DD267738A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen ein gp 120 antigen humaner t-lymphozyten - Google Patents
Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen ein gp 120 antigen humaner t-lymphozyten Download PDFInfo
- Publication number
- DD267738A1 DD267738A1 DD31013087A DD31013087A DD267738A1 DD 267738 A1 DD267738 A1 DD 267738A1 DD 31013087 A DD31013087 A DD 31013087A DD 31013087 A DD31013087 A DD 31013087A DD 267738 A1 DD267738 A1 DD 267738A1
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- monoclonal antibodies
- cells
- lymphocytes
- hybridomas
- human
- Prior art date
Links
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 abstract description 5
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 abstract 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 101000934376 Homo sapiens T-cell differentiation antigen CD6 Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100025131 T-cell differentiation antigen CD6 Human genes 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 229920013660 Cellon Polymers 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N pemoline Chemical compound O1C(N)=NC(=O)C1C1=CC=CC=C1 NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- QPFMBZIOSGYJDE-UHFFFAOYSA-N 1,1,2,2-tetrachloroethane Chemical compound ClC(Cl)C(Cl)Cl QPFMBZIOSGYJDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 101710181704 Antigenic heat-stable 120 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000045576 Lactoperoxidases Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010064093 Suggestibility Diseases 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer ein 120 kDa-Zelloberflaechenantigen normaler humaner T-Lymphozyten. Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung von entsprechenden monoklonalen Antikoerpern anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen dieser Antikoerper erlaubt. Die monoklonalen Antikoerper sollen nicht nur eine hohe Spezifitaet und Affinitaet, die ihren Einsatz in der Durchflusszytometrie und Immunhistologie gestatten, aufweisen, sondern auch zur Modulation und Eliminierung von T-Lymphozyten geeignet sein. Dazu werden in bekannter Weise Hybridzellen von B-Lymphozyten immunisierter BALB/c-Maeuse erzeugt und Hybridomzellen selektiert, deren monoklonale Antikoerper die gewuenschten Eigenschaften aufweisen. Das Selektionsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in einem mehrstufigen Selektionssystem Hybridome aufgefunden und kultiviert werden, deren monoklonale Antikoerper Pan-T-Zellspezifitaet, Bindung an ein Zelloberflaechenprotein von 120 kDa, ausreichende Affinitaet fuer die Anwendung in der Durchflusszytometrie und Immunhistologie sowie zur Modulation und Eliminiierung von T-Zellen besitzen. Die monoklonalen Antikoerper der Hybridome H-BL-TP 6 a, b und c weisen die gewuenschten Eigenschaften auf. Das Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikoerper beruht auf der In-vitro- oder In-vivo-Kultivierung der entsprechenden Hybridome H-BL-TP 6 a, b und c und der Abtrennung der monoklonalen Antikoerper. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die mit einem Zelloberflächenantigen (gp 120) humanerT- ymphozyten reagieren. Die monoklonalen Antikörper können zur medizinischen Diagnostik und zur Eliminierung vn ι humanen T-Lymphozyten eingesetzt werden.
Es ist bereits bekannt, monoklonal Antikörper herzustellen. Die Prinziplösung der Hybridomherstellung wurde von KÖHLER und MILSTFiN (Nature 256. [1975], S.495) beschrieben.
Es sind monoklonal Antikörper bekannt, die mit unterschiedlichen Zelloberflächenantigenen humaner T-Lymphozyten reagieren (P.C.KUNG, G. GOLDSTEIN: Human T-Iymphocyte differentiation antigens detected by monoclonal antibodies, Research Monographs in Immunology, Vol.3, S.5-15, Hrsg.: TURK, Elsevier/Norh Holland Biomedical Press, Amsterdam/New York/Oxford, 1981 sowie J. A. LEDBETTER, A.E. FRANKEL, L. A. HERZENBERG: Human Leu T-cell differentiation antigens:
quantitative expression on normal lymphoid cells and cell lines, ebenda, S. 16-22). Zu den verbreitetsten monoklonalen Antikörpern, die mit der Gesamtheit der humanen T-Zellen reagieren, gehören OKT3 und OKT1 (US-PS 4381295). Darüber
hinaus sind weitere monoklonsle Antikörper bekannt geworden, die ebenfalls T-Zell-spezifisch reagieren (DD 23*8168A3) und sogar an den antigenspezifischen Rezeptorkomplex der humanen T-Zellen binden.
