DD250549A1 - Screeningverfahren zur charakterisierung und selektion von effektoren - Google Patents

Abstract

Das "Screeningverfahren zur Charakterisierung und Selektion von Effektoren" dient der Effektivierung der Pflanzenschutzmittelforschung. Es verfolgt das Ziel, ueber eine minimierte Testhierarchie und minimierte Auswertungsmoden, die teils substanzinitiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften, der Ionenumsaetze und gegebenenfalls der photosynthetischen und/oder respiratorischen Gaswechselumsaetze von Algensuspensionen, die in zwei standardisierten Testvarianten autotroph und heterotroph kultiviert werden, zu analysieren und durch vergleichende Betrachtungen der absoluten Wirkquantitaeten, der Wirkquantitaetsdifferenzen aus beiden Testvarianten und von relativierten Wirkbildern, in denen die Wachstumsparameter und/oder Hemmparameter untereinander als Wirkeffekt-Wirkeffekt-Kurven in Abhaengigkeit von der Dosis betrachtet werden sowie gegebenenfalls weitere Parameter typische Aussagen zur Wirkspezifik der untersuchten Effektoren zu erhalten. Durch Vergleich solcher Wirkparameter neu zu untersuchender Substanzen mit entsprechenden Daten gut untersuchter kommerziell vertriebener Wirkstoffe koennen mit Hilfe einer Wirkdaten- und Wirkbildkartei, der elektronischen Datenverarbeitung oder anderer Vergleichsmethoden die potentiellen Wirkstoffe nach ihren gezeigten Wirkspezifiken Wirkstoffgrundtypen zugeordnet werden. Bei Uebereinstimmung der Wirkquantitaeten, Wirkbilder usw. zweier Wirkstoffe kann auf aehnliche Wirkmechanismen, Metabolismen und kommerziellen Anwendungen geschlossen werden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Screeningverfahren zur Charakterisierung und Selektion von Effektoren mittels Wachstums-, lonenumsatz- und Gaswechselumsatzanalysen autotropher und heterotropher Zellsuspensionen, das beispielsweise in der Pflanzenschutzmittelforschung angewendet werden kann.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Der Einfluß chemischer Substanzen auf biologische Prozesse kann auf vielfältige Weise geprüft werden, wobei die Nutzung von Mikroalgensuspensionen als Testmodell zunehmend an Bedeutung gewinnt.

Gemäß DD-PS 94234 lassen sich aus einer Stichprobe von Chemikalien diejenigen selektieren, die den fundamentalen Prozeß des autotrophen Zellwachstums, insbesondere von Mikroalgensuspensionen, unmittelbar oder mittelbar beeinträchtigen. Während nach diesen Verfahren zur Zellwachstumsanalyse spektralkolorimetrische oder nephelometrische Verfahren bzw. zur Bestimmung der Vermehrungsrate elektronische Teilchenzählmethoden vorgeschlagen werden, geht das Verfahren DD-PS 227464, welches auch auf Mikroalgensuspensionen als Testobjekt beruht, von Analysen der substanzinitiierten Beeinflussungen der pH-Werte der Algensuspensionen als Maß der Wirkquantitäten zur Beurteilung der Hemmwirkung der Effektoren aus.

Weitere Fortschritte für die Wirkstofforschung hinsichtlich einer besseren Charakterisierung spezifischer Wirkeigenschaften von Effektoren ermöglichen Selektionsverfahren, die in einem Arbeitsgang zwei oder mehrere substanzbeeinflußbare Wachstumsparameter der Mikroalgensuspensionen analysieren und Aussagen zur Wirkspezifik aus dem Vergleich dieser möglicherweise unterschiedlich tangierten Wachstumsparameter ableiten.

So werden in den Verfahren DD-PS 200472, DD-PS 2111 26 und DD-PS 2141 46 zur Selektion von Effektoren bzw. zu ihrer Wirkcharakterisierung die Beeinflussung der optischen Eigenschaften autotropher oder heterotropher Algensuspensionen bei mindestens zwei verschiedenen Wellenlängen (beispielsweise 680nm und 750nm) herangezogen. Beim Verfahren gemäß DD-PS 21 41 46 wird zur Charakterisierung der Wirkeigenschaften der Effektoren zusätzlich auf einen Vergleich der Beeinflussung der optischen Eigenschaften in der autotrophen und der heterotrophen Testvariante zurückgegriffen.

Vergleichsweise ähnliche Aussagen erlauben die Verfahren DD-PS 212985, DD-PS 21 3950 und DD-PS 213949. Nach diesen Verfahren erfolgt die Charakterisierung der Wirkeigenschaften der Effektoren durch Analyse der Beeinflussungen der photosynthetischen oder/und respiratorischen Gaswechselumsatzprozesse autotropher oder/und heterotropher Mikroalgensuspensionen in möglichst einem Arbeitsgang und durch Vergleiche der Analysenergebnisse. Weiterreichende Aussagen zur Wirkspezifik gestatten Verfahren, bei denen in einem Arbeitsgang die gleichzeitig substanzinitiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften und der Gaswechselumsätze autotropher (DD-PS 21 6254) oder heterotropher (DD-PS 21 6253) bzw. der optischen Eigenschaften und der lonenumsätze autotropher (DD-PS 220047) Mikroalgensuspensionen analysiert und die erhaltenen Analysenergebnisse miteinander verglichen werden. Durch Nutzung eines oder aber durch Kombination mehrerer dieser Verfahren ist man mit weniger oder aber größerer Sicherheit in der Lage, die Wirkstoffe primären bzw. unspezifischen Photosynthesehemmern, primären bzw. unspezifischen Atmungseffektoren oder primären bzw. unspezifischen Effektoren des Stickstoffhaushaltes usw. zuzuordnen. Diese Selektionsverfahren sind darüber hinaus in der Lage, über die Analyse dosisabhängiger Wirkeffekt-Einwirkzeit-Kurven Informationen über Einsetzen, Verlauf und Beständigkeit der Wirkungsausprägung in Abhängigkeit von der Dosis und von der Einwirkungsdauer der Effektoren sowie über Art und Weise der Wirkungsauslösung wie durch die Soforthemmung zu liefern. Gleichzeitig wird durch entsprechende Auswertungsverfahren die Aufdeckung von Permeations- und Transportproblemen der Effektoren ermöglicht.

Trotz dieser Fortschritte beim Screening und bei der Charakterisierung von Effektoren ist die Aufdeckung spezifischer Wirkeigenschaften potentieller Effektoren von der subjektiven Auswahl des oder der genutzten Testverfahren abhängig, da ein Screening, das alle bekannten Selektionsverfahren in sich einschließt, aus ökonomischen Gründen abzulehnen ist. Daraus ergibt sich der Wunsch nach einem Screeningverfahren, das zwar ebenfalls auf Suspensionskulturen einzelliger Grünalgen beruht, das aber mit minimiertem Aufwand an Arbeitszeit, Material und Energie eine maximale Information hinsichtlich einer eindeutigen Zuordnung der Effektoren nach ihrer Wirkspezifik zu einem Wirkstoffgrundtyp erlaubt.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, für Tests mit autotrophen und heterotrophen Suspensionskulturen einzelliger Grünalgen ein Screeningverfahren vorzuschlagen, das auf einer minimierten Test- und Auswertungshierarchie beruht und eine maximale Information hinsichtlich der Zuordnung potentieller Effektoren nach ihrer Wirkeigenschaft zu Wirkstoffgrundtypen ermöglicht.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß beim „Screeningverfahren zur Charakterisierung und Selektion von Effektoren" die teils unterschiedlich substanzinitiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften, der lonenumsätze und gegebenenfalls der photosynthetischen bzw. respiratorischen Gaswechselumsätze autotroph und heterotroph kultivierter Mikroalgensuspensionen in einer minimierten Testhierarchie analysiert und die Analysenergebnisse in einem minimierten Auswertungsverfahren, das aber eine maximale Information zur möglichen Zuordnung der getesteten Effektoren hinsichtlich der gezeigten Wirkspezifik zu Wirkstoffgrundtypen ermöglicht, vergleichende Betrachtungen unterzogen werden. Das vorgeschlagene Auswertungsverfahren liefert darüber hinaus zeitunabhängige, relativierte, dosisabhängige Wirkeffekt-Verlaufs-Kurven, die neben qualitativen Aussagen zur Wirkungsrichtung und zum Wirkungsverlauf auch zu quantitativen Vergleichen herangezogen werden können.

Beim „Screeningverfahren zur Charakterisierung und Selektion von Effektoren" werden definierte Mengen chemischer Verbindungen parallel oder simultan mit einzelligen Algensuspensionen, die in einer geeigneten Nährlösung autotroph oder heterotroph kultiviert werden, in unmittelbaren Kontakt gebracht und diese Proben parallel mit unbehandelten Vergleichskulturen bei einheitlicher Temperatur zwischen 20⁰C und 38⁰C im Licht bzw. im Dunkeln belüftet, so daß auf der Grundlage der sich vollziehenden Photosynthese bzw. des Atmungsprozesses wachsen und sich entwickeln. Zu festgelegten Zeitpunkten werden dann von Proben und von Vergleichskulturen oder von Anteilen von beiden parallel oder in definierter Folge die optischen Eigenschaften mittels spektralanalytischer Verfahren bei 688 und 750 nm oder anderen geeigneten Wellenlängenbereichen, der Stickstoffionenumsatz mittels pH-Elektroden, nitratsensitiver Elektroden bzw. anderen stickstoffionensensitiver Elektroden und bei Bedarf der photosynthetische bzw. respiratorische Sauerstoffumsatz mittels Paramagnet-Gasanalysatoren, sauerstoffsensitiver Elektroden oder anderen geeigneten Methoden und/oder der photosynthetische bzw. respiratorische Kohlendioxidumsatz mittels Infrarot-Gasanalysatoren bzw. anderer geeigneter Methoden in je einem Arbeitsgang untersucht und die dabei gewonnenen Analysenergebnisse vergleichenden Betrachtungen unterzogen.

