl und 3 µl des Ligationsgemisches werden zu 100 µl calciumbehandelten E. coli HB101-Zellen zugesetzt. Plasmidisolierung aus ampR Kolonien und Restriktionsanalyse mit SalI, BglII, EcoRI und HindIII werden wie oben ausgeführt (siehe Beispiel 24dIII). Ein positives Klon wird ausgewählt und als pJDB207/PAPEL-HIR (UAS1) bezeichnet.
  • Eine analoge Konstruktion erfolgt mit dem 201 bp-BglII-EcoRI-Fragment, das aus pGAPDH-FL isoliert wurde. Ein ausgewähltes Plasmid wird als pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1) bezeichnet.
    • V) Ligation des UAS1 (PHO5)-UAS2(PHO5)-GAPDH-Hybridpromotors mit der Protein codierenden Region von Desulfatohirudin (siehe Fig. 13):
  • Jeweils 3 µg der Plasmide pJDB207/PAPEL- HIR(UAS1) und pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1) werden mit BglII verdaut. Nach der Phenolextraktion und der Ethanolfällung werden die 3'-zurückgesetzten Enden der DNA nach Maniatis (siehe oben) in einer Reaktion mit E. coli-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment; Bethesda Research Laboratories) gefüllt. Das Enzym wird bei 70ºC 10 min inaktiviert. Die DNAs werden weiter mit SalI verdaut, und die großen 7.2 kb-Fragmente werden durch Weichagarosegelelektrophorese, Phenolextraktion und Ethanolfällung isoliert. Jedes Fragment wird mit einer Konzentration von 0,05 pMol/µl wieder in H&sub2;O suspendiert. Die Fragmente enthalten die Hirudin codierende Region, die meisten der Vektorsequenzen und eines der beiden GAPDH-Promotorelemente, die aus pGAPDH-EL oder pGAPDH-FL isoliert wurden.
  • Plasmid p31/Y (europäische Patentanmeldung Nr. 100 561) wird mit BstEII verdaut, mit E. coli-DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) inkubiert, wie das oben beschrieben wurde, und mit SalI gespalten. Das 649 bp-Fragment wird auf einem Weichagarosegel getrennt und durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gewonnen.
  • 0,3 pMol des 649 bp-Fragmentes von p31/Y, das das UAS1-UAS2 (PHO5)-Promotorelement enthält, und 0,15 pMol eines der 7,2 kb-Fragmente werden ligiert und wie oben beschrieben in E. coli HB101 transformiert. Aus ampR Kolonien werden Plasmide hergestellt und durch Restriktionsverdaue analysiert. Es werden einzelne Krone ausgewählt und deren Plasmid-DNAs bezeichnet als
  • und
    • Beispiel 25: GAPDH-Promotorelemente, fusioniert mit der Protein codierenden Sequenz von Desulfatohirudin:
  • Zwei GAPDH- Promotorelemente von unterschiedlicher Länge (wie im Beispiel 24dI beschrieben) werden mit der Protein codierenden Region des Desulfatohirudins, einschließlich der PHO5-Signalsequenz ligiert.
  • Die beiden Elemente (266 bp bzw. 201 bp) beinhalten die GAPDH-TATA-Box, die mRNA-Startstellen und eine AT-reiche 5'-nichttranslatierte Region. Die Nucleotidsequenz der beiden Elemente wird in der Fig. 10 gezeigt.
  • Die 3'-Enden der Elemente befinden sich beide in der Position -5 von ATG des GAPDH-Gens, gefolgt von einer EcoRI-Erkennungsstelle (siehe die Oligonucleotid-Linker, im Beispiel 24dI eingeführt), die 5'-Enden sind in den Positionen -198 bzw. -263 von ATG mit an diesen Positionen angefügten BglII-Linkern.
  • Die BglII-BamHI-Promotorfragmente werden an ein EcoRI-HindIII-Fragment mit Sequenzen ligiert, die für die PHO5-Signalsequenz und Desulfatohirudin codieren, und an ein HindIIIBamHI- Vektorfragment.
  • 6 µg von Plasmid pJDB207/PHO5-HIR werden vollständig mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und BamHI verdaut. Das große 6,5 kb-Fragment (Vektorteil) wird auf einem 0,8%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, abgetrennt, aus dem Gel elektroeluiert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Das Vektor-DNA-Fragment wird in einer Konzentration von 0,05 pMol/µl in H&sub2;O wieder suspendiert.
  • 0,3 pMol des 266 bp-BglII-EcoRI-Fragmentes von pGAPDH-EL (Beispiel 24d IV), 0,3 pMol des 643 bp-EcoRI-HindIII-Fragmentes von pJDB207/PHO5(Eco)-HIR (Beispiel 24d III) und 0,1 pMol des 6,5 kb-HindIII-BamHI-Vektorfragmentes werden in 10 µl von 60 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 400 Einheiten von T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) 6 h bei 1500 ligiert. 1 µl des Ligationsgemisches wird 100µl calciumbehandelten E. coli HB101-Zellen zugesetzt. Die Plasmidisolierung von ampR-Kolonien und die Restriktionsanalyse mit EcoRI werden so ausgeführt, wie das im Beispiel 24d III beschrieben wurde. Ein positiver Klon wird ausgewählt. Seine Plasmid-DNA wird als pJDB207/GAPEL-HIR bezeichnet.
  • Eine analoge Konstruktion erfolgt mit dem 201 bp-BglII-EcoRI-Fragment, das aus pGAPDH-FL isoliert wurde. Die Plasmid-DNA eines ausgewählten Klons wird pJDB207/GAPFL-HIR genannt.