Die monoklonalen Antikörper gegen humane Leukozyten sind für die medizinische Diagnostik von großer Bedeutung, so daß im Rahmen von bisher drei Workshops über Leukozytenantigene (Paris 1982, Boston 1984, Oxford 1986) eine internationale Standardisierung begonnen wurde, die zur CD-Nomenklatur („Cluster of Differentiation") der entsprechenden monoklonalen Antikörper geführt hat. Die monoklonalen Antikörper der CD-Gruppen 2,3,5,6 und 7 reagieren davon mit allen oder zumindest der großen Mehrheit der humanen T-Zellen (I eukocyte Typing II. Vol. 1-3, Hrsg. E. L. REINHERZ, B. F. HAYNES, L. M. NADLER und I.D.BERNSTEIN: Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986).
Auf dem 3. Workshop in Oxford wurden zusätzlich die Gruppen CD 27 und CD28 etabliert, die Antikörper enthalten, die hauptsächlich mit T-Zellen reagieren.
In der CD6-Gruppe sind bisher nur wenige Antikörper eingeordnet worden. Dies sind die monoklonalen Antikörper (T 12/ 3Pt 12B8 (IgM) und 12.1.5. (IgG 2a) (siehe Leukocyte Typing II). Beide Antikörper weisen eine niedrige Affinität gegenüber humanen T-Zellen auf, so daß sie sich für einen diagnostischen Einsatz nicht gut eignen. Für den Nachweis von T-Zellon im Gewebeschnitt sind sie ebenfalls nicht geeignet. Beide monoklonalen Antikörper induzieren keine Neuanordnung des CD6-Antigens auf den Zelloberflächen der reagierenden T-Zellen und lösen ke'ne Aktivierung der behandelten Zellen aus.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper für das CD6-Antigen (Glykoprotein, 12OkDa) der humanen T-Lymphozyten gestattet.
Die monoklonalen Antikörper sollen sich zur qualitativen und quantitativen durchflußzytometrischen Analyse, zum immunhistologischen Nachweis von T-Zell6n in Kryostatgewebeschnitten sowie zur Eliminierung von T-Zellen aus Lymphzytenpräparationen eignen. Die monoklonalen Antikörper sollen unterschiedliche biologische Funktionen einleiten können. Wünscnenswert ist es, daß sie mit unterschiedlichen Epitopen des CD6-Antigens reagieren und die Modulation dieses Oberflächenantigens der T-Zellen induzieren.
Die monoklonalöii Antikörper soiiun stabil und lagerfähig sein. Glieder der Serie sollen sich auch zur direkten Kopplung mit Fluoreszenzfarbstoffen eignen.
Durch die Bereitstelluni solcher monoklonalen Antikörper soll die medizinische Diagnostik cowie die experimentelle Beeinflußbarkeit von humanen T-Lymphozyten qualifiziert werden.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liogt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridoma t>i zeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung diesel Hybridome sollen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonal Antikörper erzeugt werden, die mit dom 120kDa-Glykoprotein der humanen T-Zellen reagieron.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach den bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation Lymphozyten aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Durch Passage über Nylonwolle oder E-Rosettenbildung werden daraus T-Lymphozyten gewonnen. Eine zweite Variante der T-Lymphozytengewinn'iin) besteht darin, aus hürnenem Thymus eine Zellsusponsion herzustellen und die Bindegewebsanteile durch Dichtegradientenzentrifugation abzutrennen. Mit in der vorangehend beschribhenen oder auf eine andere ähnliche Weise gewonnen humanen T-Lymphozyten werden Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden &-8 Wochen alte weIUII-u.e BALB/c-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäu.e werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert.
Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusionier*. Die geeigneten Maus-Myelomzellen P3-X63 AG 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol· 123, [1979), S. 1548) werden in RPMI-16 K) mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gehalten.
