DD258943A5 - Verfahren zur herstellung von zusammensetzungen, die zur intramammaeren infusion an einem saeugetier vorgesehen sind - Google Patents
Verfahren zur herstellung von zusammensetzungen, die zur intramammaeren infusion an einem saeugetier vorgesehen sind Download PDFInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, die zur intramammaeren Infusion an einem Saeugetier vorgesehen sind. Mit den erfindungsgemaessen Zusammensetzungen kann das Wachstum von milcherzeugenden Milchdruesenparenchym in einem normalen Saeugetier betraechtlich gefoerdert werden. Erfindungsgemaess wird eine Substanz mit mitogener Wirkung auf die Milchdruesen-Epithelzellen in dem Saeugetier mit einem Vehikel kombiniert, das die Diffusion der Substanz durch die die Infusion erhaltene Milchdruese des Saeugetiers foerdert. Das Vehikel ist zweckmaessig im wesentlichen wasserloeslich und im wesentlichen bei der Koerpertemperatur des Saeugetiers fluessig.
Description
Erfindungsgemäß wird zur Herstellung der Zusammensetzung eine Substanz mit mitogener Wirkung auf die Milchdrüsen-Epithelzellen in dem Säugetier mit einem Vehikel kombiniert, daß die Diffusion der Substanz durch die die Infusion erhaltene Milchdrüse des Säugetiers fördert.
Die Erfindung eignet sich für jedes Säugetier, bei dem ein stärkeres Wachstum von Milchdrüsenparenchym angestrebt wird. Sie ist besonders für Wiederkäuer von Nutzen, einschließlich Rinder, wie Milchkühe, Kühe in Fleischviehherden und Färsen von Milch-und Fleischkühen. Sie ist für alle bekannten Rassen von Milchkühen nützlich, z.B. Holsteiner, Friesen, Braune Schweizer, Jersey, Guernsey, Ayrshire, Milking Shorthorn und Kreuzungen davon, sowie bei allen bekannten Züchtungen von Fleischkühen, z. B. Hereford, Angus, Zebu, Charolais, Brangus, Simmental, Chianina, Dutch Belted, Limousin und Kreuzungen davon. Sie ist auch bei anderen Wiederkäuern von Nutzen, z. B. Schafen und Ziegen aller Rassen, sowie bei verschiedenen Nicht-Wiederkäuern, z. B. Schweinen aller Rassen. Besonders bemerkenswert für die praktische Anwendung ist, daß die Erfindung für die Behandlung von Säugetieren herangezogen wird, die physiologisch normal sind, worunter für die vorliegenden Zwecke zu verstehen ist, daß sie nicht ovariektomiert und nicht vorbehandelt wurden (z.B. mit einem Geschlechtshormon wie Estrogen, Gonadotropin oder dergleichen), um Pseudoträchtigkeit oder Geschlechtsreife zu induzieren.
In der hier gebrauchten Bedeutung bezieht sich die Bezeichnung „Milchdrüsen-Parenchym" auf Gewebe in einer Milchdrüse (einschließlich des normalerweise „Milchdrüsen-Epithel" genannten, das zur Milcherzeugung durch diese Drüse beiträgt. Praktisch erfolgt das Milchdrüsenwachstum beim weiblichen Tier hauptsächlich nach dem Einsetzen der Geschlechtsreife. Gewöhnlich tritt (z. B. bei der Färse) das stärkste Milchdrüsenwachstum während der ersten Trächtigkeit auf. Weiteres Wachstum und/oder Nachwachsen von Parenchym ist während folgender Trächtigkeiten zu verzeichnen.
Zur Verstärkung eines derartigen Wachstums kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung mit der erwünschten mitogenen Wirkung an das Säugetier zwischen etwa dem Einsetzen der Geschlechtsreife (einschließlich der peribubertalen Periode) und der ersten Trächtigkeit des Säugetiers oder während der ersten oder jeder nachfolgenden Trächtigkeit verabreicht werden. So wird eine solche Verabreichung im allgemeinen in einer „trockenen" Periode vorgenommen, in der das Säugetier keine Milch gibt. Bei Milchkühen und ähnlichen Säugetieren ist die Verabreichung während des letzten Vierteljahres vor der Abkalbung gewöhnlich vorteilhaft.
Die herkömmliche und überraschenderweise wirksame Verabreichungstechnik wird meistens intramammäre Infusion genannt. Bei Säugetierentwie Kühen wird diese Technik routinemäßig zur Verabreichung von Antibiotika enthaltenden Salben oder anderen Formulierungen zur Verhinderung oder Bekämpfung von Mastitis angewandt. Bei der praktischen Anwendung kann die eine mitogene Wirkung besitzende Substanz gewöhnlich mit Hilfe einer ähnlichen Technik verabreicht werden, oder noch einfacher dadurch, daß sie (mit oder ohne einem anderen Parenchym-Wachstums-Stimulans) in eine Formulierung einbezogen wird, die zur Verhinderung oder Bekämpfung von Mastitis oder für irgendeinen anderen Zweck eingegeben wird. Bei dieser Technik wird eine Spritze mit stumpfen Ende durch die Zitzenöffnung und den Strichkanal so eingeführt, daß die Substanz mit der mitogenen Wirkung in die Zitzenzisterne gelangt. Von dort breitet sie sich normalerweise durch die Zitzenzisterne, die Drüsenzisterne und das Duktalsystem der Milchdrüse aus. Diese allgemein bekannte Technik wird in „Drugs in Veterinary Practice", S. 80-83, von Spinelli, u.a., CV. Mosby Co., St. Louis, MO (1978) und in US-PS 4.011.312 beschrieben, die hier durch Bezugnahme einbezogen sind. Für erfindungsgemäße Zwecke sollten andere Verfahrensweisen als Äquivalente der intramammären Infusion insoweit betrachtet werden, als durch sie eine derartige Substanz in die Zitzenzisterne gelangt und es dadurch zu einer Ausbreitung derselben durch das Duktalsystem und die davon ausgehenden Kanäle in das Milchdrüsengewebe kommt, wo sie eine verstärkende Wirkung auf das Parenchym-Wachstum ausübt.
Im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind unter „direkten" und „parakrinen" mitogenen Wirkungen solche Wirkungen zu verstehen, bei denen es nicht erforderlich ist, und in den meisten Fällen nicht der Fall ist, daß die verabreichte Substanz in die Blutbahn des behandelten Tieres in einer Menge gelangt, durch die ihre Konzentration darin auf einen Wert erhöht wird, der durch endokrine Regulierung für eine mitogene Wirkung auf die Parenchymzellen in dem Tier in der gewünschten Stärke ausreicht. Hinsichtlich einer Übersicht über die parakrine Regulierung des Milchdrüsenwachstums siehe Oka, u. a., 15 (1). Clinics in Endocrin. and Metab. 79-97 (1986).
Die gewünschte Wirkung kann unter Anwendung jeder Substanz, die eine signifikante direkte oder parakrine mitogene Wirkung auf das Milchdrüsenparenchym in dem behandelten Säugetier hat, erreicht werden. Viele wichtige Ausführungsbeispiele werden unter Verwendung einer Substanz ausgeführt, die direkt auf Brustdrüsen-Parenchymzellen in der behandelten Drüse zur Erhöhung ihrer Rate der normalen Zellvermehrung wirkt. Bei anderen Ausführungsbeispieien wirkt die Substanz direkt auf Nicht-Parenchymzellen innerhalb der Drüse, was in solchen Zellen resultiert, die durch eine parakrine Wirkung eine örtlich erhöhte Menge einer Substanz bereitstellen, die eine direkte mitogene Wirkung auf Milchdrüsen-Parenchymzellen in der behandelten Drüse haben.
Wie aus den folgenden spezifischen Beispielen zu ersehen ist, führt die intramammäre Infusion einer derartigen Substanz in einigen Fällen zu einem erheblichen Wachstum von Milchdrüsen, die den behandelten benachbart sind, und zwar ohne nennenswerte Erhöhung der Menge der Infusionssubstanz in der Blutbahn des Tieres. Allerdings können genügend Rezeptoren für direkte oder parakrine Wirkungen einiger Substanzen innerhalb einer Milchdrüse nur während bestimmter Phasen der Physiologie des Tieres vorhanden sein. Zum Beispiel scheint eine größere Anzahl von Somatropin-Binderezeptoren in der Milchdrüse bei Rindern während der Trächtigkeit vorhanden zu sein als wenn die Tiere nicht tragend sind. Vergleiche L'HORMONE PLACENTAIRE SOMATOMAMMOTROPE BOVINE (Kapitel V) von Jean-Francois Beckers, Universität Liege, Fakultät für Veterinärmedizin (1983) mit Hormonal Control of Casein Synthesis and Organ Culture of the Bovine Lactating Mammary Gland, Gertler, u. a., 49 J. Dairy Research 387 (1982) und Lactogenic Hormones: Bindung Sites, Mammary Growth, Secretory Cell Differentiation, und Milk Biosynthesis in Ruminants, Akers, 68 J. Dairy Sei. 501 (1985).
