DD245905A1 - Selektionsverfahren fuer effektoren von stickstoffreduktions-metabolismen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung "Selektionsverfahren fuer Effektoren von Stickstoffreduktions-Metabolismen" dient der Suche nach Pflanzenschutzmitteln und der Charakterisierung von Effektoren biologischer Prozesse. Sie verfolgt das Ziel, moeglichst in einem Arbeitsgang die Ergebnisse von Tests zur Effektorbeeinflussung des Wachstums von autotrophen Algensuspensionen in mindestens zwei Variationen der Oxydationsstufe des Stickstoffs der genutzten Stickstoffquelle der Naehrloesung auszuwerten und dabei primaere Effektoren der Reduktion des Nitrat- bzw. des Nitritstickstoffs oder unspezifische Effektoren des Stickstoffhaushalts zu differenzieren und zu charakterisieren. Die Erfindung basiert auf einem Auswertungsverfahren, das die entwicklungsbedingte Beeinflussung der optischen Eigenschaften substanzbehandelter Zellsuspensionen in mindestens zwei Suspensionskulturvariationen bezueglich der Stickstoffquelle bei sonst vergleichbaren Bedingungen nutzt. Die Fig. 2, A3 und A4 illustriert, dass das Auswertungsverfahren darueber hinaus Informationen ueber Einsetzen, Verlauf, Bestaendigkeit und Richtung der Wirkungsauspraegung in Abhaengigkeit von der Dosis der Effektoren liefert.
Description
Pflanzenschutzmittelforschung, Suche nach Regulatoren biologischer Prozesse, Umweltanalyse, Naturstoffchemie
Es ist bekannt, daß Stickstoff in Form von anorganischen Verbindungen zu den Hauptnährstoffen pflanzlicher Organsimen gehört. Er wird zur Synthese von Eiweißen bzw. von Eiweißbausteinen wie Aminosäuren und anderen organischen Bestandteilen von Lebewesen unbedingt benötigt. Stickstoffautotrophe Pflanzen verwenden dazu anorganische Stickstoffquellen, insbesondere Nitrationen. Die Pflanzen sind aber auch in der Lage, Nitrit-, Ammoniumionen und weitere stickstoffhaltige Verbindungen aufzunehmen.
Die entscheidenden Schritte des pflanzlichen Stickstoffhaushaltes sind die Stufen der Reduktion des Stickstoffs der Oxydationsstufe N""5 in den Nitrationen zu N~3als Nitritionen und über weitere wasserstoff haltige Zwischenprodukte bis zur Stufe N+3 in Form von Ammoniumverbindungen.
Nach Bindung der letzteren an organische Akzeptoren erfolgt anschließend die Synthese von stickstoffhaltigen Mono- und Polymeren bis zu komplizierten Eiweißstrukturen.
Wirkstoffe, die den Stickstoff haushalt von Pflanzen tangieren, gewinnen in der landwirtschaftlichen Praxis ständig an Bedeutung. Sie können den ersteh, den zweiten oder beide Reduktionsschritte dieses wichtigen Metabolismus beeinträchtigen. Nutzt man afs Indikator Mikroalgensuspensionen, so können nach dem Verfahren DD 220047 mittels Wachstums- und lonenumsatzanalysen autotropher Mikroalgensuspensionen primäre Photosyntheseeffektoren von primären Effektoren des Stickstoffhaushaltes in einem Arbeitsgang getrennt werden. Weitere Verfahren wie DD 94234, DD 200472, DD 211126, DD212985, DD213949, DD 213950, DD 214146, DD 216 253 und 216254, die auf Auswertungsmodi basieren, die.diewachstums- bzw. entwicklungsbedingten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften und/oder der photosynthetischen bzw. respiratorischen Gaswechselumsätze substanzbehandelter autotropher und/oder heterotropher Zellsuspensionen nutzen, ermöglicht die Selektion von vorrangigen Photo-Synthese- oder Atmungshemmern und von unspezifischen Hemmern, die Aufdeckung von Permeationseffekten sowie die Selektion von Hemmern der Licht- und der Dunkelreaktion. Darüber hinaus sind diese Verfahren über die Analyse dosisabhängiger Wirkeffekt-Zeit-Verläufe in der Lage, die Wirkspezifik der Effektoren näher zu charakterisieren.
