DD209652A5

DD209652A5 - Verfahren zur herstellung eines replikablen vektors

Info

Publication number: DD209652A5
Application number: DD81249414A
Authority: DD
Inventors: Roberto Crea; Goeddel David Van Norman
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1980-09-25
Filing date: 1981-09-25
Publication date: 1984-05-16
Also published as: DD202085A5; CA1341569C; FR2490675B1; GB2098996A; NO813248L; EP0048970A2; ATA410381A; IL63916A0; HK43686A; DD209477A5; ES515032A0; AT380694B; ZW23981A1; AU582110B2; ES8306325A1; ES515033A0; BR8106137A; NL8104400A; CH651309A5; OA06908A

Abstract

DIE ERFINDUNG BETRIFFT EIN VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES REPLIKABLEN VEKTORS, DER IN EINEM MIKROORGANISMUS DIE EXPRESSION EINES POLYPEPTIDS MIT D. AMINOSAEURESEQUENZ EINES REIFEN HUMAN-FIBROBLASTEN-INTERFERONS BEWIRKT. ZIEL DER ERFINDUNG IST ES, DEN HERSTELLUNGSWEG VON INTERFERON ZU VEREINFACHEN U. WESENTLICH GROESSERE MENGEN DAVON BEREITZUSTELLEN. ERFINDUNGSAUFGABE IST DIE ENTWICKLUNG EINES VERFAHRENS ZUR HERSTELLUNG EINES REPLIKABLEN VEKTORS ALS TEILASPEKT DER REKOMBINANTEN DNS-TECHNOLOGIE BEI DER FIBROBLASTEN-INTERFERON-PRODUKTION. ERFINDUNGSGEMAESS VERBINDET MAN EINE, EIN POLYPEPTID CODIERENDES ERSTE DNS-SEQUENZ OPERABEL MIT EINER ZWEITEN DNS-SEQUENZ, DIE DIE FUER D. EXPRESSION NOTWEMDIGEN CODONS ENTHAELT. BEI DEM POLYPEPTID HANDELT ES SICH UM EIN SOLCHES MIT D. AMINOSAEURESEQUENZ EINES REIFEN HUMAN-FIBROBLASTEN-INTERFERONS OHNE PRAESEQUENZ O. TEIL EINER SOLCHEN.

Description

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Ausscheidung II aus AP G 12 .K/233 598 59 858/12/

Verfahren zur Herstellung eines replikablen Vektors Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNS-Technologie, d. h. Verfahren, die auf diesem Gebiet eingesetzt werden»

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Herstellungsverfahren eines replikablen Vektors, der in einem Mikroorganismus die Expression eines Polypeptide mit der Aminosäuresequenz eines reifen Human-Pibroblasten-Interferons bewirkt.

Hintergrund der

Human-Pibroblasten-Interferon (PIP) ist ein Protein, das antivirale sowie/ein weites Spektrum anderer biologischer Aktivitäten aufweist (Übersicht siehe W. ü, Stewart II, The Interferon System, Springer-Verlag, New York-Wien, 1979)· Angeblich ist es bis zur Homogenität gereinigt worden«. Es handelt sich um ein einzelnes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 19000 bis 20000, mit einer spezifischen Aktivität von 2 bis 10 χ 10⁸ Einheiten/mg (E₉ Knight, Proc₉ Katl. Acad. Sei. USA X2, 520 - 523 /19767; W. Berthold et al., J. Biol, Ohem, 2^, 5206 - 5212 /^9787). Die Sequenz der 13 NH₂-terminalen Aminosäuren des PIP wurde als Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly~Phe~Leü-Gln-Arg-Ser-Ser bestimmt (Ji₈ Knight et al., Science £0£,525 - 526 /T9807). Houghton et al. (Nucleic Acids Res. 8, 1913 - 1931 £^^Q^7) haben synthetische

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Deoxyoligonucleoti.de (vorausgesagt aus der vorstehend angegebenen Aminosäuresequenz) verwendet, um die Sequenz der 276 5^f-terminalen Nucleotide von PIi¹HIiRIfS zu bestimmen. Taniguchi et al. (Nature 28J>, 547 - 549 /Ϊ98θ7; Gene JO, 11 - 15 β9807) und Derynck et al. (Nature 28J>, 542-547 Ζ~98θ7) waren kürzlich in der Lage, die Nucleotidsequenz klonierter cDNS-Kopien von FIF-mRNS in l·)» coli zu bestimmen und haben daraus die vollständige Aminosäuresequenz von Human-PIF einschließlich einer 21 Aminosäure umfassende Signalsequenz abgeleitet. Das reife Peptid umfaßt 166 Aminosäuren. Schließlich haben Taniguchi et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA Jl, 5230 - 5233 /i9807) ein Plasmid konstruiert, welches die Expression des Human-FIF-Gens in i). coli veranlaßt, so daß reifes JPIF erhalten wird.

Durch rekombinante DNS-Technologie iat es inzwischen gelungen, eine große Anzahl wertvoller Polypeptide kontrolliert mikrobiell herzustellen. So existieren inzwischen bereits Bakterien, die durch diese Technologie so midifiziert wurden, daß sie die Herstellung von Polypeptiden wie Somatostatin, die A- und B-Ketten des Human-Insulins und Human-Wachstumshormon gestatten (Itakura et al», Science 198 1056 - 1063 ZT97J7); Goeddel et al., Nature 28_1,544 - 548 /19727)♦ Kürzlich gelang durch die Anwendung der rekombinanten DNS-Technik die bakterielle Herstellung von Proinsulin, Thymosin ©£,.. und Leukozyten-Interferon.

Das Zugpferd der rekombinanten DNS-Technologie ist das Plasmid, eine nicht-chromosomale Schleife doppelsträngiger DNS, die in Bakterien und anderen Mikroben oft in vielen Kopien pro Zelle vorliegt. Die in der Plasmid-DNS enthaltene Information umfaßt diejenige zur Reproduktion des Plasmids in

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Tochterzellen (d. h. ein "Replicon") und gewöhnlich ein oder mehrere Selektions-Gharakteristika wie - im Fall von Bakterien - die Resistenz gegenüber Antibiotika, die es erlauben, Klone der Wirts-Zelle, die das interessierende Plasmid enthalten, zu erkennen und in einem ausgewählten Medium selektiv zu züchten. Die Nützlichkeit der Plasmide liegt in der Tatsache, daß sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktions-Endonuclease (auch Restriktionsenzym genannt) gespalten werden können, wobei jede Endonuclease eine andere Stelle der Plasmid-DNS erkennt. Heterologe Gene oder Genfragmente können in das Plasmid an den Spaltstellen oder anschließend an die Spaltstellen rekonstruierte Anden eingefügt werden. Die DNS-Rekombination wird ausßerhalt der Zelle durchgeführt, aber das erhaltene rekombinante Plasmid wird durch einen Vorgang, der als Transformation bekannt ist, in die Zelle eingeführt, und große Mengen an hefcerologe Gene enthaltenden, rekombini.euten Plasmiden können durch Kultivierung der transformierten Zellen erhalten werden. Ist das heterologe Gen in richtiger Weise (d. h. operabel) bezüglich derjenigen Teile des Plasmids eingefügt, die für die Transcription und Translation der kodierten DNS-Nachricht verantwortlich sind, dann kann das erhaltene rekombinierte Plasmid (Expressionsvektor, Vektur) zur Herstellung des Polypeptids verwendet werden, das durch das heterologe Gen kodiert wird. Dieser Prozeß wird als Expression bezeichnet.

Die Expression wird ausgelöst in der Promotor-Region, die durch RßS-Polymerase erkannt und gebunden wird. In einigen Fällen, wie z. B. beim Tryptophan- oder "Trp"-Promotor, der in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, >werden Promotor-Regionen von sogenannten Operator-Regionen überlappt und bilden dann einen kombinierten Promotor-Opera-

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tor» Operatoren sind DNS-Sequenzen, die von sogenannten Repressor-Proteinen erkannt v/erden, die wiederum die Frequenz des Transkriptionsbeginns an einem speziellen Promotor regulieren« Die Polymerase wandert an der DNS entlang und überschreibt die Information, die der kodierende Strang enthält, vom 5'~ sum 3^f-üinde in mRHS, die dann wiederum in das Polypeptid mit der duroh die DNS-kodierten Aminosäuresequenz übersetzt wird. Jede Aminosäure eines Polypeptids wird innerhalb des sogenannten Strukturgens durch ein Nukleotid-Triplett oder Codon kodiert· Nach der Bindung an den Promote transkribiert die RMS-Polyinerase zunächst Wukleotide, die eine Ribosomen-Bindungsstelle kodieren, dann ein Translations-Startsignal (gewöhnlich ATG, das in der mRUS zu AUG wird) und schließlich die Nukleotid-Sequenzen des Strukturgens selbst, Am iinde des Strukturgens werden sogenannte Stopcodons transkribiert, nach denen die Polymerase noch weitere mRKS-Sequenzen bilden kann, die aber wegen des vorhandenen Stopsignals von den Ribosomen nicht mehr übersetzt werden. Die Ribosomen lagern sich an die vorgesehene Bindungsstelle der mRNS an, in Bakterien gewöhnlich während diese entsteht, und stellen dann ihrerseits das kodierte Polypeptid her, beginnend am Translations-Startsignal und endend mit dem bereits erwähnten Stopsignal· Das gewünschte Produkt wird hergestellt, wenn die Sequenzen, die die Ribosomen-Bindungsstelle kodieren, richtig in bezug auf das AUG-Startsignal und wenn alle übrigen Kodons mit dem Startsignal in Phase sind· Das gewünschte Polypeptid kann erhalten werden durch Lyse der Wirts-Zelle, Abtrennung von anderen Bakterienproteinen und Reinigung in üblicher Weise.