Bei vielen erfindungsgemäßen Ausführungsbeispielen handelt es sich bei der Substanz mit der mitogenen Wirkung um einen Polypeptid-Wachstumsfaktor. Verschiedene Klassen solcher für die erfindungsgemäße Anwendung bevorzugter Wachstumsfaktoren haben im allgemeinen unter etwa 45000 liegende relative Molekülmassen, und noch besser unter etwa 22500 liegende, und im Falle von Wachstumsfaktoren mit einer direkten mitogenen Wirkung nach obiger Beschreibung, im allgemeinen eine unter etwa 10000 liegende. Einige Nicht-Polypeptid-Substanzen,z. B. ovariale und placentale Steroide und Antagonisten davon, können in einigen Fällen ohne weiteres verwendet werden. In jedem Fall kann die Substanz natürlich vorkommen, zur Stimulierung einer natürlich vorkommenden Substanz synthetisiert werden oder zur Schaffung einer Substanz synthetisiert werden, die einer natürlich vorkommenden Verbindung nicht gleich ist, aber trotzdem eine solche mitogene Wirkung hat.
Eine bevorzugte Klasse von Polypeptid-Wachstumsfaktoren, die eingesetzt werden können, sind die epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF'n). Praktisch wirken sie gemeinsam mit Rezeptoren auf Milchdrüsen-Epithelzellen zur Stimulierung der Vermehrung derartiger Zellen. EGF'n verschiedener Säugetierarten wurden anhand ihrer Aminosäuresequenzen und/oder von Konfigurationen, die durch interne Vernetzung von Cysteinresten durch Disulfidbindungen diktiert waren, sequenziert und identifiziert. Eine derartige EGF ist ein gut-charakterisiertes Einzel-Ketten-Polypeptid von 53 Aminosäuren, das aus submaxillaren (salivaren) Drüsen von ausgewachsenen männlichen Mäusen isoliert werden kann. Eine andere Form von EGF, Human-Urogastron, wird in den Duodenum- und Salivadrüsen synthetisiert und kann aus Human-Urin isoliert werden. Urogastron ist zu 70% homolog (37 von 53 gemeinsamen Aminosäuren) mit Mäuse-EGF und hat dc-si Disulfidbindungen in den gleichen Positionen. Zur Verfügung stehende Daten besagen, daß Human-Urogastron und Human-EGF identisch sind. Hinsichtlich weiterer Informationen über EGF siehe „Epidermal Growth Factor" von Carpenter, u.a., 48, Ann. Rev. Biochem. 193-216 (1979) und Gregory, 257 Nature 325-27 (1975), beide hier durch Bezugnahme herangezogen.
Es ist bekannt, daß die gesamte Aminosäuresequenz von Human oder Mäuse-EGF für die mitogene Aktivität nicht erforderlich ist. Zum Beispiel werden in US-PS 3.917.824 Molekülvariationen beschrieben, die am Carboxyterminus verkürzt sind (z. B. um 2, 5 oder 6 Aminosäuren); US-PS 4.035.485 betrifft eine Molekülvariation, die um 7 Aminosäuren verkürzt ist; US-PS 3.948.875 zeigt EGF-Derivate, denen die C-terminalen Leu-Ar-Reste fehlen; PCT-PAWO 83/04030 betrifft Urogastron-Analoga, die sich in der Identität oder in der Lage von einer oder mehreren Aminosäuren unterscheiden; und PCT PA WO 85/01284 betrifft Polypeptide mit EG F-artiger Aktivität, die auf dem Vorhandensein einer Sequenz von zehn Aminosäuren beruht, die der zwischen Cys2o und Cys3i von natürlichem EGF entspricht; jede Veröffentlichung ist hier unter Bezugnahme einbezogen. Bis zu dem Maße, in dem diese oder ähnliche Molekülvariationen von EGF, Analoga davon oder andere Verbindungen, die mit EGF- (oder funktionell ähnlichen) Rezeptoren in der Milchdrüse nach intramammärer Infusion in Wechselwirkung stehen und erfindungsgemäße Ziele in erheblichem Ausmaß erreichen, sind sie für erfindungsgemäße Zwecke Äquivalente von EGF'n. Es sind verschiedene Verfahrensweisen zur Herstellung von EGF bekannt. Zum Beispiel wird in JP-PA 59/027858 beschrieben, daß geschützte 1-5-Aminosäure-Peptidezur Bildung von geschütztem Tripentacontapeptid kondensiert werden, das nach Entfernung des Schutzes oxydiert wird, um einen EGF zu erzeugen; EP-PA 128.733 und PA WO 85/00369 betreffen EGF-Herstellungen durch Expression von rekombinierter DNS; GB-PS 2.092.155 legt die Herstellung eines EGF durch die Vervielfachung von Hybridomazellen dar; und US-PS 4.528.186 betrifft die Wiedergewinnung eines EGF aus Human-Urin. Diese Patentschriften sind durch Bezugnahme einbezogen. .
In anderen bevorzugten Ausführungsbeispielen kann der Wachstumsfaktor aus fötalen EGF'n ausgewählt werden, so aus den Transformations-Wachstumsfaktoren vom Alpha-Typ. Siehe EP-PA 105.014 und 190.018 (die hier unter Bezugnahme einbezogen werden). Praktisch stehen diese mit Rezeptoren in der Milchdrüse in Wechselwirkung, um die erwünschte mitogene Aktivität zu erzeugen. Eine andere Klasse von verschiedenen erfindungsgemäß nützlichen Polypeptiden wird durch die Virus-Proteinanaloga in EP-PA 199.769 auf der Basis von WO 86/02650 erläutert.
In anderen Ausführungsbeispielen kann der Wachstumsfaktor ein Polypeptid aus der Insulin-Familie, ein Analogon eines solchen Polypeptids oder eine andere Substanz sein, die mit dem insulin-artigen Wachstumsfaktor (IGF) oder funktionell ähnlichen Rezeptoren in der Milchdrüse in Wechselwirkung steht, um eine mitogene Wirkung auf das Parenchym zu schaffen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem verwendeten IGF um einen IGF-I („Somatomedin") oder IGF-II. Ähnliche Ergebnisse lassen sich im allgemeinen bei Verwendung von Insulin oder eines Vorläufers davon (z.B. Pro-Insulin) erzielen, obwohl die erforderlichen Mengen viel größer als die bei einem IGF sind.
Es gibt eine umfassende Literatur über die Identitäten dieser Wachstumsfaktoren der Insulinfamilie und die Methoden für deren Herstellung. Zum Beispiel werden Aminosäuresequenzen für Human-IGF-I und -Il und deren Produktion durch Expression von Rekombinant-DNS in mikrobiologischen Wirten in EP-PA 128.733 und 123.228 beschrieben. IGF-I-Analoge, die Valin in der Aminosäure-Position 59 aufweisen, werden in EP-PA 158.892 beschrieben. Weitere Informationen über IGF'n sind bei Rinderknecht, u.a., 73 Proc. Natl. Acad. Sei USA 2365 (1976); Zapf, u.a., 19 Curr. Top. Cell. Reg. 257 (1981); und Wilson, u.a., 95 J. Endocrin. 59-64 (1982) zu finden. Präparate von Insulin und Pro-Insulin werden von Johnson 210 Sei. 632-37 (1983) und in EP-PA 55.945 beschrieben. Die in diesem Abschnitt zitierten Veröffentlichungen sind hier durch Bezugnahme einbezogen. Substanzen, die zur Erzielung einer parakrinen mitogenen Wirkung als Infusion angewandt werden können, sind placentares Lactogen, verschiedene vorausgehende Hypophysenhormone und andere Polypeptide, die eine ausreichend ähnliche chemische Struktur haben, um für erfindungsgemäße Zwecke im wesentlichen diegieiche(n) mitogene(n) Wirkung(en) schaffen zu können. Im allgemeinen werden aus Gründen des Wirkungsgrades andere anteriore Hypophysenhormone als Prolactin (z. B. Somatropine) bevorzugt.