    • Beispiel 26: Konstruktion von Expressionsplasmiden mit Tandem-Inserts der codierenden Sequenz von sekretiertem Desulfatohirudin (siehe Fig. 14):
  • Die folgenden Konstruktionen enthalten ein DNA-Fragment, das in einer Kopf-Schwanz-Tandemanordnung dupliziert ist. Das duplizierte Fragment umfaßt den GAPDH-Promotor oder einen Hybrid-PHO5-GAPDH-Promotor (wie in den Beispielen 24 bzw. 25 beschrieben), die PHO5-Signalsequenz, die codierende Sequenz von Desulfatohirudin und den PHO5-Transcriptionsterminator.
  • 7 µg des Plasmids pJDB207/GAPEL-HIR werden mit der Restriktionsendonuclease HindIII verdaut. Die 3'-zurückgesetzten Enden werden in einer Reaktion mit E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow- Fragment; Bethesda Research Laboratory) nach Maniatis (siehe oben) gefüllt. 1,85µg von SalI- Linker 5'-GGTCGACC-3' (Biolabs) werden in 50 µl von 60 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;. 5 mM DTT, 0,5 mM ATP und 50 Einheiten T&sub4;-Polynucleotidkinase (Boehringer) kinasiert. Nach 45 min bei 37ºC wird das Gemisch 10 min bei 75ºC erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. 7 µg (1,5 pMol) linearisiertes Plasmid pJDB207/GAPEL-HIR mit den zu stumpfen Enden umgewandelten HindIII-Stellen (siehe oben) werden 16 h bei 15ºC mit einem 80fachen Überschuß an kinasierten und "annealed" Sal-Linkern in 30 µl von 60 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP und 800 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) inkubiert.
  • Nach der Inaktivierung der T&sub4;-DNA-Ligase bei 75ºC über 10 min werden die überschüssigen Linker durch Ausfällung der DNA in Gegenwart von 10 mM EDTA, 300 mM Natriumacetat, pH-Wert 6,0, und 0,54 Volumen Isopropanol entfernt. Die DNA wird mit SalI verdaut. Die resultierenden Fragmente werden auf einem 1%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 1,1 kb-SalI-Fragment wird aus dem Gel durch Elektroeluieren, Phenolextraktion und Ethanolfällung gewonnen. Die DNA wird bei einer Konzentration von 0,1 pMol/µl wieder suspendiert.
  • 5µg Plasmid pJDB207/GAPEL-HIR werden vollständig mit SalI verdaut. Nach Phenolextraktion und Ethanolfällung wird die DNA in 100 µl von 50 mM Tris, pH-Wert 8,0, wieder suspendiert. Es werden 4,6 Einheiten alkalischer Kalbsdarmphosphatase (Boehringer) zugesetzt. Nach einer Stunde bei 37ºC wird die Phosphatase in Gegenwart von 100 mM NaCl, 5 mM EDTA und 0,5% SDS über 15 min bei 68ºC inaktiviert. Die DNA-Lösung wird einem 100 µl-Bett von DE52-Anionenaustauscher (Whatman) zugesetzt, die mit 10 mM Tris, pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl und 1 mM EDTA äquilibriert wurde. Nach dem Auswaschen der Säule mit dem gleichen Puffer wird die DNA mit 400 µl von 1,5 M NaCl, 10 mM Tris, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA eluiert und mit Ethanol ausgefällt. Linearisiertes Plasmid wird von der ungeschnittenen DNA auf einem 0,6%igen Agarose-Gel in Tris-Acetatpuffer getrennt. Das lineare 7,3 kb-DNA-Fragment wird aus dem Gel gewonnen, elektroeluiert, mit Phenol extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und bei einer Konzentration von 0.1 pMol/µl wieder suspendiert.
  • 0,2 pMol des 1,1 kb-SalI-Fragmentes und 0,1 pMol des linearisierten Vektors werden in 10 µl von 60 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 200 Einheiten von T&sub4;-DNA- Ligase 16 Stunden bei 15ºC ligiert. Ein 1-µl-Aliquot des Ligationsgemisches wird 100µl calciumbehandelten, transformationskompetenten E. coli HB101-Zellen zugesetzt.
  • 24 transformierte, ampR-Kolonien werden individuell in LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält, gezüchtet. Die Plasmid-DNA wird nach der Methode von Holmes u.a. (Anal. Biochem. 114 (1981) 193) hergestellt und durch EcoRI-Restriktionsverdau analysiert. Ein Klon wird mit den erwarteten Restriktionsfragmenten isoliert und als pJDB207/[GAPEL-HIR]D bezeichnet.
  • Analoge Konstruktionen werden mit den Plasmiden pJDB207/GAPFL-HIR und pJDB207/PAPFL/HIR (UAS1 + UAS2) ausgeführt. Die resultierende Plasmid-DNA von jeweils einem ausgewählten Klon wird pJDB207/[GAPFL-HIR]D und pJDB207/[PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2)]D genannt.
    • Beispiel 27: Konstruktion eines Expressionsplasmids mit vier Inserts der codierenden Sequenz von sekretiertem Desulfatohirudin:
  • Vier Kopien eines DNA-Fragmentes, das einen GAPDH-Promotor, die PHO5-Signalsequenz, die codierende Sequenz von Desulfatohirudin und den PHO5-Transcriptionsterminator enthält, werden in den Hefe-Expressionsvektor in einer Kopf-Schwanz-Tandemanordnung inseriert.