Für die Einordnung der untersuchten Effektoren nach ihrer Wirkspezifik in den genutzten standardisierten Chlorella-Tests in Grundtypen wird neben anderen denkbaren Test- und Auswertungshierarchien folgender Gang vorgeschlagen, de mit minimiertem Aufwand zu den notwendigen Informationen führt und durch Einbeziehung weiterer Erkenntnisse weiter präzisiert werden kann.

1. Selektion der Effektoren nach dem Absolutwert pc₅₀(A)/1 Λ der im Autotrophtest ermittelt wurde In Abhängigkeit der Größe der pc₅₀(A)-Werte der Effektoren im autotrophen Wachstumstest können die Wirkstoffe nach folgender Bonitur hinsichtlich ihrer gezeigten algiziden Wirksamkeit quantifiziert werden.

6. Stufe

5.Stufe6,1gpC₆₀(autotroph) 4. Stufe 5,2 δ pc₆o(autotroph) 3. Stufe 4,3 g pC₅₀(autotroph) 2. Stufe 3,5 ä pC₅₀(autotroph) I.Stufe PC₅0(autotroph)

s 6,1 sehr stark wirksam =§ 5,2 stark wirksam s 4,3 gut wirksam s 3,5 wirksam S 2,6schlecht wirksam S 2,6 nicht wirksam

Nach dieser Bonitur können beispielsweise entsprechend den pcsoiApWerten in Tabelle 1 die Wirkstoffe Atrazin und Prometryn als sehr stark wirksam, Simazin, Metabenzthiazuron (techn.) und Bromuron als stark wirksam, DNOC als gut wirksam und der Wirkstoff Amidinothioharnstoff als schlecht wirksam eingestuft werden

2. Selektion der Effektoren durch Vergleich der quantitativen Wirkparameter PC₅₀/!/, die in der autotrophen und derheterotrophen Testvariante bestimmt wurden

Entsprechend der Größe der Apc_so-Werte, die aus einem Vergleich der pc₅₀-Daten aus den autotrophen(A) und heterotrophen(H) Testvarianten gemäß G. (1) resultieren, können die Effektoren in verschiedene quantitative Stufen hinsichtlich ihrer Beeinflussung der Photosynthese eingeordnet werden, wobei fünf Boniturstufen vorgeschlagen werden. 1 pc₅o = -Ig {ED50}, [ED₅₀] = mol · Γ¹; aus Dosis-Wirkungs-Beziehungen ermittelte negative dekadische Logarithmen der molaren Effektorkonzentrationen, welche eine 50%ige Hemmung des autotrophen bzw. heterotrophen Wachstums synchroner Chlorella-vulgaris-Suspensionen bewirken.

Apc₆₀ =

- PC₅₀(H)

(D

5. Stufe Apc₅₀ s 3,05

4. Stufe 3,04 a Apc_5Oä 2,18 3. Stufe 2,17 SApC₅₀ S 1,31 2. Stufe 1,30 a ApC₅₀ g 0,43 I.Stufe Apc_6Og 0,42

echte bzw. primäre Photosynthesehemmer gute Photosynthesehemmer mittelmäßige Photosynthesehemmer geringe, schlechte Photosynthesehemmer unspezifische Photosynthesehemmer

Aufgrund ihrer Apc₅₀-Werte gemäß Tabelle 1 sind beispielsweise die Herbizide Simazin und Atrazin als echte Photosynthesehemmer, Prometryn, Bromuron und Metabenzthiazuron (techn.) als gute Photosynthesehemmer und DNOC und Amidinothioharnstoff als unspezifische Photosynthesehemmer einzustufen.

Tabelle 1 pc₅₀-Daten¹¹ für die Hemmung des autotrophen (A) und des heterotrophen Wachstums (H) synchroner Chlorella-Suspensionen

PC50(A)	6,07
Substanzen	6,22
Simazin	6,66
Atrazin	5,92
Prometryn	5,6
Bromuron	5,11
Metabenzthiazuron (techn.)	2,97
DNOC	5,84
Amidinothioharnstoff	6,10
A
B

PC₅₀(H)

Ε(λ=750ηΐη)

6,14 6,19 6,65 6,30 5,64 5,07 2,97 5,84 5,94

<3,0²'

3,13

3,72

3,44

3,40

4,91

<3,6²»

4,06

4,18

1) PC₅₀ =-Ig(ED₅₀) te] = mol · Γ');

Die Bestimmungen der pc₅₀-Werte erfolgten über Extinktionsmessungen der Suspensionen bei λ = 680 und λ = 750 nm.

2) Bei der maximalen getesteten Wirkkonzentration pe = 3,0 bzw. 3,6 wurde keine Wirkung festgestellt.

3. Einteilung der Effektoren nach den Effekten bei der substanzinitiierten Beeinflussung der optischen Eigenschaften beispielsweise bei 680 und 750nm im autotrophen Wachstumstest

Nach der Qualität der Wirkbilder in Form von Auftragungen der Wachstumsparameter in Form der Logarithmen der Extinktionen beispielsweise bei 680 ηm und 750 ηm als Ausdruck der substanzinitiierten Beeinflussungen der Chlorophyllentwicklung und des allgemeinen Zellwachstums bzw. in Form der A'lgE-Daten bei 680 und 750nm gemäß Gl.(2) können aufgrund der wirkstoffdeterminierten Streueffekte die Effektoren in drei Grundtypen unterschieden werden.

