DD259209A1 - Anordnung zur beschleunigung von objektdetektionen - Google Patents
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Abstract
Das "Verfahren zur Ermittlung und Charakterisierung von Kombinationswirkungen von Substanzgemischen" dient der Effektivierung der Pflanzenschutzmittelforschung. Es verfolgt das Ziel, ueber eine minimierte Testhierarchie und minimierte Auswertungsverfahren der Analyseergebnisse, die teils substanzinitiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften, der Ionenumsaetze und gegebenenfalls der Gaswechselumsaetze einzelliger Algensuspensionen in moeglichst einem Arbeitsgang zu analysieren und durch vergleichende Betrachtungen der Wirkquantitaeten von Substanzgemischen und der reinen Komponenten synergistische Effekte quantitativ zu bestimmen. Durch vergleichende Betrachtungen beispielsweise relativierter Wirkbilder der Substanzgemische und der einzelnen Komponenten, in denen die Wachstums- und/oder Hemmparameter untereinander als Wirkeffekt-Wirkeffekt-Kurven in Abhaengigkeit von der Dosis betrachtet werden sowie gegebenenfalls weitere Parameter sind typische Aussagen zur Charakteristik der synergistischen Effekte hinsichtlich der Beeinflussung der Photosynthese, der Atmung, des Wachstums oder des Stickstoffhaushaltes zugaenglich. Durch Nutzung dieses Verfahrens besteht prinzipiell die Moeglichkeit, die Zusammensetzung von synergistisch wirkenden Substanz- bzw. Wirkstoffgemischen mit gewuenschten Kombinationswirkungen zu optimieren.
Description
Hierzu 4 Seiten Zeichnungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung und Charakterisierung synergistischer Effekte von Substanzgemischen in standardisierten Tests auf der Grundlage von Mikroalgensuspensionen das beispielsweise in der Wirkstofforschung angewendet werden kann.
Es ist bekannt, daß die kombinierte Applikation von biologisch aktiven und inaktiven Verbindungen in der Praxis seit dem Gebrauch organischer Verbindungen zur Unkrautbekämpfung sowie zur Regulierung der Wachstums- und Entwicklungsprozesse pflanzlicher Organismen erfolgt. Aber auch die Kombinatorik zweier oder mehrerer biologisch aktiver Wirkstoffe gewinnen.immer mehr an Bedeutung, denn selbst nur rein additiver Wirkung der Substanzen kann das Wirkungsspektrum auch von bekannten, ökonomisch relevanten Verbindungen wesentlich verbessert werden. Andererseits ist durch eine kombinierte Anwendung in Strukturtyp sehr unterschiedlicher oder aber ähnlicher Substanzen durch Wechselwirkung bei der Aufnahme, während des Transports oder am Wirkort ein synergistischer Effekt möglich, der sich letztlich sehr positiv auf die Wirtschaftlichkeit der Produkte auswirken kann.
Die Kombinationsversuche, die in der Regel an Ganzpflanzen durchgeführt werden, können nach unterschiedlichen Modellen angelegt, ausgewertet und interpretiert werden.
(CRAFTS, A.S. und CLEARY, C. W.: Hilgardia 10 [1936], 301-314; TAMMES, P.M. L.: Neth. J. Plant. Pat. 70 [1964], 73-80; GOWING, D.P.; Weeds 8 [1960] 3, 379-391, COLBY, S.R.: Weeds 15 [1967] 1, 20-22; LOEWE, S. und MUISCHNEK, H: Arch. exp. Path. Pharmak. 114 [1926], 313-362; LANG, S. und GROEGER, U.: Speziell Agrochemie— Forschung und Praxis B8 [1978], 7-12).