Während das aus Spender-Fibroblasten isolierte homogene Pibroblasten-Interferon ausreichte zur partiellen Charakte-

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riaierung und für limitierte klinische Studien, reicht diese Quelle bei weitem nicht aus für die Gewinnung derjenigen Mengen an Interferon, die für bereits klinische Prüfungen und die anschließende prophylaktische und/oder therapeutische Verwendung notwendig sein werden. Tatsächlich bediente man sich bei den bisherigen klinischen Untersuchungen zur Evaluation des Human-Fibroblasten-Interferons in Antitumor- und antiviralen Testen hauptsächlich rohen Materials (^einheit ^1 %) _t und die langen Zeiten, die nötig sind, um genügende Mengen reinen Materials zu erhalten, haben zu einer starken Verzögerung von Untersuchungen in größerem Maßstab geführt.

Ziel der Erfindung

iüs ist Ziel der Erfindung, den Herstellungsweg zu vereinfachen und wesentlich größere Mengen bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der .b'

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines replikablen Vektors zu entwickein, der in einem Mikroorganismus die Expression eines Polypeptide mit der Aminosäuresequenz eines reifen Human-Fibroblasten-Interferons bewirkt.

Reinstes Fibroblasten-Interferoca könnte trotz der Tatsache, daß es nicht glykosyliert ist, wie vielleicht das natürliche, zur klinischen Behandlung vieler viraler und neoplastischer Erkrankungen verwendet werden,,

üin ^ibroblasten-Interferon-Gen wurde durch die folgenden Maßnahmen erhalten:

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1) Aminosäurepartialsequenzen von homogenem Human-Pibroblasten-Interferon wurden verwendet, um synthetische DÜS-Sonden zu konstruieren, deren Codons insgesamt alle möglichen Nucleotidkombinationen repräsentierten, durch die die Aminosäurepartialaequenzen kodiert werden,

2) l's wurden Bänke von Bakterienkolonien hergestellt, die komplementäre DNS (cDNS) aus induzierter mRNS enthielten. Die gemäß (1) erhaltenen Sonden wurden als Starter für die Synthese radiomarkierter einsträngiger cDNS verwendet, die wiederum als Hybridisierungssonden benutzt wurden« Die synthetischen Sonden hybridisierten mit induzierter mRJNS als Matrize und wurden ferner mittels reverser Transkription dazu verwendet, induzierte, radiomarkierte cDNS zu bilden· In dieser Weise erhaltene Klone der Koloniebank, die mit radiomarkierter cDHS hybridisierten, wurden weiterhin untersucht auf das Vorliegen eines Interferon vollständig kodierenden Gens. Jedes so erhaltene, möglicherweise eine QJeilsequenz des Interferons kodierende Genfragment wurde als Sonde für ein vollständiges Gen verwendet.

3) Das so erhaltene ungekürzte Gen wurde maßgeschneidert unter Verwendung synthetischer DKS, um jegliche Leader-Sequenz, die die mikrobielle Expression des reifen PoIypeptids verhindern könnte, auszuschließen und um es in einem Vektor in die richtige Position bringen zu können bezüglich der Startsignale und der Ribosomenbindungsstelle eines mikrobiellen Proraotors, Das exprimierte Interferon wurde so weit gereinigt, daß es charakterisiert und seine Aktivität bestimmt werden konnte.

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Unter Anwendung der vorstehend kurz beschriebenen Methoden der rekombinanten DNS-Technologie konnte eine Reihe replizierbarer Plasmid-Vektoren hergestellt werden, die die Synthese eines reifen Polypeptids mit den .Eigenschaften von authentischem Human-Fibroblasten-Interfieron in einem transformierten Mikroorganismus mit hohen Ausbeuten veranlassen. Das erhaltene Polypeptid weist die Aminosäuresequenz des ΪΊΡ auf und ist in in-vitro-Testen aktiv ungeachtet fehlender Glykosylierung, wie sie für Material, das aus natürlichen menschlichen Zellen gewonnen wurde, charakteristisch ist. Der Ausdruck "Expression von reifem Fibroblasten-Interferon" bezeichnet die mikrobielle (z· B, bakterielle) Herstellung eines Interferonmoleküls, das "weder Glykosylgruppen noch eine Präsequenz enthält, die unmittelbar die mRNS-Translation des Human-Fibroblasten-Interferon-Genoms veranlassen. Reifes Pibroblasten-Interferon wird erfindungsgemäß unmittelbar von einem Translations-Startsignal (ATG) exprimiert, das gleichzeitig die erste Aminosäure dea natürlichen Produkts kodiert. Die An- ader Abwesenheit von Methionin als erster Aminosäure im mikrobiell hergestellten Produkt ist kinetisch bedingt und hängt ab von den Fermentationsbedingungen und/oder der Höhe der impression in dem transformierten Mikroorganismus, Reifes Fibroblasten-Interferon kann zusammen mit einem konjugierten Protein, da^nicht ein üblicher leader ist, exprimiert werden, wobei das Konjugat spezifisch intra- oder extrazellulär gespalten werden kann (vergleiche britische Patentanmeldung Kr. 2OO7676A). Schließlich kann das reife Interferon zusammen mit einem mikrobiellen "Signal-Peptid" hergestellt werden, das das Konjugat an die Zellwand transportiert , wo die Signalsequenz abgespalten und das reife Polypeptid sezerniert wird.

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Die zum Inhalt dieser Beschreibung gehörenden Figuren 1 bis 5 werden an den geeigneten Textstellen genauer beschrieben. J¹Ig₀ 6 stellt schematisch die Herstellung der Plasmide dar, die die direkte Expression von reifem Fibroblasten-Interferon kodieren. Die Restriktionastellen und -fragmente sind angegeben ("Pst I", usw.). "Ap^R" und "Tc^R" bezeichnen diejenigen Orte des Plasmids, die für die Expression der Ampicillin- bzw«, Tetracyclin-Resistenz verantwortlich sind. Die Abkürzung "ρ ο " steht für "Promotor-Operator".

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Α« Die verwendeten Mikroorganismen

Der in der vorliegenden Arbeit verwendete Mikroorganismus ist 'ts. coli K-12 Stamm 294 (end A, thi", hsr", hsm£), wie in der britischen Patentpublikation Nr. 255332 A beschrieben. Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC Er. 31446) hinterlegt. Die gesamte Arbeit wurde unter Beachtung der Richtlinien des National Institutes of Health durchgeführt.

Die vorliegende Erfindung, obgleich in ihrer am meisten bevorzugten Ausführungsform an E, coli K-12 Stamm 294 beschrieben, umfaßt auch die Verwendung anderer E. coli-Stämme wie E₄, coli B, E. coli χ 1776 und E₀ coli W 3110 sowie andere Mikroorganismen, von denen viele bei einem offiziellen Depositorium (z_e B₀ der American Type Culture Collection, ATCG) hinterlegt wurden und von dort (möglicherweise) erhältlich sind (vergleiche auch deutsche Offenlegungsschrift Nr.' 2644432). Weitere Mikroorganismen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind z, B_e Bacilli, wie Bacillus sub· tilis und andere Enterobacteriaceae, unter denen vor allem

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Salmonella typhimurium und Serratia marcescens zu nennen wären, die mit Hilfe von sich vermehrenden Plasmiden heterologe Gene zur uxpreasion bringen können. Auch in Hefen, beispielsweise in Saccharomyces cerevisiae, können Interferongene zur Expression gebracht werden unter der Kontrolle eines Hefe-Promotors.

B. Allgemeine Methoden

Die Restriktionsenzyme wurden bei Hew England Biolabs gekauft und vorschriftsmäßig verwendet. Die Plasmid-DHS wurde nach einem Standard-Verfahren (D. B. Clewell, J. Bacteriol. JJO, 667 - 676 /1972:7) hergestellt und durch Säulenchromatographie an Biogel A-50 M gereinigt. Die DiSlS-Sequenzierung erfolgte nach der Methode von Maxam und Gilbert (Methods iinzymol. 65_, 499 - 560 /198C[7). Die durch Restriktion erhaltenen DHS-Pragmente wurden durch ülektroelution aus Polyacrylamidgelen erhalten. Die Radiomarkierung der DHS-Pragmente zwecks Verwendung als Hybridisierungssonden erfolgte nach der Methode von Taylor et al. (Biochim· Biophys. Acta i£2, 324 - 330 /T97£7). Die in-situ-Koloniehybridisierung wurde nach nach der Methode von Grunstein und Hogness durchgeführt (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 3961 - 3965/197^7).

