DD269629A5

DD269629A5 - Verfahren zur Herstellung von Proteinen des menschlichen Immundefizienz -Virus in mit rekombinanten Baculoviren infizierten Insekten-Zellen

Info

Publication number: DD269629A5
Application number: DD30803987A
Authority: DD
Inventors: Mark A Cochran; Gale E Smith; Franklin Volvovitz
Original assignee: Microgenesys Inc
Priority date: 1986-10-16
Filing date: 1987-10-16
Publication date: 1989-07-05
Also published as: PL268266A1; EP0265785A2; PL161448B1; DK541987D0; AU7984287A; LTIP1794A; LV10654B; JPS63207397A; DK541987A; DD284046A5; CN87107837A; ZA877752B; LTIP1792A; LV10654A; IL84154A0; FI874564A7; EP0265785A3; FI874564A0; PL161165B1; AU8832491A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von AIDS-Virus-Proteinen, bei dem man ein AIDS-Virus-Protein-Gen oder einen Teil davon in die DNA eines Insekten-Virus inseriert, Insekten-Zellen oder Insekten mit dem erhaltenen rekombinanten Virus infiziert, und die erhaltenen infizierten Insekten-Zellen oder Insekten zur Expression oder Bildung des AIDS-Virus-Proteins zuechtet.

Description

Verfahren zur Herstellung von AIDS-Virus^Proteinen Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Medizin bei der Diagnose und Prophylaxe von Immundefizienz-Viru8-Infektionen von Säugern, beispielsweise des Menschen·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das Syndrom der erworbenen Immunschwäche (AIDS) ist eine Viruserkrankung von großer weltweiter Bedeutung« Das verursachende Agenp der Krankheit 1st ein Retrovirus, das als menschliches Immundefizienz-Virus (HIV)_f manchmal auch als Lymphadenopathie-Virus (LAV) (Barre-Sinoussi et al*, 1983), menschliches T-Zell-Leukäniievirus-Typ III (HTLV-III) (Popovic et al., 1984), oder als AIDS-verwandtes Virus (ARV) (Levy et al«, 1984) bezeichnet wird« Die Struktur und die Genorganisation verschiedener AIDS-Viren wurde aus der vollständigen Nucleotidsequenz molekularer Clone und der direkten Sequenzierung viraler Proteine ermittelt.

Das Mantolprotein (envelope protein) ist der vielversprechendste Kandidat bei der Entwicklung eines AIDS-ImpfStoffs und -Diagnoetikums (Franics et al«, 1985). Antikörper gegen das Mantel-Glykoprotein lassen sich üblicherweise in AIDS-Patientenseren nachweisen (Robey et al., 1985). Außerdem stellt das Mantel-Glykoprotein ein Hauptzielantigen des AIDS-Virus dar (Barin et al., 1985).

Die Herstellung eines wirksamen AIDS-Jmpfstoffs höngt von

der Möglichkeit ab, große Mengen eines sicheren Antigene herzustellen, das die schützende Immunität stimuliert, wenn es in Menschen injiziert wird» Die DNA-Rekombinatione-Technlk bietet wegen ihrer bereits verstandenen Fähigkeit, große Mengen sicherer und wirtschaftlicher Immunogene herzustellen, die beste Möglichkeit zur Antigen-i*roduktion# Bei der Auswahl des zu verwendenden Rekombinations-Systems (Bakterien, Hife oder andere eukaryontische Zellen) werden die folgenden Überlegungen ?u berücksichtigen sein:

Das Mantel-Glykoprotein von HIV wird spezifisch durch Glykosylierung und Spaltung prozessiert» Das Rekombinations-System sollte in der Lage sein, das Genprodukt in einer erwünschten Weise zu prozessieren.

Bakterien- und Hefe-Zellen glykosylieren nicht wirksam die in ihnen exprimierten Proteine,

Obwohl Säugerzellen anscheinend die geeigneten Expressions-Vektoren sind, weisen sie den Nachteil auf, daß sie viele unerwünschte imm .inreaktive Antigene enthalten und außerdem stellen sie das Risiko dar, sekundäre Agenzien zu enthalten·

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, AIDS-Virus-Proteine und Fragmente davon bereitzustellen, mit denen sich anti-AIDS-Virus-Antikörper nachweisen bzw« induzieren lassen«

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Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung l.i.egt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zw Herstellung von AIDS-Virus-Proteinen und vun Fragmenten davon zu schaffen, die nicht mit pathogenen Agenzien oder mit Arenzien kontaminiert sind« die bei der Diagnose zu falschen positiven Ergebnissen führen.

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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von AIDS-Virus-Proteinen, das gekennzeichnet iEt dadurch, daß man ein AIDS-Virus-Protein-Gen oder einen Teil davon in die DNA eir.es Insekten-Virus inseriert, Insekten-Zellen oder Insekten mit dem erhaltenen rekombinanten Virus infiziert, und die erhaltenen infizierten Insekten-Zellen oder Insekten zur Expression oder Bildung des AIDS-Virus-Proteins züchtet.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Insekten-Virus ein Baculavirus ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das Baculovirus das Autographa Californica Kern-Polyhedrosis-Virus ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Gen in einen rekombinanten Baculovirus-Expressions-Vektor inseriert wird.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Baculovirus-Expressions-Vektor mehr als ein AIDS-Virus-Protein-Gen oder Teile davon enthält.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Gen oder der Teil davon unter der Kontrolle eines Baculovirus-Promotors exprimiert wird.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß der Baculovirus-Promotor

der Promotor des Polyhedrin-Gens ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß man den rekombinanten Baculovirus-Expressions-Vektor, der in der Lage ist, ein AIDS-Virus-Gen oder einen Teil davon in einer Insektenze]Ie als Wirt zu exprimieren, erhält durch: (a) Herstellung eines rekombinanten Insertions-Vektors durch Insertion eines Baculovirus-Genoin-Teils in ein Clonierungs-Vehikel und anschließende Insertion eines AIDS-Virv.o-Gens oder eines Teils davon in den modifizierter. Insertions-Vektor derart, daß das AIDS-Virus-Gen oder der Teil davon unter der Kontrolle einss Baculovirus-Prc.notors exprimiert wird, und (b) übertragung des so modifizierten AIDS-Virus-Gens oder des Teils davon in einen Baculovirus-Expressions-VGkter durch Vermischen des modifizierten Insertions-Vektors nit Baculovirus-DNA, Transfektion geeigneter Insekten-ZeJlen, und Isolierung rekombinanter Viren, die das AIDS-Virus-Gen oder den Teil davon enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß die Insektenzelle aus der Insektenart Spodoptera frugiperda stammt.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env-Gen oder ein Teil davon ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env gp160-Gen ist.

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Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env gp120-Gen ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env gp41-3en ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen oder der Teil davon vom env-Gen abgeleitet ist und in den Insertions-Vektoren A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L,

A-1 oder B-1 enthalten ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen oder der Teil davon für ein immu.nogenes Fragment des AIDS-Virus-env-Proteins codiert.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das gag-Gen oder ein Teil davon ist

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Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das pol-Gen oder ein Teil davon ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß man die exprimierten AIDS-Virus-Proteine reinigt, indem man eine Lentil-Lectin-Affinitatschromatographie zur Isolierung von Glykopro teinen und sodann eine Größenauftrennung der Glyko-

proteine durch Molekularsiob-Chromatographie durchführt.

