UA130511C2

UA130511C2 - Вакцина проти свинячого парвовірусу й вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому та спосіб її одержання

Info

Publication number: UA130511C2
Application number: UAA201905640A
Authority: UA
Inventors: Сонья Клокке; Роберт Томас Кул; Кертіс Роберт Едвардс; Кертис Роберт Эдвардс; Фуад Тауфік Хаддадін; Фуад Тауфик Хаддадин; Грегорі Брайан Хайвік; Грегори Брайан Хайвик; Трой Джеймс Кайзер; Джеремі Кролл; Джереми Кролл; Соня Регіна Кантісано Мальбург; Соня Регина Кантисано Мальбург; Серрат Марта Ногера; Меррілл Лінн Шеффер; Меррилл Линн Шеффер; Андреа Дж Хедрік Старкс; Андреа Дж Хедрик Старкс; Майкл Лендон Стюарт; Ерік Мартін Вон
Original assignee: Бьорінгер Інгельхайм Ветмедіка Гмбх; Берингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх
Priority date: 2016-11-03
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2026-03-11
Also published as: JP2020500843A; AU2017353380A1; MX2019005136A; JP2022000031A; MY191895A; CN109922825A; EP3534939A1; JP6941171B2; PL3534939T3; ES2942749T3; CA3042584A1; AU2017353380B2; MX380632B; US11730806B2; KR102664662B1; HUE061972T2; WO2018083156A1; EA201991041A1; EP3534939B1; DK3534939T5

Abstract

Даний винахід стосується вакцини проти свинячого парвовірусу й вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому для захисту суб'єкта, переважно свині, від захворювань, зв'язаних зі свинячим парвовірусом та/або вірусом свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому. Даний винахід також стосується способів одержання імуногенних композицій, а також таких імуногенних композицій, що проявляють знижену віруцидну активність.

Description

Ця заявка містить список послідовностей відповідно до Зведення федеральних правил 37

С.БЕ.А. 1.821 - 1.825. Таким чином, список послідовностей, доданий до цієї заявки, включений шляхом посилання в його повному обсязі.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

А. Галузь техніки, до якої належить винахід

У першому аспекті даний винахід стосується вакцини проти свинячого парвовірусу й вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому, специфічної до ізолятів, які здатні знижувати клінічні ознаки захворювання, викликаного свинячим парвовірусом та/або вірусом свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому. У другому аспекті даний винахід також стосується способів одержання імуногенних композицій, а також таких імуногенних композицій, що проявляють знижену віруцидну активність.

В. Опис рівня техніки

Вірус свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РЕКЗМ) є представником родини вірусів Апегімігідае і належить, разом з Согопамігідає, до ряду вірусів Мідомігалез. РККЗМ являє собою оболонковий вірус із геномом одноланцюгової, позитивно-полярної РНК із приблизно 15 тисяч пар нуклеотидів, що включає дев'ять відкритих рамок зчитування (ОКЕ), а саме, ОКРТа,

ОКЕтТар, ОКЕ2а, ОКЕ 2аб і ОКЕ 3-ОКЕ7. ОКЕ 1а і 1аб кодують більші поліпротеїни, перетворювані у вірусні неструктурні білки (п5р) шляхом ауто- і транс-розщеплення вірусних протеаз пер, п5р2 і п5ра (бпіддег апа Мешепрегд, 1998). ОКЕ4 кодує другорядний глікопротеїн (СР4), який після головного глікопротеїну (СР) і двох інших другорядних глікопротеїнів (сРага і ОРЗ) знаходиться у вірусній оболонці, причому всі вищезгадані глікопротеїни важливі для утворення інфекційного вірусу.

РАВ5БМ вважається одним з найбільш значних з економічної точки зору інфекційних агентів у свиней, викликаючи довгочасну репродуктивну недостатність у свиноматок і респіраторні захворювання в зростаючих свиней. Часто інфекція РКК5М ускладнюється вторинними бактеріальними інфекціями, обумовленими імуносупресивним характером вірусу. Крім того, віремія

РЕКЗМ триває тижнями, і вірус потім продовжує виявлятися в лімфоїдних органах протягом декількох місяців, що свідчить про труднощі або неможливість виведення вірусу через імунну відповідь організму-хазяїна (АЇПепае еї а!., 2000).

Існує два окремі вірусні генотипи РКК5М, що викликають подібні клінічні симптоми, які відрізняються приблизно на 40 95 на рівні нуклеотидної послідовності: генотип І (ЕМ) і генотип ЇЇ (05). Північноамериканським (05) прототипом штаму є МК-2332, а європейським (Е)О) прототипом штаму є вірус ГІ еїузіай.

Свинячий парвовірус являє собою вірус, що реплікується автономно, родини Рагуомігіпає роду

Ргоїюорагуомігиз у межах родини Раїуомійідає, що містить молекулу одноланцюгової ДНК із приблизно 5100 нуклеотидів (Соїтоге еї аї!., 2014: Агсй Мігої!.: 159(5): 1239-1247; Моїйог еї а!., 1984:

Мігоіоду: 137(2): 241-5). Тільки мінус-ланцюг ДНК упакований у віріони. Геном вірусу кодує три капсидні білки (МР1, МР2, МРЗ) і один неструктурний білок (М51). Капсид парвовірусу має діаметр приблизно 22-25 нанометрів складається із субодиниць УР і МР2. Ці білки походять від почергово сплайсованих варіантів однієї й тієї ж молекули РНК ії, таким чином, частково перекриваються в послідовності. Крім того, свинячий парвовірус демонструє високий рівень подібності послідовностей з вірусом панлейкопенії кішок, парвовірусів собак і парвовірусів гризунів (Кап: еї а!., 1989: У). деп. Міго!: 70: 2541-2553).

Хоча існують відмінності в штамах свинячого парвовірусу, деякі є надзвичайно патогенними, інші - менш патогенними або зовсім непатогенними, коли вірус встановлюється або стає ендемічним у даній країні, виявляється, що патогенні штами поширюються серед популяції.

Інфекція свинячого парвовірусу (РРУМ) є поширеною причиною репродуктивної недостатності при розведенні свиней в усьому світі. Серологічні дослідження демонструють, що свинячий парвовірус поширений у всіх свинарських регіонах світу, причому до 80 95 тварин демонструють сероконверсію.

Свинячий парвовірус (РРУ) викликає репродуктивну недостатність у свиней, що приводить до смерті й внутрішньоутробної муміфікації й мертвонародження та інших проявів репродуктивної недостатності у вагітних свиноматок. (оо 5 Уопп5зоп. 1976. Меїегіпагу ВиПейп 46, 653-660;

Мепадеїїпа. 1978. 9. Ат. Меї. Мей. Авзос. 172, 1291-1294).

РРМ викликає репродуктивну недостатність, коли сприйнятливі (неімунні) свині й свиноматки інфікуються під час вагітності. Це єдиний час, коли вірус викликає захворювання. Інфікування свиней відбувається внаслідок споживання вірусу з їжею або його вдихання. Потім РРМ циркулює в системі кровообігу, а у вагітних свиней проникає крізь плаценту й інфікує плоди й ембріони, що розвиваються. Після природного інфікування розвивається активний імунітет, який може тривати протягом усього життя свині. При набутті активного імунітету до вагітності поросята, що розвиваються, не піддаються небезпеці. При народженні поросята набувають материнського імунітету у молозиві свиноматки, і цей материнський імунітет зберігається до 20-тижневого віку.

Чим вище рівень активного імунітету у свиноматки, тим більше материнського імунітету переходить до її поросят. Згодом може відбуватися природня інфекція РРУ.

Захворювання, яке викликається РРМ у свиней, часто називається 5МЕОІ (абревіатура для мертвонародження, муміфікації, смерті ембріона й безплідності). Якщо інфікування відбувається на 0-30 дні вагітності, це може привести до ембріональної смертності, у результаті чого зменшується розмір приплоду. Найбільш явною особливістю, що виникає внаслідок інфекції на 30-70 дні вагітності, є народження муміфікованих поросят. Муміфікація являє собою процес стерильного розщеплення тканин поросят, що гинуть у матці після початку отвердіння скелету. Інфікування РРУ також пов'язане з мертвонародженням і народженням слабких поросят, якщо інфікування відбувається на пізніх стадіях вагітності. Викидень також може бути результатом інфікування РРМУ, однак він не є поширеною клінічною ознакою цього захворювання. У цілому інфекція РРМ знижує кількість поросят, народжуваних однією свиноматкою за рік.

Наявні в цей час вакцини проти РРМ роблять шляхом вирощування нативного вірусу на первинних клітинах свинячого походження або в стійких клітинних лініях. Після цього інфекційний вірус виділяють і інактивують хімічними агентами для одержання в підсумку цільноклітинної вбитої противірусної вакцини. Однак такі процеси вирощування нативного інфекційного вірусу проблематичні з погляду біозахисту й безпеки.

Субодиничні вакцини на основі рекомбінантних білків можуть мати слабку імуногенність через неправильне складання білка-мішені або неналежну презентацію перед імунною системою. Крім того, цільноклітинні вбиті вакцини представляють усі антигени нативного вірусу, тоді як у субодиничній вакцині існує обмеження конкретною амінокислотною послідовністю.

Рекомбінантні вакцини проти РРМ уже описувалися в джерелах існуючого рівня техніки, однак дотепер лише цільноклітинні вбиті вакцини випускаються серійно. Таким чином, схоже, що дотепер не були розроблені оптимальні рекомбінантні субодиничні вакцини проти РРУ, які виявили б свою ефективність і безпеку. Описані на даний момент рекомбінантні субодиничні вакцини проти РРМ не випробовувалися й не контролювалися в експериментах з лабораторним зараженням.