C. Sy_nthese der Deoxyoligonucleotide

^eoxyoligonucleotide wurden synthetisiert nach der modifizierten Phosphotriester-Methode in Lösung (Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA ^, 5765 - 5769 /Ϊ9787) unter Verwendung von 'JCrideoxynucleotiden als Bausteinen (Hirose et al., Tetrahedron Letters 28, 2449 - 2452 /T9787). Die

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Materialien und allgemeinen Verfahren ähnelten den von Crea et al. beschriebenen (Nucleic Acids Res. 8, 2331 2348 /T9807). Die 6 Starter-Pools (Fig. 1), die jeweils 4 Dodecanucleotide enthielten, wurden durch separate Kopplung von 2 Hexamer-Pools (mit jeweils 2 unterschiedlichen 5'-terminalen Sequenzen) mit 3 verschiedenen Hexamer-Pools (mit jeweils 2 unterschiedlichen 3'-terminalen Sequenzen) erhalten.

D» Induktion der Fibroblasten

Human-Pibroblasten (Zellinie GM-25O4A) wurden gezüchtet, wie bereits von Pestka et al. beschrieben (Proc, Natl. Acad. Sei. USA J2, 3898 - 3901 /Ϊ97£7). D_as Nährmedium (Eagle's Minimalmedium mit einem Gehalt von 10 % fötalem Kälberserum) wurde aus den Rollflaschen (850 omr) entfernt und ersetzt durch 50 ml Nährmedium, enthaltend 50/Ug/ml PoIy(I) V PoIy(C) und 10/Ug/ml Cycloheximid. Dieses Induktionsmedium wurde nach 4 Stunden bei 37 ⁰C entfernt und die Zell-Monoschichten wurden mit Phospaht-gepufferter Salzlösung gewaschen (PBS; 0,14M NaCl, 3mM KCl, 1,5 mM KH₂PO., 8mM Na₂HPO₄). Jede Flasche wurde bei 37 ⁰C mit 10 ml einer Trypsin-^DÜÄ-Lösung (Gibco 610 - 5305)' inkubiert, bis die Zellen sich ablösten. Dann wurde fötales Kälberserum bis zu einer Konzentration von 10 % zugesetzt. Das Zellmaterial wurde 15 Minuten bei 500 χ g zentrifugiert, der Rückstand nochmals in PBS suspendiert und sedimentiert. Die Zellen wurden in flüssigem Stickstoff gefroren. Pro Rollflasche wurden etwa 0,17 g Zellmaterial erhalten.

E₀ Herstellung und Aasay von Interferon-mRNS Poly(A)-enthaltende mRNS wurde nach der von Green et "al.

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(Arch. Biochem. Biophys. JJ2, 74 - 89 /T97l7) beschriebenen Methode aus Humanfibroblasten durch Phenolextraktion und 01igo(dT)-Zelluloae-Chromatographie erhalten. Die PoIy(A)-enthaltende RWS wurde bezüglich Interferon-mRüS durch Zentrifugieren in einem linearen Saccharose-Gradienten (5 - 20 %, w/v) angereichert· Die RHS-Proben wurden während 2 Minuten auf 80 ⁰C erhitzt, schnell abgekühlt, über die Gradienten gegeben und 20 Stunden bei 30000 U/min, bei 4 ⁰C in einem Beckman SVV-40 Rotor zentrifugiert· Die Fraktionen wurden gesammelt, mit ethanol gefällt und in V/asser gelöst·

liin-Mikrogramm-Proben von mRNS wurden, wie von Cavalieri et al· beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sei. USA JJ., 3287 3291 /T97J7), Xenopüs laevis-Oocyten injiziert. Die Oocyten wurden 24 Stunden bei 21 ⁰C inkubiert, homogenisiert und 5 Minuten mit 10000 χ g zentrifugiert. Im Überstand wurde das Interferon nach dem CPE-Hemmtest (Stewart, The Interferon System, Springer-Verlag, New-York-Wien, 1979) bestimmt unter Verwendung von Sindbis-Virus und humanen diploiden Zellen (WISH). Pur die 12 S-Praktion der mRNS wurden Interferonititer von lOOObis 6000 üinheiten/mg injizierter RIiS festgestellt (HIH Referenzstandard),

^* Synthese und Clonierung von cDMS

.ciinsträngige cDIüS wurde hergestellt in 100-ml-Reaktionen, aus 5/ug der 12 S mRüS-Praktion, 20 mM Tris-HCl (pH 8,3), 20 mM KCl, 8 mM MgCl₂, 30 mM ß-Mercaptoethanol, 100/uCi ((X ³²P)dCTP und 1 mM dATP, dCTP, dGTP und dlTP, Der Starter war das synthetische HindIII-Decamer dCCAAGCTTGG (Scheller et al., Science 196, 177 - 180 /T9727), das auf der 3¹-terminalen Seite um etwa 20 bis 30 Deoxythymidinreste unter

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Verwendung der terminalen Deoxynucleotidyl-iransferase (Chang et al., Mature 2JSi 617 - 624 /Ϊ9787) verlängert worden war, 100 Einheiten reverser Transkriptase wurden zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang bei 42 ⁰C inkubiert. Die Synthese des zweiten Stranges der MS wurde wie von Goeddel et al· bereits beschrieben (Nature 28J,, 544 - 548 /?97J_7) aufgeführt· Die doppelsträngige 'cDNS wurde mit 1200 Einheiten S1-Huklease während 2 Stunden bei 37 ⁰C in 25 ibM Natriumacetat (pH 4,5), 1mM ZnCl₂ und 0,3 m KaCl behandelt, Nach Phenolextraktion wurde das Gemisch elektrophoretisch an einem 8%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt. Durch ülektroelution wurden etwa 0,5/Ug cDiüS von 550 - 1500 Basenpaaren (bp) erhalten, üin aliquoter ^r2eil (20 ng) wurde mit Deoxy(C)-Resten verlängert unter Verwendung terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase (Chang et al., supra) und mit 100 ng des Plasmids pBR 322, welche mit Deoxyguanosinresten an der Pstl-Spaltstelle (Chang et al., supra) verlängert worden war, verbunden. Das 'Gemisch wurde zur Transformation von JtS, coli K-12 Stamm 294 nach einem publizierten Verfahren (Hershfield et al., Proc. Batl. Acad. Sei. USA 11» 3455 -'3459 /Ϊ974.7) verwendet

op

G, Herstellung von induzierten und nicht induzierten -""P-oDflS-Sonden .

5/Ug 12 S-mRNS wurden mit entweder 2/Ug 01igo(dT)13-18 oder .je 5/Ug der synthetischen Starter-Pools (Fig· 1) in 60^uI 10 mM Tris-HCl (pH 8) und 1 mM iiDTH kombiniert. Die Gemische wurden 3 Minuten gekocht, auf. JtSis gegeben und mit 6OyUl 40 mM Tri's-HCl (pH 8,3), 40 mM KCl, 16 mM MgCl₃, 50 mM ß-Mercaptoethanol, 1 mM dATP, dGTP, dTTP und 5 x 10"⁷M (<X^³²P)dCTP (2000 - 3000 Ci/mM) bei 0 ⁰C versetzt, Nach Zusatz von 100 Einheiten reverser Transkriptase wurde 30

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Minuten lang bei 42 ⁰C inkubiert und durch Passage über eine iO-ml-Sephadex-G-50-Säule gereinigt. Die Produkte wurden mit 0,3 Ii KaOH während 30 Minuten bei 70 ⁰G behandelt, neutralisiert und mit ethanol gefällt.

Die -³²P-CDWSs wurden mit 100/Ug Poly(A)-mRNS aus nicht» induzierten Pibroblasten in 50 /Ul 0,4 M Natriumphosphat (pH .6,8) und 0,1 % Natriumdodeoylsulfat (SDS) versetzt. Die Gemische wurden 5 Minuten auf 98 ⁰C erhitzt und 15 Stunden bei 45 °0 getempert. Durch Chromatographie an Hydroxyapatit, wie von Galau et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad« Sei. USA Ji, 1020 - 1023 /Ϊ9727), wurden die MS-RHS-Hybride (enthaltend nichtinduzierte cDNS-Sequenzen) von einsträngiger DlIS (induzierten cDNS-Sequenzen) getrennte Die DUS-RNS-Hybride wurden mit Alkali zwecks Entfernung von RWS behandelt.

op

H₉ Screening rekombinanter Plaamide mit ^J_ P-cDNS-Sonden

Plasmid-DiiS-Proben von etwa 1/Ug wurden aus individuellen Transformanten nach einem bekannten Verfahren (Birnboim et al·, Nucleic Acids Res. 2, 1513 - 1523 /197^7) hergestellt. Die DiNS-Proben wurden durch Behandlung mit EcoRI linearisiert, in Alkali denaturiert und jeweils auf 3 Nitrooellulosefilter nach der üOüpfelshybridisationsmethode (Kafatos et al., Nucleic Acids Res. J, 1541 - 1552 /Τ97^7) gebracht. Die Filter wurden mit den ^ P-cDliS-Sonden während 16 Stunden bei 42 ⁰C in 50 % formamid, 10 χ Denhardt's Lösung (Biochem. Biophys, Res. Comm. 2^, 641 - 646 /T96f7)i 6 χ SSC, 40 mM Tria-HCl (pH 7,5), 2mM UDiA und 40/Ug/ml Hefe-RNS hybridiert, (SSC enthält 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumeitrat, pH 7,0.) Die Filter wurden gewaschen mit 0,1 χ SSC sowie 2 χ 30 Minuten

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lang bei 42 ⁰C mit 0,1 % SDS, getrocknet und der Autoradiographie unterworfen.