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Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums, das gekennzeichnet ist dadurch, daß man eines der nach den vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen AIDS-Virus-Proteine, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Diagnose-Reagenzien, wie oinom flüssigen Träger, zu einem Diagnose-Besteck zusammenstellt.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß man die AIDS-Virus-Proteine in einen festen, gegebenenfalls transparenten Träger, wie die Bohrungen einer Polystyrol-Platte, einen Filter oder Film einbringt oder daran bindet.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Nachweis von AIDS-Virus-Antikörpern, wie menschlichen Antikörpern, das gekennzeichnet ist dadurch, daß man ein Probenmaterial mit einem der nach den vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen AIDS-Virus-Proteine^ gegebenenfalls markier⁴: und/oder gebunden an einen festen Träger, in Berührung bringt und die Bindung oder Reaktion zwischen dem AIDS-Virus-Protein und dem Antikörper bestimmt.

Gegenstand der Erfindung ist auch das genannte Verfahren mit der Besonderheit, daß man es als ELISA (enzymelinked solid phase immuno-absorbent assay) oder als Western-Blot-Analyse ausführt.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Verfahren zur Herstellung eines AIDS-Virus-Impfstoffes, das gekennzeichnet ist dadurch, daß man eines der nach den vorstehend beschriebenen Verfahren gewonnenen AIDS-Virus-Proteine gegebenenfalls zusammen mit üblichen Trägern und/oder Hilfsstoffen zu Dosierungseinheiten konfektioniert.

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Fig. 1 zeigt die Nukleotid-Servenz des Mantel-Gens dee LAV-

1a-Isolats in voller Länge. Die Nukleotid-Sequenz wird zusammen mit der davon abgeleiteten Aminosäure-Sequenz dargestellt. Die Sequenz-Information wurde von "GBNBANK" erhalten. DieNumerierung der Nukleotide beginnt beim ersten Nukleotid des vermuteten ATG-Startcodons. Die Aminosäuren sind ausgehend vom ATG-Startcodon durchnumeriert. Die dem extrazellulären Signalpeptid-Clykoprotein (gp120) und dem Transmembran-Glykoprotein (gp41/ entsprechenden Bereiche werden zusammen mit den vorgeschlagenen Peptid-Spalta teilen und den Asparaginverbundenen Glykosylierungsstellen gezeigt. Die zweckdienlichen Restriktions-Spaltstellen sind unter den Nukleotid-Sequenzen angegeben.

Fig. 2, die die Figuren 2A und 2B enthält, zeigt die Strukturen der rekombinanten Plasmide ο1614 und p1774. Das Pias mid 'pi 774 enthält die vollständige codierende Sequenz des LAV-env-Gens. Das Plasmid wurde in ?wei Stufen konstruiert: (a) das 2686 bp Kpnl-Fragment des LAV-env-Gens wurde aus p1614 isoliert und in die Kpnl-Spaltstelle von pUC18 cloniert, so daß die Smal-Spaltstelle von pUC18 stromaufwärts von der env-Gensequenz war; (b) das synthetische 121 bp Oligomer wurde mit stumpfen Enden in die Snal-Spaltste.lle ligiert. Die Pfeile gerben die Polarität der codierenden Sequenzen an. Entsprechende Re-striktions-Spaltstellen sind angegeben. Die Nukleotid-Sequenz der für die Erfindung hergestellter, synthetischen Oligomere wurde mit einem "Pharmacia Gene Assemb.'.or", basierend auf der vorhergesagten Aminosäure-Sequenz des LAV-L-»re.lchs konstruiert, wobei die bevorzugte Codon-Benutzung det PoIyhedrin-Gens benutzt wurde.

Fig. 3, die die Figuren 3A, 3B und 3C enthält, zeigt die Strukturen der Insertions-Vektoren. Die Insertions-Vektoren MGS-3, MGS-3+2, MGS-4 ui d MGS-5 werden zusammen mit den entsprechenden Restriktions-Spaltstellen und der Nukleotid-Sequenz gezeigt. Die Polarität der Promotor-Sequenzen ist von links nach rechts.

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Fig. 4 zeigt die vorhergesaote Sekimdär-Struktur und die Hydrophilie-Muster des Vorläufers gp160, wie sie durch Computeranalyse mit rem Programm von Chow und Fastman erhalten werden (Biochemistry 13 (1974), S. 222).

Fig. 5 zeigt Wege zur Konstruktion der rekombinanten Vektoren. Die hier gezeigten Plasmide werden beschrieben oder sind mit einem Buchstaben (z.B. A) bezeichnet, der den in den Tabellen 1 und 2 beschriebenen Konstrukten entspricht.

Nachstehend werden Beispiele für besondere Ausführungsformen von Arten der erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide angegeben

AIDS-Vi rus-ervv-Protein, exprimiert von einem rekombinanten Insekten-Virus;

AIDS-Virus-env-Protein, exprimiert von einem rekombinanten Insekten-Baculovirus;

AIDS-Virus-env-Protein, exprimiert in rekombinanten, infizierten Zellen;

AIDS-Virus-env-Protein, exprimiert in rekombinanten, infizierten Insekten-Zellen; AIDS-Virus-env gp 160-Protein; AIOS-Virus-env gp 120-Protein; AIDS-Virus-env gp 41-Protein;

immunogenes Fragment eines AIDS-Virus-env-Proteins; AIDS-Virus-env-Protein, eingebaut in oder gebunden an ein Substrat oder einen Träger;

AIDS-Virus-env-Protein, eingebaut in oder gebunden an einem Film;

gO AIDS-Virus-env-Protein, eingebaut in oder gebunden an einem, transparenten Substrat oder Träger;

AIDS-Polypeptid, gebunden an ein festes Substrat aus Polystyrol, das gegebenenfalls als Mikrotiterplatte mit mehreren Bohrungen ausgebildet ist;

gg AIDS-Virus-env-Protein, eingebaut in oder gebunden an einen N itrocellulosefilm oder eine Nitrocellulose-Membran;

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-ιοί immunogenes Fragment eines AIDS-Virus-env-Proteins, eingebaut in oder gebunden an ein festes Substrat oder einen Träger; AIDS-Virus-Proteine, Mantel und Kern, exprimiert in Insektenzellen;

AIDS-Virus-gag-Protein, exprimiert durch ein rekombinantes Insektenvirus ; und

AIDS-Virus-pol-Protein, exprimiert durch ein rekombinantes Insektenvirus .

IQ Das Baculovirus-Expressionssystem bietet eine attraktive und entwicklungsfähige Gelegenheit zur Herstellung eines wirksamen HIV-Mantel-Immunogens.

Baculoviren lassen sich als hochwirksame eurkaryontische Clonierungs- und Expressions-veKtoren zur Herstellung rekombinanter Proteine in gezüchteten Insektenzellen verwenden.