Рекомбінантні субодиничні вакцини проти РРМ, що пройшли оцінку, не діяли так само, як цільноклітинні вакцини проти РРМУ, або рекомбінантні субодиничні вакцини проти РРМ не були безпечними (демонстрували несприятливі реакції).

Були ідентифіковані польові ізоляти РРМ, які генетично й антигенно відрізняються від вакцинних штамів. Вірус РРМ генотипу 2, РРУ-27а, є високовірулентним у вагітних свиней після провокаційного інфікування, що було продемонстровано через високу смертність серед плодів свиноматок, інфікованих РРМУ-27а (85 95), у порівнянні зі свиноматками, інфікованими іншими штамами РРУ, наприклад, РРУ-МАЮОІ -2. Однак наявні вакцини, що тепер серійно випускаються проти РРМ одержують на основі інактивованих цільновірусних препаратів штамів РРМУ генотипу 1, виділених близько 30 років тому ()о2міК еї а! 2009; дошигпаї! ої Сепегаї МігоІоду; 90; 2437-2441).

Іншими джерелами існуючого рівня техніки є наступні:

Аагпаап Б.С. Апіопіз. "А поме! гесотбіпапі мігив-їКе рапісіє массіпе ог ргемепійоп ої рогсіпе рагуомігив5-іпдисей гергодисіїме Тайшиге" Массіпе 24 (2006) 5481-5490.

Спеп М. (бо МУ. "А поме! гесотбріпапі рзейдогабіез мігиз ехргез5віпуд рагуомігиз МР2 депе:

Іттиподепісіїу апа ргоїесіїме ейісасу іп зуліпе" Мігоїоду Щдоигпаї 2011, 8:307.

Мегепда еї аЇ. "агде 5саіе ргодисіоп апа аомпзігеат ргосевзіпд ої а гесотбіпапі рогсіпе рагуоміги5 массіпе" Аррі Містобріо! Віотесппої. 2002 дип; 59(1): 45-50. Ериб 2002 Арі 16.

А. Чог2міК, У. Мапіештеї!, Н.-9У. Зе!Ірії2 і О. Тпиуеп. Массіпайоп адаїп5і рогсіпе рагуоміги5 ргоїесів адаіїпвї аізеазе, Биї доеб5 пої ргемепі іпіесіоп апа міги5 5педаіпуд апйег спаПепде іптесіоп мйй а

Пейегоіодоиз мігив 5ігаіп. Уоштпаї ої Сепега! Мігоіоду (2009), 90, 2437-2441.

У китайській патентній заявці СМ 102 488 895 А розкривається потрійна вакцина на основі вірусоподібних частинок, що складається із свинячого цирковірусу, свинячого парвовірусу й

РАКЗУ. Ця потрійна МІ Р-вакцина містить головний структурний білок РСМУ-2 білок САР, білковий епітоп РРМ МР2 і білковий епітоп РКК5М ОР.

У російській патентній заявці КО 2004108484 А розкривається інактивована вакцина проти

РЕКЗМ і РРМУ. Ця інактивована вакцина містить антигенний матеріал зі штаму вірусу РЕК5, репродукований у клітинній культурі, що перевивається, Магс-145 і інактивований аміноетилетилениміном (АЕЕЇ), і антигенний матеріал зі штаму РРМУ, репродукований у клітинній культурі, що перевивається, УРК і інактивований АЕБЇ.

У китайській патентній заявці СМ 104 288 760 А розкривається вакцинна композиція, що включає імунну кількість антигену свинячого цирковірусу 2 типу, імунна кількість антигену РКК5ЗМ і антигену РРУ.

У китайській патентній заявці СМ 102 727 881 А розкривається високопатогенний штам РКК5

УХАЇ-К і бігемінальна жива вакцина проти РРУ.

Публікація Риїд еї аї. (пер:/Л/піо.пірга-сот/рОоС5/ЛОМІЗТКАІМ/РОВІ ІСАТІОМ5/ЕЗРНМ-2015/1-

СіїпісаІ-ргоїесііоп.ра?ї) стосується вакцинації зі змішаним введення інактивованоївакцини ЕКУЗЕМО

Рагмо і інактивованоївакцини ОМІЗТКАЇМ РКК5 виробництва Нірга.

У публікації еем/ ЕЛ еї аі. (оигпа!Ї ої Сепега! Мігосду 2007, 88(2): 420-427) описується дослідження вірулентності й здатність до перехресної нейтралізації недавніх польових ізолятів парвовірусу й вірусів вакцини в експериментально інфікованих вагітних свинок.

Патентна заявка США 5 2014/0322267 А1 стосується білка ОКЕ2 РСМ2 підтипу А (РСМ2А) для застосування в перехресному захисті.

Патентна заявка ЕР 2 460 818 А? стосується імуногенних композицій РСМ2 і способів одержання таких композицій.

Патент США 5 7,700,285 В1 стосується імуногенних композицій РСМ2 і способів одержання таких композицій.

Патентна заявка РСТ УМО 2013/024113 стосується вакцин від грипу Н5.

Патентна заявка США 05 2015/0283229 А1 стосується вакцини проти вірусу епізоотичної діареї свиней.

Недоліки існуючого рівня техніки, наприклад, полягають у тому, що (І) компонент РРМ у традиційній убитій вакцині не є повністю інактивованим (який потім може ввести живий РРМ у череду); (ІЇ) відсутня перехресний захист від гетерологічних штамів РРУ; відсутня схема вакцинації, яка захищає свиней і свиноматок спарювального віку й плоди від пов'язаних з РРМ і РКЕК5М захворювань репродуктивної системи.

Існує потреба в новій комбінації та/або асоційованих вакцинах проти РКК5М і РРУ, які могли б успішно застосовуватися проти інфекцій РКК5М та/або РРУ. Також існує потреба в нових способах зниження віруцидної активності композицій, які звичайно демонструють певний ступінь віруцидної активності; а також в імуногенних композиціях зі зниженою або відсутньою віруцидною активністю.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Розв'язок вищезгаданої(их) технічноїїих) проблеми (проблем) досягається завдяки представленому опису й варіантам здійснення, охарактеризованим у формулі винаходу пунктах, і що розкриваються авторами.

Таким чином, винахід у його різних аспектах втілюється відповідно до формули винаходу і пунктів, що розкриваються авторами.

Перший розгляд даного винаходу

У першому розгляді даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, яка включає а) принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРУ), причому принаймні один антиген РРУ є будь-яким антигеном, що міститься в РРМУ, і б) принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РАК), причому принаймні один антиген вірусу РКК5 є будь-яким антигеном, що міститься у вірусі

РАВ5.

Даний винахід також стосується комплекту, що включає імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію, як описується та/або заявляється авторами.

Даний винахід також стосується застосування імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як описується та/або заявляється авторами, або комплекту, як описується та/або заявляється авторами, для приготування медикаменту, переважно вакцини.

Перевага полягає в тому, що експериментальні дані, забезпечувані даним винаходом, виявляють, що компонент субодиничної вакцини проти РРМ МР2 відповідно до даного винаходу є безпечним і ефективним для профілактики віремії й інфікування плода РРМ. Крім того, експериментальні дані, забезпечувані даним винаходом, виявляють, що компонент субодиничної вакцини проти РРМ МР2 відповідно до даного винаходу має широкий спектр захисту, оскільки вакцина захищає від гетерологічних північноамериканських, а також гетерологічних європейських штамів для провокаційного зараження.

Перевага полягає в тому, що експериментальні дані, забезпечувані даним винаходом, виявляють, що компонент субодиничної вакцини проти РРМ МР2 відповідно до даного винаходу є настільки ж ефективним, як і цільний убитий вірус. Широкомасштабних процесів інактивації (які необхідні для інактивації нативних РРМ при одержанні вакцин на основі цільних убитих вірусів) можна уникнути шляхом застосування рекомбінантної субодиничної вакцини, що складається з

РРМ МР.

Іншими перевагами, що лежать в основі винаходу, є, наприклад, (І) зниження кількості ін'єкцій вакцини, яка вводиться тваринам, що поліпшує поводження із тваринами, зменшуючи стрес для тварин; (ІЇ) зменшення кількості зайнятих; (ІІІ) така ж ефективність, як при однократному введенні; (ІМ) синхронізація дії вакцини, оскільки обидва компоненти спрямовані проти захворювання репродуктивної системи у вагітних свиней; (М) профілактика віремії РРМ у вакцинованих свинок після провокації гетерологічним штамом РРМ; (МІ) зниження кількості мертвонарождених і муміфікованих поросят у вакцинованих групах після провокації РРУ; (МІЇ) збільшення загальної кількості плодів у вакцинованих проти РРМ свиноматок; (МІ!) 100 96 вакцинованих проти РРМ поросят захищені після провокації РРУ; (ІХ) тривалість імунітету (001): 6 місяців; (Х) і КергоСус?

РЕВ5 БЦ, і змішаний РергоСус? РЕК5 ЕШО-РРМУ МР2 були ефективні, з урахуванням зниження вірусного навантаження й пропорції заражених вірусом після провокації; (Хі) була продемонстрована відсутність перешкоджання ефективності вакцинації проти РКК5БУ; (ХІЇ) початок імунітету протягом чотирьох тижнів може бути встановлено для КергоСус? РАН БИ; (ХІІ) комбінована вакцина (РРМ МР2 10 мкг ї- Егу) з Іпдемас? РЕБ5 МІМ продемонструвала ефективність у запобіганні віремії й інфікування плодів РРМ на 40-й день вагітності (40 ас).