'9E0,Kontrolle ""

₍₂₎

~ !gtEnde.Kontrolle

e,Kontrolle

Eine erste Grundqualität zeigt als Beispiel das Wirkbild Fig. 1, A (A'lgE₆8o/A'lgE₇₅o) von Simazin. Die Qualität besteht darin, daß im Vergleich zur Kontrolle K dosisabhängig mitzunehmender Konzentration von Dosis 1 bis Dosis 9 die optischen Eigenschaften bei 750 nm stärker tangiert werden als bei 680 nm. Durch die Auftragung der Hemmparameter (A⁺IgEeSoM⁺IgE₇₅₀), die entsprechend Gl. (3) bestimmt werden können (Fig. 1, B), wird dieser Effekt deutlich hervorgehoben.

Eine zweite Grundqualität zeigt als Beispiel das Wirkbild Fig. 13, A von Amidinothioharnstoff. In diesem Fall bilden alle Meßpunkte A'lgE₆8₀/A'lgE₇₅₀ eine mit der Kontrolle K mehr oder weniger gute, deckungsgleiche Kurve. Die geringen Abweichungen lassen sich wahrscheinlich auf Streueffekte zurückführen, die auch in Fig. 13, B für die Auftragung optischer Eigenschaften bei 680 und 750nm auftreten.

Bei einer dritten Grundqualität (Wirkbild Fig. 11, A von DNOC) werden im Gegensatz zur ersten Grundqualität dosisabhängig mit zunehmender Effektorkonzentration 1 bis 8 die optischen Eigenschaften bei 680nm stärker tangiert als bei 750nm. Auch ein Vergleich in Form der Auftragung der Hemmparameter für DNOC Fig. 11, B macht deutlich, daß es zu einer wirkstoffdeterminierten Ausbleichung der Chloroplasten und somit zur Beeinträchtigung der Photosyntheseleistung durch diesen Wirkstoffgrundtyp kommt.

4. Einteilung der Wirkstoffe nach Effekten beim Vergleich der Beeinflussungen des Zellwachstums, das beispielsweise über Extinktionsmessungen bei 750 nm erfaßt werden kann, mit der Beeinflussung der Nitrationenaufnahme, die durch

_ entsprechende pH-Wert-Änderungen der Algensuspensionen angezeigt werden Solche Vergleiche in Form von lgE₆₈o-pH-Auftragungen bzw. lgE₇₅₀-pH-Auftragungen oder besser in Form von A'lge/A'pH- bzw. A⁺lgEM⁺pH-Auftragungen, wobei die Wachstumsparameter Δ'ρΗ gemäß Gl. (4) und die Hemmparameter Δ⁺ρΗ für die Beeinträchtigung der pH-Werte der Algensuspensionen über Gl. (5) zugänglich sind, erlauben eine detaillierte Einstufung und Differenzierung der Wirkstoffe. Hierbei genügt es meist, für solche Betrachtungen die A'lgE₇₅₀/A'pH bzw. A⁺lgE₇₅₀/A⁺pH-Auftragungen (Wirkbilder C und D) heranzuziehen.

Δ'ρΗ = ^ΡΗ°·^Probe ~ ^pHt'^Probe(4)

PH₀, Kontrolle ~ pHEnde, Kontrolle . .

.+ ι, pHt,Kontrolle ~~ pHt,Probe Λ pH = — — (5)

P"o, Kontrolle "~ P^Ende. Kontrolle

Aufgrund ihrer vergleichbaren Struktur zeigen hier als Beispiel Simazin und Atrazin vergleichbare kompliziert verlaufende AIgE₇₅₀ - Δ'ρΗ bzw. A⁺IgE₇₅₀ - A⁺pH-Kurven, Fig. 2, C und D Fig. 4, C und D, die dosisabhängig durch ihre wellenartige Form mehrere nacheinander verlaufende Metabolismen anzeigen. Zunächst wird dosisabhängig das Wachstum der Zellen stärker tangiert als der lonenumsatz. Danach wird der lonenumsatz stärker beeinflußt als das Zellenwachstum usw.

Faßt man die bisher zur Beurteilung der Wirkspezifik herangezogenen Parameter: Verhältnis pc₅₀(_A)/pc₅₀(H), Betrag von pc₅₀(A), Wirkbilder Fign. 1 und 2 zusammen, so zeigt der Wirkstoff Simazin im Vergleich zu den anderen Wirkstoffen eine eigene Qualität, die man als Simazintyp bezeichnen könnte.

Neben diesem Wirkstoffgrundtyp ist eine Vielzahl weiterer Grundtypen von Wirkstoffen hinsichtlich ihrer Wirkcharakteristik denkbar, die aber erst durch noch ausstehende Untersuchungen charakterisiert werden müssen.