  • 10µg von Plasmid pJDB207/[GAPFL-HIR]D (siehe Beispiel 26) werden mit SalI verdaut. Die klebrigen Enden des resultierenden linearen Fragmentes werden in einer Reaktion mit E. coli- DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment, BRL) nach Maniatis u. a. (siehe oben) gefüllt. 0,94µg von HindIII-Linker [5'-CAAGCTTG-3', Biolabs] werden kinasiert, selbstreassoziiert und mit dem linearisierten Plasmid pJDB207/[GAPFL-HIR]D mit den zu stumpfen Enden umgewandelten SalI-Stellen (siehe oben) ligiert. Die Linker-Ligation und die Isopropanolfällung erfolgen wie im Beispiel 26. Anschließend wird die DNA mit HindIII gespalten, und das resultierende 2,2 kb-Fragment wird durch Elektroelution, Phenolextraktion und Ethanolfällung isoliert. Die DNA wird bei einer Konzentration von 0,1 pMol/µl wieder suspendiert.
  • 5 µg des Plasmids pJDB207/[GAPFL-HIR]D werden vollständig mit HindIII verdaut. Die DNA wird mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase (Boehringer) dephosphoryliert, durch DE52-Ionenaustauschchromatographie gereinigt und aus einem 0,6%igen Agarose-Gel durch Elektroelution gewonnen, wie das im Beispiel 26 beschrieben wurde.
  • 0,2 pMol des 2,2 kb-HindIII-Fragmentes und 0,1 pMol des linearisierten Vektors werden ligiert (siehe oben). Ein 1-µl-Aliquot des Ligationsgemisches wird 100 µl calciumbehandelten, transformationskompetenten E. coli HB101-Zellen zugesetzt.
  • 12 transformierte, ampR Kolonien werden in einem LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält, individuell gezüchtet. Es wird Plasmid-DNA hergestellt und durch SalI-, XbaI-; AvaI-, XbaI-Doppelverdaue und BamHI-Verdaue analysiert. Ein 1,1 kb-BamHI-Verbindungsfragment zeigt an, daß das Insert in einer Kopf-Schwanz-Anordnung im Verhältnis zu den bereits auf dem Plasmin vorhandenen Kopien vorhanden ist. Ein Klon mit dieser Orientierung des Inserts wird als pJDB207/[GAPFL-HIR]T bezeichnet.
    • Beispiel 28: Konstruktion eines Hefeexpressionsvektors, der den PHO5-Promotor, die Invertase- Signalsequenz und die Desulfatohirudin codierende Region enthält: A) Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden für die Invertase-Signalsequenz:
  • Vier Oligodesoxyribonucleotide, I-1, I-2, I-3, I-4, werden durch DNA-Synthesizer (Modell 380B Applied Biosystems) synthetisiert. Nach dem Deblockieren werden die synthetischen Fragmente auf einem 12%igen Polyacrylamid-Gel, das 8 M Harnstoff enthält, gereinigt. Salzfreie, reine Oligodesoxyribonucleotide werden unter Verwendung von Sep. Pak (Waters Associates) gewonnen. Diese Fragmente stellen einen Duplex dar, der für die Invertase-Signalsequenz mit den häufig genutzten Hefe-Codons codiert.
    • B) Subklonierung der Invertase-Signalsequenz: a) Herstellung des Vektors:
  • 1,5 µg von p31R/SS-TPAΔ2 (europäische Patentanmeldung Nr. 143081) werden mit 10 Einheiten EcoRI (Boehringer) in 50 µl von 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 6 mM Mercaptoethanol eine Stunde bei 37ºC verdaut. Nach dem Zusetzen von 1 µl von 2,5 M NaCl werden 10 Einheiten von XhoI (Boehringer) zugesetzt und bei 37ºC eine Stunde lang inkubiert. Der 4,2 kb-Vektor wird auf einem 0,8%igen präparativen Agarose-Gel isoliert. Die Gel-Scheibe wird in ein Micro-Colloidor-Rohr (Sartorius GmbH) transferiert, mit 200 µl TE bedeckt und elektroeluiert (Elektrophorese bei 90 mA 50 min). Die TE-Lösung wird gesammelt und in 2,5 Volumen absolutem Ethanol nach dem Zusatz von 0,1 Volumen 10 x TNE ausgefällt. Das DNA-Pellet wird mit kaltem, 80%igem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die DNA wird in 6 µl TE (40 pMol/µl) wieder suspendiert.
    • b) Annealing der Oligodesoxvribonucleotide (I-1, I-2, I-3, I-4), Kination und Ligation mit Vektor:
  • Eine Lösung, die 10 pMol jedes der vier Desoxyribonucleotide in 10 µl von 0,5 Tris.HCl, pH-Wert 8,0, enthält, wird bei 95ºC fünf Minuten lang auf einem Wasserbad inkubiert. Das Wasserbad wird über eine Zeitspanne von 5 Stunden langsam auf 30ºC abgekühlt. Diesem hybridisierten (annealed) Gemisch werden jeweils 2 µl von 0,1 M MgCl&sub2;, 0,1 M NaCl, 30 mM DTT, 4 mM ATP und 8 Einheiten (1 µl) von Polynucleotidkinase (Boehringer) zugesetzt. Die Kination wird bei 37ºC über die Dauer einer Stunde vorgenommen. Die hybridisierten, kinasierten Oligodesoxyribonucleotide und 60 pMol des EcoRI-XhoI-geschnittenen Vektors (1,5 µl) werden mit 400 Einheiten (1 µl) T&sub4;-DNA-Ligase (Biolabs) bei 14ºC 17 Stunden ligiert. Die Reaktion wird durch Inkubation bei 65ºC für 10 min Dauer gestoppt. 10 µl dieses Ligationsgemisches werden für die Transformation von E. coli HB101 Ca++-Zellen verwendet (M. Dagert und S. D. Ehrlich, Gene 56, 23 - 28 (1979)). Die 20 ampR Kolonien werden herausgenommen. DNA wird durch das Schnell-Isolationsverfahren gewonnen (D. S. Holmes und M. Quigley, Anal. Biochem. 114, 193 - 197 (1981)). DNA wird mit EcoRI und XhoI verdaut, am EcoRI-Ende radioaktiv markiert und auf einem 6%igen Polyacrylamidgel, das 8 M Harnstoff enthielt, unter Verwendung der radioaktiv markierten pBR322 HaeIII-geschnittenen DNA als Marker analysiert. Bande korrekter Größe werden für die DNA beobachtet, die von allen 20 Klonen gewonnen wird. Ein Klon wird in 100 ml LB-Medium gezüchtet, das 100 µg/ml Ampicillin enthält. Die Plasmid-DNA wird isoliert und als p31RIT-12 bezeichnet.