Baculoviren weisen mehr als die notwendigen Voraussetzungen zur Verwendung als eukaryontische Clonierungs- und Expressions-Vektoren auf. Baculoviren sind sicher, da sie einen engen Wirtsbereich haben, der auf Arthropoden beschränkt ist; sie sind in der Lage, sehr große Mengen exogener DNA zu beherbergen; ihre Zellkultursysteme sind sicher, nicht transformiert und effizient; und sie besitzen den hochwirksamen Polyhedrin-Promotor, der aktiver ist als alle anderen in Virusinfizierten eukaryontischen Zellen bekannten Promotoren.

Das Baculovirensystem bietet außerdem große Vorteile bei der Herstellung von Polypeptiden zur Verwendung in diagnostischen

gO Verfahren. Viele Menschen und Tiere besitzen im allgemeinen Antikörper, die mit bakteriellen Antigenen, mit Hefe-Antigenen und mit heterologen Histokompatibilitäts-Antigenen reagieren. Das Vorliegen dieser Antikörper vermindert die Zuverlässigkeit diagnostischer Verfahren wegen falsch positiver Reaktionen mit kontaminierenden Bakterien-Proteinen, Hefe- und Säuger-Proteinen, die in von den entsprechenden Expressions-Systemen

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hergestellten Präparaten vorgefunden werden. Menschen und Tiere haben höchstwahrscheinlich keine Vorgeschichte der immunologischen Aussetzung gegen Lepidoptera-Zellen oder Baculovirus-Antigene. Es ist deshalb wahrscheinlicher, daß die in diesem System zur Herstellung rekombinanter Proteine verwendeten Lepidoptera-Zellen und das Baculovirus nicht das Problem kontaminierender Antigene aufweisen, die von üblicherweise in Menschen oder Tieren gegenwärtigen Antikörpern erkannt werden. Daher ist es unwahrscheinlich, daß Lepidopte- IQ ra-Zellen oder Baculovirus-bedingte Kontaminationen zu falsch positiven Reaktionen in Diagnose-Verfahren führen, in denen die in diesem System hergestellten rekombinanten Antigene verwendet werden.

je In einer Ausführungsform der Erfindung wurde das Baculovirus Autographa californica Kernpolyhedrosis-Virus (AcMNPV) verwendet. Die zur Expression verwendete Promotor-Sequenz ist die des von diesem Virus abgeleiteten Polyhedrin (occ)-Gens. AcMNPV und rekombinante Virus-Stämme wurden in Spodoptera

2Q frugiperda (Heerwurm)-Zellen gehalten. Die Rekombinante wurde so konstruiert, daß das Pn-Gen deletiert wurde. Damit wird das rekombinante Virus occ~. Dies gestattet eine einfache Identifizierung rekombinanter Viren anhand der Plaque-Morpho-¹ logio. Wenn es einmal isoliert ist, kann · -in rekombinantes Baculovirus zur Infektion beliebiger permissiver oder semipermissiver bzw.susceptibler Zellpopalationen verwendet werden, die als kultivierte Zellinie oder als Teil eines ganzen Insekts gehalten wird.

Ausführungsbeispiele: Beispiel 1 Konstruktion von Insertions-Vektoren

Für die Clonierung und Expression einer für ein Fremdprotein

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codierenden Sequenz in einem Baculovirus-Vektor ist es erforderlich, daß die codierende Sequenz mit dem Polyhedrin-Promotor und 5'-Sequenzen und auf der anderen Seite mit verkürzten codierenden Sequenzen des Polyhedrins so ausgerichtet wird, daß die homologe Rekombination mit dem Baculovirus-Genom zum Transfer der mit dem Polyhedrin-Promotor und einem inaktiven Polyhedrin-Gen ausgerichteten, fremden, codierenden Sequenz führt.

Dementsprechend wird eine Reihe von Insertions-Vektoren zur Verwendung bei AIDS-env-Gen-Konstruktionen entworfen. Jeder nachfolgend beschriebene Insertions-Vektor wird so geplant, daß er das ATC-Translations-Startcodon liefert. Die Insertion fremder Sequenzen in diese Vektoren muß so durchgeführt werden, daß der durch das Startcodon festgelegte Translations-Rahmen durch die fremden Sequenzen in richtiger Weise beibehalten wird.

Der Insertions-Vektor MGS-1 wird aus einem EcoRI-I-Restriktionsfragment-DNA-Clon konstruiert, der aus einem Plaque-gereinigten AcMNPV-Isolat isoliert wurde.

Der Insertions-Vektor MGS-1 weist die folgenden Strukturmerkmale auf (vgl. Fig. 3): 4000 bp Sequenz stromaufwärts vom ATG-Startcodon des Polyhedrin-Gens; ein durcr. gezielte Mutagenese (site directed mutagenesis) eingeführter Polylinker, der aus einem ATG-Startcodon und den Restriktions-Spaltstellen Smal und Kpnl besteht; 1700 bp Sequenz, die sich von der Kpnl-Restriktions-Spaltstelle (die innerhalb des Polyhedrin-Gens liegt) bis zur terminalen EcoRI-Restriktions-Spaltstelle des EcoRI-I-Clons erstrecken.

Der Insertions-Vektor MGS-3 ist identisch mit MGS-1, mit der Ausnahme, daß der Polylinker aus den Restriktions-Spaltstellen Smal, Kpnl, BgIII und einem universellen Stopcodon-Segment besteht.

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Oer Insertions-Vektor MGS-3+2 ist identisch mit MGS-3, mit der Ausnahme, daß er zwei zusätzliche Cytosin-Reste an Position +3 von MGS-3 und einen Guanosin-Rest weniger an Position +4 von MGS-3 aufweist. Das Endergebnis ist eine Verschiebung des Codon-Kahmens um ein Nukleotid gegenüber MGS-3.

Der Insertions-Vektor MGS-4 enthält dieselben Struktur-Merkmale wie MGS-3, mit der Ausnahme, daß er mit einem synthetischen Polylinker konstruiert ist, der Sequenzen enthält, die für die ersten zehn Aminosäuren des N-terminalen Bereichs des Polyhedrin-Gens codieren, auf die die Restriktions-Spalts teilen für Smal, Kpnl, BgIII und ein universelles Stopcodon-, Segment folgen. Dieser Vektor wird auf Grundlage der Beobachtung konstruiert, daß sich gesteigerte Expressions-Raten erhalten lassen, wenn die ersten 14 Aminosäure-Codons des N-Terminus des Polyhedrin-Gens mit dem N-Terminus des fremden Gens verbunden werden (Smith et a.\., 1983).

Der Insertions-Vektor MGS-5 enthält dieselben Strukturmerkmale, wie MGS-3, mit der Ausnahme, daß er mit einem synthetischen Polylinker konstruiert ist, der für das spaltbare Signal-Peptid von IL-2 codierende Sequenzen enthält, gefolgt von Restriktions-Spaltstellen für EcoRI, Kpnl, BgIII und einem universellen Stopcodon-Segment. Dieser Vektor wird verwendet, um interne HIV-env-Sequenzen mit einer Signalpeptid-Sequenz zu liefern, die bekanntlich in Insekten-Zellen wirksam erkannt und entfernt wird (Smith et al., 1985).