In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 140, [1964], S. 709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zellklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität und der anderen in der Zielstellung genannten Eigenschaften sezernieren. Die Selektion der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200μΙ-ΚυΐΗΗοη aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörper" getestet, die nur mit Zelloberflfichenantigenen von humanen T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit humanen Blutlymphozyten reagieren, mit B-Lyinphozyten, die durch Eliminierung der T-Zellen durch E-Rosettentechnik und/oder Nylonwolleseparation gewonnen werden, getestet. Nur diejenigen Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nicht oder nur mit einem geringen Prozentsatz der B-Lymphozyten, wohl aber mit der großen Mehrheit der Blutlymphozyten und allen separierten T-Lymphozyten reagieren. Die Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen kann sowohl durch indirekte Radiobindungstechnik als auch durch indirekte Immunfluoreszenz erfolgen. So selektierte Kulturen müssen ab dieser S 1Je jedoch auf jeden Fall mit der indirekten Immunfluoreszenztechnik überprüft werden. Dadurch wird ausgeschlossen, daß Hybridome weitergezogen we· Jen, deren Antikörper mit B-Lymphozyten, Non-B/Non-T-Zellen, Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Erythrozyten reagieren Unter den in solcher Art vorselektierten Hybridomen werden nun erfindungsgemäß solche Klone gesucht, deren Antikörper in der Lage sind, mit einem T-Zelloberflächenprotein von etwa 12OkDa (nach Reduktion der Disulfidbrücken) zu reagieren.
Dazu werden die Oberflächenproteine von nativen humanen T-Lymphozyten nach der Laktoperoxidasemethode radioiodiert (125-lod) oder anderweitig markiert. Die Triton X-100-Lysate solcher markierten T-Zellon werden mit den zu untersuchenden Hybridomüberständen inkubiert und anschließend diese Mausantikörper durch Zugabe von Anti-Mausimmunglobulin-Serum präzipitiert. Die von vnspezifischen Komponenten freigewaschenen Präzipitäte worden in Natriumdodozylsulfat-Puffer aufgelöst und anschließend einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen (5-10%) unterzogen.
An Hand von Referenzproteinen wird das apparente Molekulargewicht der radioiodierten, durch den entsprechenden monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennten T-Zellantigene bestimmt. Es werden solche Hybridome ausgewählt, deren monoklonal Antikörper mit Zelloberflächenantigjnen von humanen T-Zellen reagieren, die im reduzierten Zustand ein apparentes Molekulargewicht von 12OkDa aufweisen.
Im dritten Selektionsschritt v/erden davon alle die Hybridome weiterkultiviert, deren Antikörper humane T-Lymphozyten nach indirekter Markierung ausreichend stark anfärben, so daß sich die monoklonalen Antikörper sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Analyse in durchflußzytometrischen Verfahren, wie z. B. der Analyse mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS 440), eingesetzt werden können.
In einem vierten Selektionssihritt werden die selektierten Hybridome überprüft, ob sie sich für die Markierung von antigentragenden Zellen in Kryostatschnitten lymphoider Gewebe eignen und daß sie keine Nebenreaktionen mit anderen Geweben aufweisen. Wenigstens ein Glied der erhaltenen Serie monoklonaler Antikörper sollte diesen Anforderungen entsprechen.
In einem fünften Selektionsschritt wird überprüft, ob die monoklonalen Antikörper der selektierten Hvbridome bei Bindung an die T-Lymphozyten eine Modulation der Antigenoxpression induzieren. Mindestens ein Glied der erhaltenen Serie monoklonaler Antikörper sollte modulierende Eigenschaften gegenüber T-Zellen aufweisen.
Die durch eine derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die gewünschten monoklonalen Antikörper stabil sezernieren. Die so erhaltenen Hybridome werden als H-BL-TP6 bezeichnet. Die Herstellung der monoklonalen Antikörper der Serie BL-TP6, deren einzelne Glieder die zusätzliche Bezeichnung ,ia", „b" und „c" erhalten, basiert auf einem Verfahren, welches auf die In-vitro- oder In-vivo-Kultur der Hybridome H-BL-TP6a, b oder c ausgerichtet ist. Die Hybridome .1-BL-TP6a, b und c werden an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert bzw. liegen kryokonserviert vor und sind Interessenten zugänglich. Die monoklonalen Antikörper BL-TP6a, b und c haben die Registriernummern ZIM-0154, ZIM-0155 und ZIM-0227 im Zentralinstitut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten. Die durch In-vitro- oder In-vivo-Kultur erhaltenen monoklonalen Antikörper BL-TP6a, bunde reagieren mit Leukozyten, anderen Blutzellen sowie lymphoiden Zellen aus bestimmten Organen in der Tabelle 1 dargestellten Weise. Das Reaktionsmuster der monoklonalen Antikörper mit permanent wachsenden Zell-Linien ist in Tabelle 2 aufgeführt.
