DD263663A7 - Verfahren zur herstellung eines immobilisierten cholinestetase-praeparates - Google Patents
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Abstract
Immobilisierte Cholinesteraseenzympraeparate werden hergestellt durch Behandlung eines Polymerharzes, bestehend aus Acrylsaeure und/oder Methycrylsaeure und Acrylamid- und/oder Methacrylmonomeren mit einem Vernetzungsmittel vom Acryl- oder Allyltyp und mit einem Gehalt von mindestens 0,1 mAeq/g funktioneller COOH-Gruppen, mit einem Carbodiimidderivat, das in Wasser loeslich ist oder in einem organischen Loesungsmittel bei unter 0C liegenden Temperaturen loeslich ist, Auftragung einer Loesung von Cholinesteraseenzym mit einem p H-Wert von 4,5 bis 8,5 auf den resultierenden aktivierten Traeger, Waschen des resultierenden Produktes und Trocknen, wenn erforderlich, des Produktes.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuartigen immobilisierten Cholinesterase-Präparates. Es ist bekannt, daß das Enzym Cholinesterase, das meistens aus dem Blutserum von Pferden gewonnen wird, zum Nachweis von Nervengiften des Typs Phosphorsäureester, Carbamat und Sulfatester sowie zur quantitativen Bestimmung der in der Luft oder im Wasser vorkommenden Nervengifte geeignet ist. Die Grundlage des Nachweises und der Messung ist die Hemmwirkung, die die giftigen Stoffe auf das Enzym ausüben. Die immobilisierten Cholinesterase-Enzymprüparato können die zentralen Elemente von kontinuierlich arbeitenden Meßsystemen sein, wie sie zum Beispiel in Anal. Chem. 37,1378 (1965) und Anal. Biochem. 51, 326 (1973) beschrieben sind.
Zur Immobilisierung der aus dem Blutserum von Pferden gewonnenen Cholinesterase sind aus der Literatur verschiedene Methoden bekannt. Über den Einschluß des Enzyms in unterschiedliche Gele — in erster Linie Stärkegele — kann in der folgenden Literatur nachgelesen werden: Anal. Chem. 37,1378 (1965), Anal. Biochem. 19,587 (1967), Anal. Biochem. 33,341 (1970) und US-PS 3223593. In der Patentschrift ist auch der Einschluß des Enzyms in Agar- und Cai rageen-Gele beschrieben. In Biochim. Biophys. Acta 212,362 (1970) und Anal. Biochem. 33,341 (1970) wird als Einbettungsmedium Polyacrylamid vorgeschlagen. Das Enzym kann mittels kovalenter Bindung an über weitere funktioneile Gruppen verfügende, polymere Makromoleküle gekoppelt werden. So wird zum Beispiel nach Biochim. Biophys. Acta 191,478 (1969) das Enzym an vorher mit Cyanbromid aktivierter Sepharose 2B immobilisiert, während gemäß Biochim. Biophys. Acta 377,297 (1975) als Träger Polymaleinsäureanhydrid verwendet wird. Nach Clin. Chini. Acta 121,125 (1980) kann das Enzym durch mittels Carbodiimid oder Glutaraldehyd vorgenommene Kopplung an nichtporösem Glas immobilisiert werden, während es gemäß der sowjetischen Patentschiift Nr.707923 an aktiviertes poröses Glas oder Silikagel gebunden wird. Als Aktivierungsmittel dient Cyanursäurechlorid. Gemäß Can. J. Biochem. 48,1314 (1970) kann die aus dem Pferdeserum gewonnene Cholinesterase auch kovalent an einen Komplex aus Procion brilliant orange und DEAE-Cellulose gebunden werden.
Aus den in bekannter Weise hergestellten Präparaten, bei denen die Cholinesterase in ein Gel eingeschlossen ist, wird das Enzym nach und nach herausgelöst, die Präparate sind deshalb für eine Langzeitbenutzung nicht geeignet. Die kovalent an ein Substrat gebundene Cholinesterase enthaltenden Präparate haben unter dem Aspekt der Verwendung in automatischen Systemen ungünstige Durchflußeigenschaften, auch sind einige der Trägerstoffe (zum Beispiel Sepharose 2 B) anfällig gegen mikrobielle Einwirkungen.
Ziel der Erfindung ist die Beseitigung der aufgeführten Mängel. Erfindungsgemäß soll ein immobilisiertes Cholinesterase-Präparat hergestellt werden, das für l.angzeitgebrauch geeignet ist und das Enzym an einen chemisch inerten, gegen die Einwirkung von Mikroorganismen unbegrenzt widerstandsfähigen, über gute mechanische Eigenschaften verfügenden, eine große Durchflußgeschwindigkeit gewährleistenden Träger gebunden enthält.