5. Einbeziehung weiterer Effekte zur qualitativen und quantitativen Unterscheidung der Wirkstoffe nach ihrer Wirkcharakteristik

Neben den unter 1 bis 4 genannten Selektionsprinzipien können zur weiteren Differenzierung der Wirkstoffe zusätzliche qualitative und quantitative Effekte, die entweder aus den gleichen Tests oder zusätzlichen Untersuchungen resultieren, herangezogen werden. So ist eine differenzierte Selektion der Effektoren nach der Qualität von Wirkbildern möglich, bei denen beispielsweise weitere geeignete Parameter, die eng mit dem Wachstum der Algensuspensionen zusammenhängen, untereinander verglichen werden. Beispielsweise können zusätzlich die Beeinflussungen der photosynthetischen und/oder respiratorischen Gaswechselumsätze (O₂, CO₂) untereinander oder mit den Beeinflussungen der optischen Eigenschaften bei 680 und 750nm oder weiteren Wellenlängen und mit lonenumsätzen bzw. pH-Werten in beiden Testvarianten verglichen wurden.

Bei Bedarf können in weiterführenden Tests die teils unterschiedlich substanzinitiierten Beeinflussungen der lonenumsätze des durch wahlweise Nitrat- und durch Ammoniumionen determinierten Wachstums einzelliger Algensuspensionen untersucht und vergleichend betrachtet werden. Durch solche Spezialtests läßt sich die Wirkspezifik der Effektoren weiter einengen, wobei man zunehmend konkretere Hinweise betreffs der möglichen kommerziellen Nutzung erhält.

Durch Vergleich solcher Wirkdaten wie pc₅₀₍A), pc₅o(H), Apc₅₀ und von Wirkbildern gemäß den Fign. 1 bis 18 von neu untersuchten Substanzen, die aus der vorgeschlagenen minimierten Testhierarchie resultieren, mit einer Wirkdaten- und Wirkbildkartei oder mit Hilfe der elektronischen Datenverarbeitung von Wirkstoffgrundtypen, die sich in der Praxis bewährt haben, erhält man durch Nutzung der vorgeschlagenen minimierten Auswertung der Wirkdaten konkrete Hinweise über ähnliche Wirkquantitäten und vergleichbare Wirkspezifiken und damit über kommerzielle Anwendungsmöglichkeiten neuer Effektoren.

Ausführungsbeispiele

Frisch geschlüpfte Aplanosporen synchroner Kulturen einzelliger Grünalgen der Species Chlorella vulgaris var. vu Ig a ris, Stamm BÖHM und BORNS 1972/1, werden in eine anorganische Nährlösung mit Fe-EDTA-Komplex und Spurenstoffen so überführt, daß jeder Kubikzentimeter der Suspension etwa sechs Millionen Algenzellen enthält. VLiter der Kultur-Nährlösung N setzt sich dabei aus den drei Teilnährlösungen N₁, N₂ und N₃ zusammen;

1000cm³N = 998Cm³N₁ + 1 Cm³N₂ + 1 Cm³N₃.

Die Nährlösungen N₁, N₂ und N₃ enthalten folgende Substanzen:

Nährlösung N₁

Für die Nährlösung N-, werden zunächst die Stammlösungen 1 bis 4 durch Auffüllen der genannten Substanzmengen mit Aqua dest. hergestellt:

Stammlösung 1: 10OgKNO₃ZIOOOCm³

Stammlösung 2: 25g CaCI₂ · 6H₂O/1 000cm³

Stammlösung 3: 250g MgSO₄ · 7H₂O/1 000cm³

Stammlösung 4: 160g KH₂PO₄/1 000cm³.

Diese Stammlösungen sind zu sterilisieren (Feuchtsterilisation) und kühl zu lagern.

Aus je 5 cm³ der Stammlösung 1, 0,5 cm³ der Stamm lösung 2,1 cm³ der Stamm lösung 3 und 5 cm³ der Stamm lösung 4 werden durch Auffüllen mit destilliertem Wasser entweder 1 000cm³ bzw. bei Beachtung der Verhältnisse eine beliebige Menge der Nährlösung N₁ hergestellt.

Nährlösung N₂

Die Nährlösung N₂ enthält in 1 000cm³ Lösung 61 mg H₃BO₃,169 mg MnSO₄- H₂O, 287 mg ZnSO₄-7H₂O, 2,5mg CuSO₄ · 5H₂O und 12,4mg (NH₄I₂MoO₄.

Nährlösung N₃

Zur Herstellung der Nährlösung N₃ werden 6,9 g FeSO₄ · 7 H₂O und 9,3 g Na-EDTA in destilliertem Wasser gelöst und auf 1 000 cm³

mit Aqua dest. aufgefüllt. .

Für die heterotrophe Testvariante werden zu den frisch hergestellten Algensuspension 0,1 Ma.-% Glukose als organische Kohlenstoffquelle und 20mg/l Chloramphenicol zugegeben.