Beispiel 2

Konstruktion rekombinanter Baculoviren, die LAV-codierende Sequenzen enthalten

Es wird ein als NA-2 bezeichnetes rekombinantes Plasmid verwendet. Dies besteht aus einem 21, b kb-Segment eines vollständigen AIDS-Provirus, das in pl'C18 inseriert ist. Berichten zufolge ist dieser Clon infektiös, da er nach der

-μι Transfektion bestimmter menschlicher Zellen Viren bilden kann. Die vollständigen in NA-2 enthaltenen Mantel-Gen-Sequenzen w rden von dem LAV-Stamm von HIV abgeleitet (Barre-Sinoussi et al., 1983) .

Das Mantel-Gen von LAV enthält ein mit einem Met-Codon beginnendes und für 861 Aminosäuren codierendes offenes Leseraster (Wain-Hobson et al., 1985). Der HTLV-III-BHIO-Stamm enthält 856 Codons (Starich et al., 1986).

Die Signalpeptid-Sequenz besteht aus 30 Aminosäuren (von denen sich zwei von BHIO unterscheiden); der extra zelluläre Bereich besteht aus 486 Aminosäuren (von denen sich 14 von BHIO unterscheiden) ; und der Transmembran-Bereich besteht aus 345

IQ Aminosäuren (von denen sich 5 von BHIO unterscheiden). Fig. 1 zeigt die Nukleotid- und die davon abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen des LAV-env-Gens, das bei diesen Experimenten verwendet wird. Die Aminosäure-Reste sind beginnend mit dem vermuteten Met-Startcodon durchnumeriert. Hier genannte Aminocäure-Reste entsprechen den in Fig. 1 angegebenen Nummern.

Zusätzlich zum vollständigen gp160 Polypeptid wird eine Reihe von Domänen des HIV-env-Gens exprimiert. Dies wird aus verschie-. denen Gründen durchgeführt, beispielsweise der Proteinstruktur und der bekannten Heterogenität von AIDS-Retrovirus-Isolaten (Benn et al., 1985; Hahn et al., 1985). Es wird ein Computerprogramm verwendet, das die Sekundärstruktur von Proteinen zusammen mit den Hydrophilie-Werten berechnen kann (Chow und Fastman, 1984). Die in Fig. 4 gezeigte Analyse ergibt mehrere

gO hydrophile Domänen, die Beta-Windungen enthalten. Es wurde bereits gezeigt, daß solch»- Domänen mit antigenen Epitopen und struktureller Positionierung in Zusammenhang stehen (Westhoff et al., 1984). Aufgrund dieser Ergebnisse und des Vorliegens bequemer Restriktions-Spaltsteilen wird eine Reihe

gg C-terminaler, verkürzter Formen des in Fig. 4 angegebenen Mantel-Proteins exprimiert. Der Vorteil solcher Konstruktionen

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ist, daß damit progressive Deletionen erhalten werden, die mit der C-terminalun, hydrophoben Domäne beginnen. Außerdem werden die von gp41-codierenden Sequenzen überstrichenen Bereiche exprimiert. Mindestens zwei immundominante Epitope sind in den zu exprimierenden Bereichen enthalten. Für diese Konstrukte wird ein Vektor geschaffen, der die spaltbare Signalsequenz von IL-2 enthält. Es wurde kürzlich gezeigt, daß das IL-2-Signalpeptid ein korrektes zelluläres Prozessieren des IL-2-Gens verursacht, das von einem rekombi- IQ nanten Baculovirus-Genom in infizierten Zellen exprimiert wird (Smith et al., 1985).

Die für die Expression von HIV-enν-Sequenzen entworfene Clonierungs-Strategie ist in Fig. 5 dargestellt.

Das Mantel-Gen wird zuerst als 3846 bp EcoRI/SacI-Restriktions-Fragment aus NA-2 isoliert und in der EcoRI/SacI-Restriktions-Spaltstelle von p^r.'C19 cloniert. Das erhaltene Plasmid wird als p708 bezeichnet. Anschließend wird das Mantel-Gen wieder

2Q als 2800 bp Kpnl-Restriktions-Fragment isoliert und in der Kpnl-Restriktions-Spaltstelie von pUC18 cloniert. Der erhaltene Clon wird als p1614 (vgl. Fig. 2A) bezeichnet. Dieses Kpnl-Restriktions-Fragment enthält ein leicht verkürztes Stück des Mantel-Gens, so daß 121 bp der dem N-.Terminus entsprechenden Sequenz fehlen. Dieser fehlende Bereich des Gens, der die Signalpeptid-Sequenzen enthält, wird durch die Insertion eines doppelsträngigen, synthetischen Oligomers ersetzt, das ausgehend von der LA^-Aminosäure-Sequenze entworfen wurde, wobei die bevorzugte Polyhedrin-Gen-Codonnutzung angewendet

«λ wird. Um weitere Manipulationen zu erleichtern, wird gleichzeitig damit eine neue Smal-Restriktionssequenz anstelle des ATG-Startcodons eingefügt. Das ATG-Startcodon wird dann vom Insertions-Vektor geliefert .. Das so erhaltene Plasmid wird als p1774 bezeichnet. Es ist in Fig. 2B abgebildet.

Restriktions-Fragmente von p1774, die die Codon-Sequenzen ver-

schiedener Domänen des AIDS-Mantel-Proteins enthalten, werden in den MGS-Vektoren so cloniert, daß das ATG-Startcodon des Insertions-Vektors im Leseraster mit den Coions des Mantel-Gens ist. Die folgenden Konstrukte werden hergestellt (vgl. Fig. 5) .

A. gp160 wird in voller Länge als Smal/partiell gespaltenes Kpnl-Fragment in die Smal-Spaltstelle von MGS-3 cloniert. Dieser Clon enthält alle codierenden Sequenzen von gp160 und benutzt sein natürliches Translations-Stopcodon .

A1. gp160 wird in voller Länge als Smal/partiell gespaltenes Kpnl-Fragment in die Smal/Xpnl-Spaltstelle von MGS-4 . cloniert. Dieser Clon enthält alle codierenden Sequenzen von gp160 und benutzt sein natürliches Translations-Stopcodon.

B. Verkürztes gp160 wird als Smal/bamHI-Restj. ikticnG Fragment in die Smal/Bglll-Spaltstelle von MGS-3 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die Aminosäuren 1 bis 757 von gp160 codieren und benutzt ein vom MGS-3-Vektor zur Verfügung gestelltes Stopcodon .

B1 . Verkürztes gp1 60 wird als Smal/Bamtil-Restriktions-Fragment in die Smal/Bglll-Spaltstelle von MGS-4 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die Aminosäuren 1 bis 757 von gp160 codieren und benutzt ein vom MGS-4-Vektor geliefertes Stopcodon .

C. Verkürztes gp160 wird als Smal/aufgefülltes Hindlll-Restriktions-Fragment in die Smal-Spaltstelle von MGS-3 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die Aminosäurer. 1 bis 645 von gp160 codieren und benutzt ein vom MGS-3-Vektor bereitgestelltes Stopcodon.

D. gp120 wird in voller Länge als Smal/partialgespaltenes Bglll-Restriktions-Fragment cloniert, an das ein synthetischer

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DNA-Linker an der Bglll-Spaltstelle angehängt wurde, um die Sequenzen von der Bglll-Spaltstelle (bei Aminosäure-Codon 472) bis zum letzten C-terminalen Codon von gp120 aufzufüllen. Dieser Clon enthält Sequenzen, die die Aminosäuren 1 bis 516 codieren. Dies ist die vollständig für gp120 codierende Sequenz. Das Translations-Stopcodon befindet sich bei einem vom MGS-3-Vektor gelieferten TAA.