Die erfindungsgemäß gebrauchten Mengen der die mitogene Aktivität schaffenden Substanz sind sehr gering, woraus ein unerwartet hoher Wirkungsgrad bei ihrer Anwendung hervorgeht. Einheitsdosismengen zur Infusion einer Düse brauchen in einigen Fällen nicht mehr als etwa 2 Mikrogramm zu betragen, und geringere Dosen können in einigen Fällen wirksam sein. Einheitsdosismengen bis zu etwa 100 Milligramm oder darüber können im allgemeinen ohne Beeinträchtigung der beabsichtigten Wirkungen verabreicht werden, aber viel geringere Dosismengen (z.B. weniger als etwa 100 Mikrogramm) werden im allgemeinen aus wirtschaftlichen Gründen bevorzugt. Die Konzentrationen der die mitogene Aktivität schaffenden Substanz in der angewandten Zusammensetzung liegen normalerweise am besten zwischen etwa 5 und etwa 500 ng/ml, wenn auch höhere oder geringere Konzentrationen in einigen Fällen von Nutzen sein können.
Die vorteilhaftesten Dosismengen, Konzentrationen, Häufigkeiten und Anzahl von Infusionen können durch routinemäßige Versuche ermittelt werden. In vielen Fällen führen 1 bis etwa 5 aufeinanderfolgende Infusionen zu guten Ergebnissen. Diese können am besten in Abständen von z.B. 1 bis etwa 10 (vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 5) Tagen erfolgen. Die Tatsache, daß beträchtliche Steigerungen des Parenchym-Wachstums in so kurzen Zeiträumen zu erreichen sind, war ziemlich überraschend und hat beträchtliche wirtschaftliche Bedeutung. Zufriedenstellende Gesamtdosismengen, d. h. die Summe der aufeinanderfolgenden Infusionen für ein einzelnes Säugetier während einer Trächtigkeit oder der Geschlechtsreife vor der Trächtigkeit, betragen im allgemeinen mindestens etwa 10 Mikrogramm, praktisch weniger als etwa 500 Milligramm, und oftmals vorzugsweise weniger als etwa 1 Milligramm der die mitogene Aktivität schaffenden Substanz. Obwohl es möglich ist unter Anwendung einer einzigen, mitogene Aktivität vermittelnden Substanz zu arbeiten, so können auch Kombinationen solcher Substanzen in einigen Fällen vorteilhaft verwendet werden. Bei vielen Ausführungsbeispielen empfiehlt es sich, eine Infusion einer die mitogene Aktivität vermittelnden Substanz vorzunehmen, die einer natürlich in der
zu behandelnden Tierart vorkommenden Substanz, z.B. einem Rinder EGF, IGF und/oder Somatotropin, zur Behandlung von Rindern fast entspricht. Allerdings sind Substanzen, die den in anderen Tierarten natürlich vorkommenden entsprechen, gewöhnlich auch geeignet.
Normalerweise wird die Methode so ausgeführt, daß eine für die Verabreichung an ein Säugetier durchintramammäne Infusion geeignete Zusammensetzung verwendet wird, die eine zur Steigerung des Wachstums von Milchdrüsenparenchym in diesem Säugetier wirksame Menge einer'Substanz enthält, die eine mitogene Wirkung auf die Milchdrüsen-Epithelzellen in dem Säugetier hat. Solche Zusammensetzungen sollten physiologisch verträglich, vorzugsweise im wesentlichen nicht reizend und im wesentlichen frei von Endotoxinen sein. Auf Wunsch kann die die mitogene Wirkung schaffende Substanz als Feststoff verabreicht werden, der fein verteilt oder zu einer vorteilhaften Form und Größe gepreßt werden kann, z.B. zur Dauerwirkung in der Zitzenzisterne. Bei anderen Ausführungsbeispielen ist es wünschenswert, ein Vehikel zu verwenden, das im wesentlichen bei der Körpertemperatur des Säugetieres flüssig ist, und vorzugsweise auch bei den Umgebungstemperaturen der Infusion. Unabhängig davon, ob die verabreichte Zusammensetzung ein Feststoff oder eine Flüssigkeit ist, so ist es normalerweise vorteilhaft, wenn sie ein Vehikel zur Verstärkung der Diffusion der die mitogene Aktivität vermittelnden Substanz durch die Milchdrüse enthält. In einigen, aber nicht in allen. Fällen ist es vorteilhaft, wenn das Vehikel im wesentlichen wasserlöslich ist. Die vorteilhafteste Art und Menge des Vehikels für die Infusion der die mitogene Aktivität vermittelnden Substanz kann durch Routineversuche bestimmt werden. Zum Beispiel sind 1 bis 10 ml eines flüssigen Vehikels mit einem im physiologischen Bereich liegenden pH-Wert, z. B. eine physiologische Kochsalzlösung, Freund's Incomplete Adjuvant oder ein pflanzliches (z. B. Erdnußoder Sesam-) oder Mineralöl im allgemeinen zufriedenstellend. Emulsionen von zwei oder mehr derartigen Vehikeln sind gewöhnlich von Vorteil. Passende Stabilisierungsmittel, z. B. Mono- und/oder Disaccharide, Zucker und Alkohole oder neutrale Aminosäuren können auf Wunsch eingeschlossen werden.
Die folgenden Beschreibungen spezifischer Ausführungsbeispiele der Erfindung sind nur zur Veranschaulichung gedacht und sollen keinerlei Einschränkungen für den Geltungsbereich der Erfindung bedeuten. Alle Tiere in diesen Beispielen waren physiologisch normal (nach obiger Definition). Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben. Teile und Prozentanteile sind auf die Masse bezogen, außer wenn etwas anderes angegeben wird.
A. Epidermis-Wachstumsfaktoren Beispiele 1 und 2
12 trächtige, nicht-milchgebende, gekreuzte Fleischkühe, innerhalb ihrer letzten 40 bis 80 Tage der Trächtigkeit wurden in einer Frei-Boxen-Einrichtung untergebracht, mit einer Ration von Luzerneheu und pelletisiertem Konzentrat gefüttert und erhielten an den Tagen 1,3,5,7 und 9 dieser Untersuchung eine Verabreichung von 10 ml eines pharamazeutischen Lösungsmittels (Freund's Incomplete Adjuvant, emulgiert mit einem gleichen Volumen von 0,9%iger steriler Kochsalzlösung) in jedes Viertel-Euter durch intramammäre Infusion durch den Strichkanal. Die Infusionen wurden unter Verwendung einer 3,2 Zentimeter langen, annähernd 12 Gauge, stumpfendenden Plaste-Zitzen-infusions-Kanüle vorgenommen, die von Jorgensen Laboratories, Loveland, CO bezogen wurde. Da die vorderen und hinteren Euterhälften nicht die gleiche Größe haben, wurden Vergleiche von Behandlung und Kontrolle zwischen seitlich gegenüberliegenden Vierteln angestellt, d.h. vorne rechts gegen vorne links, und hinten rechts gegen hinten links. Die beiden Viertel in jeder Euterhälfte wurden willkürlich für die Behandlung und deren Kontrolle herangezogen. Bei den Behandlungsinfusionen enthielt das Lösungsmittel 25 Mikrogramm Human-EGF (hEGF), der von G.D.Searle & Co., Ltd. U.K. bezogen wurde (6Tiere), oder Mäuse EGF (mEGF), bezogen von Collaborative Research Corp., Lexington, MA (die anderen 6 Tiere). Der hEGF war von Searle durch Expression von Rekombinat-DNS zubereitet und anschließend durch Filtration auf einem 10 000 MW Filter zur Erzielung einer Reinheit von über 90%, wie durch HPLC bestimmt' wurde, gereinigt worden. Der mEGF hatte Kultur-Qualität, Katalog Nr.40001 von Mäuse-Submaxillar-Drüsen, hergestellt nach der Methode von Savage, u. a., 247 J. Biol. Chem. 7609 (1972) mit einer Reinheit von 98%, bestimmt auf SDS-Polyacrylamidgel. Vor der Behandlung wurden die Zitzen bei jedem Tier an drei aufeinanderfolgenden Tagen durch Eintauchen vorbereitet, und jede Zitze wurde am Behandlungstag mit70%igem Ethanol in Wasser vorgereinigt. Am 14.Tage wurden die Kühe getötet und ihre Milchdrüsen herausgeschnitten. Jedes Euter (wenn erforderlich ausgemolken) wurde enthäutet, längs des mittleren Aufhängebandes zerteilt und dann in vorderes rechtes, vorderes linkes, hinteres rechtes und hinteres linkes Euterviertel geteilt. Jedes Viertel-Euter wurde gemahlen, eine repräsentative Probe von 200g wurde mit ihrem vierfachen Volumen Wasser homogenisiert, und das Gesamthomogenatvolumen jeder Probe wurde gemessen.