I. Konstruktion von Plasmiden für direkte impression von FIF

Die synthetischen Starter I (dATGAGCTAGAAC) und II (dCATGAGCTACAAC) wurden nach "der von Goeddel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 106 - 110 /T97J37» beschriebenen Methode phosphoryliert unter Verwendung von T4-Polynucleotid~ kinase und ( If-P)ATP bia zu einer spezifischen Aktivität von 700 Ci/mM. ^ie Starerreparatur wurde folgendermaßen durchgeführt: 250 pM der ^J P-Starter wurden vereinigt mit 8/Ug (10 pM) eines 1200 Basenpaare langen Hhal-Restriktionsfragments, das die FliF-cDNS-Sequenz enthielt. Das Gemisch wurde mit Äthanol präzipitiert, in 50/ul »Vasser resuspendiert, 3 Minuten gekocht, in Trockeneis-Äthanol gegeben und mit 50/Ul einer Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 14 mM MgCl₂, 120 mM NaCl, 0,5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP bei 0 ⁰C vermischt. Nach Zusatz von 10 Einheiten DNS-Polymerase I Klenowfragment wurde 4 1/2 Stunden bei 37 ⁰C inkubiert. Nach Extraktion mit Phenol/CHCl- und Restriktion mit Pstl wurde das gewünschte Produkt an einer 6%igen Polyacrylamidgelsäule gereinigt. Die anschließenden Verknüfungen erfolgten bei Raumtemperatur (kohäasive Enden) oder bei 4 ⁰C (stumpfe Enden) unter den von Goeddel et al., aupra, angegebenen Bedingungen.

J₈ Assay für Interferonexpression in E. coli

Bakterienextrakte für den Interferon-Assay wurden folgendermaßen hergestellt: 1 ml Kulturen wurden über Nacht in LB (Luria-Bertani) Medium, enthaltend 5/Ug/ml Tetracyclin, gezüchtet und auf 25 ml mit M9-Medium, daa durch 0,2 % Glukose^

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0,5 % Casaminosäuren und 5/Ug/ml Tetracyclin ergänzt war, verdünnt, 10-ml-Proben wurden zentrifugiert, wenn die Absorption bei 550 mn (Aj-cq) den i/ert 1_?0 i;rz>eiohte, «Pie Zellkuchen wurden schnell in Trockeneiq^th^nol gefppyen, und geklärte Lysate wurden, wie von Clewell (supra) beschrieben, hergestellt. Die Interferonaktivität in den Überständen wurde durch Vergleich mit NIH-FIF-Standard nach dem GPJi-Hemmtest bestimmt, üis wurden 2 verschiedene Tests verwendet: (a) tflSH-Zellen (humane Amnionzellen) wurden auf Mikrotiterplatten verteilt. "Nach 16 bis 20 Stunden wurden die Proben zugesetzt und seriell zweifach verdünnt. Nach einer Inkubationszeit von mindestens 3 Stunden wurde Sidbis-Virus zugesetzt. Die Platten wurden nach 20 bis 24 Stunden mit Kristallviolett angefärbt, (b) MDBK-Zellen (aus Rindernieren) wurden ausgesät unter gleichzeitiger zweifacher Verdünnung der Proben. Nach einer Inkubationszeit von 2 bis 3 Stunden wurden vesikuläre Stomatitisviren zugesetzt, und nach weiteren 16 bis 18 Stunden wurden die Platten mit Kristallviolett angefärbt. Um die Stabilität bei pH 2 zu tasten, wurden die Bakterienextrakte und Standarde in Minimalmedium auf eine Konzentration von 1000 Einheiten/ml verdünnt. Aliquote Teile von 1ml wurden mit 1 N HGl auf pH 2 gebracht, 16 Stunden bei 4 °G inkubiert und durch Zusatz von NaOH neutralisiert. Die Interferonaktivität wurde nach dem CPJcl-Hemmtest unter Verwendung menschlicher Amnionzellen bestimmt. Um antigenische Identität herzustellen, wurden aliquote Teile (25/Ul) der 1000 iSinheiten/ml enthaltenden Interferon-Proben (unbehandelt) 60 Minuten lang bei 37 ⁰C mit 25 ul Kaninchen-Anti-Human-Leukozyten-Interferon inkubiert, 5 Minuten mit 12000 χ g zentrifugiert, und der Überstand wurde getestet. FIF- und LIF-Standarde wurden vom NIH erhalten. Kaninchen-Anti-Human-Leukozyten-Interferon wurde vom

24 94 14 1 -¹⁶- 12.9.1983

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National Institut of Allergy and Infectious Diseases erhalten,

K. Synthese von Starterpools, die komplementär sind zu FIF-mRMS '

Von der bekannten aminoterminalen .Aminosäuresequenz des Human-Fibroblästen-Interferons wurden die 24 möglichen mrütfS-Sequenzen, die für die Kodierung der ersten 4 Aminosäuren in Frage kommen, abgeleitet. Die theoretisch möglichen 24 komplementären Deoxyoligonucleotide wurden in 6 Poola zu je 4" Dodecameren synthetisiert (Fig· 1). Die Synthese erfolgte nach der modifizierten Phosphotriester-Methode in Lösung und an Festphasen (Crea et al·, supra)· Die grundlegende Strategie beruhte auf der Umsetzung zweier 3¹-geschützter Trimerer mit einem Überschuß eines einzelnen 5'-geschützten '-Crimeren zu einem Pool von 2 Hexameren, die beide gleich stark vertreten waren. Die Kupplung von 2 Poola, die jeweils 2 Hexaniere enthielten, lieferte dann einen Pool mit 4 Dodecameren.

L. Identifizierung von FIF-cDKS-Klonen

Unter Verwendung von 12S-mRHS aus induzierten Human-Fibroblasten (1000 Einheiten Interferon-Aktivität/ug im Oocytentest) wurde doppelstrangige cDdS hergestellt und in das Plasmid pBR 322 an der Pstl-Restriktionsstelle nach der Standard dG : dC-Tailing-Methode, wie von Chang et al» (supra) beschrieben, eingefügt, iiine FIF-cDMS—Bibliothek aus 30000 Ampicillin-empfindlichen, Tetracyclin-resistenten Transformanten von ü, coli K-12 Stamm 294 wurde aus 20 ng cDNS, enthaltend 550-1300 Basenpaare, angelegt· Aus 600 der Transformanten wurde Plaamid-DKS hergestellt und auf 3 Sätze

2.4 S 4 1 4 1 -17- 12.9.1983

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von Nitrocellulosefiltern, wie oben beschrieben, gebracht.

Die Methode zur Identifizierung hybrider Plasmide, die PIP-cDNS-Sequenzen enthielten, äjinelte der_f die angewandt? wurde zur Identifizierung entsprechender hybrider Plasmide mit LIP-cDNS Sequenzen (Goeddel et al·, Nature 28? _t 411 - 416 /T98p7). Radiomarkierte cDNS-Hybridisierungssonden wurden hergestellt unter Verwendung von entweder den 24 synthetischen Dodecameren oder von Oligo C^di)-t2-i8 ^^{8 Si3ar}"^ber und 12S-RImS aus induzierten Pibroblasten (5000 Einheiten/ug im Oocytentest) als Matrize· Die erhaltenen ^J P-cDNSs (spezifische Aktivität )5 x 10 cpm/ug) wurden mit einem großen Überschuß an mRNS, aus nicht induzierten Humani'ibroblasten isoliert, hybridisiert, und die mRiiS-cDNS-Hybride wurden von nicht umgesetzter cDNS mittels Chromatographie an Hydroxyapatit (Galau et alo, supta) abgetrennt. Die einsträngigen cDNS-Praktionen sollten angereichert sein mit Sequenzen, die in induzierten Pibroblasten vorhanden, in nicht-induzierten Zellen aber abwesend sind, und die mRNS-cDNS Hybride sollten Sequenzen darstellen, die aowohl in induzierten wie nicht-induzierten Zellen vorkommen« Etwa 4x10 cpm einsträngige cDNS (Hybridisierungssonde A). und 8 χ 10 cpm cDWS-mRliS-Hybride wurden unter Verwendung der mit Oligo (d^-^-ie S^es"^bar'^teten cDNS erhalten, während von der mit den synthetischen Dodecamerpools 1-6 gestarteten cDNS 1,5 x 10 cpm einsträngige cDNS (Hybridisierungasonde B) und 1,5 χ 10 cpm Hybride erhalten wurden. Die cDNS-mRWS-Hybride aus beiden Praktionierungen v/urden vereinigt, die RNS durch Behandlung mit Alkali hydrolysiert, und die ^²P-CDNS wurde als Hybridisierungssonde G verwendet. Viele der 600 Plasmidproben hybridisierten sowohl mit der Sonde A wie mit der Sonde C, was darauf hinwies, daß die Hybridisierungs-