Eine ähnliche Differenzierung und Selektion der Wirkstoffe hinsichtlich ihrer spezifischen Beeinflussung der Reduktion des Nitrat- und/oder des Nitritstickstoffs auf der Grundlage substanzbehandelter Zeil- oder Organismensuspensionen bereitet -bisher große Schwierigkeiten. Da für die Wirkstoffcharakterisierung auf der Grundlage komplexer Analysen der Lebensprozesse vergleichende Betrachtungen der Auswertungsergebnisse zunehmend an Bedeutung gewinnen, ergibt sich der Wunsch nach einem einfachen Verfahren, das als Indikator autotrophe Mikroalgensuspensionen nutzt und dessen Meßtechnik und Auswertungsmodus eine Charakterisierung der Effektoren als primäre Effektoren der Reduktion des Nitrat- bzw. des Nitritstickstoffs oder als unspezifische Effektoren des Stickstoffhaushaltes in einem Arbeitsgang erlaubt.
Die Erfindung verfolgt das Ziel, für Tests auf der Grundlage autotropher Suspensionskulturen einzelliger Grünalgen ein Verfahren und einen Auswertungsmodus vorzuschlagen, die in möglichst einem Arbeitsgang eine Selektion von Wirkstoffen gestatten, die primär die Nitratstickstoffreduktion bzw. die Nitritstickstoffreduktion oder den Stickstoffhaushalt unspezifisch tangieren und die Wirkspezifik solcher Effektoren hinsichtlich der Beeinflussung der optischen Eigenschaften der Suspensionskulturen genauer zu charakterisieren ermöglichen.
-I-
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß beim „Selektionsverfahren für Effektoren von Stickstoffreduktions-Metabolismen" die teils unterschiedlich substanzinitiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften des durch Nitrat-bzw. durch Nitritionen und durch Ammoniumionen determinierten Wachstums einzelliger Algensuspensionen analysiert und vergleichend betrachtet werden. Das Auswertungsverfahren liefert darüber hinaus Informationen über Einsetzen, Verlauf und Beständigkeit der Wirkungsausprägung in Abhängigkeit von der Dosis und von der Einwirkungsdauer der Effektoren hinsichtlich der Beeinflussung der optischen Eigenschaften.
Beim „Selektionsverfahren für Effektoren von Stickstoffreduktions-Metabolismen" werden zunächst frisch geerntete Autosporen von Mikroalgen in unterschiedlichen Nährlösungen einmal mit Nitrationen bzw. Nitritionen und zum anderen mit Ammoniumionen als Stickstoffquelle so suspendiert, daß beide, gegebenenfalls alle drei Suspensionskulturen die gleiche' Autosporendichte aufweisen. Anteile dieser autotrophen Zellsuspensionen einzelliger Grünalgen werden dann als Proben mit definierten Mengen chemischer Verbindungen in unmittelbaren Kontakt gebracht und parallel mit unbehandelten Vergleichskulturen bei einheitlicher Temperatur zwischen 2O0C und 38 °C im Licht belüftet, so daß sie auf der Grundlage des sich vollziehenden Photosyntheseprozesses wachsen und sich entwickeln.
Kontinuierlich oder zu festgelegten Zeitpunkten werden dann Proben und Vergleichskulturen oder Anteile von beiden parallel oder in definierter Folge mittels spektralanalytischer Verfahren bei einem, zwei oder mehreren Wellenlängenbereichen des infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Spektrums untersucht und die dabei gewonnenen Ergebnisse vergleichenden Betrachtungen unterzogen.
Ausführungsbeispiele
Frisch geschlüpfteAplanosporen synchroner Kulturen einzelliger Grünalgen der Species Chlorella vulgarisvar.vulgaris, Stamm BÖHM und BORNS 1972/1, werden in eine anorganische Nährlösung mit Fe-EDTA-Komplex und Spurenstoffen so überführt, daß jeder Kubikzentimeter der Suspension etwa sechs Millionen Algenzellen enthält. 1 Liter der Kultur-Nährlösung N setzt sich dabei aus den drei Teilnährlösungen N1, N2 und N3 zusammen;
1 000cm3 N = 998cm3 N1 + 1 cm3 N2 + 1 cm3 N3.