Es wurde nun gefunden, daß die aus den Monomeren Acrylsäure und/oder Methacrylsäure sowie Acrylamid und/oder Methacrylamid mit einem Acryl- oder Allyl-Vernetzer (wie N.N'-Methylen-bis-acrylamid, Äthylen-diacrylat oder N,N'-Diallyl-Weinsäureamid) aufgebauten, als funktioneile Gruppen pro Gramm wenigstens 0,1 mÄquival., zweckmäßig 2-8mÄquival. Carboxylgruppen enthaltenden Polymei harze den an die Trägerstoffe gestellten Anforderungen völlig gerecht werden. Diese Enzymträger können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Zum Beispiel können Acrylamid und/oder Methacrylamid in Gegenwart eines vernetzend wirkenden Monomers mit Acrylsäure und/oder Methacrylsäure copolymerisiert werden, während gemäß einer anderen Möglichkeit zunächst aus Acrylamid und/oder Methacrylamid mit den bereits genannten Vernetzern ein vernetztes Polymer hergestellt wird und an diesem dann durch partielle Hydrolyse der Säureamidgruppen die Carboxylgruppen in der gewünschten Menge erzeugt werden. Zu diesem letzteren Typ gehören z. B. die aus dem von Reanal Finomvegyszergyär (Budapest) in Form von Copolymerperlen in den Handel gebrachten Acrylamid „Akrilex P" (N,N'-Methylenbis-acrylamid-Copolymer in den Typen Akrilex P-30, P-100 und P-200) durch mit Säure (zum Beispiel Salzsäure oder eine sonstige starke Säure) oder Lauge (zum Beispiel Natriumhydroxid, Natriumcarbonat oder einer sonstigen starken Lauge) vorgenommene partielle Hydrolyse entstehenden Enzymträger des Typs Akrilex C. In diesen Substanzen wird während der Hydrolyse etwa die Hälfte der-CO-NHj-Gruppen zu Carboxylgruppen hydrolysiert, während die verbloibenden -CO-NHj-Gruppen auch unter energischen Reaktionsbedingungen nicht hydrolysieren. In dem partiell hydrolysieren Copolymer befinden sich demnach zwischen den Carboxylgruppen unveränderte -CO-NH2-Gruppen, die eine günstige räumliche Verteilung der Carboxylgruppen gewährleisten. Wird nun an die freien Carboxylgruppen mittels der bekannten Aktivierung mit Carbodiimid ein Enzym gekoppelt.
so behindern sich die immobilisierten Enzymmoleküle infolge der günstigen räumlichen Verteilung der Carboxylgruppen gegenseitig nicht in ihrer Funktion, d. h. die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms kann beträchtliche Werte annehmen. Dio gleichen vorteilhaften Eigenschaften weisen auch die aus Acrylsäure und/oder Methacrylsäure sowie Acrylamid
und/oder Methacrylamid und vernetzenden bifunktionellen Monomeren hergestellten, pro Gramm 0,1-8mÄquival.
Carboxylgruppen enthaltenden Polymere auf. Diese Polymere liegen in Form von Perlen vor, wodurch eine hohe '
Durchströmungsgeschwindigkait ermöglicht wird, auch sind sie chemisch inert und gegen Mikroorganismen völlig resistent.
Die funktioneilen Carboxylgruppen der zu verwand' '.Jt>n Enzymträger können in bekannter Weise mit Carbodiimld aktiviert werden und sind dann zum Binden der Cholinesterai: geeignet. Die Kopplungsreaktion kann auch untor schonenden
Bedingungen (0-4°C, pH 7,0) vorgenommen werden. j
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Cholinesterase-Präparaten. Für das
erfindungsgemäße Verfahren ist charakteristisch, daß man aus Acrylsäure- und/oder Methacrylsäure- sowie Acrylamid- und/ \
oder Methacrylamid-Einheiten mit Acryl- oder Allylvernetzern aufgebaute, pro Gramm 0,1-8mÄquival. Carboxylgruppen '
enthaltende Polymerharze mit einer wasserlöslichen oder bei Temperaturen unter O0C mit einer in organischen Lösungsmitteln löslichen Carbodiirnid-Verbindung behandelt, auf den aktivierten Trager in einer einen wvisctien 4,5 und 8,5 liegenden pH-Wert aufweisenden Lösung Cholinesterase aufträgt, das erhaltene Produkt wäscht und schließlich gewünschtenfalls trocknet.
Als Polymere werden besonders bevorzugt die bereits beschriebenen Polymere des Typs Akrilex C verwendet. Als Enzym kann , Cholinesterase beliebigen Ursprungs, in beliebiger Weise isoliert, Verwendung finden.
Zur Aktivierung des Enzymträger-Copolymers können als Carbodiimid-Verbindung zum Beispiel N-Cyclohexyl-N'-(ß-/N-methylmorpholinZ-athyil-carbodiimid-p-toluolsulfonatoderN-Athyl-N'-O-dimethylamino-propyD-carbodiimid-hydrochlorid
verwendet werden. Bevorzugt werden wasserlösliche Carbodiimid-Verbindungen gewählt. Von den nur in organischen ,
Lösir ^.mitteln löslichen Carbodiimid-Verbindungen sind für das erfindungsgemäße Verfahren nur diejenigen von Interesse,
die ston in dem jeweiligen organischen Lösungsmittel auch kalt (d.h. unter O0C) ausreichend lösen. ι
Die Cholinesterase wird aus einer einen pH-Wert zwischen 4,5 und 8,5 aufweisenden Lösung (vorzugsweise bei pH7,0) auf den |
aktivierten Träger aufgebracht. Zweckmäßig wird die Cholinesterase vorher in einem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH7,0) !