Zur Bestimmung der Trockenmasse jedes Viertel-Euters wurden drei 10-ml-Aliquoten eines 1:5 verdünnten Homogenats in vorgewogene Schalten gegeben, über Nacht bei 60° getrocknet und anschließend bis zu einem konstanten Wert getrocknet und gewogen.
Zur Bestimmung der trockenen, fettfreien Gewebemasse jedes Viertel-Euters wurden drei 5-ml-Aliquoten des unverdünnten Homogenats mit Hilfe der Methode von Anderson, 41. J. Anim.Sci. 118 (1975) extrahiert, mit der Ausnahme, daß Proben in vorgewogene 25 χ 150mm Glaszentrifugenröhrchen gegeben und über Nacht mit 10ml Ethanol:Ether (3:1) extrahiert und danach zentrifugiert wurden (5 Minuten mit 500 U/min) und die überstehende Flüssigkeit abgesaugt wurde; eine zusätzliche 10-ml-Aliquote von Ethanol:Ether wurde für eine zweite Extraktion zugesetzt; und die Probe wurde unter Stickstoff getrocknet, bis ein konstanter Wert erzielt war.
Die DNS in jedem Viertel-Euter wurde nach der Methode Burton, 12 B Methods in Enzymol. 163-66 (1968) unter Verwendung einer Nachweislösung von 15%igerTrichloressigsäure (TCA) in 2N HCL bestimmt. Bei diesen Bestimmungen wurden Aliquoten von Drüsenhomogenaten 1:5 mit Wasser verdünnt und erneut homogenisiert. Unter Verwendung von Triplikat-0,25-ml oder 0,5-ml-Aliquoten dieser Homogenate wurde jede Aliquote mft 2 ml der Nachweislösung vermischt. Nach 30 Minuten wurden die Proben 10min lang mit 3000U/min zentrifugiert, und die resultierenden Pellets wurden mit 2ml einer 10%igen Lösung TCA in destilliertem Wasser gewaschen. Nach erneutem Zentrifugieren wurden die resultierenden Pellets in 2 ml 0,5 N Perchlorsäure zerteilt und 30 Minuten lang auf 700C zur Extraktion von DNS erhitzt. Die Proben wurden zentrifugiert, und 1 ml jeder resultierenden überstehenden Flüssigkeit wurde in ein 12 χ 75 mm Röhrchen gegeben. Nach der Zugabe von 2 ml einer Lösung von 1,5g Diphenylamin und 1,5 ml ^SCUin 100ml Eisessig (und 0,1 ml 1,6%igem wäßrigem Acetaldehyd je 20 ml Reagens unmittelbar vor Gebrauch) wurden die Proben gewirbelt und über Nacht bei 27°C inkubiert. Als Standard diente Kalbs-Thymus-DNS.
Πια Crnohnieca einiH in Hon Tahollon 1 imH 9 on+haltpn
Naßmasse Trocken- fettfreie DNS
g masse, g Trocken- [ig
masse, g
| A. | Behandlung, | 389,9 | ·, | 120,0 | 63,2 | 794,5 |
| mittel | ||||||
| B. | Kontrolle, | |||||
| mittel | ||||||
| (nurTräger- | 357,3 | 111,4 | 58,3 | 710 | ||
| mittel) | ||||||
| C. | Mittl. | |||||
| Erhöhung | 32,6 | 8,6 | 4,9 | 84,5 | ||
| (A-B) | ||||||
| D. | Erhöhung % | 9,1 | 7,7 | 8,4 | 11,9 | |
| (A-B)/B | ||||||
| E.· | Durchschn. | |||||
| Erhöhung%/ | 12,9 | 13,1 | 16,1 | 14,8 | ||
| Tier | ||||||
| F. | Signifikanz- | |||||
| Grad von % | 0,01 | 0,09 | 0,16 | 0,06 | ||
| Erhöhung, p< | ||||||
Naßmasse, Trocken- fettfreie DNS,
g masse, g Trocken- pg
masse, g
| A. | Behandlung, | 419,6 | 150,2 | 69,6 | 905,1 |
| mittel | |||||
| B. | Kontrolle, | ||||
| mittel | |||||
| (nurTräger-' | 402,0 | 147,9 | 64,6 | 794,9 | |
| mittel) | |||||
| C. | Mittl. | 17,6 | 2,3 | 5,0 | 110,2 |
| Erhöhung (A-B) | |||||
| D. | Erhöhung % | 4,4 | 1,6 | 7,9 | 13,8 |
| (A-B)/B | |||||
| E. | Durchschn. | 1,8 | 2,1 | 5,2 | 12,0 |
| Erhöhung %/Tier | |||||
| F. | Signifikanz-Grad | 0,22 | 0,40 | 0,19 | 0,05 |
| von % Erhöhung, ρ< | |||||
Wie in den Tabellen 1 und 2 gezeigt wird, waren Viertel-Euter, die eine Infusion von hEGF oder mEGF erhalten hatten, ständig schwerer und enthielten mehr DNS als ihre seitlich-gegenüberliegenden Kontrollviertel, die nur Trägermittel erhalten hatten, und zwar bei allgemein hohen Werten von statistischer Signifikanz.
24 trächtige, nicht-milchgebende gekreuzte Fleischkühe wurden in 4 Behandlungsgruppen zu 6 Tieren je Gruppe eingeteilt. Die Wirkungen der intramammären Infusion von Human-EGF auf Viertel-Eutern bei diesen Tieren wurden nach der Beschreibung von Beispiel 1 bestimmt, mit der Ausnahme, daß (A) als Trägermittel die Freundsche Emulsion für die Gruppe 1 und eine Emulsion, die 60 Teile Sesamöl und 40 Teile 0,9%iger steriler Kochsalzlösung in injizierbarer Qualität mit einem Anteil von 0,5% Tween-20 enthielt, für die Gruppen 2,3 und 4 verwendet wurden, und (B) die in jeder Behandlungsinfusion enthaltenen hEGF-Mengen 25 Mikrogramm bei den Gruppen 1 und 2,2,5 Mikrogramm bei für Gruppe 3 und 250 Mikrogramm für Gruppe 4 betrugen. Die DNS-Bestimmungen wurden wie in den Beispielen 1 und 2 ausgeführt, mit der Ausnahme, daß die anfänglichen Triplikat-0,5-ml-Aliquotenvon Homogenat mit 2ml Ethanol:Ether (3:1)1 Stunde lang homogenisiert, 15min lang mit 3000U/min zentrifugiert, mit 2 ml 70 %igem Ethanol 10min lang gewaschen, 15 min lang mit 3 000 U/min zentrifugiert wurden und von ihnen das Ethanol vor dem Vermischen jeder Aliquote mit der TCA-Lösung abgesaugt wurde. Die Ergebnisse der Gruppen 1 bis 4 sind jeweils in den Tabellen 3 bis 6 enthalten.