E. Verkürztes gp120 wird als Smal/partiell gespaltenes

Bglll-Restriktions-Fragment in die Smal/Bglll-Restriktions-Spaltstelle von MGS-3 cloniert.

F. Verkürztes gp120 wird als Smal/Bglll-Restriktions-Fragment in die Smal/Bglll-Spaltstelle von MGS-3 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die die Aminosäuren 1 bis 279 codieren und benutzt ein vom Vei'.tor MGS-3 geliefertes Stopcodon.

G. Verkürztes gp120 wird fIs Smal/Dral-Restriktions-Fragment in die Smal-Spaltstelle von MGS-3 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die Aminosäuren 1 bis 129 codieren und benutzt ein vom Vektor MGS-3 geliefertes Stopcodon.

H. HBsAG-codierende Sequenzen werden in das oben beschriebene Smal/Dral-Konstrukt als BamHI-Fragment in die stromabwärts auf dem Vektor gelegene Bglll-Spaltstelle eingebaut. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die ersten 129 N-terminalen Aminosäuren von gp120 codieren, gefolgt im Leseraster von Sequenzen, die das HBsAg codieren.

I. gp41 wird als Bglll-Restriktions-Fragment in die BgIII-Spaltstelle von MGS-3 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die Aminosäure 472 bis zum C-Termin· .3 von gp160 codieren .

J. gp41 wird als aus P3156 isoliertes Smal/Kpnl-Fragment in die vorbereitete EcoRI-Spaltstelle und die Kpnl-Spalt-

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stelle des Vektors MGS-5 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für das Signalpeptid von IL-2 codieren und mit Sequenzen verbunden sind, die für Aminosär e 473 bis zum C-Terminus von gp160 codieren.

K. Verkürztes gp41 wird als Bglll/BamHI-Fragment in die Bglll-Spaltstelle von MGS-3 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für die Aminosäuren 472 bis 757 von gp160 codieren und benutzt das vom Vektor MGS-3 gelieferte Stopcodon

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L. Verkürztes gp41 wird als aus p3166 isoliertes Kpnl/BamHI-Fragment in die Kpnl/BamHI-Spaltstelle von pMGS-5 cloniert. Dieser Clon enthält Sequenzen, die für das Signalpeptid von IL-2 codieren und mit Sequenzen verbunden sind, die für die Aminosäuren 472 bis 757 von gp160 codieren.

Beispiel 3 Herstellung und Selektion rekombinanter Baculoviren

Die rekombinanten HIV-env-Gen-Plasmide werden zusammen mit AcMNPV mit Calciumphosphat gefällt und nicht-infizierte Spodoptera frugiperda-Zellen werden mit dem Präzipitat versetzt. Die Chimären Gene werden sodann durch homologe Rekom- ' bination in das AcMNPV-Genom inseriert. Rekombinante Viren werden anhand der occ~-Plaquemorphologie identifiziert. Solche Plaques weisen einen indentifizierbaren cytopathischen Effekt, jedoch keine Kerneinschlüsse auf. Nacheinander werden zwei weitere Plaque-Reinigungen ausgeführt, um das rekombinante Virus zu erhalten. Die Insertion der HlV-env-Sequenzen an einer spezifischen Stelle der rekombinanten Virus-DNA wird durch Vergleich ihrer Restriktions- und Hybridisierungs-Merkmale mit Wildtyp-Virus-DNA untersucht.

Beispiel 4

Expression von HlV-euy. ausgehend von rekombinanten Baculoviren in infizierten Insekten-Zellen

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Die Expression von HIV-env-Sequenzen durch die rekombinanten Viren in Insektenzelien sollte zur Synthese primärer Translations-°rodukte als prä-pro-Proteine führen, die alle codierten Aminosäuren ab dem stromabwärts vom Polyhedrin-Promotor gelegenen ATG-Startcodon des Expressions-Vektors enthalten. Dieses primären. Produkte bestehen aus Aminosäuren, die ausgehend von den vom rekombinanten Vektor gelieferten Codons translatiert. werden. Beispielsweise sollte das primäre Translations-Produkt des Konstrukts A am N-Terminus die Sequenz Met-Pro-Gly-Arg-Val aufweisen. Die Met-Pro-Gly-Codons werden als Ergebnis der Clonierungsstrategie geliefert.

Durch zwei potentielle Prozessierungs-Stellen für die Spaltung des enν-Vorläufer-Glykoproteins würden erstens 30 Aminosäureteste des Signalpeptids am N-Terminus entfernt werden utid zweitens würde ein großes Transmembranprotein entstehen, das 345 Aminosäuren und einen extrazellulären Anteil mit 486 Aminosäuren enthält. Es wird allgemein davon ausgegangen, daß Erkennung und Spaltung des Signalpeptids zur wirksamen Pro?üssierung durch die Zelle erforderlich sind.

Zur Bestimmung der Expression von HIV-enν-Gen-Sequenzen durch rekombinante Baculoviren werden Insekten-Zellkulturen mit jedem der verschiedenen rekombinanten Viren infiziert, in Spät-

35 35

scadien der Infektion in Gegenwart von S-Methionm, S-Cystin oder H-Mannose. Markierte Zellextrakte werden durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) und Autoradiographie sichtbar gemacht.

Zur Auswertung der Richtigkeit der in den mit rekombinanten HIV-Baculoviren infizierten Insektenzellen hergestellten rekombinanten Proteine werden drei Serum-Typen verwendet:

1. HIV-positive menschliche Seren, die vom Center for Disease Control (CDC, Atlanta, Georgia) als HIV-positive Standardkontrolle bereitgestellt wurden;

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2. HIV-negative menschliche Seren, die ebenso von CDC als HIV-negative Standardkontrolle bereitgestellt wurden; und

3. Polyclonale Ziegen-Antikörper, die gegen gereinigtes gp120-Mantel-Protein gerichtet sind, das aus gereinigten, infektiösen HTLV-III-Viren hergestellt wurde.

Die Ergebnisse sind in den Tabellen I und II zusammengefaßt:

Tabelle I

Isolat Nr.