Trotz der verschiedenen in der Literatur beschriebenen biometrischen und graphischen Verfahren gibt es zu ihrer Aussagekraft sowie zu ihrer Brauchbarkeit für die Beurteilung der Kombinationswirkung von Phytoeffektoren unterschiedliche Auffassungen. Die Ursache dafür dürfte hauptsächlich darin zu suchen sein, daß es nach wie vor Schwierigkeiten bereitet, die theoretische Additivwirkung der Substanzkombination auf der Basis der Einzeleffekte zu erfassen, um davon ausgehend die effektiven Wirkungsdifferenzen exakt einschätzen zu können. Da auch das von BÖHM und SCHRANT vorgeschlagene Verfahren, synergistische Effekte mit Hilfe synchroner Flüssigkeitskulturen einzelliger Grünalgen nachzuweisen, (BÖHM, H. und SCHRANDT/D.: Wiss. Hefted. Pad. Inst. Köthen, Heft 2 [1973] 107-114) in dieser Hinsicht keinen Fortschritt darstellt, ergibt sich der Wunsch nach einem Verfahren, daß zwar ebenfalls auf Suspensionskulturen einzelliger Grünalgen beruht, dessen Anlage, Auswertung und Interpretation aber die Möglichkeit bietet, die Quantität und Additivwirkung bzw. der Einzeleffekte der_ Komponenten und insbesondere die Hauptwirkrichtung bzw. Qualitäten der Einzeleffekte sowie der Kombinationswirkungen hinsichtlich der Beeinflussung der Photosynthese, der Atmung, des Wachstums und des Stickstoffhaushaltes vergleichbar und exakt einzuschätzen.
Die Erfindung verfolgt das Ziel, für die Bestimmung und Charakterisierung synergistischer Effekte von Substanzgemischen ein Testverfahren vorzuschlagen, das auf autrotroph oder heterotroph kultivierte Mikroalgensuspensionen, die unter standardisierbaren Bedingungen angezogen werden können, beruht und dessen Anlage, Auswertung und Interpretation die Möglichkeit bietet, die Quantität der Einzel- und Additivwirkungen vergleichbar einzuschätzen und Informationen zur Charakteristik der Hauptwirkrichtungen der Einzeleffekte und Kombinationswirkungseffekte hinsichtlich der Beeinflussungen und Kombinationswirkungseffekte hinsichtlich der Beeinflussungen der Photosynthese, der Atmung, des Wachstums und des Stickstoffhaushaltes der Algensuspensionen liefert.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mittels der Analyse der durch einzelne Substanzen bzw. kombinierte Applikation von Wirkstoff- bzw. Substanzgemischen initiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften, der lonenumsätze und gegebenenfalls der photosynthetischen und/oder respiratorischen Gaswechselumsätze entsprechend substanzbehandelter einzelliger Algensuspensionen in möglichst einem Arbeitsgang und spezieller Auswertungsverfahren auf der Grundlage von Vergleichen dieser Analyseergebnisse für die einzelnen Komponenten und der entsprechenden Substanzgemische die initiierten Effekte unter standardisierten Bedingungen vergleichbar zu quantifizieren und hinsichtlich ihrer gezeigten Wirkspezifik wie
vorrangige oder unspezifische Beeinträchtigung der Photosynthese, der Atmung, des Wachstums oder des Stickstoffionenumsatzes umfassend zu charakterisieren.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß definierte Mengen chemischer Verbindungen und Kombinationsreihen zweier oder mehrerer biologisch aktiver oder auch inaktiver Verbindungen parallel oder simultan mit einzelligen Algensuspensionen, die in.geeigneten Nährlösungen autotroph oder heterotroph kultiviert werden, in unmittelbaren Kontakt gebracht und diese Proben parallel mit unbehandelten Vergleichskulturen bei einheitlicherTemperaturzwischen 200C und 38°C im Licht bzw. im Dunkeln belüftet werden, so daß sie auf der Grundlage der sich vollziehenden Photosynthese- bzw. Atmungsprozesse wachsen und sich entwickeln. Zu festgelegten Zeitpunkten oder kontinuierlich werden dann von Proben und Vergleichskulturen oder von Anteilen von beiden parallel oder in definierter Folge die optischen Eigenschaften mittels spektralanalytischer oder nephelometrischer Verfahren bei einen oder mehreren Wellenlängenbereichen insbesondere des sichtbaren Spektrums, der Stickstoffionenumsatz mittels pH-Elektroden, nitratsensitiven Elektroden bzw. anderen stickstoffionensensitiven Elektroden und gegebenenfalls der photosynthetische bzw. respiratorische Sauerstoffumsatz mittels Paramagnet-Gasanalysatoren, sauerstoffsensitiven Elektroden oder anderen geeigneten Verfahren und/oder der photosynthetische bzw. respiratorische Kohlendioxidumsatz mittels Infrarot-Gasanalysatoren oder anderen geeigneten Verfahren und Methoden analysiert.