Der monoklonale Antikörper BL-TP6b ist in der Lage, bei Reaktion mit humanen T-Lymphozyten über 8 bis 16h bei 370C die T-Zellen zu modulieren, d.h. das gp-120-Antigon von der 7elloberf lache zu entfernen (Tab.3). Nach 24 bis 48h wird das Antigen neu synthetisiert und wieder auf Zellmembran exprimi'jrt. Die Behandlung von humanen T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper BL-TP6b leitet eine Aktivierung dieser Zellen ein. Die wichtigsten Eigenschaften der monoklonalen Antikörper BL-TP6a, b und c sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
1. Seispiel
BALB/c-Mäuse werden mit humanan T-Lymphozyten immunisiert. Vier Tage nach der letzten Immunisierung wird die Milz einer solchen Maus entnommen und eine Einzolzellsuspension hergestellt. Davon werden 2 χ 10akornhaltige Zellen mit 2 χ 10' Myelomzellen (P3-X63 Ag8.653) mittels 50%igam Polyethylenglykol (M1:4000) fusioniert. Anschließend werden von den Zellen 200pl-Kulturen in achOe-Well-Gewehekulturplatten angelegt.
Die Überstände der die aufwachsenden HAT-resistenten Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern getestet, die nur mit Zelloberflächenantigenen von humanen T-Lymphozyten reagieren. Nur diejenigen Kulturen werden weiter gezogen, deren Antikörper nicht oder nur mit einem geringen Prozentsatz der peripheren B-Lymphozyten, wohl aber mit der großen Mehrheit der Blutlymphozyten und allen separierten T-Zellen reagieren. Durch indirekte Immunfluoreszenz wird ausgeschlossen, daß Kulturen weitergezogen werden, die Antikörper enthalten, die mit LGL-Zellen, Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten oder Erythrozyten reagieren.
Mittels NDS-Polyacrylamidgelelektrophorese werden diejenigen Kulturen aufgedeckt, die Antikörper entholten, die aus den Triton X-100-L>saten von radioiodierten T-Lymphozyten ein 12OkDa Protein spezifisch isolieren.
Unter den so selektierten Kulturen werden alle Hybridome weiterkultiviert, dere Antikörper humana T-Zellen nach indirekter Markierung ausreichend stark anfärben, so daß sich die monoklonalen Antikörper sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Analyse in durchflußzytometrischen Verfahren, wie z. B. der Analyso mit einem fiuoreszonzaktivierten Zellsortierer, eingesetzt werden können.
Daran schließt sich eine Überprüfung an, ob die Antikörper T-Zellen in Kryostatschnitten lymphoider Gewebe markieren und keine Nebenreaktionen mit anderen Geweben aufweisen. Nur solche Kulturen werden weitergezogen, die diesen Anforderungen genügen.
Weiterhin wird überprüft, ob die Antikörper in der Lage sind, T-Zellen zur Modulation des 120-kDa-Antigens anzuregen Die so selektierten Hybridome H-BL-TP6a, 6b und 6c werden rekloniert und hochproduktive Subklone ausgewählt, die die gewünschten monoklonalen Antikörper stabil in hoher Konzentration sezernieren.
Zu Gewinnung der monoklonalen Antikörper werden die Hybridome in einer Konzentration von 1 χ 106 Zellen pro ml in Kulturgefäße eingesät und nach jeweils 3 bis 4 Tagen der Überstand teilweise entnommen, wobei mit frischem Kulturmedium ergänzt wird und darauf geachtet wird, daß die Konzentration der Hybridomzellen zwischen 1 χ 10s und 107Zellon/ml gehalten wird. Als Kulturmedium dient RPMI-1640, supplementiert mit 10% fetalem Kälberserum.
Die Kulturüberstände enthalten die monoklonalen Antikörper und können entweder direkt für entsprechende indirekte Markierungstechniken eingesetzt werden oder nach einer entsprechenden üblichen Abtrennung aus dem Kulturüberstand isoliert und weiterverwendet werden.
i. Beispiel
Mononukleäre Zellen werden aus dem Venenblut von Probanden mittels Dichtegradientenzentrifugation auf Viso.rast/Ficoll, wie allgemein bekannt, gewonnen.
5 x 105 Zellen werden in einem V-förmigen Gefäß (Zentrifugentube oder V-Boden-Mikrotiterplatte) mit 100μΙ einer Gebrauchslösung der monoklonalen Antikörper BL-TP6a, 6b oder 6c, die z. B. aus Kulturüberstand gewonnen werden, suspendiert und für 30 Minuten bei 4°C reagieren gelassen. Die Antikörperlösung enthält 0,1 % Natriumazid.