Beschreibung

Serum HIV-neg HIV-pos gp120-pos

Kontrollen

uninf. Sf Zellen wt inf. Sf Zellen

Rekombinante Vektoren

A.	2863	vollst. gp160 1-861	nd	⁺	⁺
A1	.3715		_	nd	nd
B.	3046	verkürztes gp160 1-757	nd	₊	₊
B1	.3540		nd	nd	nd
C.	3774	verkürztes gp160 1-645	nd	nd	nd
D.	4646	gp120, 1-516	-	nd	nd
E.	2040	verkürztes gp120 1-472	-	⁺	⁺
F.	2165	verkürztes gp1 20 1-279	-	-
G.	2196	verkürztes gp120 1-129	nd	-	-
H.	3076	Aminosäure 1-129 in Fusion mit HBsAg	-	nd	nd
I.	3156	gp41, 472-861	nd	+	+
J.	4585	IL-2 Signal/gp41	-	nd	nd
K.	3166	verkürztes gp41 472-757	-	⁺	⁺
L.		IL-2 Signal/verkürztes gp41	-	-

nd: nicht bestimmt

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	vohergesagter	2863	vollst. gp160 1-861	93.200 56.000 37.000	und beobachteter	Beobach tete Grö
	Ergebnisse	.3715		wie in A		160.000 120.000 41 .000
Tabelle II	Konstrukt/ Mantel- ₁ Vorhergesagte Isolat Nr. Aminosäuren Nichtglykosyliert	3046	verkürztes gp16ⁿ 1-757	82.000 56.000 26.000	2 Größe Glykosyliert	wie in
Zusammenfassung von Isolat,	A.	.3540		wie in B	160.000 120.000 41.000	150.000 120.000 30.000
	A1	3774	verkürztes gp160 1-645	69.000 56.000 14.000	wie in A	wie in B
	B.	4646	gp120, 1-516	56.000	150.000 120.000 30.000
B1	2040	verkürztes gp120 1-472	51.000	wie in B	N.D.
C.	2165	verkürztes gp120 1-279	30.000	130.000 120.000 18.000	110.000 90.000
D.	2196	verkürztes gp120 1-129	12.000	120.000	60.000
E.	3076	Aminosäure 1-129 in Fusion mit HBsAg	35.000	110.000	15.000
F.	3156	gp41, 472-861	42.000	60.000
G.	4585	IL-2-Signal/ gp41	42.000	15.000
H.	3166	verkürztes gp41 472-757	30.000	40.000	N.D.
I.		IL-2-Signal/ verkürztes gp41	30.000	46.000	N.D.
J.		46.000	N.D.
K.		33.000
L.	33.000

1; Aminosäurereste, die im nicht-prozessierten prä-pro-Genpro-.

dukt vorhergesagt wurden und von der Nukleotid-Sequenz bestimmt wurden. 2: Geschätzt entsprechend den vorliegenden Aminosäureresten

und vorher^ "!sagten prozessierten Formen. 3: Hauptimmunreaktive Polypeptide. N.D.: nicht bestimmt

269*29

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Die rekombinanten gp160-Proteine werden erfolgreich in typischen diagnostischen Tests, wie ELISA und Radioimmunpräzipitation zusätzlich zu Western Blot-Analysen eingesetzt.

Beispiel 5 Reinigung von HIV-Mantel-Proteinen

Rekombinante HIV-Mantel-Proteine werden in S. frugiperda-Zellen während 4 bis 5 Tagen nach der Infektion mit einem rekombinanten HIV-AcNPV-Virus hergestellt. Die Mehrzahl der exprimierten Proteine ist mit den infizierten Zellen assoziiert. Da alle hier beschriebenen HIV-Genprodukte ähnliche Eigenschaften aufweisen, d.h. sie sind vorwiegend zeilassoziiert und sie sind Glykoproteine, läßt sich ein und dasselbe.Reinigungs-Verfahren für alle hier beschriebenen HIV-Mantel-Genprodukte oder ähnlicheKonstrukte verwenden. Cm folgenden wird das Verfahren beispielhaft anhand der Reinigung des vom Expressions-Vektor Ac3046 hergestellten rekombinanten gp160-Proteins erläutert.

S. frugiperda-Zellen werden mit dem rekombinanten Vektor Ac3046 infiziert. 4 bis 5 Tage nach der Infektion werden die Zellen gesammelt und das Zellkultur-Medium wird durch Waschen entfernt. Die Zellen werden zuerst nach Standardverfahren in Kern- und Cytoplasmamembran-Fraktionen getrennt. Die Glykoprotein-Fraktion enthält das gp160-Protein. Sie wird gelöst und die Glykoproteine werden in an sich bekannter Weiae durch eine Lentil-Lectin-Affinitätschromatcgraphie gereinigt. Die Glykoprotein-Fraktion enthält das gp160-Protein. In diesem

gO Stadium stellt das pg160-Protein 25 bis 50 % der gesamten Glykoprotein-Fraktion dar. Dies ergibt sirh aus der SDS-PoIyacrylamid-Gel-Analyse. Zur weiteren Reinigung von gp160 wird die Glykoprotein-Fraktion an einer Molekularsieb-Flüssigkeitschromatographie-Säule gereinigt. Das gp160-Protein eluiert von der Säule als Hochmolekulargewichts-Fraktion. Das gp160-Protein bildet etwa 90 % des Gesamtproteins in der

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Hochmolekular-Fraktion.

Interessant ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Veröffentlichung mit dem Titel "AIDS Virus Env Protein Expressed from a Recombinant Vaccinia Virus" von M.P. Kieny et al., Bio/Technology 4 (September 1986), Seiten 790 - 795. In dieser Veröffentlichung wird beschrieben, wie die codierende Seguenz des env-Proteins von LAV in einen Vaccinia-Virus-Vektor eingebaut wird. Das erhaltene rekombinante Lebendvirus VVTGeLAV bewirkt sodann die Bildung von env-Protein in infizierten Säugerzellen. Dieses rekombinante Protein reagiert mit Seren von AIDS-Patienten und wird anscheinend genau wie das echte env-Protein des LAV-Retrovirus prozessiert und glykosyliert. Außerdem ruft die Inokulation von Mäusen mit VVTGeLAV Antiseren mit hohen Titern hervor, die Vaccinia-Determinanten erkennen, jedoch nur mit niedrigen Antikörper-Titern, die die env-Proteine von LAV erkennen. Mit diesem rekombinanten Virus infizierte Zellen sezernieren rasch die prozessierte Form des env-Proteins in das KuI-turmedium. Diese Möglichkeit zur Herstellung und Benutzung des env-Proteins, beispielsweise in einem Impfstoff, zur Erzeugung einer Immunantwort gegen das LAV- oder HIV-Virus, ist nicht völlig zufriedenstellend, insbesondere wegen der Verwendung des Vaccinia-Virus als Vektor.

Von weiterem Interesse im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind der Artikel "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with Baculovirus Expression Vector" von G.E. Smith et al., Molecular and Cellular Biology, 3, Nr. 12 (Dezember 1983), Seiten 183 - 192; und die Veröffentlichung "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli Beta-Galactosidase in Insect Cells with a Baculovirus Vector" von G.D. Pennock et al., Molecular and Cellular Biology, 4, Nr. 3 (März 1984), Seiten 399 - 406.

ge Von weiterem Interesse ist die gleichzeitig anhängige und übertragene, am 18. Dezember 1985 eingereichte Patentanmeldung

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mit der Seriennummer 810 938. Außerdem sind die EP-A-O 127 (veröffentlicht am 12. Dezember 1984) und die EP-A-O 155 (veröffentlicht am 25. September 1985) von Interesse im Hinblick auf die vorliegende Erfindung. Auf den Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichungen und dieser Offenlegungsschriften und der Patentanmeldung wird hiermit Bezug genommen.