Wirkungen von intramammärer Infusion von insgesamt 125 Mikrogranim hEGF in Freundscher Emulsion auf Viertel-Euter bei trächtigen Fleischkühen (Gruppe 1)
| Behandlung, | Naßmasse, | Trocken | fettfreie | DNS, | |
| mittel | g | masse, g | Trocken | ||
| Kontrolle, mittel | masse^ | ||||
| A. | (nur Trägermittel) | ||||
| Mittl. Erhöhung | 364,9 | 107,2 | 60,3 | 723,0 | |
| B. | (A-B) | ||||
| Erhöhung % | 349,5 | 101,0 | 56,8 | 629,0 | |
| C. | (A-B)/B | ||||
| Durchschn. Erhöhung | 15,4 | 6,2 | 3,5 | 94,0 | |
| D. | %/Tier | ||||
| Signifikanz-Grad | 4,4 | 6,1 | 6,2 | 14,9 | |
| E. | von% Erhöhung, ρ <' | ||||
| 8,1 | 10,3 | 8,3 | 23,0 | ||
| F. | |||||
| 0,15 | 0,11 | 0,13 | 0,18 | ||
Wirkungen von intramammärer Infusion von insgesamt 125 Mikrogramm hEGF'in Sesamemuision auf Viertel-Euter bei trächtigen Fleischkühen (Gruppe 2)
| Behandlung, | Naßmasse, | Trocken | fettfreie | DNS, | |
| mittel | g | masse, g | Trocken | MS | |
| Kontrolle, mittel | masse^ | ||||
| A. | (nurTrägermittel) | ||||
| Mittl. Erhöhung | 370,2 | 122,1. | 71,0 | 995,0 | |
| B. | (A-B) | ||||
| Erhöhung % | 356,2 | 111,1 | 68,8 | 703,0 | |
| C. | (A-B)/B | ||||
| Durchschn. Erhöhung | 14,0 | 11,0 | 2,2 | 292,0 | |
| D. | %/Tier | ||||
| Signifikanz-Grad | 3,9 | 9,9 | 3,2 | 41,5 | |
| E. | von% Erhöhung, ρ < | ||||
| 10,4 | 20,2 | 15,9 | 70,0 —- | ||
| F. | |||||
| 0,2 | 0,02 | 0,3 | 0,09 | ||
Wirkungen von intramammärer Infusion von insgesamt 12,5 Mikrogramm hEGF in Sesamemulsion auf Viertel-Euter bei trächtigen Fleischkühen (Gruppe 3)
| * | Behandlung, | Naßmasse, | Trocken | fettfreie | DNS, | |
| mittel | g | masse, g | Trocken | pg ' | ||
| Kontrolle, mittel | masse, g | |||||
| A. | (nurTrägermittel) | |||||
| Mittl. Erhöhung | 397,8 | 132,4 | 79,4 | 867,7 | ||
| B. | (A-B) | |||||
| Erhöhung % | 400,0 | 127,0 | 72,7 | 896,6 | ||
| C. | (A-B)/B | |||||
| Durchschn. Erhöhung | (2,2) | 5,4 | 6,7 | (29,0) | ||
| D. | %/Tier | |||||
| Signifikanz-Grad | (0,5) | 4,2 | 9,2 | (3,3) | ||
| E. | von % Erhöhung, ρ < | |||||
| 0,6 | 7,8 | 16,3 | (2,2) | |||
| F. | ||||||
| — | 0,17 | 0,1 | — | |||
Wirkungen von intramammärer Infusion von insgesamt 1,25 Milligramm hEGF in Sesamemulsion auf Viertel-Euter bei trächtigen Fleischkühen (Gruppe 4)
| Behandlung, | Naßmasse, | Trocken | fettfreie | DNS, | |
| mittel | g | masse, g | Trocken | ||
| Kontrolle, mittel | masse, g | ||||
| A. | (nurTrägermittel) | ||||
| Mittl. Erhöhung | 391,9 | 131,5 | 81,7 | 733,2 | |
| B. | (A-B) | ||||
| Erhöhung % | 360,2 | 117,9 | 75,1 | 729,2 | |
| C. | (A-B)/B | ||||
| Durchschn. Erhöhung | 31,7 | 13,6 | 6,6 | 4,0 | |
| D. | %/Tier | ||||
| Signifikanz-Grad | 8,8 | 11,6 | 8,8 | 0,5 | |
| E. | von % Erhöhung, ρ < | ||||
| 9,9 | 12,2 | 11,9 | 1,6 | ||
| F. | |||||
| 0,001 | 0,004 | 0,03 | — | ||
Wie aus den Tabellen 3 bis 6 hervorgeht, waren mit hEGF behandelte Viertel-Euter im allgemeinen wesentlich schwerer, und sie enthielten mehr DNS als die ihnen seitlich-gegenüberliegenden Viertel, die nur Lösungsmittel erhalten hatten.
Beispiele 7 und 8
24 trächtige, nicht-milchgebende, gekreuzte Fleischkühe wurden wahllos in 3 Behandlungsgruppen von 8 Tieren je Gruppe eingeteilt. Die Wirkungen von intramammärer Infusion von Human-EGFauf Viertel-Euter wurden bei diesen Tieren nach der Beschreibung in den Beispielen 1 und 2 bestimmt, mit der Ausnahme, daß die in jeder Behandlungsinfusion enthaltenen Mengen von hEGF 25 Mikrogramm bei Gruppe 1; 250 Mikrogramm bei Gruppe 2 und 2,5 Mikrogramm bei Gruppe 3 betrugen. Die Drüsenmassen und die DNS wurden wie in den Beispielen 1 und 2 bestimmt. Die mit der geringen Dosis bei Gruppe 3 erzielten Ergebnisse waren durch Anschwellen einiger Drüsen nicht deutlich. Die Ergebnisse von den Gruppen 1 und 2 sind in Tabelle 7 bzw. 8 enthalten.
Wirkungen von intramammärer Infusion von insgesamt 125 Mikrogramm hEGF auf Viertel-Euter bei trächtigen Fleischkühen (Gruppe 1)
| Behandlung, | Naßmasse, | Trocken | fettfreie | DNS, | |
| mittel | g | masse^ | Trocken | μg | |
| Kontrolle, mittel | masse, g | ||||
| A. | (nurTrägermittel) | ||||
| Mittl. Erhöhung | 363,0 | 113,0 | 52,8 | 396,9 | |
| B. | (A-B) | ||||
| Erhöhung % | 358,0 | 109,7 | 50,7 | 358,9 | |
| C. | (A-B)/B | ||||
| Signifikanz-Grad | 5,0 | 3,3 | 2,1 | 38,0 | |
| D. | von % Erhöhung, ρ < | ||||
| Tabelle 8 | 1,5 | 3,0 | 4,1 | 10,6 | |
| E. | |||||
| 0,34 | 0,21 | 0,16 | 0,12 | ||
Wirkungen von intramammärer Infusion von insgesamt 1,25 Milligramm hEGF auf Viertel-Euter bei trächtigen Fleischkühen (Gruppe 2)
Naßmasse, Trocken- fettfreie DNS,
g masse, g Trocken- pg
masse, g
| A. | Behandlung, | 392,5 | 122,0 | 63,8 | 344,0 |
| mittel | |||||
| B. | Kontrolle, mittel | 388,2 | 115,7 | 61,4 | 384,0 ' |
| (nurTrägermittel) | |||||
| C. | Mittl. Erhöhung | 4,3 | 6,3 | 2,4 | (40,0) |
| (A-B) | |||||
| D. | Erhöhung % | 1,1 | 5,3 | 3,9 | (10,4) |
| (A-B)/B | |||||
| E. | Signifikanz-Grad | 0,4 | 0,12 | 0,26 | — |
| von % Erhöhung, ρ < | |||||
Wie aus den Tabellen 7 und 8 hervorgeht, waren mit hEGF behandelte Viertel-Euter schwerer als die ihnen seitlich gegenüberliegenden Viertel-Euter, die nur Trägermittel erhalten hatten.
B. Insulinartige Wachstumsfaktoren Beispiele 9 bis 11
24 trächtige, nicht-milchgebende, gekreuzte Fleischkühe innerhalb ihrer letzten 40 bis 80 Tage der Trächtigkeit wurden in einer Frei-Boxen-Einrichtung untergebracht, mit einer Ration von Luzerneheu und pelletisiertem Konzentrat gefüttert und erhielten 10ml eines pharmazeutischen Lösungsmittels (eine Sesamöl-Emulsion der in den Beispielen 4 bis 6 verwendeten Art) in jedes Viertel-Euter mit Hilfe von intrammamärer Infusion durch den Strichkanal an den Tagen 1,3, 5,7 und 9 der Untersuchung. Die wahllos für Viertel-Euter angewandte Infusionstechnik zur Behandlung als Kontrolle und die Vergleiche zwischen Behandlung und Kontrolle waren wie in den Beispielen 1 und 2. Bei den Behandlungsinfusionen enthielt das Lösungsmittel insulinartigen Rinder-Wachstumsfaktor-I (blGF-l), hergestellt durch Expression in E. coli (PrIa Stamm 079) von Rekombinant-DNS, diefür blGF-l codiert, das an die „lam" B Zellwandprotein-Signalsequenz angefügt ist, Sekretion in den periplasmischen E. coli Raum und Rückgewinnung/Reinigung mit Hilfe herkömmlicher Techniken wie Gelfiltration, Kationenaustausch und Umkehrphasen-HPLC.
Dieser blGF-l hatte die gleiche Aminosäuresequenz und Sekundärstruktur wie der in Beispiel 13 verwendete AMgen Human IGF-I. Bei Standard L6-Myoblast-Nachweisen war seine Aktivität im wesentlichen die gleiche (90 bis 123%) wie die von hlGF-l von Beispiel 13. Die Mengen von blGF-l in jeder Infusion betrugen: Gruppe 1 —2,5 Mikrogramm; Gruppe 2 — 25 Mikrogramm; Gruppe 3—250 Mikrogramm. Die Tiere wurden vorbereitet und erhielten die Infusion, und die Massen ihrer Viertel-Euter und die DNS wurden wie in den Beispielen 3 bis 6 bestimmt. Die Ergebnisse der Gruppe 1 sind in Tabelle 9 enthalten.
Wirkungen von intramammärer Influsion von insgesamt 12,5 Mikrogramm blGF-l auf Viertel-Euter bei trächtigen Fleischkühen (Gruppe 1)
| Behandlung, | Naßmasse, | Trocken | fettfreie | DNS, | |
| mittel | g | masse^ | Trocken | ||
| Kontrolle, mittel | masse^ | ||||
| A. | (nurTrägermittel) | ||||
| Mittl. Erhöhung | 408,4 | 111,7 | 54,9 | 1307 | |
| B. | (A-B) | ||||
| Erhöhung % | 369,0 | 102,7 | 48,0 | 1219 | |
| C. | (A-B)/B | ||||
| Durchschn. Erhöhung | 39,4 | 9,0 | 6,9 | 88 | |
| D. | %/Tier | ||||
| Signifikanz-Grad | 10,7 | 8,7 | 14,2 | 7,2 | |
| E. | von % Erhöhung, ρ < | ||||
| 11,0 | 8,8 | 16,0 | 12,5 | ||
| F. | |||||
| 0,01 | 0,003 | 0,03 | 0,2 | ||
Bei dieser Untersuchung war durch die beiden höheren Dosismengen von biGF-l (Gruppen 2 Und 3) kein ständig verstärktes Wachstum von Behandlungs-Vierteln gegenüber Kontrollvierteln zu verzeichnen. Dagegen war ein erhebliches Wachstum der Viertel, die keine Infusion erhalten hatten, zu verzeichnen. Wenn die für die Gruppen 1 bis 3 beschriebenen Verfahrensweisen wiederholt wurden, waren die Ergebnisse im wesentlichen die gleichen. Aus der Zusammenfassung der Ergebnisse von der Originaluntersuchung und ihrer Wiederholung wurde ermittelt, daß die Behandlungs-und die Kontroll-Viertel-Euter wie folgt gewachsen waren:
| Tabelle 10 | * | hoch gegen mittel | Kontrollen | Behandlung | kombiniert |
| Dosis | +27%, | +23,1 %, | +25% | ||
| mittel gegen gering | hoch gegen gering | ρ < 0,08 | ρ < 0,12 | ||
| +34,4%, | +31,5%, | +33% | |||
| ρ < 0,08 | ρ < 0,09 | ||||
| +71,3%, | +62%, | +67 % | |||
| ρ < 0,007 " | ρ < 0,01 | ||||
Die obigen Steigerungen des Wachstums der Kontroll-Viertel-Euter erfolgten sogar dann, wenn die Plasmamengen von blGF-l während der Untersuchung nicht wesentlich zunahmen. Die Ergebnisse waren im wesentlichen die gleichen, wenn diese Versuche unter Verwendung anderer trächtiger, nichtmilchgebender Fleischkühe wiederholt wurden, die auf der Grundlage von annähernd gleichen Eutervolumen zu Beginn in Gruppen eingeteilt wurden, um diese Variableso weit wie möglich aus den Versuchsergebnissen auszuschalten. v
Wenn Milch- oder Fleischfärsen oder trächtige Kühe eine Infusion nach der Verfahrensweise in den Beispielen 9 bis 11 von insgesamt 125 Mikrogramm bis 12,5 Milligramm von insulinartigem Rinder-Wachstumsfaktor-Il erhielten, der im wesentlichen frei von allen anderen Rinderpeptiden gereinigt worden war, wie in Beispiel 1 der US-PA 888.996, eingereicht am 31.JuIi 1986, und entsprechend der EP-PA 86870128.5 beschrieben wird, die beide unter Bezugnahme hier herangezogen werden, waren die Ergebnisse im wesentlichen die gleichen wie in den Beispielen 9 bis 11, d. h. erhebliche Zunahmen bei den Massen und der DNS von behandelten Viertel-Eutern.
C. Kombinationen von lGF'n und EGF'n Beispiel 13
30 Schafe (Misch-Kreuzungen) innerhalb ihrer letzten 35 bis 45 Tage der Trächtigkeit wurden mit einer Ration von Luzerneheu und Schaffutter gefüttert und erhielten 2,5ml eines pharmazeutischen Lösungsmittels (eine Freundsche Emulsion der in den Beispielen 1 und 2 verwendeten Art für 15 Schafe; physiologische (0,9%ige) Kochsalzlösung für die anderen 15) in jedes Halb-Euter mit Hilfe von intramammärer Infusion durch den Strichkanal an den Tagen 1, 3, 5,7 und 9 dieser Untersuchung. Die Infusionen wurden unter Verwendung einer 3,2cm langen, 16 Gauge, stumpfendenden Teflon-Scheide von einer A-Katheder-Kanüle von C. R. Bard, Inc. für das Einsetzen von Dauerkathetern vorgenommen. Euterhälften wurden willkürlich bei jedem Tier für die Behandlung bestimmt, bei der das Lösungsmittel zusätzlich 2,5 Mikrogramm Mäuse-EGF der in den Beispielen 1 und 2 verwendeten Art und 2,5 Mikrogramm Human-IGF-I enthielt, das durch Expression von Rekombinant DNS hergestellt und von AMgen Biological Corp., Thousand Oaks, CA bezogen wurde (Katalog-Nr. 04111, Posten 407; mit einer über 90% liegenden Reinheit, wie durch HPLC bestimmt). Die andere Euterhälfte in jedem Tier wurde zur Kontrolle bestimmt, bei der nur eine Infusion mit dem pharmazeutischen Lösungsmittel erfolgte. Vor der Behandlung erhielten die Zitzen an sieben aufeinanderfolgenden Tagen eine Tauchbehandlung, und jede Zitze wurde mit 70%igem Ethanol in Wasser am Behandlungstag vorgereinigt. Am 13.Tag wurden die Schafe getötet und ihre Milchdrüsen herausgeschnitten. Jedes Euter (wenn erforderlich ausgemolken) wurde enthäutet und entlang des mittleren Aufhängeligaments in rechte und linke Euterhälften zerteilt. Jedes Halb-Euter wurde mit Wasser in der vierfachen Menge seiner Masse homogenisiert, und das Gesamthomogenatvolumen wurde jeweils gemessen.
Zur Bestimmung der Trockenmasse jedes Halb-Euters wurden drei 10-ml-Aliquoten eines 1:5 verdünnten Homogenats in vorgewogene Schalen gegeben, über Nacht bei 600C getrocknet und anschließend bis zu einem konstanten Wert getrocknet und gewogen.
Zur Bestimmung der Trockenmassen von fettfreiem Gewebe jedes Halb-Euters wurden drei 5-ml-Aliquoten des unverdünnten Homogenats nach der Methode von Anderson, 41 J. Anim. Sei. 118 (1975) extrahiert, mit dem Unterschied, daß die Proben in vorgewogene Glaszentrifugenröhrchen von 25 χ 150mm gegeben und über Nacht mit 10ml Ethanol:Ether (3:1) extrahiert und anschließend zentrifugiert wurden (5 min mit 500 U/min) und die überstehende Flüssigkeit abgesaugt wurde; eine zusätzliche 10-ml-Aliquote von EthanohEther für eine zweite Extraktion zugegeben wurde; und die Probe unter Stickstoff bis zu einem konstanten Wert getrocknet und gewogen wurde.
Die DNS in jedem Halb-Euter wurde nach der Methode von Burton, Biochemistry 62315 (1956) unter Verwendung einer Nachweislösung von 15%igerTrichloressigsäure (TCA) in 2 N HCI bestimmt. Bei diesen Bestimmungen wurden Aliquoten von Drüsenhomogenat aufgetaut, mit Wasser 1:5 verdünnt und erneut homogenisiert. Unter Verwendung von Triplikat-0,5-ml-Aliquoten dieser Homogenate wurde jede Aliquote mit 2 ml dieser Nachweislösung vermischt. Nach 30 Minuten wurden die Proben 10min lang mit 3000 U/min zentrifugiert, und die resultierenden Pellets wurden mit 2 ml einer 10%igen Lösung von TCA in destilliertem Wasser gewaschen. Nach erneutem Zentrifugieren wurden die resultierenden Pellets in 2 ml 0,5 N Perchlorsäure zerstört und 30 min lang auf 700C zur Extraktion von DNS gehalten. Die Proben wurden zentrifugiert, und 1 ml jeder resultierenden überstehenden Flüssigkeit wurde in ein 12 χ 75mm-Röhrchen gefüllt. Nach der Zugabe von 2 ml einer Lösung von 1,5g Diphenylaminund 1,5 ml H2SO4 in 100 ml Eisessig (und 0,1 ml 1,6%igem wäßrigem Acetaldehyd je 20 ml Reagens unmittelbar vor Gebrauch) wurden die Proben gewirbelt und über Nacht bei 200C inkubiert. Kalbsthymus-DNS diente als Standard. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 enthalten.
Wirkungen von intramammärer Influsion einer Kombination von mEGF und hlGF-l auf Halb-Euter von trächtigen Schafen
| Behandlung, | Naßmasse, | Trocken | fettfreie | DNS, | |
| mittel | g | masse^ | Trocken | ||
| Kontrolle, mittel | masse^ | ||||
| A. | (nurTrägermittel) | ||||
| Mittl. Zunahme | 277,3 | 73,6 | 75,2 | 1021,2 | |
| B. | (A-B) | ||||
| %Zunahme | 264,7 | 66,2 | 56,4 | 849,2 | |
| C. | (A-B)/B | ||||
| Sign. Grad der | 12,5 | 7,4 | 18,8 | 171,7 | |
| D. | Zunahme, ρ < | ||||
| 4,7 | 11,0 | 33,0 | 20,2 | ||
| E. | |||||
| 0,016 | 0,03 | 0,001 | 0,002 | ||
Die Angaben in Tabelle 11 zeigen, daß DNS, Naß-, Trocken- und fettfreie Trockenmassen der erfindungsgemäß behandelten Halb-Euter im Verhältnis zu den unbehandelten Halb-Eutern der gleichen Tiere wesentlich erhöht waren, und zwar bei außergewöhnlich hohen Graden statistischer Signifikanz.
8 etwa 18 Monate alte nicht-tragende Holstein-Färsen wurden hinsichtlich der Wirkungen intramammärer Infusion einer Kombination von Rinder-IGF-I und Human-EGF nach den in den Beispielen 9 bis 11 angewandten Verfahrensweisen getestet, mit den Unterschieden, daß (A) das Volumen von pharmazeutischem Lösungsmittel in jeder Infusion 2,5ml betrug, und (B) jede Behandlungsinflusion6,25 Mikrogramm blGF-l und 625 Mikrogramm hEGFder in denen Beispielen 9 bis 11, bzw. 1 und 2 verwendeten Arten enthielt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 enthalten.
Wirkungen von intramammärer Infusion einer Kombination von hEGF und blGF-l auf Viertel-Euter bei Holstein-Färsen
Naßmasse, Trocken- fettfreie
g masse, g Trockenmasse, g
Die Angaben in Tabelle 12 zeigen, daß die Naß-, Trocken- und fettfreien Trockenmassen von Viertel-Eutern bei erfindungsgemäß behandelten Holstein-Färsen wesentlich höher lagen als die ihrer seitlich gegenüberliegenden Viertel-Euter, die nur pharmazeutisches Lösungsmittel erhielten, und zwar bei hohen Graden statistischer Signifikanz.
Die Wirkungen von intramammärer Infusion einer Kombination von Rinder-IGF-I und Human-EGF bei 8 trächtigen, nichtmilchgebenden, gekreuzten Fleischkühen innerhalb ihrer letzten 40 bis 80 Tage der Trächtigkeit wurden mit Hilfe der in den Beispielen 9 bis 11 beschriebenen Verfahrensweisen bestimmt. Jede Behandlungsinfusion enthielt 25 Mikrogramm hEGFder in den Beispielen 1 und 2 verwendeten Art und 250 Mikrogramm blGF-l der in den Beispielen 9 bis 11 verwendeten Art. Die Ergebnisse werden in Tabelle 13 wiedergegeben.
Wirkungen von intramammärer Infusion einer Kombination von blGF-l (insgesamt 1,25 Milligramm) und hEGF (insgesamt 125 Mikrogramm) auf Viertel-Euter bei trächtigem Fleischvieh
| Behandlung, | 205,1 | 93,2 | 10,7 |
| mittel | |||
| Kontrolle, mittel | 188,2 | 89,0 | 9,5 |
| (nur Lösungsmittel) | |||
| Mittl. Zunahme | 16,9 | 4,2 | 1,2 |
| (A-B) | |||
| %-Zunahme | 8,9 | 4,7 | 12,1 |
| (A-B/B) | |||
| Durchschn..% | 11,3 | 7,7 | 18,8 |
| Zunahme/Tier | |||
| Sign. Grad der | 0,06 | 0,2 | 0,09 |
| Zunahme, ρ < | |||
| Behandlung, | Naßmasse, | Trocken-' | fettfreie | DNS, | |
| mittel | g | masse, g | Trocken | ||
| kontrolle, mittel | masse^ | ||||
| A.- | (nur Lösungsmittel) | ||||
| Mittl. Zunahme | 496,1 | 156,4 | 72,0 | 1392 | |
| B. | (A-B) | ||||
| % Zunahme | 474,0 | 144,0 | 60,7 | 1243 | |
| C. | (A-B/B) | ||||
| Durchschn.% | 22,1 | 12,4 | ΐΐ,'3 | 149 | |
| D. | Zunahme/Tier | ||||
| Sign. Grad der | 4,7 | 8,6 | 18,7 | 12,0 | |
| E. | Zunahme, ρ < | ||||
| 8,2 | 13,0 | 11,0 | 12,0 | ||
| F. | |||||
| 0,1 | 0,03 | 0,08 | 0,15 | ||
Wie aus Tabelle 13 hervorgeht, waren Viertel-Euter, die die Kombination von biGF-l und hEGF erhielten, ständig schwerer und enthielten mehr DNS als die ihnen seitlich gegenüberliegenden Kontroll-Viertel, und zwar bei hohen Graden statistischer Signifikanz.
D. Somatropine Beispiele 16 und 17
24 trächtige, nicht-milchgebende,.gekreuzte Fleischkühe in ihren letzten 40 bis 80 Tagen der Trächtigkeit wurden in 2 Gruppen eingeteilt und hinsichtlich der Wirkungen von intramammärer Infusion unter Anwendung der Verfahrensweisen der Beispiele 3 bis 6 getestet, mit dem Unterschied, daß (A) das Volumen des pharmazeutischen Lösungsmittels in jeder Infusion 5 ml betrug und (B) jede Behandlungsinfusion 1% Zinksalz eines N-Methionyl-Rinder-Somatropins (BST) (Gruppe 1 —100 mg, Gruppe 2 — 40mg) enthielt, das durch Expression von Rekombinant-DNS hergestellt und im wesentlichen nach der Beschreibung in Beispiel 1A von US-PA 787.473, eingereicht am 16. Oktober 1985, basierend auf EP-PA 177.478, gereinigt wurde. Die Ergebnisse enthalten dieTabellen 14 und 15.
-11- Z58 943
Wirkungen von intramammärer Infusion von insgesamt 500 Milligramm BST auf Viertel-Euter bei trächtigen Fleischkühen (Gruppe 1)
| Behandlung, | Naßmasse, | Trocken | fettfreie | DNS | |
| mittel | g | masse, g | Trocken | ||
| Kontrolle, mittel | masse, g | ||||
| A. | (nur Lösungsmittel) | ||||
| Mittl. Zunahme | 790,1 | 207,6 | "146,7 | 2185 | |
| B. | (A-B) | ||||
| % Zunahme | 736,6 | 190,6 | 141,5 | 2054 | |
| C. | (A-B/B) | ||||
| Durchschn.% | 53,5 | 17,0 | 5,2 | 131 | |
| D. | Zunahme/Tier | ||||
| Sign. Grad der | 7,3 | 8,9 | 3,6 | 6,4 | |
| E. | Zunahme, ρ < | ||||
| 9,8 | 10,7 | 7,9 | 10,5 | ||
| F. | |||||
| 0,004 | 0,03 | 0,18 | 0,3 | ||
Wirkungen von intramammärer Infusion von insgesamt 200 Milligramm BST auf Viertel-Euter bei trächtigen Fleischkühen (Gruppe 2)
| Behandlung, | Naßmasse, | Trocken | fettfreie | DNS, | |
| mittel | g | masse^ | Trocken | M9 | |
| Kontrolle, mittel | masse, g | ||||
| A. | (nur Lösungsmittel) | ||||
| Mittl. Zunahme | 396,9 | 96,4 | 49,5 | 1 371 | |
| B. | (A-B) | ||||
| % Zunahme | 345,4 . | 85,1 | 44,8 | 1299 | |
| C. | (A-B/B) | ||||
| Durchschn.% | 51,5 | 11,3 | 4,7 | 72 - | |
| D. | Zunahme/Tier | ||||
| Sign. Grad der | 14,9 | 13,3 | 10,5 | 5,5 | |
| E. | Zunahme, ρ < | ||||
| 13,4 | 10,7 | 7,8 | 15,8 | ||
| F. | |||||
| 0,007 | 0,06 | 0,06 | 0,1 | ||
Die Angaben in den Tabellen 14 und 15 zeigen, daß die Zunahmen bei der DNS und den Naß-, Trocken- und fettfreien Trockenmassen von erfingungsgemäß behandelten Viertel-Eutern trächtiger Fleischkühe erheblich größer waren als die der ihnen seitlich gegenüberliegenden Viertel-Euter, die nur pharmazeutisches Lösungsmittel erhalten hatten, und daß die Unterschiede zwischen den Behandlungs- und Kontrollzunahmen hohe Grade statischer Signifikanz zeigen.
E. Transformations-Wachstumsfaktoren Beispiele 18 bis 21
Wenn Milch- oder Fleischfärsen oderträchtige Kühe eine Infusion unter Anwendung der Verfahrensweisen und Dosierungen der Beispiele 3 bis 6 mit Human-Transformations-Wachstumsfaktor des Alpha-Typs von Bachern Inc. Fine Chemicals, Torrance, CA (Katalog-Nr. PGRO-30) erhalten, sind die ERgebnisse im wesentlichen die gleichen, d. H. erhebliche und statistisch signifikante Zunahmen der Massen und der DNS bei den behandelten Viertel-Eutern.
F.Insulin Beispiele 22 bis 24
Wenn Milch-oder Fleischfärsen oder trächtige Fleisch-oder Milchkühenach den Verfahrensweisen der Beispiele 3 bis 6 eine Infusion von 25,100 oder 250mg Rinder-Pankreas-Insulin von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO (Katalog-Nr. I-5500; 24IU/mg) je Infusion erhielten, waren die Ergebnisse ähnlich, d. h. erhebliche und statistisch signifikante Zunahmen bei den Massen und der DNS der behandelten Viertel-Euter.
G. Piacentale Lactogene Beispiele 25 bis 27
Wenn Milch-oder Fleischfärsen oder trächtige Fleisch-oder Milchkühe nach den Verfahrensweisen der Beispiele 3 bis 6 eine Infusion von insgesamt 0,25,' 10 oder 250 Milligramm von natürlichem Rinder-Placenta-Lactogen, gereinigt nach der Methode von Byatt, 119 Endocrin. 1343-50 (1986) erhielten, waren die Ergebnisse sehr ähnlich, d. h. erhebliche und statistisch signifikante Zunahmen in den Massen und der DNS der behandelten Viertel-Euter.
Wenn auch der biologische Mechanismus der Erfindung noch nicht vollkommen klar ist, so wird doch deutlich, daß er in Übereinstimmung mit herkömmlich anerkannten Kriterien angewandt werden kann, um Vergrößerungen des Milchdrüsenparenchyms und daher der Milchproduktionskapazität bei behandelten Tieren zu ermöglichen, die während der nächsten Milchbildungsperiode und in vielen Fällen während mehrerer nachfolgender Milchbildungsperioden anhalten werden.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, die zur intramammären Infusion an einem Säugetier zur Verstärkung des Wachstums von Milchdrüsenparenchym bei dem Säugetier vorgesehen sind, dadurch gekennzeichnet, daß eine Substanz mit mitogener Wirkung auf die Milchdrüsen-Epithelzellen in dem Säugetier mit einem Vehikel kombiniert wird, das die piffusion der Substanz durch die die Infusion erhaltene Milchdrüse des Säugetiers fördert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Vehikel im wesentlichen wasserlöslich und im wesentlichen bei der Körpertemperatur des Säugetiers flüssig ist.
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, die zur intramammären Infusion an einem Säugetier zur Verstärkung des Wachstums von Milchdrüsenparenchym bei dem Säugetier vorgesehen sind.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Die Milcherzeugung ist bei einem Säugetier unweigerlich durch die Menge von milcherzeugendem Parenchym (sekretorischem Gewebe) in der Milchdrüse begrenzt. Vergleiche der Milchabgabe mit der gesamten Naßmasse, Trockenmasse und fettfreien Trockenmasse des Parenchyms und der gesamten Drüsen-DNS haben hohe Korrelationswerte ergeben. In 43 Proc. N.Z. Soc. Anim. Prod. 71 (1983) haben Davis, u.a., die erhöhte Milchproduktion bei genetisch hochwertigen Tieren ausschließlich dem vergrößerten Eutervolumen zugeschrieben, das auch mit der Menge der Parenchymzellen im Verhältnis steht. Der klassische Nachweis ergibt, daß das Wachstum von Milchdrüsen-Parenchym durch Hypophysen-, ovariale, adrenale und placentale Faktoren bestimmt wird. Siehe Cowie, 15 Monographs on Endocrinology (1980) und US-PS 4.521.409, worin beschrieben wird, daß das Wachstum von Milchdrüsenparenchym bei einem Wiederkäuer durch die Verabreichung eines Wachstumshormons (Somatropin) in die Blutbahn des Wiederkäuers etwa zwischen dem Beginn der Geschlechtsreife und etwa der ersten Abkalbung (vorzugsweise etwa der ersten Konzeption) erhöht werden kann. Bei der Verabreichung in die Blutbahn des Tieres binden sich die meisten Mitogenefür Milchdrüsen-Parenchymzellen zusätzlich an Rezeptoren in vielen anderen Geweben des Tieres. Infolge einer solchen Abschwächung der vorgesehenen Wirkung auf die das Milchdrüsenwachstum stimulierenden Rezeptoren, nimmt man an, daß die Vergrößerung von Milchdrüsenparenchym durch die Verabreichung in die Blutbahn möglicherweise verhältnismäßig große Mengen solcher Mitogene erforderlich macht. Es besteht daher ein großer Anreiz für die Entwicklung einer praktischen Technik zur Erhöhung der Milcherzeugungskapazität und/oder der Leistungsfähigkeit eines Säugetieres, die nicht von einer Verabreichung in die Blutbahn des Säugetieres abhängig ist.
Unter Verwendung von physiologisch anormalen Kaninchen, Mäusen und Ratten, d. h. die zur Induzierung von Pseudoträchtigkeit ovariektomiert und/oder vorbehandelt waren (z. B. mit einem Geschlechtshormon) sind Untersuchungen gemacht worden, um die durch subkutane Injektion eines Somatropins und/oder anderer Hormone, Implantate, die Choleratoxin freisetzen, oder intraduktale Injektion von „laktogenem (milchabsonderndem) Hormon" erzielten Auswirkungen auf die Miichdrüsenentwicklung zu ermitteln. Lyone, u.a., 50 Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 308—11 (1942) und 14 Recent Prog. Hormone Res. 219-54 (1958); Fiddler, u.a., 49 J. Endocrin. 459-69 (1971); Daniel, u.a., 224 Sei 1 245-47 (1984); und Silberstein, u.a., 81 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 4950-54 (1984). Andere Wissenschaftler haben die in vitro Wirkungen von Mitogenen, wie eines epidermalen Wachstumfaktors, mit oder ohne Insulin, auf das Wachstum gezüchteter Milchdrüsenzellen von verschiedenen Tierarten untersucht. Imagawa, u.s.,79 Proc. Natl. Acad. Sei. USA4074-77 (1982); Taketani, u.a. 113(3) Endocrin. 871 (1983) und 80 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2647-50 (1983); Tonelli, u.a., 285 Nature 250-52 (1980); und Turkington, 57 Exper. Cell Res. 79-85 (1969). Die in diesem Abschnitt zitierten Veröffentlichungen sind unter Bezugnahme einbezogen.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen zur intramammären Infusion an einem Säugetier bereitzustellen, mit denen eine Verstärkung des Wachstums von Milchdrüsenparenchym erreicht werden kann.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Es wurde entdeckt, daß dieses Ziel bei physiologisch normalen Säugetieren durch intramammäre Infusion einer Substanz, die eine mitogene Wirkung auf Milchdrüsen-Epithelzellen in diesem Säugetier hat, erreicht werden können. Überraschenderweise kann eine erhebliche Steigerung von normalem Parenchym-Wachstum durch diese Methode erzielt werden, die keine Verabreichung in die Blutbahn des Tieres, subkutane Injektion oder Implantation erforderlich macht, sondern bei der stattdessen eine herkömmliche Verabreichungstechnik einer Art angewandt wird, wie sie im Falle der meisten Milchkühe und einiger anderer Säugetiere routinemäßig für die Infusion von Antibiotika ausgeführt wird. Durch die Erfindung kann eine erhebliche Steigerung des Parenchym-Wachstums über das normalerweise zu beobachtende hinaus erzielt werden, wobei nur sehr geringe Mengen solcher Substanzen angewandt werden, und in verhältnismäßig kurzen Zeiträumen.
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