4 -18- 12,9.1983

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reaktionen zwischen nicht induzierter mRMS und P-cDNS (vor der Hydroxyapatitfraktionierung) nicht vollständig verlaufen waren. Hur 1 der 600 Plasmide (ρϊ'526) hybridisierte stark mit der speziell gestarteten, induzierten cDNSf-Sande B, (Pig. 2). Plasmid pF526 hybridisierte auoh mit! der Qligo (d'U)_12--i8 £^es-fcarteten, induzierten cDIiS-Sonde A und lieferte keine nachweisbare Hybridisierung mit der kombinierten nicht-induzierten Sonde 0,

Pstl-Behandlung mit pF526 zeigte, daß der klonierte cDHS-Abschnitt etwa 550 Basenpaare lang war, wahrscheinlich zu kurz, um den gesamten kodierenden Bereich für Pibroblaaten-Interferon zu enthalten. Daher wurde eine * P-markierte DHS Sonde aus diesem Pstl-Pragment hergestellt mittels DWS-Starter aus Kälberthymus (Taylor et al., supra). Diese Sonde wurde gebraucht, um 2000 einzelne Kolonien einer neu hergestellten Fibroblasten-cDNS-Bibliothek zu screenen. Die neue cDNS-Bibliothek wurde unter Verwendung von 12S-mKNS aus induzierten tfibroblasten mit einem Titer von 6000 Einheiten/ml im Oocytentest hergestellt. 16 Klone hybridisierten mit der Sonde. Die aus der Mehrzahl dieser Klone gewonnenen Plasmide lieferten bei Spaltung mit Pstl 2 Fragmente, d. h., sie besaßen eine interne Pstl-Spaltstelle, Klon ρ£Ί3?3 enthielt den längsten cDHS-Abschnitt von etwa 800 Basenpaaren. Die DNS-Sequenz dieses Abschnitts wurde nach der i/Iaxam-Gilbert-Methode (supra) bestimmt und ist in Pig. 3 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des Human-Fibroblasten-Interferons, die aus der Nucleotidsequenz vorhergesagt wurde, ist mit der kürzlich von Taniguchi et al. (Gene J_-O, 11 - 15 /1f9S07) sowie von Derynck et al. (supra) beschriebenen identisch. iis wird zunächst eine Präsequenz oder ein Signalpeptid von 21 Aminosäuren kodiert, dann eine Aminosäuresequenz von

I 4 b ifr I 4 I · -15- 12.9.1983

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166 Aminosäuren, die das reife Interferon darstellen. Schließlich folgen 196 nicht übersetzte Nucleotide und ein PoIy(A)-Schwanz. -Die 20 aminoterminalen Aminosäuren des reifen FIF sind direkt bestimmt worden durch Sequenzierung und stimmen überein mit der aus der DNS-Sequenz vorhergesagten Sequenz.

M. Direkte Expression von Fibroblasten-Interferon

Um eine möglichst hohe Expression von reifem Fibroblasten-Interferon in jti, coli zu erhalten, sollte der "Start der ProteinsyntheBe am ATG-Godon des reifen Polypeptids (Aminosäure 1) und nicht am ATG-Codon des Signalpeptids (Aminosäure S1) stattfinden (Fig· 3)·

Wie die das Signalpeptid kodierende Region aus dem Plasmid pFIF3 entfernt wurde, ist in Fig. 4 dargestellt. JBin DKS-Fragment aus 1200 Basenpaaren, das den gesamten, FIF kodierenden cDitfS Abschnitt enthielt, wurde nach Behandlung von pFIF3 mit Hhal an einem Polyacrylamidgel isoliert. Zwei synthetische Deoxyoligonucleotidstarter, dATGAGCIACAAG(I) und dCATGAGCTACAAC(II) wurden hergestellt. Beide Starter enthalten die die ersten 4-Aminosäure des reifen Fibroblasten-Interferons kodierenden Sequenzen, und Starter II besitzt zusätzlich ein C am 5*--^nde, Starterreparatur und anschließende Verknüpfungen wurden für jeden der beiden Starter I und II getrennt durchgeführt und lieferten nahezu identische Resultate. Ab werden daher hier nur die Reaktionen mit dem Starter I im Datail beschrieben. Die Starter wurden 5'-radiomarkiert unter Verwendung von ( ff ~-> ²P) ATP und T4 PoIynucleotidkinase und mit dem 1200 Basenpaare enthaltenden Hhal-DNS-Fragment kombiniert. Das Gemisch wurde durch erhitzen denaturiert. Wach Hybridisierung des Starters an das

-Λ / A / -

ί H J * I H I -20- 12.9.1983

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denaturierte Hhal-DNS-Fragment, wurde die Reparatur dea oberen (+)-Strangea mit ^. coli-DIÜS-Polymeraae I Klenowfragment (Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 65» 168 - 175 /T96J27) katalysiert (Fig. 4). Gleichzeitig wird durch die y ^ 5'--^xonucleaaeaktivität des Klenowfraginenta daa in 3^f-dichtung vorragende ^nde des unteren (-)-Strangea entfernt unter Schaffung einea glatten üJndea. Die Analyse dea Reaktionsgemiachs durch Polyacrylamidgelelektrophoreae zeigte, daß die Reparatur nicht vollständig war, sondern an verschiedenen bestimmten Stellen aufgehört hatte. Daher wurde daa gesamte Reaktionsgemiach mit Pstl behandelt, und daa gewünachte 141 Baaenpaare-enthaltendes Fragment (180000 Cerenko cpm; ca. 0,3 pM) wurde durch Polyacrylamidgelelektrophoreae gereinigt (Fig. 5). Die Bindung dieses Fragments an 1/Ug (ca. 4 pM) des 363 Basenpaare-enthaltenden Pstl-Bglll-Fragments, das auch pFi:F3 isoliert wurde, mit anachließender Bglll-Behandlung, lieferte etwa 30 ng (ca. 0,1 pM, 50,000 Cerenkow cpm) des 504 Basenpaare-enthaltenden DftS-Fragments, daa die gesamte reifes Fibroblasten-Interferon kodierende Sequenz enthielt· Dieaelben Reaktionen mit dem Starter II lieferten etwa 50 ng (ca. 0,15 pM, 83,000 Cerenkow cpm) des 505 Basenpaare-enthaltenden Produkta.

Die Konstruktion von Plasmiden, die die Synthese von Human-Fibroblaaten-Interferonen lenken, iat in Fig. 6 dargestellt. üs wurden verschiedene Plasmide konstruiert, die die FIF-Synthese unter die Kontrolle von iS. coli Lac- oder Trp-Promotor-Operatoraystemen brachte. Diese beiden Systeme haben sich bereita als geeignet für die direkte iiocpression von iüukaryoten-Genen in E, coli erwiesen: humanes Wachstumshormon wurde unter Verwendung des Lac-Systema (Goeddel et al.,

243414 1 -²¹- 12.9.1983

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Nature 281, 544 - 548 /T97j?7) synthetisiert, während Human-Leukozyten-Interferon in hohen Ausbeuten unter Verwendung des Trp-3ystems erhalten wurde (Goeddel et al., Mature 287» ΖΪ9807).

pBRH-trp wurde mit ücoRI behandelt, und das erhaltene Fragment wurde durch PAGE und Blektroelution isoliert. lucoRI-behandeltes Plasmid pSomll (Itakura et al., Science 198, 1056 - 1063 /19717); brit. Patentpublikation Nr. 2007676 A) wurde mit dem obigen Fragment kombiniert. Das Gemisch wurde mit 1\ DNS-Ligase behandelt und die erhaltene DKS zur Transformation von Ji'. coli K-12 Stamm 294 in der bereits beschriebenen Weise verwendet. Die transformierten Bakterien wurden auf Grund ihrer Ampicillinresistenz selektioniert und nach der Koloniehybridisationsmethode von Grunstein et al. (supra) getestet, wobei das obige, aus pBRHtrp isolierte Fragment, das den Trp-Promotor-Operator enthielt und mit P^-^ radioaktiv markiert war, als Sonde verwendet wurde. Die Plasmid-DNS verschiedener, im Koloniehybridisationstest positiver Kolonien wurde isoliert, und die Orientierung der eingefügten Fragmente wurde durch Restriktionsanalyse mit den Enzymen BgIII und BamHI bestimmt. E. coli 294 mit dem Plasmid pS0M7A2, das das Trp-Promotor-Operator-Fragment in der gewünschten Orientierung enthielt, wurde in LB-Medium, enthaltend 10/Ug/ml Ampicillin, gezüchtet. Man ließ die Zellen bis zu einer optischen Dichte von 1 (bei 550 nm) wachsen, zentrifugierte und suspendierte in'M9-Medium bei 10facher Verdünnung. Die Zellen wurden nochmals 2 bis 3 Stunden zu einer optischen Dichte 1 wachsen gelassen, dann lysiert und das gesamte Zellprotein wurde durch SDS-Harnstoff (15 %) PAGE (Maizel et al., Methods Virol. £, 180 - 246 /T97J.7) analysiert.