Die Bestimmung der Quantität der synergistischen Effekte erfolgt mit Hilfe der Änalyseergebnisse wahlweise nach bekannten . Methoden durch biometrische oder graphische Verfahren nach CRAFTS und CLEARY, TAMMES, GOWING, COLBY, LOEWE und MUISCHNEK, LANG und GROEGER oder anderen.
Durch vergleichende Betrachtungen beispielsweise relativierter Wirkbilder der Substanzgemische und der reinen Komponenten, in denen die Wachstums- und/oder Hemmparameter untereinander als Wirkeffekt-Wirkeffekt-Kurven in Abhängigkeit von der Dosis betrachtet werden sowie gegebenenfalls weiterer Parameter lassen sich typische Aussagen zu den Hauptwirkrichtungen und zur Spezifik der synergistischen Effekte hinsichtlich der Beeinflussung der Photosynthese, der Atmung, des Wachstums oder des Stickstoffhaushaltes usw. ableiten.
Von den zu prüfenden Substanzgemischen AB und den reinen Komponenten A und B werden in einem Autotrophtest die Beeinflussungen der optischen Eigenschaften bei 680 und 750 nm und des pH-Wertes während des Wachstums von
Chlorellasuspensionen untersucht. Hierzu werden frisch geschlüpfte Aplanosporen synchroner Kulturen einzelliger Grünalgen der Species Chlorella vulgarisvar. vulgaris, Stamm BÖHM und BORNS 1972/1 in eine anorganische Nährlösung N so überführt, daß im Autotrophtest jeder Kubikzentimeter der Suspension etwa sechs Millionen Algenzellen enthält.
11 der Kultur-Nährlösung N setzt sich dabei aus den drei Teilnährlösungen N1, N2 und N3 zusammen:
1 000ml N = 998Cm3N1 + 1 cm3 N2 + 1cm3 N3. · ·
Für die Nährlösung N1 werden zunächst die Stammlösungen 1 bis 4 durch Auffüllen der genannten Substanzmengen mit Aqua dest. hergestellt:
Starnmlösung 1: 100 g K NO3/ 1 000 cm3 Stammlösung 2: 25 g Ca Cl2 · 6 H2O/1 000 cm3 Stammlösung 3: 250 g Mg SO4 7 H2O/1 000 cm3 Stammlösung 4: 160 g K H2PO4/1 000 cm3
Die Stammlösungen sind zu sterilisieren (Feuchtsterilisation) und kühl zu lagern. Aus je 5cm3 der Stammlösung 1, 0,5 cm3 der Stammlösung 2,1 cm3 der Stammlösung 3 und 5cm3 der Stammlösung 4 werden durch Auffüllen mit destilliertem Wasser entweder 1 000cm3 bzw. bei Beachtung der entsprechenden Verhältnisse eine andere gewünschte Menge der Nährlösung N1 hergestellt. Die NährlösungervN2 und N3 enthalten in 1 000cm3 61 mg H3 BO3,169 mg Mn SO4 · H20,287 mg Zn SO4 7 H20,2,5mg Cu SO4 · 5H2O und 12,4mg (NH4J2 MoO4 bzw. 6,9g FeSO4 · 7H2O und 9,3g Na-EDTA.