Другий розгляд даного винаходу

У другому розгляді даний винахід стосується способу одержання імуногенної композиції, що включає рекомбінантний білок, причому спосіб включає етапи в наступному порядку: (І) забезпечення / одержання суміші, що включає першу рідину, рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, і вектор, що включає нуклеїновокислотну послідовність, що кодує вищезгаданий рекомбінантний білок; (І) додавання другої рідини до суміші з етапу (І), причому друга рідина відрізняється від першої рідини; (ІП) промивання й, необов'язково, остаточне концентрування рекомбінантного білка та/або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків у суміші шляхом додаткового додавання другої рідини до суміші, отриманої в результаті виконання етапу (ІЇ), і видалення частини першої та/або другої рідини з такої комбінованої суміші; (ІМ) інактивацію вектора шляхом додавання інактивуючого агента до суміші, отриманої в результаті виконання етапу (ПІ); (М) нейтралізацію інактивуючого агента шляхом додавання нейтралізуючого агента до суміші, отриманої в результаті виконання етапу (ІМ).

Даний винахід також стосується способу, як описується та/або заявляється авторами, причому суміш із вищезгаданого етапу (І) одержують із застосуванням процедури, що включає етапи (а) інфікування сприйнятливих клітин у культурі вектором, що включає нуклеїновокислотну послідовність, що кодує вищезгаданий рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, причому вищезгаданий рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, експресуються вищезгаданим вектором, (б) наступного відновлення рекомбінантного білка та/або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, із клітинної культури, причому клітинний дебрис переважно відокремлюють від рекомбінантного білка та/або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків через етап відділення, що переважно включає мікрофільтрацію через принаймні один фільтр, більш переважно два фільтри, причому принаймні один фільтр переважно має розмір пор, більший, ніж рекомбінантний білок та/(або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, зокрема, має розмір пор від приблизно 0,1 мкм до приблизно 4 мкм.

Відносно препаратів антигену РРМУ, при виконанні інактивації бакуловірусу при 37 "С після освітлення й до діафільтрації спостерігався високий ступінь осадження (агрегації). Уважається, що ця агрегація, хоча вона й не пов'язана з антигеном РРМУ, перешкоджає кінетиці інактивації й віруцидному випробуванню. Попередні дані вказують, що процес діафільтрації після освітлення культури й до інактивації бакуловірусу значно знижує ступінь агрегації в зібраних вірусоподібних частинках (МІ Р) РРМ під час процесу інактивації. Дані показують, що ступінь агрегації підсилюється при підвищеній температурі (37 "С) і мінімізується при більш низьких температурах (27 "С або 4 "С) згодом: процес діафільтрації до інактивації бакуловірусу при 37 "С додатково усуває віруцидну активність реакції інактивантів нейтралізуючого агента тіосульфату натрію й середовища Ехсеї 420. Затверджений процес підтверджує, що інактивований бакуловірус, що експресує продукт РРМ

МІ Р, стабільно є невіруцидним для вакцини РКК5М. Така вакцина проти РРМ МІР, зокрема, має довгострокову стійкість після змішування з РКЕК5У, судячи з відсутності віруцидного ефекту, що дозволяє змішувати його з компонентами РРМ і РЕКЗМ незадовго до введення та/або приводити його в комерційну, готову для введення форму (наприклад, комбіновану вакцину або комплект).

КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР

Представлені далі фігури становлять частину даного опису й включені для додаткової демонстрації певних аспектів даного винаходу. Винахід може бути краще пояснений з посиланням на одну або декілька цих фігур у комбінації з докладним описом представлених авторами конкретних варіантів здійснення.

Фіг. 1 показує віремію РКК5М (КПЛР, Іод10 СЕ/мл) по групах і дням.

Фіг. 2 показує площу під кривою (АОС) віремії РКК5М (КкПЛР, Іод10 СЕ/мл) по групах.

Фіг. З показує середнє геометричне титрів РРУ НІ по групах і дням.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Перед описом аспектів даного винаходу слід відзначити, що застосовувані в описі й доданій формулі винаходу форми однини також охоплюють посилання на множину, якщо контекст прямо не вказує на інше. Таким чином, наприклад, посилання на "антиген" включає багато антигенів; посилання на "вірус" є посиланням на один або декілька вірусів і їх еквівалентів, відомих фахівцям у даній галузі, і так далі. Якщо немає іншого визначення, усі застосовувані авторами технічні й наукові терміни мають значення в загальноприйнятому розумінні серед фахівців в галузі, до якої належить даний винахід. Хоча при практичному втіленні або випробуванні даного винаходу можуть застосовуватися будь-які способи й матеріали, подібні до описуваних авторами або еквівалентні до них, тут описуються переважні способи, обладнання й матеріали. Усі згадані авторами публікації включаються в даний опис шляхом посилання з метою опису й розкриття клітинних ліній, векторів і методологій, про яких повідомляється в публікаціях, які можуть використовуватися у зв'язку з винаходом. Жодне з положень даного опису не слід тлумачити як визнання того, що винахід не має права на протиставлення такого розкриття в силу наявності більш раннього винаходу.

Перший розгляд відповідно до даного винаходу

В одному аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, яка включає (а) принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРУ), причому принаймні один антиген РРУ є будь-яким антигеном, що міститься в РРМУ, і (б) принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК), причому принаймні один антиген вірусу РКК5 є будь-яким антигеном, що міститься у вірусі

РАВ5.

Термін "свинячий парвовірус" або "ТРУ" добре відомий серед фахівців у даній галузі. Однак "свинячий парвовірус" являє собою автономний вірус, що реплікується, роду парвовірус у межах родини Рагуомігідає, що містить молекулу одноланцюгової ДНК. Геном вірусу кодує три капсидні білки (МР1, МР2, МР) і один неструктурний білок (М51). Захворювання, яке викликається РРМ у свиней, часто називається ЗМЕОІ (абревіатура для мертвонародження, муміфікації, смерті ембріона й безплідності). Термін "Свинячий парвовірус" у рамках даного винаходу охоплює всі штами, генотипи й серотипи свинячого парвовірусу, а також родини Рагуомігіпає роду

Ргоюрагуомігиз у межах родини Рагуомігідаеє.

Терміни "вірус свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому" або "РКК5 вірус" або "РКК5М" добре відомий серед фахівців у даній галузі. "Вірус свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому" є представником родини вірусів Апегімігідае, належить разом з

Согопамігідає до ряду вірусів Мідоміга(ез, і є оболонковим вірусом з геномом одноланцюгової, позитивно-полярної РНК із приблизно 15 тисяч пар нуклеотидів, який містить дев'ять відкритих рамок зчитування (ОКЕ), а саме, ОКЕТа, ОКЕТар, ОКЕ2а, ОКЕ 2аб і ОКЕ 3-ОКЕ7. ОКЕ Та і таб кодують більші поліпротеїни, перетворювані у вірусні неструктурні білки (п5р) шляхом ауто- і транс- розщеплення вірусних протеаз пері, п5р2 і пзр4і (Зпіїдег и Мешепрегуд, 1998). ОКЕ4 кодує другорядний глікопротеїн (ОР), який після головного глікопротеїну (СРБ) і двох інших другорядних глікопротеїнів (сРга і СРЗ) знаходиться у вірусній оболонці, причому всі вищезгадані глікопротеїни важливі для утворення інфекційного вірусу. Існує два окремі вірусні генотипи РКК5БМ клінічні симптоми, що викликають подібні, які розходяться приблизно на 40 95 на рівні нуклеотидної послідовності: генотип І (Е)) і генотип ІІ (05). Північноамериканським (5) прототипом штаму є МЕ- 2332, а європейським (ЕО) прототипом штаму є вірус Іеїузіад. Термін "вірус свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому" у рамках даного винаходу охоплює всі штами, генотипи й серотипи РККЗМУ.

У зв'язку з РКК5М слід розуміти, що терміни "генотип І" ї "генотип ІІ" еквівалентні термінам "генотип 1" і "генотип 2" або термінам "тип 1" і "тип 2", які часто вживаються в літературі в контексті

РАВ5БУ.

Терміни "принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРМ)" ї " принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК5)" у рамках даного винаходу охоплюють кожний антиген, від окремих антигенів РРМ та/або РККЗМ до цілих вірусів, що включають багато антигенів.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як описується й заявляється авторами, причому РРМ вибирають із групи, до якої належать: живий атенуйований / модифікований живий вірус РРУ, убитий / інактивований вірус

РРУ, убитий / інактивований штам РРМУ 014, німецькі польові ізоляти свинячого парвовірусу РРМУ- 27а і РРУ-143За і віруси вакцини РРМ-МА0І-2 і РРМУ-ІЮОТ (М5М) свинячого парвовірусу РРМУ-ІОТ (М5У).

Терміни "живий атенуйований" і "модифікований живий" відповідно до даного винаходу застосовуються взаємозамінно й особливо стосуються зниженої вірулентності РРМ та/або РЕК5М, зокрема, вірусу РРМ та/або РКК5 дикого типу, якої досягають шляхом традиційного множинного пасивування клітинних ліній РРМ та/"або РКК5МУ та/або досягають за допомогою генної інженерії, причому "вірулентність" слід розуміти як ступінь патогенності, і "патогенність" стосується здатності вірусу до викликання клінічних ознак у хазяїна або потомства хазяїна, наприклад, репродуктивну недостатність.