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Das Plasmid pBE 322 wurde mit HindIII behandelt, und die vorstehenden Hindlll-iänden wurden mit S1-Nuclease entfernt, Für letztere Reaktion wurden 10/Ug Hindlll-gespaltene pBR322 in 30/Ul S1-Puffer (Q_?3 M WaOl₁ 1 m ZnGl₂, 25 mjvl Natriumacetat, pH 4,5) mit 300 Einheiten S1-Nuolease 30 Minuten lang bei 15 ⁰G behandelt. Die Reaktion vorde beendet durch Zusatz von 1/Ul 30 χ Si-Nuclease-Stoplb'sung (0,8 M Trisbase, 50 mlvl üD'üa), Das Gemisch wurde mit Phenol und anschließend mit Chloroform extrahiert, mit ethanol gefällt und schließlich mit EcoRI, wie bereits beschrieben, behandelt, Wach PAGE und iilektroelution wurde das große Fragment (1") erhalten, das ein .ücoRI kohäsives ünde und ein stumpfes Ende, dessen kodierender Strang mit Thymidin beginnt, besitzt.

Das Plasmid pSom7^l2 wurde mit BgIII behandelt, und die resultierenden kohäsiven tfnden wurden mittels Klenow-Polymerase I unter Verwendung aller 4 Deoxynucleotidtriphosphate doppeis tr ängig gemacht. Spaltung mit jicoRI sowie PAGJi und KLektroelution lieferten ein kurzes lineares DNS-Fragment (2), das den Tryptophan-Promotor-Operator enthielt sowie Godons der Lü¹· "proximalen" Sequenz stromaufwärts von der Bglil-Spaltstelle ("Le' (p)¹«). Dieses Fragment besaß ein kohäsives EcoRI-^nde und ein stumpfes Ünde, das von der Auffüllung der Bglll-Spaltstelle herrührt, Aus den beiden Fragmenten (1) und (2) wurde mit Hilfe von T.-DNS-Ligase das Plasmid pHKY 10 gebildet, mit dem kompetente Ü, coli Stamm 294-Zellen transformiert wurden.

Das Plasmid pGMI trägt das E, coli-Iryptophan-Operon mit der Deletion Δΐ*ώ1413 (Miozzari et al,, J, Bateriology 133» 1457 - 1466 /t9787) und exprimiert daher ein Fusionsprotein mit den ersten 6 Aminosäuren des Trp-Leaders und etwa dem letzten Drittel des !rp Ü-Polypeptids (im folgenden LhI* ge-

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nannt) sowie dem vollständigen Trp D-Polypeptid, und zwar unter der Kontrolle des Trp-Promotor-Operator-Systems. Das Plasmid (20/Ug) wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII an 5 Stellen gespalten. Die Genfragmente wurden dann mit jciooRI-Verbindungssequenzen (bestehend aus einer selbstkomplementären Polynukleotidsequenz pCATGAATTCATG) kombiniert, um eine EcoRI-Spaltstelle für das spätere Klonieren in ein Plasmid mit einer solchen EooRI-Spaltstelle zu schaffen· Die 2OyUg der aus pGMi erhaltenen DNS-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T. DNS-Ligase in Gegenwart von 200 pMol des 5*-phosphorylierten synthetischen Oligonucleotids pCATGAATTGATG in 20,ul T₄ DNS-Ligase-Puffer (20 nMol Tris, pH 7,6, 0,5 mMol ATP, 10 mMol MgCl₂, 5 mMol Dithiothreit) bei 4 ⁰C über Nacht behandelt. Die Lösung wurde dann 10 Minuten auf 70 ⁰C erwärmt. Die Verbindungssequenzen wurden mit EcoRI gespalten, und die Fragmente, die nun EcoRI-Enden enthielten, wurden mittels 5 % Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGiO aufgetrennt. Die drei größten Fragmente wurden aus dem Gel isoliert. Dazu wurde zunächst mit Ethidiumbromid angefärbt, die lokalisierten Fragmente wurden über UV-Licht ausgemacht und die betreffenden Regionen aus dem Gel herausgeschnitten. Jedes Gelfragment wurde mit 300 Microliter 0,1 χ TBB in eine Dialysetasche gebracht und während 1 Stunde in 0,1 χ TBE-Puffer der Elektrophorese bei 100 Volt ausgesetzt (ΐΒΕ-Paffer enthält: 10,8 g Tris-Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Na₂^DTA in 1 Liter HgO). Die wäßrige Lösung wurde gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und 0,2 M an Natriumchlorid gemacht. Die DlSTS wurde nach Ethanolfällung in wäßriger Lösung erhalten. Das den trp-Promotor-Operator enthaltende Gen mit JäicoRI kohäsiven ü-nden wurde nach der im folgenden beschriebenen Methode identifiziert, die darin besteht, daß man Fragmente in ein

') LQ / 1 /'. 1 -24- 12.9.1983 ^ « J ^ ' - V 61 982/12/38

Tetracyclin-empfindliches Plasmid einbaut, die durch Einbau eines Promotor-Operators Tetracyclin-resistent werden.

Das Plasmid pBRHl (Rodriguez et al·» Nucleic Acids Res· S₉ 3267 - 3287 /T97.27) exprimiert Ampicillinresistenz und enthält das Gen für i'etracyclinresistenz, aber, weil kein zugehöriger Promotor existiert, exprimiert diese Resistenz nicht. Das Plasmid ist daher Tetracyclinempfindlich. Durch Einfügung eines Promotor-Operator-Systems an der EcoRI-Spaltstelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden»

pBRHl wurde mit ü'coRI behandelt und das ünzym durch Phenolextraktion und Chlor of orciextrakt ion entfernt. Das nach Ethanolpräzipitation in '«Yasser erhaltene DHS-Molekül wurde in getrennten Reaktionsgemischen kombiniert mit jedem der drei DN3-Fragmente, die oben erhalten wurden und mit 1\ DNS-Ligase, wie bereits beschrieben, verbunden. Die DWS des Reaktionsgemische wurde zur Transformation kompetenter ii. coli K-12 Stamm 294-Organismen nach Standardmethoden (Hershfield et al., Proc. Hatl. Acad. Sci„ U.S.A. JQ, 3455 - 3459 ZT974Z) verwendet. Die Bakterien wurden auf LB (Luria-Bertani) - Platten gebracht, die 20yUg/ml Ampicillin und 5/Ug/ml tetracyclin enthielten. Es wurden verschiedene Tetracyclin-res^istenze Kolonien ausgewählt, die Plasmid-DMS isoliert und das Vorhandensein des gewünschten Fragmentes durch Restriktionsenzymanalysen bestätigt. Das entstandene Plasmid wurde pBRHtrp genannt.

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Hin EcoRI- und BamHI-Digestionsprodukt des Genoms des Hepatitis-B-Virus wurde nach bekannten Methoden erhalten und in die ucoRI und BamHI Spaltstellen des Plasmids pGH6 eingefügt (Goeddel et al., Nature £81, 544 ßSl$J), wodurch das Plasmid pHS32 entstand. Das Plasmid pHS32 wurde mit Xbal gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und der jithanolpräzipitation unterworfene ^s wurde dann mit 1/Ul E. coli DHS-Polymerase I, Klenow Fragment (Boehringer-Mannheim), in 30/Ul Polymerase-Puffer (50, mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 7 mM MgCl₂* 1 mM ß-Mercaptoethanol), enthaltend 0,1 mM dTTP und 0,1 mM dCi'P, während 30 Minuten bei 0 ⁰C und 2 Stunden bei 37 ⁰C behandelt. Durch diese Behandlung wurde die Xbal Spaltstelle folgendermaßen verändert:

5^! CTAGA 5*ν CTAGA

y T 3'

Dieser lineare Rest des Plasmids pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und i^fchanolpräzipitation in Wasser) wurde mit ücoRI gespalten« Das große Plasmidfragment wurde vom kleinen ücoRI-Cbal-Pragment abgetrennt durch PAGü und nach ülektroeiution isoliert. Dieses DNS-Pragment von pHS32 (0,2 /Ug) wurde durch ähnliche Bedingungen wie den oben beschriebenen an das AcoRI-Taql-Pragment des Tryptophanoperons (etwa 0,01/Ug) aus pBRHtrp gebunden. Dabei geschieht folgendes:

— T Ci¹AGA . —TCTAGA--

— AGC + TCT— ^ —AGCTCT—

S4 I Α 1 -26- 12.9.1933

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Diese Plasmide konnten auch mit EcoRI und Hpal gespalten werden und lieferten die erwarteten Restriktionsfragmente, Ein Plasmid, pTrp14 bezeichnet, wurde für die Expression heterologer Peptide, wie im folgenden beschrieben, verwendet.