Je 80 cm³ der so hergestellten Suspension werden in je eine Kulturröhre eingebracht und mit je 1 cm³ verschieden konzentrierter wäßriger Lösung der zu prüfenden Substanzen gemäß Tabelle 1 sowie der zu prüfenden Effektoren A und B beimpft oder als unbehandelte Kontrollen in der autotrophen Testvariante bei 37°C belichtet und mit gereinigter Luft, der 2VoI.-% Kohlendioxid beigegeben wird, begast oder in der heterotrophen Testvariante nur bei 37°C im Dunkeln mit gereinigter Luft begast, so daß alle erforderlichen Voraussetzungen für die Photosynthese bzw. für das heterotrophe Wachstum gegeben sind.

Während die in Nährlösung suspendierten Zellen in den unbehandelten Vergleichskulturen normal wachsen und sich entwickeln, werden Wachstum und lonenumsatz in den mit Chemikalien versetzten Proben mehr oder weniger beeinflußt, wenn verschiedene Substanzkonzentrationen den Photosyntheseprözeß, die Atmung oder den Stickstoffhaushalt mehr oder weniger stören. In definierter Zeitfolge werden von den Vergleichskulturen und den mit den Substanzen behandelten Proben die optischen Eigenschaften bei 680 und 750 nm als Wachstumsparameter sowie der pH-Wert als Maß für den Stickstoffhaushalt gemessen.

Die Ergebnisse der Analysen sind der Tabelle 1 unddenFign.1 bis 18 zu entnehmen.

Die Tabelle 1 enthält die Wirkquantitäten PC₅₀(A), pcsoim und ApC₅₀, die aus Dosis-Wirkungs-Untersuchungen meistens bereits in einem Vorscreening, bei dem der Wirkbereich der Effektoren eingegrenzt wird, zugänglich und in der angegebenen Weise (siehe Tabelle 1) definiert sind. Von allen Wirkstoffen wurden die über die Gleichungen (2) und (3) bestimmten Wachstumsparameter AMgE₆₈₀, AIgE₇₅₀ und Δ'ρΗ und die über die Gleichungen (4) und (5) zugänglichen Hemmpareameter A⁺IgE₆S₀, A⁺IgE₇₅₀ und A⁺pH in Form von Wirkbildern verglichen. In den Wirkbildern A und C der Fign.1 bis 18 wurden einmal die Wachstumsparameter A¹IgE₆₈₀ als Maß der Chlorophyllbeeinträchtigung und A¹IgE₇₅₀ als Maß des allgemeinen Zellwachstums bzw. die A'lgE₇₅₀-Daten mit den A'pH-Werten als Maß der Nitrationenaufnahmebeeinflussungen miteinander verglichen. Die Wirkbilder B und D der Fign. 1 bis 18 enthalten die Vergleiche der entsprechenden HemmRarameter in Form von A⁺IgE₆₈₀ZA⁺IgE₇₅₀- und A⁺lgE₇₅₀ZA⁺pH-Auftragungen.

So zeigt das Wirkbild Fig.1, A für Simazin, daß im Vergleich zur Kontrolle K mitzunehmender Dosis von 1 bis 9 das allgemeine Zellwachstum (A¹IgE₇₅₀) etwas stärker tangiert wird als das Chlorophyllwachstum (A'lgE₆₈₀), wobei dieser relativ geringe Effekt am Anfang der Kurven am deutlichsten zu erkennen ist. Die Auftragung der Hemmparameter A⁺IgE₆₈₀ZA⁺IgE₇₅₀ in Fig. 1, B bestätigt die Aussagen aus Fig. 1, A. Deutlich ist zu erkennen, daß alle Dosen 1 bis 9 eine stärkere Hemmung des Zellwachstums, angezeigt durch die entsprechenden A⁺lgE₇₅₀-Daten, determinieren.

Aus beiden Wirkbildern Fig. 1, A und B kann geschlußfolgert werden, daß Simazin neben der Beeinflussung der Photosynthese bzw. der Ch loropl asten primär zu einer Oberflächenbeeinflussung bzw. Form veränderung der Zellen führt, die über St reu effekte durch die Extinktionsmessungen bei 750 nm erfaßt werden und in diesem Fall eine scheinbare stärkere Tangierung des Zellwachstums anzeigen.

Ein ganz anderes Bild zeigen die Wirkbilder, in denen die Wachstumsparameter A¹IgE₇₅₀ mit den entsprechenden A'pH-Werten, Fig.2, C bzw. die Hemmparameter A⁺IgE₇₅₀ mit den A⁺pH-Daten, Fig. 2, D verglichen werden.