Da AIDS (Human Acguired Immune Deficiency Syndrome) in den USA, Zentralafrika, Europa und in anderen Gebieten der Erde epidemisch ist, ist die vorliegende Erfindung von großer Bedeutung. Wie bereits ausgeführt, ist das verursachende Agens dieser Krankheit (AIDS) ein als menschliches Immundefizienz-Virus (HIV) bezeichnetes Retrovirus, das bisweilen auch als Lymphadenopathie-Virus (LAV), menschliches T-Zell-Leukämi.i-Virus-Typ III (HTLV-III) oder AIDS-verwandtes Virus (ARV) bezeichnet wird. Die Struktur- und Ginorganisation mehrerer AIDS-Viren wurde aus der vollständigen Nukleotid-Sequen?. molekularer Clone und durch direkte Sequenzierung viraler Proteine aufgeklärt. Das HIV-Mantel-Gen (env) codiert ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 160 000 und wird als gp160 bezeichnet. In mit dem Virus infizierten Zellen wird der gp160-Vorläufer an eir.^r konservierten Sequenz basischer Aminosäuren gespalten. Dabei entsteht ein N-terminales Glykoprotein gp120 und ein kleineres C-terminales Protein gp41. Die HIV-Glykoproteine gp160, gp120 bzw. gp41 enthalten etwa 833, 488 und 345 Aminosäuren.

Das reife gp120 ist mit dem Virus-Mantel assoziiert. Man nimmt an, daß es ein externes Protein ist, während gp41 zwei lange Bereiche hydrophober Reste aufweist, von denen einer oder beide durch den Virus-Mantel hindurchreichen kann. Der gp160-Vorläufer und die reifen gp120 und gp41 Proteine werden durch Antiseren bei den meisten exponierten Individuen nachgewiesen. Außerdem wurde gezeigt, daß das gp120-Protein an das T4-Molekül der Zelloberfläche von Helfer/In-

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duktor-T-Lymphocyten bindet, und daß das HIV-gp160-Protein in der Lage ist, eine Syncytium-Bildung mit Zellen zu induzierer., die das T4-Rezeptor-Protein exprimieren. Es ist ferner bekannt, daß die 104 carboxyterminalen Aminosäuren von gp160 nicht zur Fusion von T4+ T-Lymphocyten erforderlich sind.

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Erfindungsgemäß wird das AIDS-Virus-Mantel-Glykoprotein gp160 von HIV von einem AIDS-Virus-env-Gen exprimiert, das aus einem infektiösen HIV-Isolat cloniert wurde. Das für die Expression verwendete HIV-env-Gen codiert lediglich für die im natürlichen HIV-env-Gen vorgefundenen Sequenzen. Das HIV-env-Gen wird in ein rekombinantes Baculovirus inseriert, so daß die Expression eines reifen Proteins erfolgt, das keine veränderten oder zusätzlichen Aminosäuren enthält. Von den verschiedenen hergestellten Rekombinanten enthält e-' \e das vollständige HIV-env-Gen und eine andere ist bis auf eine kleine Deletion in der Sequenz von etwa 100 Aminosäuren am C-Terminus von gp160 vollständig. Die Deletion wird durchgeführt, um die Stabilisierung des exprimierten rekombinanten Proteins gp160 zu unterstützen. Dadurch werden jedoch die zwei in gp41 vorkommenden hydrophoben Domänen nicht entfernt.

Das HIV-gp160 wird, wie nachstehend beschrieben, in einem Insekten-Zell-Expressions-System hergestellt und ist, wie bereits vorstehend erläutert, frei von Kontaminationen durch Säugerzell-Proteine. Die Expression und Reinigung des gp160-Proteins wird unter Bedingungen durchgeführt, bei denen die natürliche Protein-Struktur und dessen biologische Aktivität erhalten bleiben. Das entstehende exprimierte HIV-env-Protein ist hochreaktiv mit Seren von AIDS-Patienten. Dies wird durch Immunpräzipitation, Western-Blot-Analyse und durch ELISA-Tests gezeigt.

Das erfindungsgemäße HIV-gp160-Protein wird in unterschiedlicher Menge, Reinheit und Form hergestellt, bei-3G spielsweise in einem sterilen wässrigen Puffer mit einer Konzentration von etwa 100 Mikrogramm Mantel-Protein pro Milliliter bei einer Reinheit von mehr als 50 %,

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bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-FPLC-Analyse. Es wurde gefunden, daß das HIV-gp160-Protein mindestens sechs Wochen bei 4⁰C stabil ist. Dieses Protein wird in Mengen oder Volumina zum einmaligen Gebrauch bereitgestellt und läßt sich zufriedenstellend bei -7O⁰C lagern. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte möglichst vermieden werden. Verdünnungen sollten mit Lösuncan durchgeführt werden, die geeignete Proteine oder Detergenzien enthalten, um einen Verlust an Proteinen und biologischer Aktivität zu vermeiden. Geeignete Verdünnungsmittel sind 0,1 %iges Rinderserumalbumin (BSA) oder ..quivalente davon, 0,1 %iges Serum in sterilem Wasser oder Kulturmedium und 0,1 %iges Natriumdodecylsulfat oder andere geeignete Detergenzien in Wasser oder Puffer. Das erfindungsgemäß hergestellte Protein HIV-gp160 läßt sich, wie vorstehend angegeben, verwenden. Es läßt sich in verschiedenen Größen, je nach Gebrauch oder vorgesehener Verwendung, verpacken, beispielsweise in Packungen mit 25 Mikrogramm, 50 Mikrogramm oder 100 Mikrogramm Protein. Das Protein ist für in vitro-Untersuchungen und .\ndere Untersuchungen verwendbar, die verschiedene Aspekte der AIDS-Forschung betreffen. Dazu gehören Impfstoff-Entwicklung, Anfertigung von Western-Blots, ELISA, Rezeptor-Bindung, Inununprazipitation, Herstellung von Antiseren, Bildung von Synzytien und andere Verwendungen, einschließlich physikalischer Untersuchungen und die Verwendung als Standard-Kontrollmaterial.

Die Western-Blot-Analyse ist eine der spezifischsten und sensitivsten Meu.oden, die es für den Nachweis von AIDS-Antikörpemgibt. Sie wird häufig in verschiedenen Bereichen der AIDS-Forschung angewendet. Dabei lassen sich der gp160-Vorläufer und die reifen Proteine gp120 und gp41 durch Antiseren von AIDS-serumpositiven Individuen

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nachweisen. Dementsprechend wird in einer Ausführurgsform der vorliegenden Erfindung das AIDS-Virus-Mantel- oder env-Protein auf einem geeigneten Substrat aufgebracht, beispielsweise Keramik, Glas, Polystyrol-Piastikplatten, Bohrungen oder Film, wie Nitrozellulose-Membran-Streifen, zur Verwendung in Verbindung mit dem Nachweis von AIDS-Antikörpern.