Das Plasmid pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281, 544, /T97j?7) enthält ein Gen für das menschliche Wachstumshormon, bestehend aus 23 synthetisch hergestellten Aminosäurecodons und 153 Aminosäurecodons, die von cDiiS über reverse Transcription der mRNS erhalten wurde. Dieses Gen, obgleich es den Codon der Präsequenz des menschlichen Wachstumshormons nicht enthält, besitzt ein ATG-Translations-Startcodon. Das Gen wurde aus 10/Ug pHGH 107 isoliert nach Behandlung mit EcoRI und E. coli DNA Polymerase I. Klenow-Pragment sowie dTTP und ddATP, wie oben beschriebene Nach Phenol- und Chloroformextraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde das Plasmid mit BamHI behandelt·

Das das HGH-Gen enthaltende Fragment wurde durch PAGü) und Elektroelution isoliert. Das erhaltene DNS-JJYagment enthält auch die ersten 350 Nikleotide des Tetracyclinerestitenzverleihenden Strukturgens, aber es fehlt ihm das Tetracyclin Promotor-Operator-System, so daß, wenn es anschließend in ein Expressionsplasmid kloniert wird, diejenigen Plasmide, die diesen Abschnitt enthalten, durch die wiedergewonnene Tetracyclinresistenz identifiziert werden können. Weil das JäcoRI-ji'nde des Fragments aufgefüllt wurde nach dem Klenow-Polymerase-I-Verfahren, hat das Fragment ein stumpfes Ende und ein kohäsives Ende, wodurch die richtige Orientierung gesichert ist, wenn es später in ein Expressionsplasmid eingefügt wird.

2494-14 1 "-27- 12.9.1983

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Als nächstes wurde das Plasmid pTrp14 für den !Empfang des das HGH-Gen enthaltende Fragment, das oben hergestellt wurde, vorbereitet, ρΦ#ρ14 wurde mit Xbal behandelt und die entstehenden kohäsiven ünden wurden nach dem Klenow-Polymerase-I-Verfahren unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt. Wach Phenol- und Chloroform-Extraktion sowie JSthanolpräzipitation wurde die erhaltene DNS mit BamHI behandelt, und das entstandene große Plasmidfragment wurde durch PAGS und ülektroelution eluiert. Dieses Fragment besaß ein stumpfes und ein kohäsives ünde und erlaubte die Rekombination in der richtigen Richtung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, dessen Herstellung oben beschrieben wurde·

Das das HGH-Gen enthaltende fragment und das pTrp14 /{ Xba-BamHI-Pragment wurden kombiniert und miteinander verbunden unter ähnlichen Bedingungen wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind· Durch die Verbindung der aufgefüllten Xbal- und EcoRI-finden wurden die Xbal- und iiCoRI-Restriktionastellen wieder hergestellt·

Xbal aufgefüllt EcoRI aufgefüllt HGH-Gen-Anfang

-TCTAG ₊ AATTCTATG- -AGATC TTAAGATAC-

Xbal EcoRI

Durch diese Konstruktion wurde auch das Tetracyclinresistenz-Gen wiederhergestellt, "eil das Plasmid pHGH 107 Tetraoycliaresistenz von einem Promotor, der stromaufwärts vom HGH-Gen (Lac-Promotor) liegt, exprimiert, erlaubt das vorstehend

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konstruierte Plasmid, bezeichnet pHGH 207, die Expression des Gens für Tetracyclinresistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promotor-Operator. Das erhaltene Gemisch wurde in E, coli 294 transformiert, und die Kolonien wurden auf LB-Platten, die 5/Ug/ml Tetracyclin enthielten, selektioniert.

Das Plasmid pHGH 207 wurde mit EcoRI behandelt, und das den Trp-Promotor enthaltende Fragment wurde mittels PAGü und ülektroelution isoliert· Das Plasmid pBRH1 wurde mit üicoRI behandelt, und die Spaltstellen wurden mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP, 1/Ug, in 50 mM Tris, pH 8, und 10 mM MgGl₂) 30 Minuten lang bei 65 ⁰C behandelt, um die Phospahtgruppen an den vorstehenden EcoRI-ünden zu entfernen, überschüssige bakterielle alkalische Phosphatase wurde durch Phenolextraktion, Chloroformextraktion und Äthanol-Fällung entfernt. Infolge der an den überstehenden linden fehlenden Phosphatgruppen kann das erhaltene lineare DNS-Fragment sich nicht selbst zu einem Kreis schließen, sondern nur mit solchen anderen DNS-Fragmenten reagieren, deren kohäsive ünden phosphoryliert sind.

Das EcoRI-Fragment aus pHGH 207 wurde mit dem aus pBRH1 erhaltenen linearen DK3-Fragment in Gegenwart von T.-Ligase wie vorstehend beschrieben verbunden, üin Teil des erhaltenen Gemische wurde zur Transformation von B. coli Stamm in der vorstehend beschriebenen Weise verwendet. 12 Tetracyclin-resistente Kolonien wurden selektioniert (LB-Medium mit einem Gehalt von 5/Ug/ml Tetracyclin), Aus jeder Kolonie wurde Plasmid-DNS isoliert und durch Behandlung mit ücoRI und Xbal auf das Vorhandensein des gewünschten DIiS-Abschnitts untersucht· Ein Plasmid, das den gewünschten Abschnitt enthielt, wurde pHKY1 bezeichnet.

94 14 j -29- 12.9.1933

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Das Plasmid ρΗΚΠΟ ist ein Derivat von pBR 322, das eine Bglll-Spaltetelle zwischen dem Tetracyclinresistenz (I¹C^)-PrOmOtOr und dem ötrukturgen enthält, Pas große DNS-Fragment, das nach Behandlung von pHKYlO mit Pstl und BgIII isoliert wurde, enthält daher einen Seil des .Ampicillin-

R R

resistenz (Ap )-Gene und das gesamte Tc -^trukturgen aber nicht den Tc^R-Promotor (Fig. 6). Das Plasmid pGH6 (Goeddel) et al·, Nature 281, 544 - 548 /T97.9.7) wurde mit ücoRI behandelt, die einsträngigen ^nden wurden mit DMS-Polymerase I aufgefüllt und das Plasmid wurde mit Pstl gespalten. Das kleine Fragment, enthaltend einen Teil des Ap -Gens, einen doppelten Lac-Promotor und die Lac-Ribosomenbindungsstelle, nicht aber den ATG-Startcodon, wurde isoliert. Kin ähnliches Trp-Promotor-i?ragment, das die Trp-Leader-Ribosomenbindungsstelle enthält, nicht aber eine ATG-öequenz (Goeddel et al., Nature 282, 41¹ - 4i6 /T9307), kann aus pHKYl isoliert werden.

Das soeben erwähnte Trp-Fragment ist ein analoges des ü. coli-Tryptophan-Operons, aus dem der sogenannte Trp-Attenuator entfernt wurde (Miozzari et al., J. Bact. 133» 1457 - 1466 /T9787), um die'expression kontrolliert zu erhöhen. Expressions· plaamide, die das modifizierte Trp-Regulon enthalten, können bis ζώ vorgegebenen Konzentrationen in einem Nährmedium, das genügend zusätzliches (Tryptophan enthält, um das Promotor-Operator-Üystem zu unterdrücken, gezüchtet werden. Kntzug des Tryptophane, wodurch der Promotor-Operator in Aktion tritt, bewirkt die Expression des gewünschten Produktes.

Die üxpressionsplasmide können zusammengesetzt werden über 3stufige Verbindungsschritte, wie in Fig. 6 gezeigt, 15 ng (0,05 pM) des FIF-Gens (504 bzw. 505 Basenpaare) 0,

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(0,2 pM) des großen Pstl-Bglll-^ragments von pHKYIO und 0,2/Ug (0,3 pH) des geeigneten Promotorfragments wurden miteinander verbunden, und das Gemisch wurde verwendet zur Transformation von £-.. coli 294 (Goeddel et al., Nature 287. 411 - 416 /T98Ö7). Aus den einzelnen Transformanten wurde Plasmid-MS isoliert und mittels Restriktionsenzymen analysiert. Bei korrekter Verbindung des FIF-Gens mit dem Promotorfragment wird die iugoRI (Lac)- oder die Xbal (Trp)-Erkennungs· aequenz wieder hergestellt. Die überwiegende Zahl der Plasmide lieferten das erwartete Restriktionsmuster, oiinzelne Klone wurden hochgezüchtet (12 mit dem Trp-Promotor und 12 mit dem Lac-Promotor). Für den Interferon-Assay wurden aus ihnen Extrakte, wie bereits beschrieben, hergestellt.

Im CPE-Hemmtest auf menschlichen Amnionzellen (WISH) waren 5 Trp-Transformanten positiv (alle etwa gleich stark), und 11 der Lac-Transformanten zeigten äquivalente Ixterferonaktivitäten. Daher wurde aus jeder Serie ein Transformant für die weiteren Untersuchungen ausgesucht (pFIFac9 und pFIFtrp69, Tabelle 1). Die DNS-Sequenzanalyse bestätigte, daß in beiden Fällen die gewünschte Verknüpfung des Promotors an das FIP-3trukturgen stattgefunden hatte.

Tabelle 1

Interferon-iktivität in Extrakten von E, coli

2/,34U 1

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E, coli K-12 Stamm 294 transformiert mit

Zelldichte (Zellen/ml)

IF-Aktivität

(E/l

Kultur)

Moleküle pro Zelle

pBR 322	3,5	X	10⁸	9	,0'	Wl	•	10^b	2	_
pPIPlac9	3,5	X	1O^Ü	1	,8	X	10⁷	4	,250
pFIFtrp69	3,5	X	1O^Ö	8	,1	X	10⁷	20	,500
pPIPtrp³69	3,5	X	10⁸		X		,200

Die Züchtung der Zellen und die Herstellung von Extrakte erfolgte in der oben angegebenen V/eise, -Die menschliche Amnionzellinie (WISH) wurde für den CPE-Hemmtest verwendet. Die angegebenen Aktivitäten sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen. Um die Anzahl der Interferonmoleküle pro Zelle zu bestimmen, wurde eine spezifische PIF-.Aktivität von 4 χ 10 Einheiten/mg verwendet (Knight, supra)

Die mit pPIPlac9 und pPIPtrp69 erhaltenen FIP-Mengen sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Der Trp-Promotor lieferte eine höhere Expression/als der Lac-Promotor, Um die FIF-Expression weiter zu erhöhen, wurde pPIPtrp69 mit ü'coRI gespalten, und zwei 300 Basenpaar-lange .bcoRI-Fragmente, die den Trp-Promotor enthielten (Goeddel et al., Nature 287, 411 /T9827), wurden eingefügt. DaB erhaltene Plasmid, pFIFtr enthält drei aufeinanderfolgende Trp-Promotoren, die in Hichtung des FIF-Gens orientiert sind. Die von E. coli K-12 Stamm 294/pPIP^69 produzierte PIP-Menge ist vier- bis fünfmal so groß wie die von E. coli K-12 Stamm 294/pPIPtrp69 produzierte (i'abelle 1). Das von E. coli K-12 Stamm 294/ pPIPtrp69 hergestellte PIP verhält sich wie authentisches

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Human-PIP. Viiie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, ist seine antivirale Aktivität etwa 30mal größer bei menschlichen Zellen als bei Rinderzellen. Zusätzlich ist das bakteriell hergestellte FIP bei pH 2 über" Nacht stabil und wird nicht durch Kaninchen—^nti-Human-Leiikozyten-Interferon-Antikörper neutralisiert (Tabelle 3)·

Tabelle 2

Interferon-Aktivitäten verschiedener Zelltypen

Zellen Interferon-Aktivität (E/ml)

	LeIP	000 000	PIP	E. coli K-12 Stamm 294/pFIPtrp69-Extrakt
Amnion (human) Niere (Rind)	20, 13,		10,000 400	1280 40
Tabelle 3:

Vergleich der Interferon-Aktivitäten aus Extrakten von E, coli K-12 Stamm 294/pPIPtrp69 mit Human-LelP- und -PIP-Standard

Interferon-Aktivität (£/ml)

	LeIP	PID	E. coli K-12 Stamm
			294/pPIPtrp69
unbehandelt	1000	1000	1000
pH2	1000	1000	1000
Kaninchen-anti- Human-LeIP-Anti körper	16	1000	1000

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LeIF und PIF sind NIH-Standardlösungen mit 20,000 bzw. 10,000 Einheiten/ml.

N. Reinigung

Bakteriell hergestelltes Fibroblasten-Interferon wird folgendermaßen gereinigt:

1. Die gefrorenen Zellen v/erden in der 12fachen Menge (v/w) eines Saccharoaepuffers (100 mM Tris-HGl, 10 % Saccharose, 0,2 m NaGl, 50 mM i-'DTA, 0,2 mM PMSF /Phenylmethylsulfonylchloridf/, pH 7|9)» enthaltend 1 mg/ml Lysozym, suspendiert. ^Xe Zellsuspension wird 1 Stunde bei 4 ⁰G gerührt und zentrifugiert« Die Fibroblasten-Interferonaktivität findet sich im Überstand.

2. Der mit Ultraschall behandelte Überstand wird mit 5%iges Polyethylenimin (v/y) bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % (v/v) versetzt. Die Lösung wird 1 Stunde bei 4 ⁰G gerührt und dann zentrifugiert, Die Interferonaktivität verbleibt im Überstand.

3. Der Überstand wird mit festem Ammoniumsulfat bis zu einer iindkonzentration von 50 % versetzt, 30 Minuten bei 4 ⁰C gerührt und zentrifugiert. Die Interferonaktivität befindet sich im Niederschlag·

4. Der Aminoniumsulfatniederschlag wird im PBS (20 mM üatriumphosphat, 0,15 m NaCl, pH 7,4) suspendiert und zwar in einem Volumen, das halb so groß ist wie das der 50%igen iimmoniumsulfat-Su.gpension. Es wird Polyethylenglykol 6000 (50 %, w/v, in PBS) zugesetzt bis zu einer

if 9 4 1 4 1 -34- 12.9.1983

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zentration von 12,5 % (ν/ν), 2 Stunden bei 4 ⁰G gerührt und zentrifugiert. Die Interferonaktivität befindet sich im niederschlag, der in einer minimalen Menge des unter (1) definierten Saccharosepuffers suspendiert und durch Zentrifugieren geklärt wird.

Durch dieses .Extrakt ions verfahren wird eine Anreicherung des Fibroblasten-Interferons von 0,001 % Gesamtprotein auf Q.,05 % Gesamtprotein erreicht· Das Material kann weiter bis zur Homogenität durch folgende säulenchromatographischen Verfahren gereinigt werden:

5. Affinitätschromatographie an Amicon-Blau B in dem unter (1) definierten Saccharosepuffer.

6. Anionenaustauschchromatographie an QAE Sephadex in dem unter (1) definierten Saccharosepuffer bei Abwesenheit von 0,2 M NaGl.

7. Größenausschlußchromatographie an Sephadex G-75 in dem unter (1) definierten Saccharosepuffer.

8. HPLG an Umkehrphasen

0. Parenterale Applikation

£ΊΡ kann parenteral verabreicht werden an Individuen, die eine antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen und in solche, die immundepressive Zusätze aufweisen. Die Dosierung kann sich an die des zur Zeit in klinischer Prüfung befindlichen Materials, das aus menschlichen Zellen gewonnen wurde, anlehnen und kann z. B. etwa 1 - 10 χ 10

/, 1 / 1 -35- 12.9.1983 "* ' * ' 61 982/12/38

Einheiten/Tag, im Fall von Material mit einer Reinheit, die größer ist als 1 %, bia zu etwa 15 x 10' Einheiten/Tag betragen. Die Dosierungen von bakteriell hergestelltem Ji¹Ii' können zur Erzielung einea beaaeren Effekte markant erhöht werden, wegen der höheren Reinheit und der wdtgehenden Abwesenheit anderer Human-Proteine, die als Pyrogene wirken können und für unerwünschte Nebenwirkungen verantwortlich sein kann, beispielsweise erhöhte Temperatur, Übelkeit usw₀

Ein für die parenterale Applikation geeignetes Präparat kann beispielsweise dadurch hergestellt werden, daß man 3 bakteriell hergestelltes KD? mit einer spezifischen Aktivi-

tat von etwa 2 χ 10 Einheiten/mg in 25 ml 5tigern humanem Serumalbumin löst, die Lösung durch ein bakteriologischea filter gibt und die filtrierte Lösung aseptisch in 100 Ampullen abfüllt, von denen jede 6 χ 10 Einheiten reines Interferon enthält. Die Ampullen werden vorzugsweise in der Kälte (-20 ⁰C) aufbewahrt.

Die Herstellung pharmazeutischer Präparate, die erfindungsgemäß Verbindungen enthalten, kann nach den allgemein bekannten Methoden der Galenik unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägermaterialien, wie sie in der einschlägigen Literatur beschrieben sind, erfolgen.

Claims

£-49414 1 "³⁶- 12.9ο 1983

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ujrf indungsanspruch

1. Verfahren zur Herstellung eines replikablen, in einem Mikroorganismus die Expression eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz eines reifen Human-Fibroblasten-Interferons ohne Präsequenz oder 'JJeil einer solchen bewirkenden Vektors, gekennzeichnet dadurch, daß man eine dieses Polypeptid codierende erste DIiS-Sequenz operabel mit einer zweiten DJSS-Sequenz, die die für die Expression notwendigen Codons enthält, verbindet,
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die zweite DNS-Sequenz einen mehrfachen Trp-Promotor-Operator enthält.

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