So zeigt die Fig.2, C für die Beeinflussung des Zellwachstums und des Nitrathaushaltes durch Simazin mehrere Metabolismen, die durch die in mehreren Wellen verlaufenden A'lgE₇₅₀-A'pH-Kurven angezeigt werden. Dosisabhängig wird zunehmend in einem primären Schritt das Zellwachstum stärker tangiert als die Beeinflussung des Nitrathaushaltes. Die Dosis 7 führt zu einer Blockierung der Nitrationenaufnahme bei gleichzeitig weiterem Wachstum der Zellen. Die sehr starken Dosen 8 und 9 führen zu einer Protonenemission, denn es wird eine pH-Wert-Abnahme angezeigt. In einem sekundären Prozeß wird dann die Beeinflussung des Nitrathaushaltes im Vergleich zum Zellwachstum stärker tangiert. Ein Vergleich der entsprechenden A¹IgE₇₅₀-A'pH-Kurven verdeutlicht auch, daß bei kleiner werdenden Dosen mit weiterem Verlauf der Kurven das entsprechende Verhältnis A'lgE₇₅₀ZA'pH der Kontrolle K angenähert wird. Das läßt Reparatureffekte vermuten. Einen ganz anderen Beitrag zur Wirkspezifik

von Simazin vermittelt das Wirkbild Fig. 2, D. Hier wird klar ersichtlich, daß in einem primären Metabolismus zunächst dosisabhängig das Wachstum der Zellen stärker gehemmt wird als der lonenumsatz. In einem sekundären Prozeß wird dann dosisabhängig der Austausch der Nitrationen gegen Hydroxidionen bedeutend stärker gehemmt als das Zellwachstum. Aufgrund der ähnlichen Struktur von Atrazin und Simazin sind auch vergleichbare Wirkparameter pc₅₀ und ApC₅₀ sowie vergleichbare Beeinflussungen der optischen Eigenschaften und des pH-Wertes der Algensuspensionen zu erwarten. Das wird durch die pc₅₀- und Apc₅₀-Daten in Tabelle 1 und die Wirkbilder A, B, C und D in Fig.3 und 4 bestätigt. Geringe Unterschiede zeigt nur der Vergleich der Wirkbilder C und D in den Fign.2 und 4 für Simazin und Atrazin, die strukturell bedingt sein dürften und sich beim Atrazin in einer zum Simazin vergleichsweise abgeschwächten Beeinflussung der gleichen Metabolismen äußert. Auch die Wirkdaten in Tabelle 1 und die Wirkbilder A, B, C und D von Prometryn und Metabenzthiazuron, Fign.5 und 6 bzw. Fign.7 und 8, sind bei vorliegenden quantitativen Unterschieden prinzipiell mit denen des Simazins bzw. Atrazins zu vergleichen. Damit können diese vier Wirkstoffe einem Wirkstoffgrundtyp zugeordnet werden, zu dessen Mustererkennung die genannten Wirkdaten und Wirkbilder herangezogen werden können.

Auch die Wirkdaten und Wirkbilder von Bromuron, Fign. 9 und 10, sind prinzipiell qualitativ mit denen des Simazins vergleichbar und illustrieren ahn liehe Wirkmechanismen und Metabolism en, die hier aber in stark abgeschwächter Form angezeigt werden. Im Gegensatz zu den bisher betrachteten Wirkstoffen weisen die Wirkquantitäten pc₅₀ und ApC₅₀ in Tabelle 1 und die Wirkbilder A, B, C und D von DNOC in den Fign. 11 und 12 auf einen weiteren Grundtyp der herbiziden Wirkstoffe hin. Neben quantitativen Unterschieden des pc₅₀-Wertes von DNOC zu Simazin, Atrazin, Prometryn, Bromuron und Metabenzthiazuron (techn.) fällt die neue Qualität des Apc₅₀-Wertes von 0,20 auf, die bereits hier darauf hinweist, daß DNOC im Gegensatz zu den bisher betrachteten Wirkstoffen nur ein unspezifischer Photosynthesehemmer ist. Auch ein Vergleich der Wachstumsparameter AIgE₆₈₀ZAIgE₇₅₀ in Fig. 11, A für DNOC weist im Gegensatz zu den bisher betrachteten Wirkstoffen einen anderen Effekt aus, der zur Mustererkennung genutzt werden kann. DieA'lgE₆8o/A'lgE_75O-Kurvenfürdie Dosen 5 bis 8 lassen erkennen, daß die optischen Eigenschaften bei 680nm und somit die Photosynthese stärker gehemmt werden als das Zellenwachstum. Bei der Betrachtung der Auftragung der Hemmparameter (A⁺lgE₆₈₀/A⁺lgE₇₅₀) in Fig. 11 B sind nur wenig Effekte zur Aufklärung der Wirkspezifik zu erkennen. Bei der Betrachtung der Auftragungen der Wachstumsparameter A'lgE₇₅₀/A'pH in Fig. 12, C bzw. der Hemmparameter in Fig. 12, D zeigen die Kurven für die Dosen 5 bis 8, daß das Zeil wachstum stärker gehemmt wird als der lonenumsatz, wobei dieser Effekt keine eindeutige Dosisabhängigkeit aufweist. Der wellenartige Verlauf der Kurven weist darauf hin, daß in einem sekundären Prozeß der Nitrathaushalt und in einem tertiären Prozeß das Zellwachstum stärker beeinflußt werden. Die Kurve 5 erreicht die Kurve der Kontrolle K, was wiederum auf Reparaturprozesse hinweist.

Insgesamt kann aus den Fig. 11 und 12 zur Wirkspezifik von DNOC abgeleitet werden, daß dieser Effektor im wesentlichen unspezifisch wirkt, wobei eine primäre Chlorophyllbeeinträchtigung angenommen werden kann.

Aufgrund der Wirkparameter in Tabelle 1 und der Wirkbilder A, B, C und D in den Fign. 13 und 14 kann Amidinothioharnstoff als ein weiterer Grundtyp der Effektoren eingestuft werden, der sich durch relativ geringe Wirkung im standardisierten Algentest und in einer relativ unspezifischen Wirkung in den Vergleichen der Wachstums-und Hemmparameter in Fig. 13 auszeichnet. Nur die Wirkbilder Fig. 14, C und D weisen auf eine dosisabhängige stärkere Beeinflussung des Nitrationshaushaltes im Vergleich zum allgemeinen Zellwachstum.

Die Wirkstoffe A und B, für die vergleichbare Wirkdaten pc₅₀ und ApC₅₀ (Tabelle 1) bestimmt wurden, weisen aber in den Auftragungen der Wachstums- und Hemmparameter in den Wirkbildern A, B, C und D in den Fign. 15 bis 18 qualitative teilweise gegenläufige Effekte auf, so daß beide Wirkstoffe aufgrund ihrer Wirkspezifik zwei weiteren Wirkstoffgrundtypenzuzuordnen sind.

Bereits die Wirkparameter (Tabelle 1) und die Wirkbildner Fign. 1 bis 18 der neun untersuchten Wirkstoffe verdeutlichen, daß die vorgeschlagene minimierte Testhierarchie auf der Grundlage autotroph und heterotroph kultivierter Algensuspensionen und das vorgeschlagene minimierte Auswertungssystem der Meßdaten zu klaren Informationen über die Wirkspezifik der Wirkstoffe führen können, die sich als Screeningverfahren zur Charakterisierung und Selektion von Effektoren nutzen lassen.

Claims (7)

1. Screeningverfahren zur Charakterisierung und Selektion von Effektoren, gekennzeichnet dadurch, daß mittels einer minimierten Testhierarchie die teils substanzinitiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften, der lonenumsätze und gegebenenfalls der photosynthetischen und/oder respiratorischen Gaswechselumsätze in zwei standardisierten Testvarianten basierend auf autotroph und heterotroph kultivierten Algensuspensionen, analysiert und die Analysenergebnisse einem minimierten Auswertungsmodus unterzogen werden, um dann mittels Vergleich der absoluten Wirkquantitäten, die Wirkquantitätsdifferenzen aus beiden Testvarianten und von Wirkbildern, in denen die für die Beeinflussungen der optischen Eigenschaften bei beispielsweise zwei Wellenlängen bzw. -bereichen, der lonenumsätze bzw. der pH-Werte und gegebenenfalls der Gaswechselumsätze als Wirkeffekt-Wirkeffekt-Kurven in Abhängigkeit von der Dosis betrachtet werden, typische Aussagen zur Wirkspezifik der untersuchten Effektoren zu erhalten, die dann mit entsprechenden Daten gut untersuchter, beispielsweise kommerziell vertriebener Wirkstoffe mit Hilfe einer Wirkdaten- und Wirkbildkartei, der elektronischen Datenverarbeitung oder anderer Vergleichsmethoden verglichen werden, um die untersuchten Wirkstoffe nach ihrer in den standardisierten Tests gezeigten Wirkspezifik bestimmten Wirkstoffgrundtypen zuzuordnen und Aussagen über Wirkmechanismen, Metabolismen und möglichen Anwendungen ableiten zu können.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als autotrophe und heterotrophe Zellsuspensionen alle suspendierbaren autotrophen und heterotrophen einzelligen Grünalgen verwendet werden können.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die optischen Eigenschaften der Mikroalgensuspensionen mittels Spektralkolorimetrie, Spektralphotometrie oder Nephelometrie bei ein bzw. zwei bis η verschiedenen Wellenlängenbereichen oder ganzen Spektralbereichen im infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Spektralbereich analysiert werden.

4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß der lonenumsatz der Mikroalgensuspensionen mittels pH-Elektroden, nitratsensitiver Elektroden oder anderer ionensensitiver Elektroden, polarographischer Methoden oder anderen elektrochemischen Verfahren, kond.uktometrischer Methoden, spektralanalytischer Verfahren oder durch Kombination mehrerer dieser Methoden analysiert wird.

5. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß der Sauerstoffumsatz mittels Paramagnet-Gasanalysatoren, sauerstoffsensitiver Elektroden, Polarographie und anderen elektrochemischen Meßketten, manometrischen Verfahren, der Winklermethode oder durch Kombination mehrerer dieser Methoden analysiert wird.

6. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß der Kohlendioxidumsatz mittels Infrarot-Gasanalysatoren, ¹⁴C-Methode, photometrischer Methoden oder durch Kombination mehrerer dieser Methoden analysiert wird.

7. Verfahren nach Punkt 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die optischen Eigenschaften, der lonenumsatz und der Gaswechselumsatz der autotrophen oder heterotrophen Mikroalgensuspensionen in je einem Arbeitsgang kontinuierlich oder in definierter Zeitfolge parallel oder simultan analysiert werden.

Hierzu 18 Seiten Zeichnungen