Besonders im Zusammenhang mit dieser Ausführungsform der Erfindung wird elektrophoretisch getrenntes, rekombinantes AIDS-Mantel-Protein HIV-gp160 auf Nitrozellulose-Membran-Streifen aufgebracht, die beim Western-Blot oder als Blot-Streifen verwendbar sind. Da das HIV-env-gp erfindungsgemäß in einem Insekten-Zell-Expressions-System hergestellt wird, ist es frei von kontaminierenden Säuger-Zell-Proteinen. Es wurde gefunden, daß diese Substanz, aufgebracht auf Nitrozellulose-Streifen zur Verwendung als Western-Blot-Streifen hoch reaktiv mit AIDS-Patienton-Seren ist,und das auf Nitrozellulose-Streifen aufgebrachte HIV-gp160 wurde erfolgreich mit menschlichen AI')S-positiven Seren in Verdünnungen von 1 : 100 bis zu 1 : 10 000 getestet. Die spezifisch darauf gebundenen Antikörper lassen sich entweder mit Enzym-gebundenen Reagenzien nachweisen, wie alkalischerPhosphatase oder Peroxidase, mit konjugierten zweiten Antikörpern oder mit spezifischen anti-Antikörpern oder mit mit radioaktivem Jod markiertem Protein A. Die immunologischen Verfahren zur Western-Blot-Analyse, die bei diesen besonderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung angewendet werden, d.h. die mit dem HIV-env-Protein imprägnierten Träger oder Blot-Streifen zur Western-Blot-Analyse, sind übliche Verfahren.

Die HIV-gp160-Streifen oder -Träger werden erfindungsgemäß in Einwegschalen in einer geeigneten Anzahl, wie

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acht Streifen in acht verschiedenen Bohrungen, hergestellt. Alle Inkubationen lassen sich in der Schale durchführen. Es wird ein Deckel mitgeliefert, so daß die Schalen als bequeme Lagerbehälter für die entwickelten Western-Blots oder Untersuchungsergebnisse verwendet werden können. Jeder dieser Streifen wird erfindungsgemäß mit rekombinantem HIV-gp160-Mantel-Protein imprägniert, das durch Elsktrophorese au:: einem 10 %igen SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und sodann elektrophoretisch auf Nitrozellulose-Membranen oder -Streifen oder Träger übertragen wird. Das erhaltene Produkt eignet sich zum Nachweis von anti-AIDS-Mantel-Antikörpern in vitro, zur Untersuchung von Tiermaterial, von Zellen oder Gewebekulturen, im Zusammenhang mit verschiedenen Aspekten der AIDS-Forschung, einschließlich Western-Blot zum Nachweis von AIDS-Antikörpern, und für Qualitätskontrolle, Absuchen von Blutbanken und für die Diagnose von AIDS. Es wurde gefunden, daß die Nitrozellulose-Membran-Träger oder -Streifen mindestens sechs Wochen bei Raumtemperatur stabil sind und sich beispielsweise in den Schalen an einer, kühlen, trockenen Platz gut lagern lassen.

Die HIV-gp160-ELISA-Platten werden erfindungsgemäß in Einwegschalen mit einer geeigneten Anzahl, beispielsweise mit 96 verschiedenen Bohrungen hergestellt. Alle Inkubationen werden in den Schalen durchgeführt. In jede Bohrung wird eine geeignete Menge HIV-gp160 gegeben, beispielsweise 100 Mikroliter gereinigtes HIV-gp160 mit einer. Konzentration von 1 Mikrogramm HIV-gp160 pro Milliliter. Das HIV-gp160-Protein wird an das Plastik in der Bohrung ausreichend lange angelagert, beispielsweise über Nacht bei 4⁰C. Die hinterbleibende Lösung wird dann aus jeder Bohrung der ELISA-Platte entfernt, und die ELISA-Platten werden bei Raumtemperatur getrocknet. Die

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erhaltenen Platten mit dem auf die Bohrungen aufgebrachten HIV-gp160 sind mindestens sechs Wochen bei Raumtemperatur stabil und lassen sich beispielsweise in Schalen an einem kühlen, trockenen Platz gut lagern. Das erhaltene Produkt ist zum Nachweis von AIDS-Mantel-Antikörpern oder -Antigenen bei Untersuchungen von Tieren und Zeil- oder Gev/ebe-Kulturen im Rahmen verschiedener Aspekte der AIDS-Forschung verwendbar,dazu gehören ELISA-Tests, und auch das Absuchen und die Diagnose von menschlichen Seren nach AIDS-Antikörpern oder -Antigenen.

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung wird auf die folgenden Veröffentlichungen verwiesen:

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Claims

Patentanspruch;

1. Verfahren ;;ur Herstellung von AIDS-Virus-Proteinen, gekennzeichnet dadurch, daß man ein AIDS-Virus-Protein-Gen oder einen Teil davon in die DNA eines Insekten-Virus inseriert, Insekten-Zellen oder Insekten mit dem erha.'.tenen rekombinanten Virus infiziert, und die erhaltenen infizierten Insekten-Zellen oder Insekten zur Expression oder Bildung des AlOS-Virus-Proteins züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Insekten-Virus ein Baculovirus ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Baculovirus das Autographa Californica Kern-Polyhedrosis-Virus ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-G^n in einen rekombinanten Baculovirus-Expressions-Voktor inseriert wird.

5. Verfahren nac . Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß

der Baculovirus-Exf.' essions-Vektor nehr als ein AIDS-Virus-P]otein-Gen oder Teile davon enthält .

ng

6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Gen oder der Teil davon unter der Kontrolle eines Baculovirus-Promotors exprimiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß „p. der Baculovirus-Promotor der Promotor des Polyhedrin-Gens ist.

8 . Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch daß man den rckombinanten Baculovirus-Expressionö-Vektor, der in der Lage ist, ein AIDS-Virus-Gen oder einen Teil davon in einer Insekten-Zelle als Wirt zu exprimieren, erhält durch:

(a) Herstellung eines rekciiünanten Insertions-Vektors durch Insertion eines Baculovirus-GeNoin-Teils in ein Clon.lerungs-Vehikel und anschließende Insertion eines AIDS-Virus-Gens oder eines Teils davon in den modifizierten Insertions-Vektor derart, daß das AIDS-Virus-Gen oder der Teil davon unter der Kontrolle eines Baculovirus-Promotors exprimiert wird , und

(b) Übertragung des so modifizierten AIDS-Virus-Gens oder des Teils davon in einen Baculovirus-Expressions-Vektor durch Vermischen des modifzierten Insertions-Vektors mit Baculovirus-DNA, Transfektion geeigneter Insekten-Zellen, und Isolierung rekombinanter Viren, die das AIDS-Virus-Gen oder den Teil davon enthalten.

9. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Insektenzelle aus der Insektenart Spodoptera frugiperda stammt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env-Cen oder ein Teil davon ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dpjurch, daß

das AIDS-Virus-Protein-Gen das env gp160-Gen ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß OQ das AIDS-Virus-Protein-Gen das env gp120-Gen ist.

13. Verfahren na^h Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das env gp41-Gen ist.

„p.

14. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen oder der Teil davon vom env-Gen

abgeleitet ist und in den Insertions-Vektoren A, B, C, D, E, F, G₁ H, I₁ J, K, L₁ A-1 oder B-1 enthalten ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen oder der Teil davon für ein immunogenes Fragment des AIDS-Virus-env-Proteins codiert.

16. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das q_ag_-Gen oder ein Teil davon ^ist·

17. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das AIDS-Virus-Protein-Gen das pol-Gen oder ein Teil davon ist.

18. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß

man die .exprimierten AIDS-Virus-Proteine reinigt, indem man eine Lentil-Lectin-Affinitätschromatographie zur Isolierung von Glykoproteinen und soiann eine Größenauftrennung der on Glykoproteine durch Molekularsieb-Chromatographie durchführt.

Hierzu 7 Selten Zeichnungen