    • C) Verbindung des GAPFL-Promotorelementes mit der Invertase-Signalsequenz:
  • 5 µg von Plasmid p31RIT-12 werden vollständig mit SalI und EcoRI verdaut. Das große 3,3 kb-SalI-EcoRI-Fragment wird auf einem 0,6%igen Agarose-Gel in Tris-Acetatpuffer, pH-Wert 8,2, isoliert. Die DNA wird aus dem Gel elektroeluiert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. 10 µg von Plasmid pJDB207/GAPFL-HIR (siehe Beispiel 25) werden mit SalI und EcoRI verdaut. Das 477 bp-SalI- EcoRI-Fragment wird auf einem 0,8%igen Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, isoliert. Die DNA wird elektroeluiert, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die beiden isolierten DNA-Fragmente werden ligiert. Ein Aliquot des Ligationsgemisches wird dazu verwendet, kompetente E. coli HB101-Zellen zu transformieren. Es werden ampR Kolonien gezüchtet, und die Plasmid-DNA wird durch HindIII, SalI-Doppelverdauung analysiert. Ein Plasmid mit dem korrekten Insert wird als p31/GAPFL-IT bezeichnet.
    • D) Konstruktion von Plasmid JDB207/GAPFL-I-HIR (siehe Fig. 15):
  • 25µg von Plasmid p31/- GAPFL-IT werden vollständig mit PstI und SalI verdaut. Das resultierende 676 bp-Fragment wird auf 10%igem präparativem Agarose-Gel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, isoliert. Die DNA wird elektroeluiert, durch DE52-Ionenaustauschchromatographie gereinigt. mit Ethanol ausgefällt und mit einer Konzentration von 0,1 µg/µl wieder in dem Puffer suspendiert, der für HgaI-Verdaue empfohlen wird. Das SalI-PstI-DNA-Fragment wird in Gegenwart von 0,5 Einheiten/µg DNA für die Dauer von 60 min bei 37ºC mit HgaI teilweise verdaut. Die Reaktion wird durch den Zusatz von EDTA zu einer Endkonzentration von 10 mM gestoppt. Das 534 bp-SalI-HgaI- Fragment wird auf einem 1%igen präparativen Agarose-Gel isoliert. Die DNA wird aus dem Gel elektroeluiert, durch DE52-Chromatographie gereinigt, mit Ethanol ausgefällt und mit einer Konzentration von etwa 0,1 pMol/µl in H&sub2;O wieder suspendiert.
  • 10µg von Plasmid pJDB207/PHO5-HIR (siehe Beispiel 16) werden mit BalI und HindIII verdaut. Das resultierende 587 bp-BalI-HindIII-Fragment wird auf einem 1%igen präparativen Agarose-Gel isoliert. Die DNA wird elektroeluiert, mit Ethanol ausgefällt und weiter mit Hinfl verdaut.
  • 1,3 µg (160 pMol) jedes der folgenden Oligonucleotide
  • werden wie im Beispiel 24d III beschrieben kinasiert und "annealed". 0,6 µg (1.6 pMol) des Hinfl-verdauten BalI-HindIII-Fragmentes (siehe oben) und 160 pMol des kinasierten und hybridisierten Linkers werden 16 Stunden lang bei 15ºC in 83 µl von 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP und 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase ligiert. Nach 10 Minuten bei 85ºC werden die überschüssigen Linker durch Isopropanolfällung der DNA entfernt (siehe Beispiel 24d III). Das 584 bp-HgaI-HindIII-Fragment wird auf einem 1%igen präparativen Agarose- Gel isoliert. Die elektroeluierte, gereinigte und mit Ethanol ausgefällte DNA wird in einer Konzentration von 0,1 pMol/µl in H&sub2;O wieder suspendiert.
  • 5µg von pJDB207/PHO5-HIR werden mit HindIII und SalI verdaut, und das große 6,2 kb-Fragment wird isoliert.
  • 0,2 pMol des 534 bp-SalI-HgaI-Fragmentes, 0,2 pMol des 584 bp-HgaI-HindIII-Fragmentes und 0,1 pMol des 6,2 kb-SalI-HindIII-Vektorfragmentes werden 5 Stunden bei 15ºC in 10 µl von 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase ligiert. Ein 1-µl-Aliquot des Ligationsgemisches wird zur Transformation von kompetenten E. coli HB101-Zellen verwendet.
  • 24 transformierte, ampicillinresistente Kolonien werden individuell in LB-Medium, das 100 µg/ml Ampicillin enthält, gezüchtet. Es wird Plasmid-DNA hergestellt und durch HindIII, SalI- Doppelverdauung analysiert. Ein einzelner Klon mit dem korrekten Restriktionsmuster wird isoliert und als pJDB207/GAPFL-I-HIR bezeichnet. Die Identität der Invertase-Signalsequenz und die korrekte Fusion mit der Hirudin codierenden Sequenz werden durch Nucleotid-Sequenzierung bestätigt.