Je 80cm3 der so hergestellten Suspensionen werden in je eine Kulturröhre eingebracht, durch ein Gemisch aus gereinigter Luft und 2Vol.-% Kohlendioxid begast und mit je 1 cm3 der DMSO-Lösungen der zu prüfenden Substanzgemische entsprechend der Kombinationsreihen bzw. verschiedener konzentrierter DMSO-Lösungen der reinen Komponenten A und B beimpft oder als unbehandelte Kontrollen bei 37,50C belichtet, so daß alle erforderlichen Voraussetzungen für die Photosynthese gegeben sind. Während die Änderungen der optischen Eigenschaften der in Nährlösung suspendierten Zellen und der pH-Wert der Suspensionen in den unbehandelten Vergleichskulturen einer normalen Wachstumsentwicklung entsprechen, werden die optischen Eigenschaften und der pH-Wert in den mit Chemikalien versetzten Chlorellasuspensionen während des Wachstums mehr oder weniger beeinflußt, wenn verschiedene Konzentrationen der Substanzgemische oder der reinen Komponenten den Photosyntheseprozeß mehr oder weniger stören.
In definierter Zeitfolge werden von den Vergleichskulturen und den substanzbehandelten Proben die optischen Eigenschaften und der pH-Wert der Suspensionen analysiert. Die Ergebnisse der Analysen für die Beurteilung der Quantität von Kombinationswirkungen sind den Fign. 1 bis 4 zu entnehmen.
Die Fig. 1 enthält als Beispiel die Dosis-Wirkungs-Kurven für die Hemmung des autotrophen Wachstums der Chlorella-Suspensionen. Die Kurve 1 istdieDosis-Wirkungs-Kurvefürdie reirre Hauptkomponente A des Gemisches AB. Die Kurve 2 ist die berechnete und die Kurve 3 die experimentell bestimmte Dosis-Wirkungs-Kurve für das Substanzgemisch AB, bestehend aus der Hauptkomponente A, die in den gleichen Konzentrationen entsprechend Kurve 1 appliziert wurde und der Nebenkomponente B, die in allen Fällen in einer konstanten unwirksamen Konzentration zugeführt wurde. Der gemäß Gl. (1) bestimmte Apc-Wert von 0,3 weist auf einen potentiellen bzw. überadditiven Synergismus (Fig. 1).
pe = PC50 exp. (Gemisch) — pcsoberech. (Gemisch)* (1)
* peso = negativer dekadischer Logarithmus der isoaktiven Konzentration, die eine 50%ige Wachstumshemmung, die über
Extinktionsmessungen bei 680nm bestimmt wurde, verursacht PC50 = Durchschnittswert
Die Beurteilung der Kombinationswirkungen kann aber auch wahlweise nach anderen bekannten biometrischen oder graphischen Verfahren beispielsweise nach CRAFTS und CLEARY, TAMMES, GOWING, COLBY, LOEWE und MUISCHNEK, LANG und GROEGER, GROEGER usw. erfolgen. '
Die Fig. 2 bis 4 illustrieren als Beispiel eine Beurteiiungsmöglichkeit der Qualität von Kombinationswirkungen. Die Fig. 2, Ai,3, B1 und 4,AB1 zeigen Auftragungen der Wachstumspgrameter in Form der relativen Änderungen der Logarithmen der Extinktionen beispielsweise bei 680 nm (A'lgE680) als Ausdruck der substanzinitiierten Beeinflussungen der Chlorophyllentwicklung und bei 750 nm (AMgE750) als Maß des allgemeinen Zellwachstums. Beide Wachstumsparameter sind über Gl. (2) und die Hemmparameter A*lgE über Gl. (3) zugänglich.
λ,, ρ _ IgEp.Probe ~ IgEi.Probe · ,„ι
IgEo.Kontrolle ~ IgEENDE.KONTROLLE
.+. _ IgEt.Probe ~ IgEt,Kontrolle /o,
Δ IgE = —ζ . - (3)
Ig11O,Kontrolle - IgEEnde,Kontrolle
Ein Vergleich dieser Wirkbilder veranschaulicht, daß die Hauptkomponente A nur eine unspezifische Wirkung zeigt, Fig. 2, A1. Die Kurven ANgE75O für die Proben zunehmender Konzentration 1 bis 3 verlaufen deckungsgleich mit der Kontrolle K. Der entsprechenden Fig. 3, B1 ist zu entnehmen, daß primär dosisabhängig mit zunehmender Dosis die optischen Eigenschaften bei 680 nm stärker gehemmt werden als das Wachstum bei 750 nm. Das weist Substanz B zunächst als einen primären Photosynthesehemmer aus. Das entsprechende Wirkbild für die Gemische AB, bestehend aus den entsprechenden Dosen der Hauptkomponente A und einer konstanten unwirksamen Menge an Substanz B in Fig.4, AB1 zeigt anschaulich, daß der sich in Fig. 3, B1 andeutende Effekt erheblich verstärkt wurde.