gelöst. :
Das bei der Kopplungsreaktion entstandene immobilisierte Enzympräparat wird in bekannter Weise gewaschen und dann j
gewünschtenfalls getrocknet. Es ist jedoch — bei 0-4"C — auch in wäßriger Suspension haltbar.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten immobilisierten Enzympräparat haben eine spezifische Aktivität von 100-120 Einheiten/g Xerogel, was im Vergleich zu den Aktivitätsangaben in Anal. Chem. 37,1378 (1965), Anal. Biochem. 19,687 (1967), Biochim. Biophys. Acta 212,362 (1970) und Anal. Biochem. 51,362 (1973) unter dem Aspekt der praktischen Anwendung günstig ist.
Die erfindungsgemäß immobilisierte Cholinesterase ist unter schwach basischen Bedingungen, d.h. beim optischen pH-Wert ihrer Anwendung (pH 8,0), stabiler als das lösliche Enzym. Das ist für die Langzeitbenutzung ein bedeutender Vorteil.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert, ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
100,6mg des Xerogels Akrilex C-100 (Acrylamid/Acrylsäure/N.N-Methylen-bis-acr/lamid), das pro Gramm 3 mÄquival. Carboxylgruppen enthält, wurden in 0,1 M Kaliumphosphatpufferlösurig (pH7,0) suspendiert, und bei 00C unter ständigem Rühren 102,5mg N-Äthyl-NMS-d'methylamino-propyll-carbodiimid-hydrochlorid, gelöst in 2,5ml Pufferlösung von 4°C Temperatur, zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 47,4mg Cholinesterase in 2,5m! kaltem (40C) Puffer versetzt. Bei 0-40C verlief die Reaktion innerhalb von 48 Stunden; während 2x6 Stunden wurde die Suspension gerührt. Dann wurde das Gel durch Filtrieren abgetrennt und dreimal mit 10ml 0,1 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0), dann dreimal mit 10 ml des gleichen Puffers, der außerdem noch pro Liter 0,5 Mol NaCI enthielt, dann wieder mit 10 ml des Puffers dreimal und schließlich viermal mit 25 ml destilliertem Wasser salzfrei gewaschen. Nach dem Lyophilisieren erhielt man 106,2mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: 1 g der Trockensubstanz hydrolysiert in einer Minute 120μΜοΙ Butyrylthiocholin-jodid.
102 mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 2 mÄquival. -COOH/g) wurden in 5,0 ml 0,1 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH7,0) suspendiert. Bei O0C wurde zu der Suspension unter ständigem Rühren die Lösung von 202mg N-Cyclohexyl-N'-(ß-/N-methyl-morpholin/-äthyl)-carbodiimid-p-toluolsulfonat in 2,5ml kalter (4°C) Pufferlösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang gorührt und dann mit der Lösung von 49 mg Cholinesterase in 2,5 ml kaltem (4°C) Puffer versetzt. Bei 0-40C verlief die Reaktion innerhalb von 48 Stunden; während 2x6 Stunden wurde das Gemisch gerührt. Dann wurde das Gel durch Filtrieren abgetrennt und dreimal mit 10ml 0,1 M Kaliumphosphatpufferlös'jng (pH7), dreimal mit 10ml des gleichen Puffers, der außerdem noch 0,5 Mol/' NaCI enthielt, dreimal mit 10 ml Kaliumphosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) und schließlich viermal mit 25ml destilliertem Wasser salzfrei gewaschen. Nach dem Lyophilisieren erhielt man 110mg immobilisierte CholinesterasG.
Aktivität: 1 g Trockensubstanz hydrolysiert in einer Minute 1 ΊΟμΜηΙ Butyrylthiocholin-jodid.
Vergleichsversuche und inre Ergebnisse
Die Aktivität und spezifische Aktivität der erfindungsgemäß hergestellten immobilisierten Enzympräparate wurde mit den entsprechenden Da'.on sonstiger, auf Trägern immobilisierter Enzympräparate verglichen. Folgende Vergleichssubstanzen wurden verwendet:
a) Der Träger Qnzacryl AA (als funktionell Gruppen aromatische Aminogruppen enthaltendes Acrylamid/N.N'-methylen-bisacrylamid-Copolymer, hergestellt von der Koch-Light Laboratories Ltd., Colnbrook, Bucks, Großbritannien) wurde den Vorschriften des Herstellers entsprechend (Koch-Light Laboratories Ltd., KL3, S.343 [197Oj) diazotiert. Dann wurden 100mg
diazotiertes Enzacryl AA und 2,5mg Cholinesterase Γη 0,5ml 0,1 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH7,5) bei 0-40C zweimal je 8 Stunden lang gerührt, wobei zwischen den beiden Rührperioden und nach Beendigung des Rührens eine Abstehzeit von je 16 Stunden bei 4°C eingehalten, wurde.