Durch Suspendieren, Zentrifugieren und Absaugen des Überstandes werden die Zellen anschließend dreimal mit 1 % FKS/0,15 M NaCI, 0,01 M Phosphat/0,1 % Natriumazid (pH 7,4) gewaschen.
Dann werden die Zellen mit ΙΟΟμΙ FITC-markiertem Ziege-anti-Mauj'rnrrunglubulin für 30 Minuten bei 4°C inkubiert.
Anschließend wird die dreimalige Waschung mit der obengenannten Lösung wiederholt.
Die Zellen werden in gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) mit 1 % Formaldehyd aufgenommen und sind damit für die fluoreszenzmikroskopische Auswertung oder für eine durchflußzytometrische Bestimmung vorbereitet, die in der üblichen Art und Weise erfolgen kann.
| Zelltyp | BL-TP68 | Durch mAk markierte Zellen (%)" | BL-TP6C |
| 72 + 8 | BL-TP 6 b | 72 ±10 | |
| Blutlymphozyten | >95 | 71 ±6 | >95 |
| T-Lymphozyten (SE-positiv) | <5 | >95 | <5 |
| B-Lymphozyfn (SE-negativ) | <5 | <5 | <5 |
| LGL(NK) | 0 | <5 | 0 |
| Monozyten | 0 | 0 | • o |
| Granulozyten | 0 | 0 | 0 |
| Thrombozyten | 0 | C | 0 |
| Erythrozyten | >95 | 0 | >95 |
| Lymphoblasten (PHA stimul.) | >95 | >95 | >95 |
| Lymphoblasten (BL-TRec stimul.) | 32 | >95 | 28 |
| Thymozyten | 35 | 24 | 33 |
| Tonsülenlymphozyten | 30 | ||
1) Entwicklung durch FITC-anti-Mausimmunglobulin; FACS-440 Durchflußzytometrie
Linie
Bindung der monoklonalen" Antikörper BL-TP6a BL-TP6Ö BL-TP6c
T-Zellen: CEM MOLT-3 MOLT-4 JURKAT HSB-2 SKW-3 HUT-102
B-Zellen: REH RAJI IM-9 GM-607 HMy-2
1) Indirekte Immunfluoreszenz:
+ + + = 100% stark markiert + + = 100%schwach markiert f = <100%, >20% + /- = <20%, >0% = unmarkiert
Behandlung der PBL"
BL-TPGa
Durch mAk markierte Zellen |%|21 BL-TP6b BL-TP6C BL-TP3
PBS
BL-TP6? BL-TPPc B L-TP 6 b BL-TP3(CD3)
1) Inkubation der Zellen (2 χ 106) mit jeweils 1Opg monoklonalem Antikörper für 16h bei 370C
2) Indirekte Immunfluoreszenz: FACS-440 Durchflußzytometrie
| 73 | 70 | 72 | 69 |
| 74 | 72 | 71 | 70 |
| 72 | 70 | 69 | 68 |
| <5 | <5 | <5 | 70 |
| 74 | 71 | 73 | <5 |
| Eigenschaft | BLTP6a | Monoklonaler Antikörper | BL-TP6C |
| IgGI | BL-TF1Bb | IgM | |
| Isotyp | noin | igin | nein |
| Modulation | nein | la | ja |
| Zy totoxUität (mit Komplement! | π. in | ||
| Eignung für: | sehr gut | gut | |
| Durchilußzytometrie | sehrgut | gut | gut |
| Immunhistologie | gut | ||
Claims (1)
- -1- 7.67 738 Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegin ein gp-120-Antiyen humaner T-Lymphozyten durch Immunisierung von Mäusen mit nnggroicherten humanen T-Lymphozyten, Fusion von aus der Milz dor Mäuse gewonnen B-Lymphozy en mit murinen Myelomzellen, Selektion von Hybridomen, die monoklonal Antikörper mit Pan-T-?allreaktivität sozernieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridome, deren monoklonal Antikörper mit einem Glykoprotein von etwa 120 kOa im reduzierten Zustand spezifisch reagieren, dergestalt spezifisch selektiert werden, daß zuerst T-Lymphozyten-spezifische Klone ausgewählt we· den, anschließend diejenigen Hybridome, deren monoklonal Antikörper mit einem radiomarkierten, durch Detergensbehandlung der T-Zellcn solubilisierten Oberflächenprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 12OkDa im reduzierten Zustand -eagieren, selektiert werden, wobei in einem dritten Selektionsschritt nur diejenigen monoklonalen Antikörper berücksichtigt werden, die bei indirekter Immunfluoreszenz und durchflußzytometrischer Auswertung eine für die stabile Markierung ausreichend hohe Affinität aufweisen, in einem vierten Schritt einzelne Glieder der Serie monoklonaler Antikörper ihre Eignung zur Markierung der T-Zellen in Kryostatgewebeschnitten bestätigen und durch einen fünften Schritt monoklonal Antikörper selektiert werden, die die Antigenexpression auf T-Zellen modulieren, daß die so determinierten Hybridome H-BL-TP 6a, b und c in vitro und in vivo kultiviert werden und die sezerniei ien monoklonalen Antikörper BL-TP 6a, b und c isoliert, angereichert und gegebenenfalls mit Markorn oder an feste Phasen gekoppelt werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD31013087A DD267738A1 (de) | 1987-12-09 | 1987-12-09 | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen ein gp 120 antigen humaner t-lymphozyten |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD31013087A DD267738A1 (de) | 1987-12-09 | 1987-12-09 | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen ein gp 120 antigen humaner t-lymphozyten |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD267738A1 true DD267738A1 (de) | 1989-05-10 |