Ein Vergleich der Wirkbilder in Form von lgE68<rpH- bzw. lgE750-pH-Auftragungen oder besser in Form von A'lgE/A'pH (Fign. 2,A2, 3, B2 und 4, AB2) bzw. A*lgE/A*pH-Auftragungen, wobei die Wachstumsparameter Δ'ρΗ gemäß Gl. (4) und die Hemmparameter Δ*ρΗ für die Beeinträchtigung der pH-Werte der Algensuspensionen über G. (5) zugänglich sind, erlauben eine detaillierte Charakterisierung der Qualität der Kombinationswirkungen hinsichtlich der Beeinflussung des Stickstoff ha ushaltes der Zellen.
Λ OH =
Λ+ u = pHt,Kontrolle ~ pHt,Probe ,j-,
pH0, Kontrolle ~~ P^nde, Kontrolle
| pHo, Probe "Γ ί |
| PHo, Kontrolle ~ P^ |
| pHt, Kontrolle ~~ i |
| -,LJ 3nt, Probe |
| 'Ende, Kontrolle |
| f Ht, probe |
Sowohl die Hauptkomponente A (Fig.2, A2) und in stärkerem Maße die Nebenkomponente B (Fig. B2) zeigen dosisabhängig, daß mit zunehmender Konzentration der pH-Wert der Suspensionen und damit der Stickstoffionenhaushalt stärker beeinträchtigt wird als das Zellwachstum. Demgegenüber ist in Fig.4, AB2 für das Substanzgemisch AB zu erkennen, daß die kleinen Dosen 1 und 2 zunächst den Stickstoffionenhaushalt stärker tangieren als das Zellwachstum. Ab Dosis 3 aber wird dann dosisabhängig primär das Zellwachstum, angezeigt durch die entsprechenden A'lgE75o-Daten, zunehmend stärker beeinflußt. In einem sekundären Metabolismus werden dann auch dosisabhängig der Stickstoffionenumsatz stärker gehemmt als das Zellwachstum. Während die reinen Komponenten A und B entsprechend den Fig. 2 A2 und 3, B2 als Effektoren des Stickstoffhaushaltes einzustufen sind, zeigt die Kombinationswirkung beider in Fig.4, AB2, daß das Substanzgemisch primär als Photosynthesehemmer wirkt.
Vergleicht man die Aussagen insbesondere der Fig. 2 bis 4 für die reinen Komponenten A und B sowie für das Gemisch AB miteinander, so wird deutlich, daß die Auswertung solcher Tests bei verschiedenen Wellenlängen, für die die Extinktionsmessungen bei 680 und 750nm lediglich eine mögliche Kombination von vielen darstellen, und gleichzeitiger pH-Wertmessungen, die wiederum nur eine von mehreren lonenumsatzmessungen darstellen, in einem Arbeitsgang zu sehr differenzierten Aussagen hinsichtlich der Wirkspezifik der reinen Substanzen und des Gemisches führen kann. Besonders deutlich zeigen sich diesbezüglich Unterschiede bei Korrelationen der Wachstumsparameter Δ' IgE bzw. der Hemmparameter A+IgE bei zwei verschiedenen Wellenlängen wie 680 und 750 nm zueinander sowie Auftragungen solcher Wachstumsparameter (Hemmparameter) in Abhängigkeit von den entsprechenden pH-Werten (Δ'ρΗ bzw. Δ+ρΗ). Durch Vergleich entsprechender Wirkbilder der reinen Komponenten und der Substanzgemische.erhält man konkrete Hinweise über die Qualität bzw. Änderungen in der Qualität der Kombinationswirkungen im Vergleich zu den reinen Komponenten. Darüber hinaus können zur weiteren Differenzierung der Spezifik der Kombinationswirkungen zusätzliche qualitative und quantitative Effekte, die entweder aus den gleichen Tests oder zusätzlichen Untersuchungen resultieren, herangezogen werden. So ist eine differenziertere Beurteilung der Kombinationswirkungen nach der Qualität von Wirkbildern möglich, bei denen beispielsweise weitere geeignete Parameter, die eng mit dem Wachstum der Algen zusammenhängen, untereinander verglichen werden. Beispielsweise können zusätzlich die durch die Substanzgemische bzw. die reinen Komponenten determinierten Beeinflussungen der photosynthetischen und/oder respiratorischen Gaswechselumsätze (O2, CO2) betrachtet oder untereinander oder mit den Beeinträchtigungen der optischen Eigenschaften bei gegebenen Wellenlängen oder mit lonenumsatzparametern wie pH-Werten der Suspensionen verglichen werden.