Die Nährlösungen N1, N2 und N3 enthalten folgende Substanzen:
Nährlösung Ni für die Testvariante mit Nitrationen als Stickstoffquelle. Für die Nährlösung N1 werden zunächst die Stammlösungen 1 bis 4 durch Auffüllen der genannten Substanzmengen mit Aqua dest. hergestellt:
Stammlösung 1: 100g KNO3/1000cm3
Stammlösung 2: 25g CaCI2 · 6H2O/1 000cm3
Stammlösung 3: 250g MgSO4 · 7H2O/1 000cm3
Stammlösung 4: 160g KH2PO4/1 000cm3.
Nährlösung N-, für Testvariante mit Ammoniumionen als Stickstoffquelle.
Stammlösung 1: 120g NH4H2PO4, 260g Na2HPO4/1 000cm3
Stammlösung 2: 25g CaCI2 · 6H2O/1 000cm3
Stammlösung 3: 250g MgSO4 · 7H2O/1 000cm3
Stammlösung 4: 160g KH2PO4/1 000cm3.
Diese Stammlösungen sind zu sterilisieren (Feuchtsterilisation) und kühl zu lagern.
Aus je 5 cm3 der Stamm lösung 1,0,5 cm3 der Stammlösung 2,1 cm3 der Stamm lösung 3 und 5 cm3 der Stammlösung 4 werden durch Auffüllen mit destilliertem Wasser entweder 1 000cm3 bzw. bei Beachtung der Verhältnisse eine beliebige Menge der Nährlösung N1 hergestellt.
Die Nährlösung N2 enthält in 1 000cm3 Lösung 61 mg H3BO3,169mg MnSO4- H2O, 287mg ZnSO4 · 7H2O, 2,5mg CuSO4 · 5H2O und 12,4mg (NH4I2MoO4.
Zur Herstellung der Nährlösung N3 werden 6,9g FeSO4 · 7 H2O und 9,3 g Na-EDTA in destilliertem Wasser gelöst und auf 1 000cm3 mit Aqua dest. aufgefüllt.
Je 80cm3 der so hergestellten Suspension werden in je eine Kulturröhre eingebracht, mit je 1 cm3 verschieden konzentrierter Lösung der zu prüfenden Substanzen A und B beimpft oder als nur mit dem Lösungsmittel behandelte Kontrollen bei 370C belichtet und mit gereinigter Luft, der 2 Vol.-% Kohlendioxid beigegeben werden, begast, so daß alle erforderlichen Voraussetzungen für die Photpsynthese gegeben sind.
Während die in den zwei Nährlösungen mit unterschiedlicher Stickstoffquelle suspendierten Zellen in den unbehandelten Vergleichskulturen normal und vergleichbar wachsen und sich entwickeln, werden Wachstum und lonenumsatz in den mit Chemikalien versetzten Proben mehr oder weniger beeinflußt, wenn verschiedene Substanzkonzentrationen den Photosyntheseprozeß bzw. den Stickstoffhaushalt mehr oder weniger stören. In definierter Zeitfolge werden von den Vergleichskulturen und den mit der Substanz A behandelten Proben die optischen Eigenschaften bei 680 und/oder 750nm als Wachstumsparameter gemessen.
Die Ergebnisse der Analysen sind den Fig. 1 und 2 zu entnehmen. Fig. 1, A1 enthält die dekadischen Logarithmen der Extinktionsmessungen bei 680 nm für die unbehandelten Kontrollen K bzw. K' und die mit abgestuft zunehmenden Konzentrationen der Substanz A versetzten Proben 1 (V) bis_5 (5'), die von der nullten Stunde bis zur sechsten Stunde alle 60
Minuten vorgenommen wurden. Die IgE-t-Kurven ( ) V bis 5'wurden für die dosisabhängige Beeinflussung des Wachstums
der Zellen in Suspensionskultur mit Nitrationen als Stickstoffquelle und entsprechend die IgE-t-Kurven ( ) für die
Beeinflussung des Wachstums in Suspensionskultur mit Ammoniumionen als Stickstoffquelle durch den Effektor A gefunden. Ein Vergleich der parallel in einem Arbeitsgang unter vergleichbaren Bedingungen gewonnenen Wirkeffekt-Zeit-Kurven in Fig. 1,
A1 zeigt deutlich Unterschiede der Wirkung des Effektors A auf das Wachstum der Algen in beiden Testvarianten. Das durch die Nitrationen determinierte Wachstum wird deutlich stärker gehemmt als das durch die Ammoniumionen determinierte Wachstum. Dieses differenzierte Verhalten des Effektors A kann auch in Form von Wirkquantitäts (AlgE)-Zeit-Kurven veranschaulicht werden, Fig. 1, A2, wobei die Wirkquantität gemäß
bestimmt werden kann.