    • Beispiel 29: a) Transformation von Saccharomyces cerevisiae GRF18:
  • Der Stamm Saccharomyces cerevisiae GRF18 (α, his3-11, his3-15, leu2-3, leu2-112, canR) wird transformiert mit den Plasmiden:
  • pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1),
  • pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1),
  • /pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2),
  • pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2),
  • pJDB207/GAPEL-HIR,
  • pJDB207/GAPFL-HIR,
  • pJDB207/[GAPEL-HIR]D,
  • pJDB207/[GAPFL-HIR]D,
  • pJDB207/[PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2)]D,
  • pJDB207/[GAPFL-HIR]T und
  • pJDB207/GAPFL-I-HIR unter Anwendung des von Hinnen u. a. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)) beschriebenen Transformationsprotokolls. Die transformierten Hefezellen werden auf Hefe-Minimalmedium-Platten ohne Leucin ausgewählt. Es werden einzelne transformierte Hefekolonien isoliert und bezeichnet als:
  • Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1),
  • Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1),
  • Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2),
  • Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2),
  • Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPEL-HIR,
  • Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR,
  • Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/[GAPEL-HIR]D,
  • Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]D,
  • Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/[PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2)]D,
  • Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]T,
  • Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-I-HIR.
    • b) Fermentation der Transformanten:
  • Zellen der S. cerevisiae GRF18-Transformanten werden jeweils in 10 ml Hefe-Minimalmedium ("Difco Yeast Nitrogen Base" ohne Aminosäuren, der 2% Glucose und 20 mg/l L-Histidin zugesetzt werden) in einem Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsvermögen von 50 ml unter Schütteln für die Dauer von 24 h bei 30ºC bis zu einer Dichte von 3 x 10&sup7; Zellen/ml gezüchtet. Bei Hefetransformanten, die Plasmide mit einem Hybrid-PHO5- GAPDH-Promotor enthalten, ist die Derepression des Promotors für die Expression von Desulfatohirudin erforderlich. Die Zellen werden in 0,9%igem NaCl gewaschen und dazu genutzt. 50 ml eines Minimalmediums mit niedrigem Pi-Wert zu inokulieren, das nach der Rezeptur des "Difco Yeast Nitrogen Base"-Mediums (ohne Aminosäuren) hergestellt wurde, aber 0,03 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 10 g/l L-Asparagin anstelle von (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2% Glucose und 1 g/l L-Histidin enthält. Die Kulturen werden bis zu einer Zelldichte von 4 x 10&sup6; Zellen/ml inokuliert und bei 30ºC bis zu 24 h bei 200 U/min gerührt. Man erhält Enddichten von 1 x 10&sup8; Zellen/ml.
  • Hefetransformanten, die Plasmide mit dem GAPDH-Promotor aufweisen, exprimieren Desulfatohirudin konstitutiv. Zellen werden in einem Komplexmedium gezüchtet, das aus (g/l) Pepton (5), Hefeextrakt (10), Glucose (20), Saccharose (40), Ammoniumsulfat (3), KH&sub2;PO&sub4; (2), MgSO&sub4; (0,5), NaCl (0,1), CaCl&sub2; (0,1), Biotin (10µg/l) besteht. Nach 48 h Inkubationszeit bei 30ºC und 200 U/min erhält man etwa 1 x 10&sup9; Zellen/ml.
  • Die Mengen an Desulfatohirudin (bestimmt durch den Thrombininhibitionsassay). das durch einige repräsentative transformierte Hefestämme abgegeben wird, werden in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Stamm Saccharomyces cerevisiae GRF18/ Sekretiertes Hirudin (mg/l) Erntezeit
  • Außerdem wird festgestellt, daß wenigstens 90% der Desulfatohirudinverbindungen, die durch die Hefetransformanten exprimiert werden, in das Kulturmedium sekretiert werden. Um die Verteilung des Desulfatohirudins in der Kulturbrühe und in den Zellen als eine Funktion der Erntezeit zu bestimmen, wird die Fermentation in einem 3 l-MBR-Bioreaktor (MBR Bioreactor AG, Wetzikon, Schweiz) durchgeführt. Der Stamm Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR wird in 3 l Komplexmedium (siehe oben) inokuliert und bei 30ºC bei einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min und einer Belüftungsrate von 200 l/h inkubiert. Eine abschließende Dichte von 5 x 10&sup9; Zellen/ml wird umgesetzt. Proben werden nach 18, 24 bzw. 48 Stunden entnommen, und der Gehalt an Desulfatohirudin in der Kulturbrühe und in den Zellen (nach der Zersetzung, siehe Beispiel 22) wird durch den Thrombininhibitionsassay und durch HPLC bestimmt. Zeit (h) Desulfatohirudin (mg/l) Thrombininhibition Kulturbrühe Zellinneres
    • Beispiel 30: Kultivierung der Transformanten im Umfang von 300 l: a) Der Inokulationszyklus:
  • Eine Reihe von Agarschrägflächen wird aus einer tiefgefrorenen Ampulle inokuliert, welche Zellen des Stammes Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR enthält. Eine oder mehrere Agarschrägflächen werden 3 bis 5 Tage bei 28º bis 30ºC inkubiert. Der Inhalt einer einzelnen Agarschrägfläche wird steril in einzelne Erlenmeyer-Kolben zu 500 ml ohne Trennplatten, die 100 ml Vorkulturmedium enthalten, inokuliert. Die Kolben werden auf einer Umlaufschüttelmaschine mit 50 mm Ausschlag bei 250 U/min bei einer Inkubationstemperatur von 28ºC geschüttelt. Nach 48 Stunden werden 2% (v/v) des Inhalts dieser Kolben (1. Vorkultur) steril in 2 l-Erlenmeyer-Kolben inokuliert, die 600 ml Vorkulturmedium enthalten. Diese Kolben (2. Vorkultur) werden 48 Stunden lang bei 28ºC auf einer Umlaufschüttelmaschine mit 120 U/min bei einem Ausschlag von 50 mm geschüttelt. Der Inhalt eines der Kolben mit der 2. Vorkultur (2% v/v) wird steril in einen 50 l-Fermentor aus rostfreiem Stahl eingeführt, das 30 l Vorkulturmedium (Pflanzenvorkultur) enthält. Die Fermentationsbedingungen für die Pflanzenvorkultur sind wie folgt: 600 U/min (einzelnes Turbinenrührwerk mit sechs Blättern, 115 mm Durchmesser), 4 Leitplatten; Druck: 0,3 bar, Lüftung 1 l Luft je Liter Medium je Minute, Temperatur 23ºC, 48 Stunden Dauer.
  • Das Agar-Medium und das Vorkulturmedium sind gleich, abgesehen vom Vorhandensein bzw. Fehlen von Agar. Für alle Vorkulturstufen wurde das gleiche Vorkulturmedium verwendet.
  • Zusammensetzung des Vorkulturmediums (g/l): "Yeast Nitrogen Base" (Difco) 8,4; L-Asparagin.H&sub2;O 11,6; L-Histidin 1,0; Glucose (getrennt sterilisiert) 2,0.
  • Zusammensetzung des Agar-Mediums: wie Vorkulturmedium plus 20 g Agar/l.
    • b) Die Produktionsfermentation (300 l Maßstab):
  • 5% (v/v, 15 l) der gezüchteten Pflanzenvorkultur werden steril in einen 600 l-Fermentor eingeführt, das 300 l steriles Fermentationsproduktionsmedium enthält. Das Produktionsmedium von 300 l hat folgende Fermentationsbedingungen: 450 U/min (einzelnes Rührwerk, sechs Blätter, Durchmesser 230 mm); 4 Leitplatten, Druck 0,3 bar; Luftdurchsatz 0 - 9 h, 0,25 l Luft je Liter Medium je Minute, 9 Stunden-Ernte: 1 l Luft je Liter Medium je Minute; Temperatur 28ºC, Dauer 24 - 48 h. OD&sub6;&sub0;&sub0; 15 - 20. Ausbeute: 15 - 25 mg/l (Prüfmethoden: HPLC und Thrombintests).
  • Zusammensetzung des Produktionsmediums (g/l): Pepton 5; Hefeextrakt 10; Saccharose 40; (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 6; MgSO&sub4;.7H&sub2;O 1; NaCl 0,1; KH&sub2;PO&sub4; 2; CaCl&sub2;.2H&sub2;O 0,013. pH-Wert vor der Sterilisation 6,0; Antischaummittel: UCON LB 625, soweit erforderlich.
    • Beispiel 31: Isolierung von Desulfatohirudin aus den 300 l Kulturbrühe:
  • Die Kulturbrühe (siehe Beispiel 30) mit einem pH-Wert von 3,3 wird auf 17ºC gekühlt. Die Zellen werden durch eine Entschlammungsvorrichtung Westfalia SA-14 (400 - 600 l/h) abgetrennt. Der dicke Schlamm wird verworfen. Ein leicht trüber Überstand wird durch eine Reihe von Skan-Filterkartuschen (erste: Porenbreite 5 µm, zweite: Porenbreite 1 µm, dritte: Poren breite 0,22 um mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht und einer DEAE-Anionenaustauschsäule zugeführt. Die Säule wird mit Natriumacetat (20 mM, pH-Wert 4,5) gewaschen und mit Natriumacetat (20 mM, pH-Wert 3,1) eluiert. Die Lösung (15 l) wird mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht und auf ein Endvolumen von 1,8 l in einem Umlaufverdampfer gebracht. Ein Aliquot von 1 l wird einer Sephadex G25-Säule zugeführt (Bettvolumen: 8 l; die Säule wird mit Wasser äquilibriert). Fraktionen, die Desulfatohirudin enthalten, werden durch HPLC identifiziert. Die Desulfatohirudinfraktion (2,5 l) wird mit einem Rotavap im Hochvakuum auf ein Endvolumen von 200 ml konzentriert und lyophilisiert.
  • Ein Aliquot (2 g) des Rohmaterials wird in 50 ml Wasser aufgelöst, mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht und einer Q Sepharose-Schnellflußsäule zugeführt (Bettvolumen: 200 ml). Die Säule wird mit Ammoniumformiat (100 mM, pH-Wert 3,9) gewaschen. 25 ml-Fraktionen werden entnommen und durch HPLC auf Desulfatohirudin geprüft. Fraktionen, die Desulfatohirudin (1-65) enthalten, werden zusammengefaßt (125 ml) und mit einem Rotavap im Hochvakuum auf ein Endvolumen von 10 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird einer Sephadex G25-Säule (Amicon, die Säule wird mit Wasser äquilibriert) zum Entsalzen zugeführt. Die gewonnene klare Lösung (25 ml) wird lyophilisiert. Der resultierende Feststoff besteht aus reinem Desulfatohirudin.
    • Beispiel 32: Konstruktion von Plasmid pJDB207/PHO5-EGL:
  • Die Nucleotidsequenz, codierend für Eglin C, ein Polypeptid von 70 Aminosäuren vom Blutegel, wurde in vitro synthetisiert, subkloniert und in E. coli exprimiert, wie das in der europäischen Patentanmeldung Nr. 146 785 beschrieben wird. Die exakt im Rahmen erfolgende Verschmelzung der Eglin codierenden Sequenz mit der für das PHO5-Signalpeptid codierenden Sequenz wird vollständig analog zur Beschreibung von Hirudin in den Beispielen 15 und 16 erreicht. Ein einzelner Klon mit der korrekten Orientierung des Inserts im Vektor wird als pJDB207/PHO5-EGL bezeichnet. Der Stamm Saccharomyces cerevisiae GRF18 wird wie üblich transformiert. Transformanten werden wie im Beispiel 29 ausgewählt und kultiviert. In der Kulturbrühe kann kein Eglin C festgestellt werden.

Claims (20)

1. Verfahren zur Herstellung von Desulfatohirudin, umfassend das Kultivieren von Hefe-Wirtszellen, die mit einem Hybridvektor transformiert sind, der ein oder mehrere DNA-Inserts hat, jeweils umfassend eine Hefe-Expressionskontrollsequenz, ein DNA-Segment bestehend aus einer ersten DNA-Sequenz, die für das Hefe-PHO5- oder -Invertase-Signalpeptid codiert, stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, welches DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollsequenz steht, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält, unter geeigneten Nährbedingungen und Isolierung von Desulfatohirudin aus dem Kulturmedium.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Expressionskontrollsequenz ein Hybridpromotor ist, umfassend Upstream-Aktivierungssequenzen von einem Hefegen und Downstream-Promotorelemente einschließlich einer funktionellen TATA-Box von einem anderen Hefegen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung der Des-(Leu&sup6;&sup4;, Gln&sup6;&sup5;)-Desulfatohirudin-Variante HV1 mit der Formel
4. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung der Des-(Gln&sup6;&sup5;)-Desulfatohirudin-Variante HV1 mit der Formel
5. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung der Desulfatohirudin-Variante HV1 mit der Formel
6. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung der Desulfatohirudin-Variante HV2 mit der Formel
7. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung der Desulfatohirudin-Variante PA mit der Formel
8. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von Des-(Val)&sub2;-Desulfatohirudin.
9. DNA-Konstrukt, enthaltend eine Hefe-Expressionskontrollsequenz, ein DNA-Segment bestehend aus einer ersten DNA-Sequenz, die für das Hefe-PHO5- oder -Invertase-Signalpeptid codiert, stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, welches DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der besagten Expressionskontrollsequenz steht, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält.
10. Konstrukt nach Anspruch 9, enthaltend den PHO5-Promotor, ein DNA-Segment bestehend aus der PHO5-Signalsequenz stromautwärts von und im Leserahmen mit einer DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, welches DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle des PHO5-Promotors steht, und die 3'-flankierende Sequenz des PHO5-Gens.
11. Konstrukt nach Anspruch 9, enthaltend den GAPDH-Promotor, ein DNA-Segment bestehend aus der PHO5-Signalsequenz stromautwärts von und im Leserahmen mit einer DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, welches DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle des GAPDH-Promotors steht, und die 3'-flankierende Sequenz des PHO5-Gens.
12. Konstrukt nach Anspruch 9, enthaltend einen Hybridpromotor umfassend Upstream-Aktivierungsstelle(n) des Hefe-PHO5-Gens und ein Downstream-Promotorelement einschließlich der TATA- Box des Hefe-GAPDH-Gens, ein DNA-Segment bestehend aus der PHO5-Signalsequenz stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, welches DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle des Hybridpromotors steht, und die 3'-flankierende Sequenz des PHO5-Gens.
13. Konstrukt nach Anspruch 9, enthaltend den PHO5-Promotor, ein DNA-Segment bestehend aus der Invertase-Signalsequenz stromautwärts von und im Leserahmen mit einer DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, welches DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle des PHO5-Promotors steht, und die 3'-flankierende Sequenz des PHO5-Gens.
14. Verfahren zur Herstellung eines DNA-Konstrukts nach Anspruch 9, umfassend das Verknüpfen einer Hefe-Expressionskontrollsequenz, eines DNA-Segments bestehend aus einer ersten DNA-Sequenz, die für das Hefe-PHO5- oder -Invertase-Signalpeptid codiert, stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz. die für Desulfatohirudin codiert, und einer DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält, in der vorbestimmten Reihenfolge.
15. Hybridvektor, der ein oder mehrere DNA-Inserts hat, jeweils umfassend eine Hefe-Expressionskontrollsequenz, ein DNA-Segment bestehend aus einer ersten DNA-Sequenz, die für das Hefe-PHO5- oder -Invertase-Signalpeptid codiert, stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, welches DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollsequenz steht, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält.
16. Hybridvektor nach Anspruch 15, der ein DNA-Konstrukt nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 13 enthält.
17. Verfahren zur Herstellung eines Hybridvektors nach Anspruch 15, umfassend das Einführen eines oder mehrerer DNA-Konstrukte, jeweils enthaltend eine Hefe-Expressionskontrollsequenz, ein DNA-Segment bestehend aus einer ersten DNA-Sequenz, die für das Hefe-PHO5- oder -Invertase-Signalpeptid codiert, stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, welches DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der besagten Expressionskontrollsequenz steht, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält, als solche oder Einführen der Komponenten der besagten DNA-Konstrukte nacheinander in der vorbestimmten Reihenfolge in eine Vektor-DNA.
18. Hefe-Wirtszelle, die transformiert ist mit einem Hybridvektor, der ein oder mehrere DNA-Inserts hat, jeweils umfassend eine Hefe-Expressionskontrollsequenz, ein DNA-Segment bestehend aus einer ersten DNA-Sequenz, die für das Hefe-PHO5- oder -Invertase-Signalpeptid codiert, stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, welches DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollsequenz steht, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält.
19. Hefe-Wirtszelle nach Anspruch 18, die transformiert ist mit einem Hybridvektor nach irgendeinem der Ansprüche 15 und 16.
20. Verfahren zur Herstellung transformierter Hefe-wirtszellen nach Anspruch 18, umfassend das Transformieren von Hefe-Wirtszellen mit einem Hybridvektor, der ein oder mehrere DNA-Inserts hat, jeweils umfassend eine Hefe-Expressionskontrollsequenz, ein DNA-Segment bestehend aus einer ersten DNA-Sequenz, die für das Hefe-PHO5- oder -Invertase-Signalpeptid codiert, stromaufwärts von und im Leserahmen mit einer zweiten DNA-Sequenz, die für reifes Desulfatohirudin codiert, welches DNA-Segment unter der Transcriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollsequenz steht, und eine DNA-Sequenz, die Hefe-Transcriptionsterminationssignale enthält.
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE64956T1 (de) * 1984-06-14 1991-07-15 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren.
MC1834A1 (fr) * 1986-07-10 1988-06-03 Transgene Sa Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation
GB8620926D0 (en) * 1986-08-29 1986-10-08 Delta Biotechnology Ltd Yeast promoter
US6005071A (en) * 1987-01-23 1999-12-21 Merrell Pharmaceuticals Inc. Anticoagulant peptides
CA1341032C (en) * 1987-01-23 2000-06-20 John L. Krstenansky Anticoagulant peptides
US5789540A (en) * 1987-01-23 1998-08-04 Merrell Pharmaceuticals Inc. Anticoagulant peptides
US5256559A (en) * 1988-03-04 1993-10-26 Biogen, Inc. Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation
GB8809860D0 (en) * 1988-04-26 1988-06-02 Ciba Geigy Ag Process for production of polypeptides
GB8907110D0 (en) * 1988-05-04 1989-05-10 Ciba Geigy Ag Improvements in the production of polypeptides
US5268296A (en) * 1988-06-11 1993-12-07 Ciba-Geigy Corporation DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18
US5112615A (en) * 1988-08-03 1992-05-12 New England Deaconess Hospital Corporation Soluble hirudin conjugates
US5167960A (en) * 1988-08-03 1992-12-01 New England Deaconess Hospital Corporation Hirudin-coated biocompatible substance
GB8826428D0 (en) * 1988-11-11 1988-12-14 Biopharm Ltd Antithrombin
FR2646437B1 (fr) * 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
US5179196A (en) * 1989-05-04 1993-01-12 Sri International Purification of proteins employing ctap-iii fusions
DE4009268A1 (de) * 1990-03-22 1991-09-26 Consortium Elektrochem Ind Sekretion von hirudinderivaten
US6514730B1 (en) 1991-03-21 2003-02-04 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Secretion of hirudin derivatives
EP1031628A1 (de) * 1992-09-04 2000-08-30 Novartis AG Verfahren zur Herstellung von Proteaseinhibitoren
US5981227A (en) 1995-02-09 1999-11-09 Movartis Ag Process for the production of proteins
US6468098B1 (en) 1999-08-17 2002-10-22 Formfactor, Inc. Electrical contactor especially wafer level contactor using fluid pressure
US7795205B2 (en) 2004-04-12 2010-09-14 Canyon Pharmaceuticals, Inc. Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor
JP7284955B2 (ja) * 2020-07-20 2023-06-01 フォーデイズ株式会社 神経幹細胞の増殖促進剤及びそれを用いた神経幹細胞の増殖促進方法
WO2025262265A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 Etablissement Francais Du Sang Chimeric molecules comprising an anti-fibrin antibody and an antithrombotic molecule

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1984004330A1 (en) * 1983-04-22 1984-11-08 Amgen Secretion of exogenous polypeptides from yeast
DE3486452T2 (de) * 1983-10-03 1997-11-06 Chiron Corp., Emeryville, Calif. Superoxiddismutase und deren Expression in Mikroorganismen
DE3479520D1 (en) * 1983-11-21 1989-09-28 Ciba Geigy Ag Synthesis of tissue plasminogen activator(tpa) by yeast
DE3342139A1 (de) * 1983-11-22 1985-05-30 Ciba-Geigy Ag, Basel Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel
WO1985004418A1 (fr) * 1984-03-27 1985-10-10 Transgene S.A. Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine
ATE64956T1 (de) * 1984-06-14 1991-07-15 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren.
FR2568891B1 (fr) * 1984-08-09 1988-05-27 Transgene Sa Procede de preparation d'une souche, notamment de levure, transformee par un vecteur d'expression, qui peut etre cultivee sur un milieu complet sans pression de selection et souche ainsi obtenue
DE3429430A1 (de) * 1984-08-10 1986-02-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
FR2593518B1 (fr) * 1985-05-02 1989-09-08 Transgene Sa Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees
GB8521496D0 (en) * 1985-08-29 1985-10-02 Ciba Geigy Ag Repressible yeast promoters
MC1834A1 (fr) * 1986-07-10 1988-06-03 Transgene Sa Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation

Also Published As

Publication number Publication date
JPH0787791B2 (ja) 1995-09-27
PT83898A (en) 1987-01-01
IE863244L (en) 1987-06-12
JPH0650990B2 (ja) 1994-07-06
IE57859B1 (en) 1993-04-21
PH31277A (en) 1998-07-06
DK595286D0 (da) 1986-12-11
CA1341496C (en) 2006-02-14
FI94773C (fi) 1995-10-25
AU6650486A (en) 1987-06-18
NO178035B (no) 1995-10-02
DE3686399D1 (de) 1992-09-17
IL80932A (en) 1998-02-22
FI865003A0 (fi) 1986-12-08
AU615413B2 (en) 1991-10-03
EP0225633A3 (en) 1988-11-30
EP0225633B1 (de) 1992-08-12
ATE79403T1 (de) 1992-08-15
JPS62208296A (ja) 1987-09-12
DK595286A (da) 1987-06-13
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ES2051688T3 (es) 1994-07-01
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FI94773B (fi) 1995-07-14
IL80932A0 (en) 1987-03-31
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MY101203A (en) 1991-08-17
EP0225633A2 (de) 1987-06-16
DK175492B1 (da) 2004-11-08
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GR3006248T3 (de) 1993-06-21
HUT42523A (en) 1987-07-28
NO865007D0 (no) 1986-12-11
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NO865007L (no) 1987-06-15

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