b) Der Träger Enzacryl AH (Acrylamid/Acrylsäurehydrazid/N.N'-methylen-bis-acrylamid-Copolymer; Hersteller: Koch-Light Laboratories Ltd., Colnbrook, Bucks, Großbritannien) wurde den Vorschriften des Herstellers entsprechend (Koch-Light Laboratories Ltd., KL3, S.344 [1970]) in saurem Medium mit Natriumnitrit aktiviert. Dann wurden 100mg des aktivierten Trägers, der als funktioneile Gruppen Säureuzidgruppen enthält, zusammen mit 2,5mg Cholinesterase in 0,1 M Boratpufferlösung (pH8,0) wie unter Punkt a) gerührt.
c) 93mg einer pro Gramm 2,3mÄquival. Carboxylgruppen enthaltenden Carboxymethylcellulose (Hersteller: Reanal) wurden in 5ml 0,1 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH7,0) suspendiert. Zu der Suspension wurde unter ständigem Rühren die Lösung von 50mg N-Äthyl-N'-ß-dimethylamino-propyD-carbodiimid-hydrochlorid in 2,5ml kaltem (40C) Puffer gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 25mg Cholinesterase in 2,5ml kaltem (40C) Puffer versetzt. Das Enzym wurde insgesamt 48 Stunden lang mit dem aktivierten Träger bei 0-4°C umgesetzt; von dieser Zeit wurde 2 x 6 Stunden gorührt.
d) Ein Polymaleinsäureanhydrid-Träger (Hersteller: Merck, Darmstadt, BRD) wurde den Vorschriften des Horstellers entsprechend (Biochemies Merck: Poly[maleic anhydride] crosslinked enzyme support) mit Cholinesterase gekoppelt: 1 g 1 rager wurde in 25ml 0,05M Kaliumphosphatpufferlösung O0C, pH7,0) suspendiert. Die Suspension wurde eine Minute lang gerührt und dann mit der Lösung von 0,5g Cholinesterase in 5ml kaltem (4"C) Puffer versetzt. Der pH-Wert des Gemisches wurde durch kontinuierlichen Zusatz von I η wäßriger Natronlauge zwischen 8 und 9 gehalten. Die Lauge wurde so lange zugesetzt, bis sich der pH des Gemisches fber 30 Minuten hinweg nicht mehr änderte.
Nach Ablauf der unter d)-d) beschriebenen Immobilisierungsreaktionen wurden die immobilisierten Enzympräparate durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt und mit dem jeweils zur Immobilisierung verwendeten Puffer, dann mit einer 0,5-1 M NaCI-Lösung, die mit dem Puffer bereitet wurde, und schließlich erneut mit dem zum Immobilisieren verwendeten Puffer gewaschen, um das nicht kovalent gebundene Eiweiß zu entfernen. Dann wurden die Ionen der Pufferlösung durch Waschen mit Wasser entfernt und die inmobilisierten Enzympräparate lyophilisiert. Die lyophilisierten Produkte wurden bei 40C im Kühlschrank gelagert.
Die in den immobilisierten Enzympräparaten gebundene Eiweißmenge wurde-auf indirektem Wege bestimmt, indem der Unterschied zwischen der in das Reaktionsgemisch eingebrachten Eiweißmenge und der nach der Immobilisierung im Filtrat und in der Waschflüssigkeit wiedergefundenen Eiweißmenge ermittelt wurde. Der Eiweißgehalt der Cholinesterase-Lösungen wurde mit der Biuretmethode (A. G. Gorna'l, C.S. Bardawill, M. M. David: J. Biol. Chem. 177,751 [1949]) bestimmt.
Die Aktivita: der gelösten und der immobilisierten Cholinesterasen wurde durch Bestimmung der bei der Zersetzung des Substrats Buiyrylthiocholin-jodid freiwerdinderi Sulfhydrylgruppen mit bis(5-Carboxy-4-nitrophenyl)-disulfid ermittelt
(G. L. Ellman, K. D. Courtney, V. Andres Jr., F-. M. Featherstone: Biochem. Pharmacol. 7,88 [1961]). Als eine Aktivitätseinhei». wurde diejenige Enzymmenge betrachtet, die bei 25CC pro Minute die Umsetzung von 1 Mikromol Butyrylthiocholin-jodid katalysiert, und zwar beim optimalen pH-Wert der katalytischen Aktivität, der für da s gelöste Enzym bei pH 7,6, für das immobilisierte Enzym bei pH 8,0 liegt.
Die Ergebnisse der Versuche sind in der Tabelle 1 zusammengestellt.
| Parameter | Enz | Enz | Akr. | Carboxy- | PoIy- |
| acryl | acryl | C-100 | methyl- | malein- | |
| AA | AH | Bei | cellu- | säure- | |
| spiel 1 | lose | anhydrid |
| immobilisiertes | 100 | 61,8 | 24,5 | 5,5 | 23,3 |
| Eiweiß, % | |||||
| immobilisierte | 0 | 0,2 | 7,5 | 0,2 | 7,5 |
| Aktivität,0/» | |||||
| im gelösten Zustand | |||||
| zurückgewonnene | 0 | 60,7 | 60 | 3,5 | 31,3 |
| Aktivität, % | 100 | 39,1 | 32,5 | 96,3 | 61,1 |
| Aktivitätsverlust, % | |||||
| Aktivität des Produktes | 0 | 0,2 | 120 | 2 | 106 |
| (E/mg Trockensubstanz) | |||||
| spezifische Aktivität | 0 | 0,3 | 30,6 | 3,6 | 32,2 |
| (gelöste Enzym = 100%) | bezogen auf das Trockengewicht (Eiweiß + Träger) beziehungsweise den Eiweißgehalt, | ||||
| Aus der Tabelle 1 ist ersichtlich, daß, | |||||
das Produkt mit der größten Aktivität im erfindungsgemäßen Verfahren entsteht. Die Aktivitätsdaten des unter Verwendung des Polymaleinsäureanhydrid-Trägers erhaltenen Produktes kommen denen des erfindungsgemäß hergestellten Produktes nahe; dieser Träger wird jedoch durch Blockpolymerisation hergestellt, die Durchflußparameter einer aus dem immobilisierten Präparat bereiteten Säule sind dadurch wesentlich schlechter als die einer Säule, die mit dem erfindungsgemäß hergestellten, perlförmigen Präparat gefüllt ist.
99,8mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 0,8mÄquival. -COÜH-Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH7,0) suspendiert. Die Suspension wurde bei O0C unter ständigem Rühren mit der Lösung von 108,6mg N-Äthyl-N'-O-dimethylamino-propyD-carbodiimid-hydrochlorid in 2,5ml kaltem (40C) Puffer versetzt. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt, dann wurde die Lösung von 60,1 mg Cholinesterase in 2,5ml kaltem (40C) Puffer zugegeben. Die gesamte
Reaktionszeit betrug bei 0-4 °C 48 Stunden; während dieser Zeit wurde die Suspension 2x6 Stunden lang gerührt. Dann wurde das GoI abfiltriert, dreimal mit 10ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH7,0), dann dreimal mit 10ml des gleichen Puffers, der darüber hinaus noch 0,5 Mol/l NaCI enthielt, schließlich erneut dreimal mit 10ml 0,1 M Phosphatpuffer {pH 7,0) gewaschen. Durch viermaliges Waschen mit 25ml destilliertem Wasser wurden dieSalzionen entfernt. Nach dem Lyophilisieren erhielt man 144,7 mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: ein g Trockensubstanz hydrolysiert in einer Minute 80μΜοΙ Butyrylthiocholinjodid.
200mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 4mÄquival. -COOH-Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0ml 0,1 M kaltem Kaliumphosphatpuffer (pH7,0) suspendiert. Zu der Suspension wurden bei O0C unter ständigem Rühren 200mg N-Äthyl-N'-3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid-hydrochlorid in 2,5ml kaltem (4°C) Puffer gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 50mg Cholinesterase in 2,SmI kaltem (40C) Phosphatpuffer versetzt. Die gesamte Reaktionszeit betrug bei 0-4°C 48 Stunden; während dieser Zeit wurde die Suspension 2x6 Stunden lang gerührt. Das Gel wurde wie in Beispiel 3 beschrieben gewaschen. Ausbeute: 220mg immobilisierte Cholinesferase. Aktivität: Hydrolyse von 240μΜοΙ Butyrylthiocholin-jodid/min · g.
249,3mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 6,5mÄquival. -COOH-Gruppen pro Grtimrn) wurden in 5,0ml 0,1 M kaltem Kaliumphosphatpuffer (pH7,0) suspendiert. Zu der Suspension wurde bei O0C unter ständigem Rühren die Lösung von 250mg N-Äthyl-N'-O-dimethylamino-propyD-carbodiiinid-hydrochlorid in 2,5ml kaltem Phosphatpuffer gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 50 mg Choiinesterase in 2,5ml kaltem Puffer versetzt. Die gesamte Reaktionszeit betrug 48 Stunden; davon wurde 2x6 Stunden lang gerührt. Das Waschen des Gels erfolgte auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise. Ausbeute: 321 mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: Hydrolyse von 24OpMoI Butyrylthiochinolinjodid/min · g.
300 mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 5,7 mÄquival. -COOH-Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0 ml kaltem, 0,1 M Puffer (pH7,0) suspendiert. Unter ständigem Rühren wurde bei 00C die mit 2,5ml kaltes Puffer bereitete Lösung von 300mg N-Äthyl-N'-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid-hydrochlorid zugegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 50 mg Cholinesterase in 2,5 ml kaltem Puffer versetzt. Die gesamte Reaktionszeit betrug 48 Stunden; während dieser Zeit wurde 2x6 Stunden gerührt. Das Waschen des Gels erfolgte auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise. Ausbeute: 340mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: Hydrolyse von 215 μΜοΙ Butyrylthiocholinjodid/min g.
253,4mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 7 mÄquival. -COOH-Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0ml 0,1 M kaltem Kajiumphosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Zu der Suspension wurde die Lösung von 130,8 mg N-Äthyl-N'-(3-dimethylaminopropyD-carbodiimid-hydrochlorid in 2,5ml kaltem Puffer gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 50,2 mg Cholinesterase in 2,5 ml kaltem (40C) Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) versetzt. Die gesamte Reaktionszeit beträgt 48 Stunden; während dieser Zeit wurde 2x6 Stunden gerührt. Das Gel wurde auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise gewaschen. Ausbeute: 355,9 mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: Hydrolyse von 252 μΜοΙ Butyrylthiocholin-jodid/ min · g Trockensubstanz.
251,7 mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 3,5mÄquival. -COOH-Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH7,0) suspendiert. Zu der Suspension wurde die Lösung von 381,1 mg N-Äthyl-N'-(3-dimethylaminopropyD-carbodiimid-hydrochlorid in 2,5mk kaltem (40C) Puffer gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 50,2mg Cholinesterase in 2,5ml kaltem (40C) Puffer (pH 7,0) versetzt. Die gesamte Reaktionszeit betrug 48 Stunden, davon wurde 2x6 Stunden lang gerührt. Gewaschen wurde auf die in den vorhergehenden Beispielen beschriebene Weise. Ausbeute: 334,2 mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: Hydrolyse von 137μΜοΙ Butyrylthiocholin-jodid/min · g Trockensubstanz.
256,1 mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 0,5mÄquival. -COOH-Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Zu der Suspension wurde die mit 2,5ml kaltem Puffer bereitete Lösung von 518,3 mg N-Äthyl-N'-ß-dimethylamino-propyO-carbodiimid-hydrochlorid gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 49,3 mg Cholinesterase ini 2,5 ml kaltem Puffer versetzt. Die gesamte Reaktionszeit betrug 48 Stunden; davon wurde 2x6 Stunden lang gerührt. Das Gel wurde auf die bereits beschriebene Weise gewaschen. Ausbeute: 298,8 mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: Hydrolyse von 45,6μΜο! Butyrylthiocholin-jodid/min · g Trockensubstanz.
256,7mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 3,5mÄquival. -COOH-Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0ml 0,1 M kalter Kaliumphosphatlösung (pH 3,6) suspendiert. Zu der Suspension wurde die mit 2,5 ml kaltem Pu ff er (pH 3,6) bereitete Lösung von 131,8mg N-Äthyl-N'-l3-dimethylaminopropyl)-carbodiinr J-hydrochlorid gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 49,8mg Cholinesterase in 2,5ml kaltem Kaliumphosphatpuffer (pH3,6) versetzt. Die gesamte Reaktionszeit betrug 48 Stunden; davon wurde 2x6 Stunden lang gerührt. Das Gel wurde dann dreimal mit 10ml kaltem (4CC) 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH3,6), dann dreimal mit 10ml des gleichen Puffers, der zusätzlich noch 0,5 Mol/l NaCI enthielt und anschließend erneut dreimal mit 10 ml Kaliumphosphatpuffer gewaschen. Die Salzionen wurden durch viermaliges Waschen mit 25ml destilliertem Wasser entfernt. Nach dem Lyophilisieren erhielt man 182,5mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: Hydrolyse von Ο,ΟμΜοΙ Butyrylthiochinolin-jodid/min · g Trockensubstanz.
259,1 mg Akrilex C-IOO (enthaltend 4,8mÄquival. -COOH-Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0ml 0,1 M kaltem j
Kaliumphosphatpuffer (pH4,0) suspendiert. Zu der Suspension wurde die mit 2,5ml kaltem Puffer (pH4,0) bereitete Lösung von ι
126,9mg N-Äthyl-N'-IS-dimethylamino-propyO-carbodiimid-hydrochlorid gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang j
gerührt und dann mit der Lösung von 49,6mg Cholinesterase in 2,5ml kaltem Kaliumphosphatpuffer (pH4,0) versetzt. Die {
gesamte Reaktionszeit betrug 48 Stunden; davon wurde 2x6 Stunden lang gerührt. Das Gel wurde dreimal mit 10ml kaltem, ;
0,1 fvi Ksüumphosphatpuffer (pH4,0), dann dreimal mit dem gleichen Puffer, der zusätzlich noch 0,5Mol/l NaCI enthielt, und j danach erneut dreimal mit 10ml Kaliumphosphatpuffer (pH4,0) gewaschen. Die Salzionen wurden durch viermaliges Waschen
mit kaltem, destilliertem Wasser entfernt. Nach dem Lyophilisieren erhielt man 168,0mg immobilisierte Cholinesterase. ι
Aktivität: Hydrolyse von 13μΜοΙ Butyrylthiocholin-jodid/min g Trockensubstanz. I
Beispiel 12 I
252.5mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 2,5mÄquival. -COOH-Gruppen prc Gramm) wurden in 5,0ml 0,1 M kalter j
Kaliumphosphatlösung (pH4,6) suspendiert. Zu der Surpension wird die mit 2,5ml kaltem Puffer (pH4.6) bereitete Lösung von :
142,2mg N-Äthyl-N'-O-dimethylaminopropyD-carbodiimid-hydrochlorid gegeben. Das Gemisch wird 10 Minuten lang gerührt
und dann mit der Lösung von 52,9mg Cholinesterase in 2,5ml kaltem Kaliumphosphatpuffer (pH4,6) versetzt. Die gesamte I
Reaktionszeit betrug 48 Stunden; davon wurde 2x6 Stunden lang gerührt. Das Gel wurde dann dreimal mit 10 ml kaltem, 0,1 M '
Kaliumphosphatpuffer (pH4,6), dann dreimal mit 10ml des gleichen Puffers, der jedoch zusätzlich noch 0,5Mol/l NaCI enthielt, j
und dann erneut dreimal r-M 10ml Puffer gewaschen. Die Salzionen wu/den durch viermaliges Waschen mit 25ml kaltem, I
destilliertem Wasser entfernt. Nach dem Lyophilisieren erhielt man 280,8mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität; Hydrolyse !
von 101,7μΜοΙ Butyrylthiocholin-jodid/min · g Trockensubstanz. j
252,6mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 7,8mÄquival. -COOH-Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0 ml 0,1 M kalter Kaliumphosphatlösung (pH 5,0) suspendiert. Zu der Suspension wurde die mit 2,5ml kaltem Puffer (pH 5,0) bereitete Lösung von 125,0mg N-Äthyl-N'-(3-dimethylaminopropy!}-carbodiimid-hydrochlorid gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 50,5 mg Cholinesterase in 2,5 ml kaltem Kaliumphosphatpuffer (pH 5,0) versetzt. Die gesamte Reaktionszeit betrug 48 Stunden; davon wurde 2x6 Stunden lang gerührt. Das Gel wurde dann dreimal mit 10 ml kaltem, 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 5,0), dann dreimal mit 10 ml des gleichen Puffers, der zusätzlich noch 0,5 Mol/l NaCI enthielt, und dann erneut dreimal mit 10ml Kaliumphosphatpuffer gewaschen. Die Salzionen wurden durch viermaliges Waschen mit 25ml kaltem, destilliertem Wasser entfernt. Nach dem Lyophilisieren erhielt man 239,9 mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: Hydrolyse von 163,2μΜοΙ Butyrylthiocholin-jodid/min · g Trockensubstanz.
249,2 mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 6,9mÄquival. -COOH-Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0 ml 0,1 M kaltem Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0) suspendiert. Zu der Suspension wurde die mit 2,5ml kaltem Puffer (pH 6,0) bereitete Lösung von 127,2 mg N-Äthyl-N'-O-dimethylaminopropyD-carbodiimid-hydrochlorid gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 51,9 mg Cholinesterase in 2,5 ml kaltem Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0) versetzt. Die gesamte Reaktionszeit betrug 48 Stunden; davon wurde 2x6 Stunden lang gerührt. Das Gel wurde dann dreimal mit 10 ml kaltem, 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0), dann dreimal mit 10 ml des gleichen Puffers, der zusätzlich 0,5 Mol/l NaCI enthielt, und dann erneut dreimal mit 10ml Kaliumphosphatpuffer gewaschen. Die Salzionen wurden durch viermaliges Waschen mit 25 ml kaltem, destilliertem Wasser entfernt. Nach dem Lyophilisieren erhielt man 277,8 mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: Hydrolyse von 252μΜοΙ Butyrylthiocholin-jodid/min · g Trockensubstanz.
257,4mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 0,7mÄquival. -COOH Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0ml 0,1 M kaltem Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Zu der Suspension wurde die mit 2,5 ml kaltem Puffer (pH 7,0) bereitete Lösung von 127,8mg N-Äthyl-N'-O-dimethylamino-propyll-carbodiimid-riyclrochlorid gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 51,9mg Cholinesterase in 2,5ml kaltem Kaliumphosphatpuffer (pH7,0) versetzt. Die gesamte Reaktionszeit betrug 48 Stunden; davon wurde 2x6 Stunden lang gerührt. Das Gel wurde dann dreimal mit 10 ml 0,1 M kaltem Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), dann dreimal mit 10ml des gleichen Puffers, der zusätzlich 0,5Mol/l NaCI enthielt, und danach erneut dreimal mit 10 ml Kaliumphosphatpuffer gewaschen. Die Salzionen wurden durch viermaliges Waschen mit 25 ml kaltem, destilliertem Wasser entfernt. Nach dem Lyophilisiereri erhielt man 292,9 mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: Hydrolyse von 107,6μΜοΙ Butyrylthiocholin-jodid/min · g Trockensubstanz.
250,6mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend 0,2 mÄquival. -COOH Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0ml 0,1 M kalter Kaliumphosphatlösung (pH8,0) suspendiert. Zu der Suspension! wurde die mit 2,5 ml kaltem Puffer (pH 8,0) bereitete Lösung von 122,7mg N-Äthyl-N'-IS-dimethylamino-propylJ-carbodiimid-hydrochlorid gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 58mg Cholinesterase in 2,5ml kaltem Calciumphosphatpuffer (pH7,0) versetzt. Die gesamte Reaktionszeit betrug 48 Stunden; davon wurde 2 χ 6 Stunden lang gerührt. Das Gel wurde dann dreimal mit 10ml kalter, 0,1 M Kaliumphosphatlösung (pH8,0), dann dreimal mit 10ml des gleichen Puffers, der zusätzlich 0,5 Mol/l NaCI enthielt, und dann erneut dreimal mit 10ml Kaliumphosphatpuffer gewaschen. Die Salzionen wurden durch viermaliges Waschen mit 25 ml kaltem, destilliertem Wasser entfernt. Nach dem Lyophilisieren erhielt man 300,3 mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: Hydrolyse von 29,4μΜοΙ Butyrylthiocholin-jodid/min · g Trockensubstanz.
252,7mg des Xerogels Akrilex C-100 (enthaltend lOmÄquival. -COOH Gruppen pro Gramm) wurden in 5,0ml 0,1 M kaltem Kaiiumphosphatpuffer (pH 9,0) suspendiert. Zu der Suspension wurde die mit 2,5 ml kaltem Puffer (pH 9,0) bereitete Lösung von 125,3mg N-Äthyl-N'-O-dimethylamino-propyD-carbodiimid-hydrochlorid gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang gerührt und dann mit der Lösung von 60mg Cholinesterase in 2,5ml kaltem Calciumphosphatpuffer (pH7,0) versetzt. Die gesamte Reaktionszeit betrug 48 Stunden; davon wurde 2x6 Stunden lang gerührt. Das Gel wurde dann dreimal mit 10ml kaltem, 0,1 M Kaiiumphosphatpuffer (pH 9,0), dann dreimal mit dem gleichen Puffer, der zusätzlich noch 0,5Mol/l NaCI enthielt, und danach erneut dreimal mit 10ml Kaiiumphosphatpuffer gewaschen. Die Salzionen wurden durch viermaliges Waschen mit 25ml kaltem, destilliertem Wasser entfernt. Nach dem Lyophilisieren erhielt man 361,9mg immobilisierte Cholinesterase. Aktivität: Hydrolyse von 6,8μΜοΙ Butyrylthiocholin-jodid/mg · g Trockensubstanz.
| Zusammensetzung des Reaktionsgemisches | AC-100 | Gew.-T. | mg | EDAPC | Gew.-T. | mg | ChE | Gew.-T. | Aktivität des Produktes |
| 1,66 | 108,6 | 1,81 | 60,1 | 1 | (Einheit/g Trockensubstanz) | ||||
| mg | 2,12 | 102,5 | 2,16 | 47,4 | 1 | ||||
| 99,8 | 5,04 | 130,8 | 2,6 | 50,2 | 1 | 80 | |||
| 100,6 | 4 | 200 | 4 | 50 | 120 | ||||
| 253,4 | 5 | 250 | 5 | 50 | 252 | ||||
| 200 | 6 | 300 | 6 | 50 | 240 | ||||
| 249,8 | 5,01 | 381,1 | 7,59 | 50,2 | 240 | ||||
| 300 | 5,19 | 518,3 | 10,5 | 49,3 | 215 | ||||
| 251,7 | 137 | ||||||||
| 256,1 | 45,6 | ||||||||
AC-100 Akrilex C-100
EDAPC N-Äthyl-N'-O-dimethylaminopropyDcerbodiimidhydrochlorid
ChE Cholinesterase aus Pferdeserum
Einheit Eine Einheit ist diejenige Enzymmenge, die bei 250C in einer Minute die Hydrolyse von 1 μΜοΙ Butyrylthiochulin-jodid katalysiert.
Der Einfluß des pH-Wertes des Reaktionsgemisches auf die Immobilisierung des aus Pferdeserum gewonnenen Enzyms
Cholinesterase pH des Reaktionsgemisches Aktivität des Produktes
(Einheiten/g Trockensubst.)
4,6 101,7
5,0 163,2
6,0 252
7,0 107,6
8,0 29,4
Einheit: Eine Einheit ist diejenige Enzymmenge, die bei 25°C in einer Minute die Hydrolyse von 1 μΜι I Butyrylthiochoün-jodid katalysiert.
Claims (2)
- Patentansprüche:1. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Cholinesterase-Präparates unter Verwendung von Acrylpolymeren, dadurch gekennzeichnet, daß man als funktioneile Gruppen 0,1-IOmÄquival., zweckmäßig 2-8mÄquival. Carboxylgruppen enthaltende Acrylamid/Acrylsäure/N.N-Methylenbis-acrylamid-Copolymere bei 0-40C mit einer wasserlöslichen oder einer bei Temperaturen unter O0C in organischen Lösungsmitteln löslichen Carbodiimid-Vorbindung, vorzugsweise mit N-Äthyl-N'-O-dimethylamino-propyD-carbodiimid-hydrochlorid oder mit iv-Cyclohexyl-N'-(ß-/N-methylmorpholin/-äthyl)-carbodiimid-toluolsulfonat behandelt, wobei man zwischen Polymer und Carbodiimid-VerbndMng ein Verhältnis von 1 -6:1-11 einhält, dann auf den aktivierten Träger in einer einen pH-Wert zw? jfr^n 4,5 und 8,5 aufweisenden Lösung die Cholinesterase aufbringt, wobei das Verhältnis zwisuien Polymer, Carbodiimid und Enzym 4-5:2,5-5:1 beträgt, das erhaltene Produkt wäscht und gewünschtenfalls trocknet.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Cholinesterase in 0,1 M Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,0) gelöst auf den aktivierten Träger aufbringt.
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