Einen Eindruck über Qualität und Quantität der Wirkeffekte vermitteln die Fig. 2, A3 und Fig. 2, A4.
Die Fig. 2, A3 zeigt eine gegenseitige Auftragung der Wachstumsparameter IgE aus den beiden Testvarianten. Während in diesem Fall für die Kontrolle die Gerade K mit einem Anstieg von 45 Grad gefunden wird, erhält man bei gleicher Auftragung für die wirkstoffbehandelten Proben typische Kurven 1 bis 5, die auf mehrere Metabolismen hinweisen. Typisch für den' Effektor A ist, daß das Wachstum in Suspensionskultur mit Nitrationen als Stickstoffquelle nach einer gewissen Einwirkzeit dosisabhängig blockiert wird, während in Suspensionskultur mit Ammoniumionen als Stickstoffquelle weiteres Wachstum, welches aber auch dosisabhängig gehemmt wird, FJg^A1 und Fig.1, A2, erfolgt. Gleichzeitig zeigt Fig. 2, A3, daß die stärkste Dosis 5, angezeigt durch den zweiten Kurvenabschnitt, in beiden Testvarianten zu einer totalen Hemmung des Wachstums führt, wobei die Blockierung in „Nitrationenkultur" eher einsetzt als in „Ammoniumionenkultur". Die Wirkkurve der Dosis 4 veranschaulicht zunächst eine Blockierung des Wachstums in „Nitrationenkultur", die im Verlaufe in eine zunehmende Hemmung des Wachstums in „Ammoniumionenkultur" bei gleichzeitiger verstärkter Zunahme relativen Wachstums in „Nitrationenkultur" übergeht. Die mittleren Dosen 2 und 3 determinieren zunächst den gleichen Kurvenverlauf, der auch im zweiten Kurventeil eine Blockierung bzw. einen relativen Rückgang des Wachstums in „Nitrationenkultur" anzeigt. Im dritten Kurvenabschnitt spaltet sich die Kurve in zwei Teiläste. Während der Kurventeil für Dosis 3 mit einem Anstieg kleiner als der Anstieg der Kontrolle darauf hinweist, daß die Dosis 3 bei diesem sekundären Metabolismus eine relativ stärkere Hemmung in „Nitrationenkultur" determiniert, scheint der Anstieg des Kurvenabschnitts für Dosis 2, der ähnlich wie für Dosis 1 größer als der Anstieg der Kontrolle ist, auf Reparaturmetabolismen hinzuweisen. Aus Fig. 2, A3 und insbesondere aus den dosisabhängigen Blockierungen des Wachstums in „Nitrationenkultur" kann geschlußfolgert werden, daß es sich beim Effektor A um einen typischen Hemmer der Nitratstickstoffreduktion-Metabolismen handelt. Für den Wirkstoff B, mit dem wie beim Effektor Averfahren wurde, konnte bei einer entsprechenden Auftragung der Wachstumsparameter gemäß Fig. 2, A3 nur die Gerade B, die mit der Geraden für die Kontrollen identisch ist, gefunden werden. Das weist darauf hin, daß im Gegensatz zum Wirkstoff Ader Effektor B nur ein unspezifischer Hemmer des Stickstoffhaushaltes ist. Zu gleichen Schlußfolgerungen führt eine gegenseitige Auftragung der Hemmquantitäten AIgE aus beiden Testvarianten, Fig. 2, A4. Auch hier wurde erwartungsgemäß für den unspezifischen Hemmer des Stickstoffhaushaltes B die Gerade B erhalten. Demgegenüber weisen die Kurvenverläufe auch für die geringen Dosen 1 und 2 bei typischer Konzentrationsabhängigkeit auf eine relativ stärkere Hemmung in „Nitrationenkultur". Für die Wirkstoffcharakterisierung ist die übergeordnete Kurve A bedeutsam, da sie relativiert für das Wachstum von 0 bis 1 in einer bestimmten Standardwirkzeit und unter streng standardisierten Bedingungen als quantitatives Maß der spezifischen Wirkung des Effektors angesehen werden kann.