Терміни "убитий" або "інактивований" у рамках даного винаходу стосуються РРМ та/або РККЗМУ, який не здатний інфікувати відповідний суб'єкт (на відміну від живого вірусу), та/або інфективність якого не вказується в порівнянні з нативним вірусом. Зокрема, убитий / інактивований вірус не може (втрачає здатність) інфікувати нативні клітини-хазяї.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як описується й заявляється авторами, причому принаймні один антиген РРМ являє собою одну або декілька субодиниць РРМ.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінація, як описується й заявляється авторами, причому принаймні одна субодиниця РРУ являє собою вірусний білок 2 РРМ (МР2), причому РРМ МР2 переважно є єдиним антигеном РРУ.

Термін "вірусний білок 2" або "МР2" стосується капсидного білку МР2 свинячого парвовірусу.

Термін "вірусний білок 2" або "МР2" добре відомий серед фахівців у даній галузі.

Термін "білок", "амінокислота" і "поліпептид" застосовуються взаємозамінно. Термін "білок" стосується послідовності амінокислотних залишків, що складається із природних амінокислот, а також їх похідних. Природні амінокислоти загальновідомі серед фахівців у даній галузі й описуються в стандартних підручниках з біохімії У межах амінокислотної послідовності амінокислотні залишки з'єднуються пептидними зв'язками. Крім того, два кінці амінокислотної послідовності вказуються як карбоксильний кінець (С-кінець) і аміно-кінець (М-кінець). Термін "білок" охоплює фактично очищені білки або білкові препарати, що додатково включають інші білки.

Крім того, термін також стосується фрагментів білків. Крім того, він включає хімічно модифіковані білки. Такі модифікації можуть бути штучними модифікаціями або природними модифікаціями, такими, як фосфорилування, глікозилування, міристилування й т.п.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як описується й заявляється авторами, причому РРМ МР2 має 1. в амінокислотній позиції 228 глутаміновокислотний залишок або глутаматний залишок, та/або 2. в амінокислотній позиції 414 сериновий залишок, та/або 3. в амінокислотній позиції 419 глутаміновий залишок, та/або 4. в амінокислотній позиції 436 треоніновий залишок, причому нумерація амінокислотних позицій стосується амінокислотної послідовності дикого типу РРМ МР2.

Термін "причому нумерація амінокислотних позицій стосується амінокислотної послідовності дикого типу РРМ МР2" стосується нумерації амінокислотних позицій, що належать до амінокислотної послідовності білка РРМ МР2 повної довжини дикого типу. Переважно нумерація аміно-позицій згідно з даним описом вказується з посиланням на білкову послідовність РРМ МР2 дикого типу, що має 579 амінокислотних залишків, включаючи метионіновий залишок в (М-кінцевій) амінокислотній позиції 1. Термін "причому нумерація амінокислотних позицій стосується амінокислотної послідовності дикого типу РРМ МР2" охоплює РРМ МР дикого типу, як вказано для прикладу в БЕО ІО МО: 1 (РРМ 27а МР).

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як описується й заявляється авторами, яка відрізняється тим, що РРМ МР2 також має в амінокислотній позиції 25 ізолейциновий залишок, та/або в амінокислотній позиції 36 сериновий залишок, та/або в амінокислотній позиції 37 ізолейциновий залишок, причому нумерація амінокислотних позицій стосується амінокислотної послідовності дикого типу РРМ МР2.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як описується й заявляється авторами, причому нумерація амінокислотних позицій стосується амінокислотної послідовності, показаної в ЗЕО ІЮО МО: 1.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації як описується й заявляється авторами, причому РРМ МР2 являє собою рекомбінантний РРМ МР.

Термін "рекомбінантний" у контексті даного опису стосується, зокрема, молекули білка, яка експресується з молекули рекомбінантної ДНК, такої, як поліпептид, утворений із застосуванням технологій рекомбінантних ДНК. Приклад таких технологій включає випадок, коли ДНК, що кодує експресований білок (наприклад, РРМ УР), вставляють у підходящий вектор експресії, переважно вектор експресії бакуловірусу, який, у свою чергу, використовують для трансфекції або, у випадку вектора експресії бакуловірусу, для інфікування клітини-хазяїна для одержання білка або поліпептиду, що кодується ДНК. Термін "рекомбінантний РРМ МР2" у контексті даного опису, таким чином, зокрема, стосується молекули білка, яка експресується з молекули рекомбінантної ДНК.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як описується й заявляється авторами, у якій РРМ МР2 являє собою експресований рекомбінантним бакуловірусом РРМ МР2.

Термін "бакуловірус" добре відомий серед фахівців у даній галузі. У контексті даного опису "бакуловірус", зокрема, означає систему вироблення досліджуваного білка в клітинах комах із застосуванням рекомбінантного бакуловірусного вектора, призначеного для експресії вищезгаданого білка. Бакуловірусна система експресії в цілому включає всі елементи, необхідні для досягнення експресії рекомбінантного білка в клітинах комах, і, як правило, включає інженерію бакуловірусного вектора для експресії досліджуваного білка, введення підданого інженерії бакуловірусного вектора в клітини комах, культивування клітин комах, що містять підданий інженерії бакуловірусний вектор, у підходящому середовищі для вирощування, таким чином, щоб експресувався досліджуваний білок, і виділення білка. Як правило, інженерія бакуловірусного вектора включає побудову й виділення рекомбінантних бакуловірусів, у яких кодуюча послідовність для вибраного гена вставлена за промотором для другорядного вірусного гена, причому більшість застосовуваних у цей час бакуловірусних систем експресії засновані на послідовності вірусу ядерного поліедрозу совки каліфорнійської люцернової (Астпру) ((Мігоїоду 202 (2), 586-605 (1994),

МОВІ Ассезвзіоп Мо.: МС 001623). Бакуловірусні системи експресії загальновідомі серед фахівців у даній галузі й описувалися, наприклад, у публікаціях "Васціомігиє Ехргеззіоп Месіог:: А І арогайогу

Мапиа!", Оамій ЯК. О'Кейу, Гоїз МіПйег, Мегпе ГисКом/,, вид-во. Охіога Опім. Ргез5 (1994), "ТНе

Васшомігиз Ехргеззіоп Зузіет: А І арогаїгу сціае", І іпда А. Кіпо, К. 0. Роззеє, вид-во. Спартап 5

На (1992). Типовий необмежуючий приклад бакуловірусної системи для одержання рекомбінантного білка описується, наприклад, у документі МО 2006/072065 А2.

Кращі бакуловірусні вектори включають бакуловірус, такий, як ВасшосСоїй (ВО Віозсіепсев5

Рпагтіпдеп, Зап Оієдо, Саїїї.) або ОіатопаВас (Зідта Аїагісі), зокрема, за умови, що продукуючі клітини є клітинами комах. Хоча перевага віддається бакуловірусній системі експресії, фахівцям у даній галузі стане зрозуміло, що з погляду даного винаходу можуть застосовуватися й інші системи експресії, а саме, експресія РРМ МР2 у супернатант клітинної культури. Інші подібні системи експресії можуть вимагати застосування сигнальної послідовності з метою викликання експресії

РРМ МР2 у середовища.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому РРМ МР2 включає або складається з амінокислотної послідовності, яка має принаймні 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІО МО: 1, 5ЕО ІО МО: 2 та/або 5ЕО ІО МО: 5-16.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому РРМ МР2 включає або складається з амінокислотної послідовності, яка має принаймні 90 95, принаймні 91 95, принаймні 92 95, принаймні 93 95, принаймні 94 95, принаймні 95 95, принаймні 96 95, принаймні 97 95, принаймні 98 95, принаймні 99 95, принаймні 99,1 956, принаймні 99,2 95, принаймні 99,3 90, принаймні 99,4 95, принаймні 99,5 95, принаймні 99,6 95, принаймні 99,7 95, принаймні 99,8 95, або принаймні 99,9 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 1, 5ЕО ІЮ

МО: 2 та/або ЗЕО І МО: 5-16.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому РРМ МР2 включає або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІО МО: 1, 5ЕО ІО МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 5 - 16 або включає або складається з будь-якого фрагмента, який має принаймні 210, принаймні 250 або принаймні 300 суміжних амінокислотних залишків з ЗБЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІО МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 5 - 16.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому РРМ МР2 включає або складається з амінокислотної послідовності 5ЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІО МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 5 - 16.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому РРМ МР2 кодується нуклеотидною послідовністю, що кодує амінокислотну послідовність, яка має принаймні 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 2 та/або

ЗЕОІО МО:5- 16.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому РРМ МР2 кодується нуклеотидною послідовністю, що кодує амінокислотну послідовність, яка має принаймні 90 905, принаймні 91 95, принаймні 92 95, принаймні 93 95, принаймні 94 95, принаймні 95 95, принаймні 96 до, принаймні 97 956, принаймні 9895, принаймні 9995, принаймні 99,1 95, принаймні 99,2 90, принаймні 99,3 956, принаймні 99,4 95, принаймні 99,5 95, принаймні 99,6 95, принаймні 99,7 95, принаймні 99,8 95, або принаймні 99,9 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 2 та/або 5ЕО ІО МО: 5 - 16.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому РРМ МР2 кодується нуклеотидною послідовністю, що кодує амінокислотну послідовність 52620 10 МО: 1, ЗЕО ІО МО: 2 або 5ЕО ІЮО МО: 5 - 16. 5ЕО ІЮО МО: 4 являє собою кодон-оптимізовану нуклеотидну послідовність РРМ 27а МР2, яка була піддана подальшій модифікації таким чином, щоб включати два сайти рестрикційних ферментів Сіа! (в амінокислотній позиції 25 знаходиться ізолейциновий залишок, в амінокислотній позиції 36 знаходиться сериновий залишок, в амінокислотній позиції 37 знаходиться ізолейциновий залишок), щоб примикати до кодуючої ділянки МР2, що складається із гліцинових повторів. Сайти

Сіа! включали таким чином, щоб не переривати кодуючу ділянку МР2. 5ЕО ІЮО МО: 2 являє собою білкову послідовність, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 4. 5ЕО ІО МО: З являє собою кодон-оптимізовану нуклеотидну послідовність РРМ 27а МР (без сайтів рестрикційних ферментів Сіа!). ЗЕО І МО: 1 являє собою білкову послідовність, що відповідає ЗЕО ІЮ МО: 3.