Bei Bedarf können in weiterführenden Tests die teils unterschiedlich substanzinitiierten Beeinträchtigungen der lonenumsätze des durch wahlweise Nitrat-und durch Ammoniumionen determinierten Wachstums einzelliger Algensuspensionen untersucht und vergleichend betrachtet werden. Durch solche Spezialtests läßt sich die Wirkspezifik der Substanzgemische tiefgehender charakterisieren, wobei man zunehmend konkretere Hinweise betreffs möglicher kommerzieller Nutzungen erhält.
Claims (7)
1. Verfahren zur Ermittlung und Charakterisierung von Kombinationswirkungen von Substanzgemischen, gekennzeichnet dadurch, daß mittels einer minimierten Testhierarchie die teils durch Substanzkombinationsreihen und der reinen Komponenten initiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften, der lonenumsätze und gegebenenfalls Gaswechselumsätze einzelliger Algensuspensionen analysiert die Analyseergebnisse einem minimierten Auswertungsmodus unterzogen werden, um dann mittels Vergleich der absoluten Wirkquantitäten der Substanzgemische und der reinen Komponenten der Gemische die synergistischen Effekte quantitativ und vergleichbar zu bestimmen und mittels Vergleich von Wirkbildern, in denen die für die Beeinflussungen der optischen Eigenschaften bei beispielsweise zwei Wellenlängen bzw. bereichen, der lor.enumsätze bzw. der pH-Werte und gegebenenfalls der Gaswechselumsätze miteinander beispielsweise als Wirkeffekt-Wirkeffekt-Kurven in Abhängigkeit von der Dosis betrachtet werden, typische Aussagen zur Hauptwirkrichtung und zur Spezifik des betrachteten Synergismus hinsichtlich der Beeinflussung der Photosynthese, der Atmung, des Wachstums und/oder des Stickstoffhaushaltes zu erhalten.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Testmodell alle suspendierbaren autotroph und heterotroph kultivierbaren einzelligen Grünalgen verwendet werden können.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die optischen Eigenschaften der Mikroalgensuspensionen mittel Spektralkolorimetrie, Spektralphotometrie oder Nephelometrie bei ein bzw. zwei bis η verschiedenen Wellenlängenbereichen oder ganzen Spektralbereichen, insbesondere im sichtbaren Spektralbereich analysiert werden.
4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß der lonenumsatz der Mikroalgensuspensionen mittels pH-Elektroden, nitratsensitiver Elektroden oder anderer ionensensitiver Elektroden, oder anderen geeigneten Verfahren oder durch Kombination dieser Methoden analysiert wird.
5. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß-der Sauerstoffumsatz mittels Parmagnet-Gasanalysatoren, sauerstoffsensitiver Elektroden oder geeigneten anderen Methoden
- oder durch Kombination mehrerer dieser Methoden analysiert wird.
6. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß der Kohlendioxidumsatz mittels . Infrarot-Gasanalysatoren, 14C-Methode, photometrischer Methoden oder durch Kombination mehrerer dieser Methoden analysiert wird.
7. Verfahren nach Punkt 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die optischen Eigenschaften, der lonenumsatz und der Gaswechselumsatz der autotrophen oder heterotrophen Mikroalgensuspensionen in je einem Arbeitsgang kontinuierlich oder in definierter Zeitfolge parallel oder simultan analysiert werden.
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