Vergleicht man die Aussagen der Figuren 1 und 2 für die Substanzen A und B miteinander, so wird deutlich, daß die Auswertung solcher parallel durchgeführten Tests mit unterschiedlichen Stickstoffquellen in den Suspensionskulturen zu sehr differenzierten Aussagen hinsichtlich der Wirkung von Effektoren auf den Stickstoffhaushalt führen kann.
Besonders deutlich zeigen sich diesbezüglich Unterschiede bei Korrelationen der Wachstumsparameter IgE und der Hemmquantitäten AIgE für die Beeinflussung des Wachstums in den Testvarianten mit unterschiedlichen Stickstoffquellen zueinander. Durch Vergleich entsprechender Wirkbilder von neu untersuchten Substanzen, über deren herbizide Wirksamkeit bisher nichts oder wenig bekannt ist, mit einer Wirkbildkartei gemäß den Fig. 1 und 2 oder mit Hilfe der elektronischen Datenverarbeitung, die beide entsprechende Wirkdaten von gut untersuchten, auch kommerziell vertriebenen Herbiziden oder Standardherbiziden speichern, erhält man konkrete Hinweise über ähnliche Wirkspezifika, Wirkmechanismen, Selektivität und Anwendungsmöglichkeiten solcher Effektoren.
Claims (4)
- Erfindungsanspruch:1. Verfahren zur Selektion von Effektoren von Stickstoffreduktions-Metabolismen, dadurch gekennzeichnet, daß die teils unterschiedlich substanzinitiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften des durch Nitrat- bzw. Nitritionen und durch Ammoniumionen determinierten Wachstums autotropher Mikroalgensuspensionen unter vergleichbaren Bedingungen analysiert werden, um mittels Vergleich der substanzinitiierten Variation der optischen Eigenschaften während des Wachstums der Algensuspensionen in mindestens zwei Varianten der Oxydationsstufe des Stickstoffs der genutzten Stickstoffquelle die Effektoren in möglichst einem Arbeitsgang nach ihrer Wirkspezifik hinsichtlich des Stickstoffhaushaltes in primäre Effektoren der Reduktion des Nitrat- bzw. des Nitritstickstoffs oder als unspezifische Effektoren des Stickstoffhaushalts differenzieren und charakterisieren zu können.
- 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als autotrophe Zellsuspensionen alle suspendierbaren autotrophen einzelligen Algen verwendet werden können.
- 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Eigenschaften der Algensuspensionen mittels Spektralkolorimetrie, Spektralphotometrie oder Nephelometrie bei ein bzw. zwei bis η verschiedenen Wellenlängenbereichen oder ganzen Spektralbereichen im infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Spektralbereich analysiert werden.
- 4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Eigenschaften der verschiedenen Proben in einem Arbeitsgang kontinuierlich oder in definierter Zeitfolge parallel oder simultan analysiert werden.Hierzu 2 Seiten Zeichnungen
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD28624886A DD245905A1 (de) | 1986-01-16 | 1986-01-16 | Selektionsverfahren fuer effektoren von stickstoffreduktions-metabolismen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD28624886A DD245905A1 (de) | 1986-01-16 | 1986-01-16 | Selektionsverfahren fuer effektoren von stickstoffreduktions-metabolismen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD245905A1 true DD245905A1 (de) | 1987-05-20 |
Family
ID=5575928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD28624886A DD245905A1 (de) | 1986-01-16 | 1986-01-16 | Selektionsverfahren fuer effektoren von stickstoffreduktions-metabolismen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD245905A1 (de) |
-
1986
- 1986-01-16 DD DD28624886A patent/DD245905A1/de unknown
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