Family
ID=5594824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD31013087A DD267738A1 (de) | 1987-12-09 | 1987-12-09 | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen ein gp 120 antigen humaner t-lymphozyten |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD267738A1 (de) |
-
1987
- 1987-12-09 DD DD31013087A patent/DD267738A1/de not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69028684T2 (de) | Gegen die beta-kette des leukozyten-adhäsions-rezeptors gerichtete monoklonale antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung | |
| DE3853588T2 (de) | Monoklonaler antikörper, spezifisch gegen den funktionellen adhäsionsbereich des oberflächenproteins einer phagocyten-zelle. | |
| EP0030815B1 (de) | Hybridzellinie zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen ein menschliches Prothymozyt-Antigen; Antikörper und Verfahren zu seiner Herstellung; diagnostische und therapeutische Verwendungen und diesen Antikörper enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen | |
| DE69731977T2 (de) | Spezifische antikörper für dendritische zellen | |
| EP0033578B1 (de) | Hybridzellinie zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen ein menschliches T-Zellen-Antigen, Antikörper und Verfahren | |
| EP0030814B1 (de) | Hybridzellinie zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen ein menschliches frühes Thymozyt-Antigen; Antikörper und Verfahren zu seiner Herstellung; diagnostische und therapeutische Verwendungen und diesen Antikörper enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen | |
| DE3751827T2 (de) | Gamma, delta t-zellenrezeptor und verfahren zum nachweis | |
| JPS649998B2 (de) | ||
| DE3886237T2 (de) | Reinigung von LFA-3. | |
| DE3687014T2 (de) | Zum erkennen von tumoren faehige klonierte t-zelle und ein t-zellen-antigenrezeptor. | |
| DE3218312A1 (de) | Monoklonale antikoerper, hybridoma-zellklone, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur erkennung von brustkrebs und maligner lymphogranulomatose | |
| DE3689948T2 (de) | Monoklonale antikörper und testverfahren. | |
| DE19727814C1 (de) | Anitkörper 4G8B4B12 | |
| DE68914016T2 (de) | Identifizierung von NK-Zellen und cytotoxische T-Lymphozyten. | |
| DE69434024T2 (de) | Auf humanen cortikalen thymozyten exprimierte oberflächenproteine und ihre verwendung | |
| DE69230762T2 (de) | Icams konstante domäne wasserlöslichen fusionsproteine, immunoglobulin | |
| DE3490527C2 (de) | ||
| DD267738A1 (de) | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen ein gp 120 antigen humaner t-lymphozyten | |
| DD297899A7 (de) | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen ein 40 kda antigen humaner t-lymphozyten | |
| US4624925A (en) | Hybrid cell line for producing monoclonal antibody to a human early thymocyte antigens, antibody, and methods | |
| DD267737A1 (de) | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen epitope eines 67 kda zelloberflaechenantigens humaner t-lymphozyten und b-cll | |
| DE19708877C1 (de) | Antikörper 97A6 | |
| DD272473A1 (de) | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen die epsilon-kette des cd 3-antigens humaner t-lymphozyten | |
| DD272472A1 (de) | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen ein 50 kda-antigen humaner t-lymphozyten | |
| DD272471A1 (de) | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen den il-2-rezeptor humaner t-lymphozyten |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |