DD267737A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen epitope eines 67 kda zelloberflaechenantigens humaner t-lymphozyten und b-cll - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer unterschiedliche Epitope eines 67 kDa-Zelloberflaechenantigens normaler humaner T-Lymphozyten, eine normalen B-Zellsubpopulation (CD 5 - positiv) und von neoplastischen B-CLL-Zellen. Solche monoklonalen Antikoerper koennen zur Differenzierung von normalen T-Lymphozyten, zur Bestimmung der CD 5-positiven normalen B-Zellsubpopulation aber auch zur Bestimmung und Differenzierung von neoplastischen B-CLL-Zellen eingesetzt werden. Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung von entsprechenden monoklonalen Antikoerpern anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen dieser Antikoerper erlaubt. Die monoklonalen Antikoerper sollen nicht nur eine hohe Spezifitaet und Affinitaet, die ihren Einsatz in der Durchflusszytometrie und Immunhistologie gestatten, aufweisen, sondern auch zur Modulation von T-Lymphozyten und zur Eliminierung von T-Lymphozyten, der CD 5-positiven B-Zellsubpopulation und von B-CLL-Zellen geeignet sein. Dazu werden in bekannter Weise Hybridzellen von B-Lymphozyten immunisierter BALB/c-Maeuse erzeugt und Hybridomzellen selektiert, deren monoklonale Antikoerper die gewuenschten Eigenschaften aufweisen. Das Selektionsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in einem mehrstufigen Selektionssystem Hybridome erzeugt und kultiviert werden, deren monoklonale Antikoerper mit unterschiedlichen Epitopen des 67 kDa-Zelloberflaechenantigens humaner T-Lymphozyten, einer B-Zellsubpopulation und von B-CLL-Zellen reagieren und zur Bestimmung der CD 5-positiven B-Zellsubpopulation und der Unterscheidung dieser normalen Zellpopulation von den B-CLL-Zellen durch Doppelmarkierungstechnik geeignet sind. Die monoklonalen Antikoerper BL-TP 5a und BL-TP 5b weisen die gewuenschten Eigenschaften auf. Das Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikoerper beruht auf der In-vitro- oder In-vivo- Kultivierung der entsprechenden Hybridome H-BL-TP 5 a und H-BL-TP 5 b und der Abtrennung der monoklonalen Antikoerper. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die mit ein jm Zelloberf lächenantigen (gp 67) humaner T-Lymphozyten und B-CLL reagieren. Die monoklonalen Antikörper können zur medizinischen Diagnostik, besonders zur Bestimmung von T-Lymphozyten, einer bestimmten B-Zellsubpopulation und von B-Cl L und zur Eliminierung von normalen humanen T-Lymphozyten und bestimmten B-Zellsubpopulationen sowie B-Zell-Leukämien eingesetzt werden.
Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen. Die Prinziplösung der Hybridomherstellung wurde von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256, (19751, S. 495) beschrieben.
Es sind monoklonale Antikörper bekannt, die mit unterschiedlichen Zelloborflächenantigenen humaner T-Lymphozyten reagieren (P.CKUNG, G.GOLDSTEIN: Human T-lymphocyte differentiation antigens detected by monoclonal antibodies. Research Monographs in Immunology, Vol.3, S. 5-15, Hrsg.: TURK, Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam/New York/Oxford, 1981 sowie J.A.LEDBETTER, A.E.FRANKEL, LA.HERZENBERG: Human Leu T-cell differentiation antigens: quantitative expression on normal Iy ^ohoid colls and cell-lines, ebenda, S. 16-22). Zu den verbreitesten monoklonalen Antikörpern, die mit der Gesamtheit der humanen T-Zellen reagieren, gehören OKT3 und OKT1 (US-PS 4381295). Darüber hinaus sind weitere monoklonale An,!körper bekanntgeworden, die ebenfalls T-zellspozifisch reagieren (DD 238168 A3) und sogar an den antigonspezifischen Rezeptorkomplex der humanen T-Zellen binden.
i'io monoklonalen Antikörper gegen humane Leukozyten sind für die medizinische Diagnostik von großer Bedeutung, so daß im Rahmen von bishordrei Woi^shops über Leukozytenantigene (Paris 1982, Boston 1984, Oxford 1986) eine internationale Standardisierung begonnen wurde, die zur CD-Nomenklatur („Cluster of Differentiation") der entsprechenden monoklonalen Antikörper geführt hat. Die monoklonalen Antikörper der CD-Gruppen 2,3,5,6 und 7 reagieren mit allen oder zumindest der großen Mehrheit der humanen T-Zellen (Leukocyte Typing II. Vol. 1-3, Hrsg.: E. L.REINHERZ, B. F. HAYNES, L. M. NADLER und I.D.BERNSTEIN: Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986). Auf dem 3. Workshop (Oxford 1986) wurden zusätzlich die Gruppen CD27 und CD28 etabliert, die Antikörper enthalten, die hauptsächlich mit T-Zellen reagieren. In die CD5-Gruppe sind die verbreiteten Antikörper OKT1 und Anti-Leu 1 eingeordnet worden. Weiterhin wurden die monoklonalen Antikörper NUTPAN, 1247, UCHT2, KS6 und YTH265 dem CD5 zugeordnet (Leukocyte Typing III, Hrsg.: A. J. Mc MICHAEL et al., Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo 1987). Diese bekannten CD 5-Antikörper reagieren mit einem oder eventuell mehreren unterschiedlichen Epitopen des gp67, das auf allen normalen T-Lyrrohozyten sowie auf einer kleinen Subpopulation von B-Lymphozyten und auf der Mehrheit der B-CLL ausgeprägt ist. Eine Unterscheidung, ob die markierten Zellen T-, B- oder B-CLL-Zellen sind, ist nur durch Doppelmarkierung mit anderen linienspezifischen monoklonalen Antikörpern zu treffen. Die bekannten monoklonalen Antikörper können keine Informationen über die Assoziierung des
CD5-AntJQens mit anderen Zelloberflächenantigenen liefern. Für den Nachweis von T-Zellen im Geweboschnitt sind die bekannten Antikörper nur bedingt geoignet. Von den meisten der CD 5-An*.ikörper ist es nicht bekannt, ob sie eine Neuanordnung des CD5-Antigens auf den Zolloberflächon der reagierenden T-, B- und 8CLI.-Zellen induzieren.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbaier Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper für das CD5-Antigen (Glykoprotein, 67KDa) dar humanen T-Lymphozyten, einer B-Zellsubpopulation sowie der B-CLL gestattet.
Die monoklonalan Antikörper sollen sich zur qualitativen und quantitativen durchflußzytometrischen Analyse, zum immunhistologischen Nachweis von T-Zellen, einer bestimmten B-Zellsubpopulation, aber auch von B-CLL-Zellen in Kryostatgewebeschnitten sowie zur Eliminierung von normalen T-Zellen und neoplastischon B-Zellen (B-CLL) aus Lymphozytenpräparationen eignen.
Das Hauptanliegen ist es jedoch, mittels monoklonaler Antikörper die normalen T-Lymphozytun und die normalen gp67-positiven B-Lymphozyten von den neoplastischen B-CLL zu differenzieren. Die monoklonalen Antikörper sollen stabil und lagerfähig sein. Sie sollen sich auch zur direkten Kopplung mit Fluoreszenzfarbstoffen eignen.
Durch die Bereitstellung solcher monoklonalen Antikörper soll die medizinische Diagnostik sowie die experimentelle Beeinflußbarkeit von humanen T-Lymphozyten, der CD5-positiven B-Zellsubpopulation und der B-CLL qualifiziert werden.
Der Erfindung liegt dio Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschließenden Verfahrensaustausch monoklonal Antikörper erzeugt werden, die mit unterschiedlichen Epitopen des CD 5-Antigens (67 kDa-Glykoprotein) der humanen T-Zellen, einer B-Zellsubpopulation sowie B-CLL-Zellen reagieren und sich zui Differenzierung der normalen T-Lyrnphozyten und der B-Zellsubpopulation von den neoplastischen B-CLL eignen. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach den bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation Lymphozyten aus dem peripheren Bht von gesunden Spendern isoliert werden. Durch Passage über Nylonwolle oder E-Rosettenbildung werden daraus T-Lymphozyten gewonnen. Mit ir der vorangehend beschriebenen oder auf eine andere ähnliche Weise gewonnenen humanen T-Lymphozyten werden Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert
Die B-Lymphoz/ten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert. Die geeigneten Maus-Myelomzellen P3-X63 Ag8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [19791. S. 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gehalten. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 145, (1964), S. 709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zeilklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität und der anderen in der Zielstelluno genannton Eigenschaftun sozernieren. Die Selektion der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der fusion in eine Vielzahl von separaten 200-Ml-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern getestet, die mit Zelloberflächenantigenen von humanen T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit humanen Blutlymphozyten reagieren, mit B-Lymphozyten, die durch Eliminierung der T-Zellen durch E-Rosehantechnik und/oder Nylonwolleseparation gewonnen werden, getestet. Nur diejenigen Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nur mit einer kleinon Subpopulation der peripheren B-Lymphozyten (< 10%), wohl aber mit der großen Mehrheit der Blutlymphozyten und allen separierten T-Lymphozyten reagieren. Die Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen kann sowohl durch indirekte Radiobindungstechnik als auch durch indirekte Immunfluoreszenz erfolyon. So selektierte Kulturen müssen ab dieser Stufe jedoch auf jeden Fall mit der indirekten Immunfluoreszenztechnik überprüft werden.
Dadurch wird ausgeschlossen, daß Hybridome weitergezogen werden, deren Antikörper mit der Gesamtheit der B-Lymphozyten, Non-B/Non-T-Zellen, Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Erythrozyten reagieren. Unter den in solcher Art vorselektierten Hybridomen werden nun erfindungsgemäß solche Klone gesucht, deren Antikörper in der Lage sind, mit einem T-Zelloberflächenprotein zu reagieren, welches nicht nur auf der Mehrheit der normalen peripheren T-Lymphozyten sondern auch einer B-Zellsubpopulation ausgeprägt ist und ein apparentes Molekulargewicht von etwa 67kDa (nach Reduktion der Disulfidbrücken) besitzt.
Zur Bestimmung dos Molekulargewichtes werden die Oberflächenproteine von nativen humanen T-Lymphozyten nach der Laktoperoxidasemethode radioiodiert (125-lod) oder anderweitig markiert. Die Triton X-100-Lysate solcher markierten T-Zellen werden mit den zu untersuchenden Hybridomüberständen inkubiert und anschließend diese Mausantikörper durch Zugabe von Anti-Mausimmunglobulin-Serum präzipitiert.
Die von unspezifischen Komponenten freigewaschenen Präzipitate werden in Natriumdodezylsulfat-Puffer aufgelöst und anschließend einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen (5-1 L/%) unterzogen. An Hand von Referenzproteinen wird das apparente Molekulargewicht der radioiodierten, durch die entsprechenden monoklrnalen Antikörper spezifisch abgetrennten Oberflächenantigene bestimmt. Es werden solche Hybridome ausgewählt, deren rr.onoklonale Antikörper mit Zelloberflächenantigenen von humanen T-Zellen reagieren, die im reduzierten Zustand ein apparentes Molekulargewicht von 67 kDa aufweisen.
Im dritten Selektionsschritt werden davon alle die Hybridome weiterkultiviert, deren Antikörper humane T-Lymphozyten und eine kleine Subpopulation der B-Zellen nach indirekter Markierung ausreichend stark anfärben, so daß die monoklonalen Antikörper sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Analyse in durchf lußzvtornetrischen Verfahren, wie z. B. der Analyse mit einem fluoresz jnzaktivierten Zellsortierer (FACS440), eingesetzt werden können.
In einem vierten Selektionsschritt werden die selektierten Hybridoma überprüft, ob sie sich für die Markierung von antigentragenden Zellen in Kryostatschnitten mit anderen Geweben aufweisen.
In einem fünften Selektionsschritt wird überprüft, ob die monoklonaten Antikörper der selektierten Hybridome bei Bindung an die T-Lymphozyten eine Modulation der Antigenexpression induzieren.
In einem sechsten Selektionsschritt werden Hybridome ausgowählt, deren monoklonale Antikörper mit unterschiedlichen Epitopen des 67kDa-Antigens reagieren. Dabei sind sowohl solche Epitope von Interesse, die auf dem 67kDa-Antigen von T-Lymphozyten, einer B-Zellsubpopulation und B-CLL-Zellen vorhanden sind, als auch solche Epitope, die zwar auf dem gp67 der T-Lymphozyten und der normalen B-Zellsubpopuletion vorhanden sind, auf dem 67 kDa-Antigen der B-CLL-Zellen jedoch fehlen oder nicht zugänglich sind.
Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die gewünschten monoklonalen Antikörper stabil sezernieron. Die so erhaltenen Hybridome werden als H-BI.-TP5 bezeichnet. Die Herstellung der monoklonalen Antikörper BL-TPSa und BL-TP5b basiert auf einem Verfahren, welches auf die In-vitro- oder In-vivo-Kultur der Hybridome H-BL-TP5a und H-BL-TP5bausgcrichtet ist. Die Hybridome H-BL-TPBa und H-BL-TPBb werden an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert bzw. lingen kryokonserviert vor und sind Interessenten zugänglich. Die monoklonalen Antikörper ÜL-TPSa und BL-TPBb haben die Registriernummern ZIM-0153 und ZIM-0226 im Zentralinstitut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten.
DU durch In-vitro- oder In-vivo-Kultur erhaltenen monoklonalen Antikörper BL-TPSa und BL-TPBb reagieren mit Leukozyten, anderen Blutzellen sowie lymphoiden Zellen aus bestimmten Organen in der in Tabelle 1 dargestellten Weise. Das Reaktionsmuster der monoklonalen Antikörper mit permanent wachsenden Zellinien ist in Tabelle 2 aufgeführt. Die monoklonalen Antikörper BL-TPBa und BL-TPSb sind in der Lage, die Expression des gp67 auf der Zelloberfläche von T-Lymphozyten zu modulieren, d. h. durch Reaktion mit den T-Zellen bei 37 0C für 2 bis 8h das CDS-Antigen von der Zelloberfläche zu entfernen (Tab. 3). Nach 24 bis 48h wird dieses Antigen neu synthetisiert und wieder auf der Zellmembran exprimiert. Obwohl beide monoklonalen Antikörper mit dem CD5-Antigen (gp67) reagieren, zeigen sie überraschenderweise unterschiedliche Biodungsfähigkeit mit B-CLL-Zellen. Während der monoklonale Antikörper BL-TP5 b auch mit B-CLL-Zellen reagiert, zeigt der Antikörper BL-TPBa keine oder nur eine sehr schwache Bindung an CDB-positive B-CLL-Zellen (Tab.4). Diese überraschende Eigenschaft geht offenbar auf die Reaktion des BL-TPSa mit einem besonderen EpitopdesCDB-Antigens zurück, der offenbar auf dem CD5-Antigen der B-CLL-Zellen nicht vorhanden oder nicht zugänglich ist. Damit ist eine monoklonale Sonde verfügbar, die eine genauere Analyse der Zelloberflächenexpression des CDS-Antigens zuläßt und dadurch auch für diagnostische Fragestellungen äußerst nützlich ist.
Da die beiden von BL-TP5a und BL-TP5b erkannton Epitope nicht nur auf dem gp67 aller normalen T-Lymphozyten, sondern auch auf einer Subpopulation normaler B-Lymphozyten vorkommen, sind sie in Kombination mit einem geeigneten Pan-B-Zell-Antikörper bei Anwendung der Doppelmarkierungstechnik zur eindeutigen Determination dieser funktionell bedeutsamen B-Zellsubpopulation geeignet. Damit erschließen sich neue diagnostische Wege bei der Beurteilung von Autoimmunkrankheiten und komplexen Krankheitsbildern mit Beteiligung des Immunsystems.
Die wichtigsten Eigenschaften der m "ioklonalen Antikörper BL-TPSa und BL-TP5b sind in Tabelle B zusammengefaßt. Der monoklonale Antikörper BL-TP5a gehört der lgG3-Klasse und der Antikörper BL-TPBb der IgG 1-Klasse an.
I.Beispiel
BALB/c-Mäuse werden mit humanen T-Lymphozyten immunisiert. Vier Tage nach der letzten Immunisierung wird die Milz einer solchen Maus entnommen und eine Einzelzellsuspension hergestellt. Davon werden 2 χ 108 kernhaltige Zellen mit 2 χ 107 Myelomzellen (P3-X63 Ag8.653) mittels 50%igem Polyethylenglykol (M,: 4000) fusioniert. Anschließend werden von den Zellen 200-pl-Kulturen in acht96-Wellen-Gewebekulturplatten angelegt.
Die Überstände der die aufwachsenden HAT-resistenten Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von
Antikörpern getestet, die nur mit Zelloberflächenantigenen von humanen T-Lymphozyten und einer kleinen Sub'population der B-Lymphozyten reagieren. Nur diejenigen Kulturen werden weitergezogen, deren Antikörper nur mit einem geringen Prozentsatz der peripheren B-Lymphozyten, wohl aber mit der großen Mer rheit der Blutlymphozyten und allen separierten T-Zellen reagieren. Durch indirekte Immunfluoreszenz wird ausgeschlossen, daß Kulturen weitergezogen werden, die Antikörper enthalten, die mit der Gesamtheit der B-Lymphozyten, LGL-Zsllen, Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten oder trythrozyter, reagieren.
Mittels NDS-Polyacrylamidgelelektrophorese werden diejenigen Kulturen aufgedeckt, die Antikörper enthalten, die aus den Triton X-100-Lysaten von radioiodierten T-Lymphozyten ein o?-kDa Protein spezifisch isolieren.
Unter den so selektierten Kulturen werden alle Hybridome weiterkultiviert, deren Antikörper humane T-Zellen und eine B-Zellsubpopulation nach indirekter Markierung ausreichend stark anfärben, so daß sich die monoklonalen Antikörper sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Analyse in durchflußzytometrischen Verfahren, wie z. B. der Analyse mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer, eingesetzt werden können.
Daran schließt sich eine Überprüfung an, ob die Antikörper T-Zellen und eine kleine B-Zellsubpopulation in Kryostatschnitten lymphoider Gewebe markieren und keine Nebenreaktionen mit anderen Geweben aufweisen. Nur solche Kulturen werden weitergezogen, die diesen Anforderungen genügen.
Weiterhin wird überprüft, ob die Antikörper in der Lage sind, T-Zellen zur Modulation des 67 kDa-Antigens anzuregen.
In einem weiteren Selektionsschritt werden Hybridome ausgewählt, die mit unterschiedlichen Epitopen des 67 kDa-Antigens reagieren.
Die so selektierten Hybridome H-BL-TPSa und Sb werden rekloniert und hochproduktive Subklone ausgewählt, die die gewünschten monoklonnien Antikörper stabil in hoher Konzentration sezerniaren.
Zur Gewinnung der monoklonalen Antikörper werden die Hybridome in einer Konzentration von 1 χ 106 Zellen pro ml in Kulturgefäße eingeoat und nach jeweils 3 bis 4 Tagen der Überstand teilweise entnommen, wobei mit frischem Kulturmedium ergänzt wird und darauf geachtet wird, daß die Konzentration der Hybridomzellen zwischen 1 χ 106 und 107 Zellen/ml gehalten wird. Als Kulturmedium dient RPMI-1640, supplementiart mit 10% fetalem Kälberserum.
Die Kulturüberstände enthalten die monoklonalen Antikörper und können entweder direkt für entsprechende indirekte Markierungstechniken eingesetzt werden oder nach einer entsprechenden üblichon Abtrennung aus dem Kulturüberstand isoliert und weiterverwendet werden.
2. Beispiel
Mononukloare Zellen werden aus dem Venenblut von Probanden mittels Dichtegradientenzentrifugat'on auf Visotrast/Ficoll, wie allgemein bekannt, gewonnen.
5 χ 105 Zellen werden in einem V-förmigen Gefäß (Zentrifugentube oder V-Bogon-Mikrotiterplatte) mit ΙΟΟμΙ einer Gebrauchslösung der monoklonalen Antikörper BL-TP5a oder 5b, die z. B. aus Kulturüberstand gewonnen werden, suspendiert und für 30 Minuten bei 4°C reagieren gelassen. Die Antikörperlösung enthält 0,1 % Natriumazid.
Durch Suspendieren, Zentrifugieren und Absaugen des Überstandes werden die Zellen anschließend dreimal mit 1 % FKS/0,15M NqCI, 0,01 M Phosphat/0,1 % Natriumazid (pH 7,4) gewaschen.
Dann werden die Zellen mit ΙΟΟμΙ FITC-markiertom Ziege-anti-Mausimmunglobulin für 30 Minuten bei 4"C inkubiert.
Anschließend wird die dreimalige Waschung mit der obengenannten Lösung wiederholt.
Die Zellen werden in gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) mit 1 % Formaldehyd aufgenommen und sind damit für dio fluoreszenzmikroskopische Auswertung oder für eine durchflußzytometrisr.he Bestimmung vorbereitet, die in der üblichen Art und Weise erfolgen kann.
mit humanen Zellen aus dem Blut und aus lymphoiden Organen
| Zelltyp | Durch mAk markierte Zellen |%) | BL-TP 5 b |
| BL-TP 5 a | 70 +/- 6 | |
| Blutlymphozyten | 69 +/- 8 | >95 |
| T-Lymphozyten (SE-pos.) | >95 | 4+/-4 |
| B-Lymphozyten (SE-neg.) | 3+/-4 | <3 |
| LGL(NK) | <3 | 0 |
| Monozyten | 0 | 0 |
| Granulozyten | 0 | 0 |
| Thrombozyten | 0 | 0 |
| Erythrozyten | 0 | >95 |
| Lymphoblasten (PHA) | >95 | >95 |
| Lymphoblasten (BL-Trec) | >95 | 226+/-6 |
| Thymozyten | 28 +/- 5 | 35 +/- 3 |
| Tonsillenlymphozyten | 32 +/- 5 |
Der Nachweis der Antikörperbindung erfolgte durch indirekte Immunfluoreszenz mittels FITC-anti-Meusimmunglobulin und Durchflußzylometrie (FACS-MO).
mit humanen permanent wachsenden Zelllnien
Linie Bindung des monoklonalen Ak
BL-TP5a BL-TP5b
T-Zellen:
CEM + +
MOLT-3 ++ +f
MOLT-4 +H- +
JURKAT +/- +/-
HSB-2
SKW-3 f + + + +
HUT-102 B-Zellen:
REH RAJI IM-9 GM-607
Linie Bindung des monoklonalen Ak
BL-TPb a BL-TPBb
HMy-2 Monozyt. Linio:
U-937 Erythroide Linie:
K-562 Leukämien:
TALL
c-ALL B-CLL -( + /-) + + +
+ f = 100% schwach m. + = <100%,>20% +/- = <20%,>0% = unmarkiert
BL-T1PSb
| Behandlung der PBL | BL-TP5a | Markierung der Zellen durch mAk | CD 5 (OKT1) | CD3(BL-TP3) |
| 68 | BL-TPBb | 68 | 63 | |
| PBS | <5 | 67 | <5 | 65 |
| BL-TP5a | <5 | <5 | <5 | 63 |
| BL-TP 5 b | 69 | <5 | 67 | <5 |
| CD 3 (BL-TP 3) | 70 | |||
Die PBL wurden für 8h bei 370C mit den monoklonen Antikörpern inkubiert, anschließen! gewaschen ui<, mit den verschiedenen monoklonalen Antikörpern markiert.
Zelltyp Markierung der Zellen durch mAk (%|
BL-TP 5 a BL-TPBb CD 5 (OKT1) CD3(BL-TP3)
T-Lymphozyten >95 >95 >95 >95
B-CLL/I <rR ^>95 r-95 <5
B-CLL/II 10 >95 >95 <10
B-CLL/III 8 >95 >95 <5
B-CLL/IV 25 >85 >85
B-CLL/V 20 >85 >85
| Eigenschaften | Monoklonnler Antikörper | BL-TP 5 b |
| BL-TP 5 a | IgGi | |
| Isotyp | IgG 3 | stark |
| Modulation von T-Zellen | sehr stark | nein |
| ZytotoxizitätmitC | nein | schwach |
| ADCCI! | sehr stark | |
| Eignung für: | je | |
| Durchflußzytometrie | ja | ja |
| Immunhistologie | ja | |
| Eigenschaften | Monoklonaler Antikörper | BL-TPBb |
| BL-TP5a | ja | |
| FITC-Kopplung | ja | ja |
| Biotinyliarung | ja | |
| Diagnostische Bedeutung | ||
| für Bestimmung von: | ja | |
| T-Lymphozyten | ja | ja |
| B-Ze'lsubpopulatiun | ja | ja |
| B-CLL | ja | |
| Reaktion mit Zellen bei | ||
| Differentialdiagnostik: | + + + | |
| Normale B- u. T-Zellen | + + | + + + |
| BCLL | - | |
1) AOCC: Antikörper-abhängige »!!vermittelte Zytotoxität, Bindung dor mAk an den Fc-Rozeptor dor NK- u. K-Zellen
Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Epitope eines 67 kDa-Zelloberflächenantigens humaner T-Lymphozyten und B-CLL-Zellen durch Immunisierung von Mäusen mit angereicherten humanen T-Lymphozyten, Fusion von B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen, Selektion von Hybridomen, die monoklonal Antikörper mit Pan-T-Zellreaktivität sezernieren, dadurch gekennzeichnet, daß Hybridome, deren monoklonal Antikörper mit einem Glykoprotein von 67kDa im reduzierten Zustand spezifisch reagieren, dergestalt spezifisch selektiert werden, daß zuerst Pan-T-Lymphozyten-Klone ausgewählt werden, die auch mit einer kleinen Subpopulation der normalen S-Lymphozyten reagieren, anschließend diejenigen Hybridome, deren monoklonal Antikörper mit einem radiomarkierten, durch Detergensbehandlung von T-Zellen solubilisierten Oberflächenpiotein mit einem Molekulargewicht von 67kDa im reduzierten Zustand reagieren, selektiert werden, wobei in einem dritten Soleictionsschritt nur diejenigen monoklonalen Antikörper berücksichtigt werden, die bei indirekter Immunfluoreszenz und durchflußzytometrischer Auswertung eine für die stabile Markierung ausreichend hohe Affinität aufweisen, in einem vierten Schritt die Antikörper ihre Eignung zur Markierung der T-Zellen und der CD5-positiven B-Zellsubpopulation in Kryostatgewebeschnitten bestätigen, durch einen fünfton Schritt monoklonale Antikörper selektiert werden, die die Antigenexpression auf T-Zellen modulieren und durch einen sechsten Selektionsschritt Hybridome separiert werden, deren monoklonale Antikörper mit unterschiedlichen Epitopen des gp67-Antigens reagieren, wobei sowohl monoklonale Antikörper ausgewählt werden, die mit gp67-Epitopen, die auf T-Zellen, einer B-Zellsubpopulation und B-CLL-Zellen vorkommen, reagieren, als auch solche, die mit einem Epitop des gp67 reagieren, welcher zwar auf normalen T-Lymphozyten und einer normalen B-Zellsubpopulation, nicht aber auf B-CLL-Zellen vorkommt bzw. zugänglich ist, daß die so determinierten Hybridome H-BL-TP5a und H-BL-TP5 b in vitro und in vivo kultiviert werden und die sezernierten monoklonalen Antikörper BL-TP5a und BL-TPBb isoliert, angereichert und legebenenfalls mit Markern oder an feste Phasen gekoppelt werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD31012887A DD267737A1 (de) | 1987-12-09 | 1987-12-09 | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen epitope eines 67 kda zelloberflaechenantigens humaner t-lymphozyten und b-cll |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD31012887A DD267737A1 (de) | 1987-12-09 | 1987-12-09 | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen epitope eines 67 kda zelloberflaechenantigens humaner t-lymphozyten und b-cll |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD267737A1 true DD267737A1 (de) | 1989-05-10 |
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ID=5594822
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD31012887A DD267737A1 (de) | 1987-12-09 | 1987-12-09 | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen epitope eines 67 kda zelloberflaechenantigens humaner t-lymphozyten und b-cll |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD267737A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994023747A1 (de) * | 1993-04-14 | 1994-10-27 | Fresenius Ag | Arzneimittel, das antikörper enthält, zur behandlung von t-zell spezifischen immunreaktionen und t-zell-leukämien |
-
1987
- 1987-12-09 DD DD31012887A patent/DD267737A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994023747A1 (de) * | 1993-04-14 | 1994-10-27 | Fresenius Ag | Arzneimittel, das antikörper enthält, zur behandlung von t-zell spezifischen immunreaktionen und t-zell-leukämien |
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