Терміни "нуклеїнова кислота" або "нуклеїновокислотна послідовність" або "нуклеотидна послідовність" або "полінуклеотид" застосовуються в даному описі взаємозамінно й стосуються полінуклеотидів, включаючи молекули ДНК, молекули РНК, молекули кКДНК або похідні. Термін охоплює одноланцюгові, а також дволанцюгові полінуклеотиди. Нуклеїнова кислота відповідно до даного винаходу охоплює виділені полінуклеотиди (тобто, виділені із природного середовища) і генетично модифіковані форми. Крім того, також включаються хімічно модифіковані полінуклеотиди, включаючи природні модифіковані полінуклеотиди, такі, як глікозиловані або метиловані полінуклеотиди, або штучні модифіковані, такі, як біотиніловані полінуклеотиди. Крім того, терміни "нуклеїнова кислота" і "полінуклеотид" є взаємозамінними й стосуються будь-якої нуклеїнової кислоти. Терміни "нуклеїнова кислота" і "полінуклеотид" також конкретно включають нуклеїнові кислоти, які складаються із основ, що відрізняються від біологічних основ (аденіну, гуаніну, тиміну, цитозину й урацилу).

Термін "ідентичність" або "ідентичність послідовностей" відомий фахівцям у даній галузі й стосується відношення між двома або більше поліпептидними послідовностями або двома або більше полінуклеотидними послідовностями, тобто, контрольною послідовністю й даною послідовністю, що підлягає порівнянню з контрольною послідовністю. Ідентичність послідовностей визначають шляхом порівняння даної послідовності з контрольною послідовністю після оптимального вирівнювання послідовностей для одержання найвищого ступеня подібності послідовностей, обумовленої шляхом співставлення між ланцюгами таких послідовностей. Після такого вирівнювання ідентичність послідовностей установлюється на основі співставлення відповідних позицій, наприклад, послідовності є "ідентичними" у конкретній позиції, якщо ця позиція, нуклеотиди або амінокислотні залишки ідентичні. Загальну кількість таких ідентичних позицій потім ділять на загальну кількість нуклеотидів або залишків у контрольній послідовності для визначення відсотка ідентичності послідовностей. Ідентичність послідовностей легко обчислюють відомими способами, включаючи, крім інших, описувані в публікаціях Сотршиїайопа

Моїесшіаг Віоіоду, І езкК, А. М., ед., Охота Опімегейу Ргез55, Мем Хоїк (1988), Віосотршиійпд: Іптогптаїісе і Сепоте Ргоіесів, 5тйй, О.МУ., ед., Асадетіс Ргез5, Мем ХогкК (1993); Сотршег Апаїувзіз ої Зедцепсе

Оаїа, Рап І, стійніп, А.М., ії Сгініп, Н. С, ед5., Нитапа Ргезз, Мем дегзеу (1994); бедиепсе Апаїузів іп

Моїіесшіаг ВіоІоду, моп Неїіпде, б., Асадетіс Ргез5 (1987); Зедиепсе Апаїузів Ргітег, Сгіб5Коу, М. і

Оемегеинх, У., еав., М. БіосКіоп Ргез5, Мем/ ХогКк (1991); і Сапо, Н., апа Гіртап, 0., 5ІАМ У. Арріїєй

Маїй., 48: 1073 (1988), ідеї яких включаються в даний опис шляхом посилання. Переважні способи визначення ідентичності послідовностей розроблені для одержання найбільшої відповідності між досліджуваними послідовностями. Способи визначення ідентичності послідовностей кодифіковані в загальнодоступних комп'ютерних програмах послідовностей, що визначають ідентичність, між даними послідовностями. Прикладами таких програм є, крім інших, пакет програм СО (Оеємегеих,

У., егаї., Мисівїс Асіазх Везеагсі, 12(1): 387 (1984)), В А5ТР, ВІ АТМ і ЕАЗТА (АЇвспиї, 5. Р. еї аї., у.

Моїес. Віо!ї., 215: 403-410 (1990). Програма ВІГА5ТХ доступна на ринку від МСВІ ї з інших джерел (ВГА5Т Мапаиаї, Аїї5спиї, 5. еї аІ., МСМІ ММ МІН ВеїНезаа, МО 20894, АЇїв5спиї, 5. Е. еї аї., У. Моїес.

Віо!., 215: 403-410 (1990), ідеї яких включаються в даний опис шляхом посилання). Ці програми оптимально вирівнюють послідовності з використанням штрафів за делецію за замовчуванням з метою одержання найвищого рівня ідентичності послідовностей між даної й контрольної послідовностями. Як ілюстрація, у випадку полінуклеотиду, що має нуклеотидну послідовність, яка має принаймні, наприклад, 85 95, переважно 90 95, ще більш переважно - 95 95 "ідентичності послідовностей" з контрольною нуклеотидною послідовністю, мається на увазі, що нуклеотидна послідовність даного полінуклеотиду є ідентичною до контрольної послідовності, за винятком того, що дана полінуклеотидна послідовність може включати до 15, переважно до 10, ще більш переважно - до 5 точкових мутацій на кожні 100 нуклеотидів контрольної нуклеотидної послідовності. Інакше кажучи, у полінуклеотиді, що має нуклеотидну послідовність, яка має принаймні 85 95, переважно 90 95, ще більш переважно - 95 95 ідентичності з контрольною нуклеотидною послідовністю, до 15 95, переважно до 10 95, ще більш переважно - до 5 905 нуклеотидів у контрольній послідовності можуть бути вилучені або заміщені іншим нуклеотидом, або певна кількість нуклеотидів до 15 95, переважно до 10 95, ще більш переважно - до 5 95 від загальної кількості нуклеотидів у контрольній послідовності, може бути вставлена в контрольну послідовність. Ці мутації контрольної послідовності можуть мати місце в 5'- або 3"-кінцевих позиціях контрольної нуклеотидної послідовності або в будь-якому іншому місці між цими кінцевими позиціями, або окремими вставками серед нуклеотидів у контрольній послідовності, або однією або декількома суміжними групами в межах контрольної послідовності. Аналогічним чином, у випадку поліпептиду, що має дану амінокислотну послідовність, яка має принаймні, наприклад, 85 95, переважно 90 95, ще більш переважно - 95 95 ідентичності послідовностей з контрольною амінокислотною послідовністю, мається на увазі, що дана амінокислотна послідовність поліпептиду є ідентичною до контрольної послідовності, за винятком того, що дана поліпептидна послідовність може включати до 15, переважно до 10, ще більш переважно - до 5 амінокислотних змін на кожні 100 амінокислот контрольної амінокислотної послідовності. Інакше кажучи, для одержання даної поліпептидної послідовності, яка має принаймні 85 95, переважно 90 95, ще більш переважно -- 95 95 ідентичності послідовності з контрольною амінокислотною послідовністю, до 15 95, переважно до 95, ще більш переважно -- до 5 95 амінокислотних залишків у контрольній послідовності можуть бути вилучені або заміщені іншою амінокислотою, або певна кількість амінокислот до 15 905, переважно до 10 95, ще більш переважно -- до 5 95 від загальної кількості амінокислотних залишків у контрольній послідовності, може бути вставлена в контрольну послідовність. Ці зміни контрольної послідовності можуть мати місце в аміно- або карбокси-кінцевих позиціях контрольної амінокислотної послідовності або в будь-якому іншому місці між цими кінцевими позиціями, або окремими вставками серед залишків у контрольній послідовності, або однією або декількома суміжними групами в межах контрольної послідовності. Переважно позиції залишків, які не ідентичні, відрізняються консервативними амінокислотними заміщеннями. Однак консервативні заміщення не включаються як збіги при визначенні ідентичності послідовностей.

Терміни "ідентичність", "їюндентичність послідовностей" і "відсоток ідентичності" застосовуються в даному описі взаємозамінно. З погляду цього винаходу встановлено, що для визначення відсотка ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох нуклеїновокислотних послідовностей послідовності вирівнюють із метою оптимального порівняння (наприклад, у послідовність першої амінокислоти або нуклеїнової кислоти можуть бути включені гепи для оптимального вирівнювання з метою співставлення із другою амінокислотною або нуклеїновокислотною послідовністю). Потім порівнюють амінокислоти або нуклеотидні залишки у відповідних амінокислотних або нуклеотидних позиціях. Коли позиція в першій послідовності зайнята тією ж амінокислотою або нуклеотидним залишком, що й відповідна позиція в другій послідовності, молекули в цій позиції є ідентичними.

Відсоток ідентичності між двома послідовностями залежить від кількості ідентичних позицій, загальних для цих послідовностей (тобто, 95 ідентичності - кількість ідентичних позицій / загальна кількість позицій (тобто позицій, що перекриваються) х 100). Переважно дві послідовності мають однакову довжину.

Порівняння послідовностей здійснюють по всій довжині двох порівнюваних послідовностей або по довжині фрагмента двох послідовностей. Як правило, порівняння здійснюють по всій довжині двох порівнюваних послідовностей. Однак ідентичність послідовностей може визначатися й по ділянці, наприклад, із двадцяти, п'ятдесяти, ста або більше амінокислотних залишків.

Фахівцям у даній галузі відомо, що існує декілька різних комп'ютерних програм для визначення гомології між двома послідовностями. Наприклад, порівняння послідовностей і визначення відсотка ідентичності між двома послідовностями здійснюють із застосуванням математичного алгоритму. У кращому варіанті здійснення відсоток ідентичності між двома амінокислотними або нуклеїновокислотними послідовностями із застосуванням алгоритму Нідлмана-Вунша (9. Мої. Віої. (48): 444-453 (1970)), включеного в програму САР у пакеті програм Ассеігує СО (доступний за адресою пПЕр:/Лимлу.ассеїгув.сот/ргодисів/дсо/), із застосуванням матриці Віозит 62 або матриці

РАМ250О, і штрафу за відкриття гепа 16, 14, 12, 10, 8, 6 або 4 і штрафу за продовження гепа 1, 2, 3, 4, 5 або 6. Фахівцям у даній галузі стане зрозуміло, що всі ці різні параметри дають дещо різні результати, однак загальний відсоток ідентичності двох послідовностей при застосуванні різних алгоритмів значно не міняється.

Білкові послідовності або нуклеїновокислотні послідовності відповідно до даного винаходу також можуть використовуватися як "шукана послідовність" для виконання пошуку в загальнодоступних базах даних, наприклад, для ідентифікації інших представників родини або споріднених послідовностей. Такі пошуки виконують із застосуванням програм ВГАБТМ і ВГА5ТР (версія 2.0) згідно з публікацією АїЇвепПиЇї, еї аЇ. (1990) 9. Мої. ВіоІ. 215: 403-10. Пошук білків В А5Т виконують за допомогою програми ВІА5БТР, вага - 50, довжина слова - 3, для одержання амінокислотних послідовностей, гомологічних до білкових молекул відповідно до винаходу. Для одержання вирівнювання з гепами з метою порівняння застосовують Сарреа ВІ А5Т, як описується в публікації Акеспці еї аї. (1997) Мисієїс Асіаз Кев. 25(17): 3389-3402. При застосуванні програм

ВГА5Т ії Саррей ВГА5Т використовують параметри відповідних програм (наприклад, ВІ А5ТР і

ВІА5ТМ) за замовчуванням. Див. домашню сторінку Національного центру біотехнологічної інформації за адресою пЕр:/Лумли. порі. піт. пій.дом/.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому РККЗ вірус вибирають із групи, до якої належать: вірус РКК5 генотипу 1, вірус РКК5 генотипу 2, вірус РКК5 генотипу 1, що включає геном, який кодується нуклеотидною послідовністю, яка має принаймні 90 95, принаймні 91 95, принаймні 92 95, принаймні 9395, принаймні 94 95, принаймні 9595, принаймні 96 95, принаймні 97 95, принаймні 98 95, принаймні 99 95, принаймні 99,1 95, принаймні 99,2 95, принаймні 99,3 96, принаймні 99,4 956, принаймні 99,5 95, принаймні 99,6 95, принаймні 99,7 95, принаймні 99,8 95, принаймні 99,9 95, або 100 95 ідентичності з нуклеїновокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ

МО: 17 (послідовність І еіуєїаай дикого типу), вірус РККЗ генотипу 2, що включає геном, який кодується нуклеотидною послідовністю, яка має принаймні 90 95, принаймні 91 95, принаймні 92 95, принаймні 93 95, принаймні 94 95, принаймні 95 956, принаймні 96 95, принаймні 97 95, принаймні 98 У5, принаймні 99 95, принаймні 99,1 956, принаймні 99,2 95, принаймні 99,3 95, принаймні 99,4 95, принаймні 99,5 95, принаймні 99,6 95, принаймні 99,7 956, принаймні 99,8 95, принаймні 99,9 95, або 100 95 ідентичності з нуклетїновокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 18 (МК2332 послідовність дикого типу).

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому вірус РКК5 вибирають із групи, до якої належать: живий атенуйований / модифікований живий вірус РКК5, живий атенуйований / модифікований живий вірус РКК5 тип 1 генотип (наприклад, Рогсіїв РЕК5З, Опівігайп РЕК5,

Атегуас РККЗ і т.п.), живий атенуйований / модифікований живий вірус РКК5, генотип типу 2 (наприклад, Іпдемас? РЕЕ5 МІУ, Еовіега РРЕКЗ і т.п.), живий атенуйований / модифікований живий вірус РЕК5, штам 94881 |(генотип 1), КергоСус? РЕБ5 ЕІ, убитий / інактивований вірус РЕБ5, убитий / інактивований вірус РЕК5, генотип типу 1 (наприклад, Ргодгезвіз), убитий / інактивований вірус РКЕК5, генотип типу 2, штам вірусу ГІ еїувіай (СОІ-МІ -2.91, Іп5ЩШиї Разіеиг, Париж, Франція, номер депонування 1-1102), субодиниця(ї) вірусу РКК5, або інші штами, такі, як депоновані під номерами доступу ЕСАСС 04102703, ЕСАСС 04102702, ЕСАСС 04102704, номером доступу СМСМ

І-1140, номером доступу СМСМ 1-1387, номером доступу СМСМ 1І-1388, АТОС МА 2332, МА 2385, УА 2386, МК 2429, МК 2474 і МК 2402; СМСМ 1-1102, СМОМ 1-1140, СМОМ 1-1387, СМОСМ 1-1388, або

ЕСАСС У93070108, північноамериканський вірус РЕК5 рТ7Р129А (номер доступу АТОС 203488), під номером депонування АТСС УК-2332, АТОС УН-2368; АТОС МА-2495; АТОСС УА 2385, АТОС У 2386, АТСС МК 2429, АТСС МК 2474 і АТСС МУК 2402.

Терміни "імуногенна композиція" або "комбінована вакцина" або "комбінація" стосується композиції, яка включає принаймні один антиген, у випадку комбінованої вакцини" або "комбінації" - принаймні два антигени, які забезпечують імунну відповідь у хазяїна, якому вводять "імуногенну композицію" або "комбіновану вакцину" або "комбінацію". Така імунна відповідь може бути клітинним і/ або антитілоопосередкованою імунною відповіддю на "імуногенну композицію" або "комбіновану вакцину" або "комбінацію" відповідно до винаходу. Переважно "імуногенна композиція" або "комбінована вакцина" або "комбінація" викликає імунну відповідь, більш переважно - забезпечує захисний імунітет від однієї або декількох клінічних ознак інфекції РРМ та/або РЕК5М. Хазяїн також описується як "суб'єкт". Переважно будь-який з описуваних або згадуваних хазяїв або суб'єктів є свинею.

Як правило, "імунна відповідь" включає, крім іншого, один або декілька з наступних ефектів: вироблення або активації антитіл, В-клітин, хелперних Т-клітин, супресорних Т-клітин та/або цитотоксичних Т-клітин та/або гамма-дельта-Т-клітин, специфічно спрямованих на антиген або антигени, включені в "імуногенну композицію" або "комбіновану вакцину" або "комбінацію" відповідно до винаходу. Переважно хазяїн повинен демонструвати захисну імунну відповідь або терапевтичну відповідь. "Захисна імунна відповідь" або "захисний імунітет" демонструється через зниження або відсутність клінічних ознак, які звичайно виявляються в інфікованих хазяїв, більш швидке видужання та/або зниження тривалості інфективності або зниження титру патогену в тканинах або рідинах організму або екскрементах інфікованого хазяїна.

У випадку, якщо хазяїн демонструє захисну імунну відповідь, таку, як підвищена опірність до нової інфекції талабо зниження клінічної тяжкості захворювання, "імуногенна композиція" або "комбінація" описується як "вакцина".

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію рецептують для введення разовою дозою.

Об'єм разової дози введення визначається в інших розділах даного опису.

Імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію, як розкривається й заявляється авторами, переважно вводять місцево або системно. Підходящими традиційно застосовуваними шляхами введення є пероральне або парентеральне введення, таке, як інтраназальне, внутрішньовенне, внутрішньом'язове, внутрішньоочеревинне, підшкірне, а також інгаляція. Однак, залежно від характеру й способу дії сполуки, імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація, як розкривається й заявляється авторами, також може вводитися іншими шляхами. Найбільш переважно імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію, як розкривається й заявляється авторами, вводять внутрішньом'язово.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію вводять внутрішньом'язово.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація є безпечною для свинок та/або свиноматок під час вагітності й лактації.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація є безпечною для свинок та/або свиноматок після 30 днів вагітності, переважно після 40 днів вагітності.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація також включає принаймні один фармацевтично прийнятний носій.

Термін "фармацевтично прийнятний носій" включає будь-які й усі розчинники, диспергатори, покриття, стабілізатори, розріджувачі, консерванти, протимікробні й протигрибкові засоби, ізотонічні агенти, агенти, що сповільнюють адсорбцію, ад'юванти, імуностимулятори і їх комбінації. "Розріджувачі" можуть включати воду, сольовий розчин, декстрозу, етанол, гліцерин, фосфатно-буферний сольовий розчин і т.п. Ізотонічні агенти можуть включати, крім інших, хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт і лактозу. Стабілізатори включають, крім інших, альбумін і солі лужних металів з етилендіамінтетраоцтовою кислотою.

В одному аспекті даного винаходу фармацевтично прийнятним носієм є карбомер.

Переважно імуногенна композиція також може включати один або декілька інших імуномодуляторів, таких, як, наприклад, інтерлейкіни, інтерферони або інші цитокіни. Кількість і концентрація ад'ювантів і добавок, використовуваних у контексті даного винаходу, можуть бути легко визначені фахівцем у даній галузі.

У деяких аспектах імуногенна композиція відповідно до даного винаходу містить ад'ювант. "Ад'юванти" у контексті даного опису можуть включати гідроксид алюмінію й фосфат алюмінію, сапоніни наприклад, Оці А, 05-21 (Сатбгідде Віоїесп Іпс., Сатбідде МА), СРІ-0100 (Саепіса

Рпаптасеціісса!5, Іпс., Віптіпдайат, АГ), емульсію типу вода в маслі, емульсію типу масло у воді, емульсію типу вода в маслі у воді. Емульсія, зокрема, може бути на основі легкого рідкого вазелінового масла (згідно з вимогами Європейської фармакопеї); ізопреноїдного масла, такого, як сквалан або сквален; масла, одержуваного в результаті олігомеризації алкенів, зокрема, ізобутену або децену; складних ефірів кислот або спиртів, які містять лінійну алкільну групу, більш конкретно - рослинних олій, етилолеату, пропіленглікольди-(каприлату/капрату), гліцерилтри- (каприлату/капрату) або пропіленглікольдіолеату; складні ефіри розгалужених жирних кислот або спиртів, зокрема, складні ефіри ізостеаринової кислоти. Масло застосовують у комбінації з емульгаторами для утворення емульсії. Емульгаторами переважно є неіонні поверхово-активні речовини, зокрема, складні ефіри сорбіту, маніду (наприклад, ангідроманітолеат), гліколю, полігліцерину, пропіленгліколю Й олеїнової, ізостеаринової, рицинолеїнової або гідроксистеаринової кислоти, які необов'язково є етоксилованими, і блокспівполімери поліоксипропілену-поліоксіетилену, зокрема продукти типу Ріпгопіс, насамперед 1121. Див. Нипіег еї аі., Тне Тнеогу апа Ргасіїса! Арріїсайноп ої Адіимапіз (Ед. сіеулап-Тиї, 0. Е. 5.), хоппумеу апа 5опв,

МУ, рр 51-94 (1995) і Тода ега!., Массіпе 15: 564-570 (1997). Типовими ад'ювантами є емульсія 5РТ, описана на сторінці 147 публікації "Массіпе ЮОезідп, Те 5ибипії апа Адіймапі Арргоасі" за редакцією

М. РомжеїЇ апа М. Мем/тап, Ріепит Ргез5, 1995, і емульсія МЕ59, описана на сторінці 183 тієї ж книги.

Ще одним прикладом ад'юванту може бути сполука, вибрана з полімерів акрилової або метакрилової кислоти й співполімерів малеїнового ангідриду й алкенільної похідної. Оптимальними ад'ювантними сполуками є полімери акрилової або метакрилової кислоти, зшиті, зокрема, з поліалкенільними складними ефірами цукрів або багатоатомних спиртів. Ці сполуки відомі як карбомери (Рпатеигора Мої. 8, Мо. 2, дипе 1996). Фахівці в даній галузі також можуть звернутися до

Патенту США Мо 2,909,462, у якому описуються такі акрилові полімери, зшиті з полігідроксилованою сполукою, що мають принаймні З гідроксильних групи, переважно не більше 8, причому атоми водню принаймні трьох гідроксилів замінені на ненасичені аліфатичні радикали, що мають принаймні 2 атоми вуглецю. Кращими радикалами є ті, які містять від 2 до 4 атомів вуглецю, наприклад, вініли, аліли й інші етиленненасичені групи. Ненасичені радикали самі можуть містити інші замісники, такі, як метил. Особливо підходящими є продукти, які продаються за назвою

Сагророї; (ВЕ Сооагісй, Огайо, США). Вони зшиті з алілсахарозою або з алілпентаеритритом.

Серед них можна згадати Сагророї 974Р, 934Р і 971Р. Найбільш кращим є використання СагророЇ

971Р. До співполімерів малеїнового ангідриду й алкенільної похідної належать співполімери ЕМА (Мопзапіо), які являють собою співполімери малеїнового ангідриду й етилену. Розчинення цих полімерів у воді веде до утворення розчину кислоти, що підлягає нейтралізації, переважно до фізіологічного рівня рН, з метою одержання розчину ад'юванта, у яку включають саму імуногенну, імунологічну або вакцинну композицію.

Інші підходящі ад'юванти включають, крім інших, ад'ювантну систему КІВІ (КІібрі Іпс.), блокспівполімер (Суїх, Айапіа СА), ЗАБ-М (СпПігоп, Етегумійе СА), монофосфорил-ліпід. А ад'ювант авридин ліпід-амін, термолабільний ентеротоксин з Е. соїї (рекомбінантний або інший), холерний токсин, ІМ5 1314 або мурамілдипептид, або природні або рекомбінантні цитокіни або їх аналоги або стимулятори вивільнення ендогенного цитокіну й ін.

Очікується, що ад'ювант може додаватися в кількості від приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу, переважно в кількості від приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу, більш переважно - у кількості від приблизно 500 мкг до приблизно 5 мг на дозу, ще більш переважно -- у кількості від приблизно 750 мкг до приблизно 2,5 мг на дозу, і найбільш переважно -- у кількості від приблизно 1 мг на дозу. В альтернативному варіанті ад'ювант може бути в концентрації від приблизно 0,01 95 до 95, переважно в концентрації від приблизно 2 95 до 30 95, більш переважно - у концентрації від приблизно 595 до 2595, ще більш переважно - у концентрації від приблизно 795 до 22 90, і найбільш переважно -- у концентрації від 10 95 до 20 95 за об'ємом готового продукту.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому принаймні один фармацевтично прийнятний носій є карбомером.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація включає від 0,1 мкг до 50 мкг антигену РРМ МР2, переважно від 0,5 мкг до 10 мкг антигену РРМ МУР2, більш переважно -- від 1,0 мкг до 10 мкг антигену РРМ МР2 та/або від 3,9 до 7,0 Ісд1оТСІЮОзо вірусу РЕК5Б.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, включає приблизно від 0,1 мкг до 50 мкг антигену РРМ МР2. Переважно імуногенна композиція включає приблизно від 0,2 мкг до 40 мкг, більш переважно - приблизно від 0,3 мкг і 30 мкг, більш переважно - приблизно від 0,4 мкг до 20 мкг, ще більш переважно - приблизно від 0,5 мкг до 10 мкг, ще більш переважно - приблизно від 1,0 мкг до 10 мкг, причому найбільш краща кількість становить 0,5 мкг, 0,75 мкг, 1 мкг, 1,25 мкг, 1,5

МКГ, 2 мкг, 2,5 мкг, З мкг, 3,5 мкг, 4 мкг, 4,5 мкг, 5 мкг, 5,5 мкг, б мкг, 6,5 мкг, 7 мкг, 7,5 мкг, 8 мкг, 8,5 мкг, 9 мкг, 9,5 мкг або 10 мкг антигену РРМ МР2.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, включає приблизно від 3,9 до 7,0

Іодіо ГСІО о вірусу РКК.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінація є вакциною.

Термін "вакцина" уже описувався в інших розділах даного опису. Однак у випадку, якщо хазяїн демонструє захисну імунну відповідь, таку, як підвищена опірність до нової інфекції та/або зниження клінічної тяжкості захворювання, імуногенна композиція або комбінація описується як "вакцина.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, захищає від гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження. Перевага полягає в тому, що експериментальні дані, забезпечувані даним винаходом, виявляють, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація відповідно до даного винаходу має широкий спектр захисту, оскільки вакцина захищає від гетерологічних північноамериканських, а також гетерологічних європейських штамів для провокаційного зараження.

Терміни "захищає" і "профілактика" і "запобігання" застосовуються в цій заявці взаємозамінно.

Ці терміни визначаються в інших розділах даного опису.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, захищає від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами.

Термін "північноамериканські та/або європейські ізоляти" добре відомий серед фахівців у даній галузі. Термін "північноамериканські та/або європейські ізоляти" охоплює всі ізоляти, які були або будуть виділені в Північній Америці і Європі.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, забезпечує перехресний імунітет від північноамериканських та/або європейських ізолятів.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, ефективна для лікування та/або профілактики клінічних ознак, викликаних інфекцією РРМ та/або РКАК5М у суб'єкта, який цього потребує. Терміни "лікування та/або профілактика", "клінічні ознаки" і "потребує" визначені в інших розділах цього опису.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація захищає від гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження вірусом РРМУ та/або гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження вірусом РКЕК5.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація захищає від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами РРУ та/або від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами вірусу РКК5.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація забезпечує перехресний захист від північноамериканських та/або європейських ізолятів РРУ та/або забезпечує перехресний захист від північноамериканських та/або європейських ізолятів вірусу РККЗ5.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація ефективна для лікування та/або профілактики клінічних ознак, які викликаються інфекцією вірусу РРМ та/або РККЗ у суб'єкта, який цього потребує.

Крім того, даний винахід забезпечує вірусоподібну частинку, що включає РРМ МР2, як описується й заявляється авторами.

Термін "вірусоподібна частинка" (МІР) охоплює нерепліковану порожню вірусну оболонку вірусу. МЕР звичайно складаються з одного або більше вірусних білків, до яких, крім інших, належать білки, що вказуються як капсиди, білки покриття, поверхні та/або оболонки, або поліпептиди, які утворюють частинки, похідні від цих білків. МР можуть утворюватися спонтанно після рекомбінантної експресії білка у відповідній експресуючій системі. Присутність МІР. після рекомбінантної експресії вірусних білків виявляють із застосуванням традиційних технологій, відомих фахівцям у даній галузі, таких, як електронна мікроскопія, рентгенівська кристалографія й т.п. Див., наприклад, Вакег еї а!., Віорпув. 9. (1991) 60: 1445-1456; Надепзее еї аї., у. Міго!. (1994) 68: 4503-4505. Наприклад, кріоелектронну мікроскопію виконують на вітрифікованих водних зразках даного препарату МІ Р і зображення записують при відповідних умовах експозиції.

Термін "вірусоподібна частинка" (МІ Р) також охоплює МІ Р, що складаються із багатьох РРУ

УРаг.

В іншому аспекті даного винаходу вірусоподібна частинка складається з багатьох РРМ МР2, як описується й заявляється авторами.

Крім того, даний винахід забезпечує клітину, що включає полінуклеотид або вектор, як описується авторами. Переважно вектор є бакуловірусом.

Термін "клітина" добре відомий серед фахівців у даній галузі. Термін "клітина" охоплює еукаріотичну клітину, таку, як клітина тварини, клітина найпростішого, рослинна клітина або грибкова клітина. Переважно еукаріотична клітина є клітиною ссавця, такого, як СНО, ВНК або

СО5, або грибковою клітиною, наприклад, Засспаготусев сегемізіає, або клітиною комахи, наприклад, 519.

В іншому аспекті даного винаходу клітина є клітиною комахи. "Клітина комахи" у контексті даного опису означає клітину або клітинну культуру, узяту з виду комахи. Особливий інтерес із погляду даного винаходу представляють клітини комах, узяті з видів зЗродоріега Ігидірегаа і Тгіспоріивіа пі.

Переважно клітина комахи, як згадано авторами, є клітиною Зроадорієга Ітидірегда (55) або клітиною із клітинної лінії, узятої з 5родорієга Егидірегада, більш переважно -- вибраної із групи, що складається із клітини 519 і клітини 5. Відповідно, клітини комах, згадані авторами, переважно являють собою клітини Зродоріега Іпидірегаа (50) або клітини із клітинної лінії, узятої з 5родоріега

Ігидірегаа, більш переважно -- вибрані із групи, що складається із клітин 919 і клітин Зк.

В іншому аспекті даного винаходу клітину комаху вибирають із групи, до якої належать клітини 9І9 і клітини 51.

Крім того, даний винахід забезпечує спосіб одержання РРМ МР, як описується й заявляється авторами, що включає трансфекцію клітини вектором, як описується авторами.

Термін "вектор" добре відомий серед фахівців у даній галузі. Термін "вектор", відомий фахівцям у даній галузі, стосується полінуклеотидної конструкції як правило, плазміди або вірусу, які використовують для переносу генетичного матеріалу в клітину-хазяїн. Вектори можуть бути, наприклад, вірусами, плазмідами, космідами або фагами. Вектор у контексті даного винаходу може складатися із ДНК або РНК. У деяких варіантах здійснення вектор складається із ДНК.

"Вектор експресії" являє собою вектор, здатний направляти експресію білка, кодованого одним або декількома генами, які несе вектор, коли він присутній у відповідному середовищі. Вектори переважно здатні до самостійної реплікації. Як правило, вектор експресії включає промотор транскрипції, ген і термінатор транскрипції. Експресію гена звичайно здійснюють під контролем промотору, і ген вважається "функціонально зв'язаним" із промотором.

У контексті даного опису термін "функціонально зв'язаний" застосовують для опису зв'язку між регуляторними елементами й геном або його кодуючою ділянкою. Як правило, експресію гена здійснюють під контролем одного або декількох регуляторних елементів, до яких, крім інших, ставляться, наприклад, конститутивні або індуцибельні промотори, тканиноспецифічні регуляторні елементи й енхансери. Ген або кодуюча ділянка вважається "функціонально зв'язаним" або "функціонально з'єднаним" або "функціонально асоційованим" з регуляторними елементами в тому розумінні, що ген або кодуюча ділянка знаходиться під контролем або впливом регуляторного елемента. Наприклад, промотор вважається функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо промотор здійснює транскрипцію або експресію кодуючої послідовності.

Вектори й способи одержання та/або застосування векторів (або рекомбінантів) для експресії можуть бути ідентичними або аналогічними до способів, що розкриваються в: патентах США МоМо 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235, 382,425, публікаціях РСТ УМО 94/16716, УМО 96/39491, УМО 95/30018; Раосіейі, "Арріісайопв ої рох міги5 месіог5 юю массіпаййоп: Ап ирдаїє, "РМА5 ОА 93: 11349- 11353, Осіорег 1996; Моз5, "СепеїісаПйу епдіпеегей рохмігизез Тог гесотбріпапі депе ехргезвіоп, массіпайоп, апа заїеіу, " РМАБ ОБА 93: 11341-11348, Осіорег 1996; тій еї аїІ., Ш.5. Раї. Мо. 4,745,051 (рекомбінантний бакуловірус); Кіспагазоп, С. О. (Едйог), Меїйод3з іп Моїесшіаг Віоіоаду 39, "Васшомігиз Ехргеззіоп Ргоїосоїів" (1995 Нитапа Ргезз Іпс.); тій еї аї., "Ргодисіїоп ої Нитап Веїа

Іпіепегоп іп Іпзесі СеїЇв Іптесієй м/йй а Васиїомігив Ехргеззіоп Месіог", Моїесшціаг апа СеїІшаг Віоіоаду,

Оесетрбе"!, 1983, Мої. З, Мо. 12, р. 2156-2165; РеппоскК еї аї., "Бігопуд і Кедшаїей Ехргезвіоп ої

Езепетісніа соїї В-Саїасіозідазе іп Іптесі СеїЇв м/йй а Васиіоміги5 месіог, "МоіІесшаг апа СеїІшаг Віоїоду

Магсі 1984, Мої. 4, Мо. З, р. 406; ЕРАО 370 573; заявці США Мо 920,197, поданої 16 жовтня 1986 р.;

Патентної публікації ЕР Мо 265785; Патенті США Мо 4,769,331 (рекомбінантний герпесвірус); публікаціях Коії2тап, "Те їпсійоп ої пегрез 5ітрієх міги5 депев: А ргітег їог депеїйс епдіпеегіпуд ої поме! месіої5, " РМАБ БА 93: 11307-11312, Осіорег 1996; Апагеап5Ку еї аї!., "Пе арріїсайоп ої депеїїсаїу епдіпеегейд Пегрез зітріех мігизев5 0 Пе ігеаїтепі ої ехрегітепіа! Ббгаїп їштогв, " РМА5

БА 93: 11313-11318, Осіорег 1996; Нобенізоп еї аї., "Ерзівїп-Ваїт міги5 месіогз їог депе аеїїмегу о В

Іутрпосуїе", РМАБ ОБА 93: 11334-11340, Осіорег 1996; ЕгоЇом еї аї., "АІрнамігиз-базей ехргеззіоп месіогв: 5ігагедієз апа арріїсанйоп5, " РМАБ ОБА 93: 11371-11377, Осіорег 1996; Кіїзоп еї аї., У. Мікої. 65, 3068-3075, 1991; патентах США МоМо 5,591,439, 5,552,143; ММО 98/00166; акцептованих заявках

США, сер. МоМо 08/675,556 і 08/675,566, обидві з яких були подано З липня 1996 р. (рекомбінантний аденовірус); публікації Сгипнацзх еї аї., 1992, "Адепомігих5 аз сіопіпуд месіог5, " Зетіпагв5 іп Мігоїоду (Мої. 3) р. 237-52, 1993; Ваїау еї аї. ЕМВО доитгпаї, мої. 4, р. 3861-65, Станат, Тіріесні 8, 85-87, Аргі, 1990; Ргемес еї аї., У. Сеп Мігої. 70, 42434; РСТ МО 91/11525; ГРеїІдпег еї а. (1994), 9. Віої. Спнет. 269, 2550-2561, Осіепсе, 259: 1745-49, 1993; ії МеСіетепів еї аї., "Іттипігайоп уп ОМА массіпе5 епсодіпод діусоргоївіп О ог аіусоргоївіп В, аіопе ог іп сотбіпаїййоп, іпдисе5 ргоїесіїме іттипйу іп апітаї тоде!5 ої Негрез 5ітріех мігив-2 аізеазе", РМАБ ОА 93: 11414-11420, Осіобег 1996; і патентах США

МоМо 5,591,639, 5,589,466, і 5,580,859, а також УМО 90/11092, УМО 93/19183, УМО 94/21797, МО 95/11307, УМО 95/20660; публікаціях Тапд еї аї., Маїшиге, і Бий еї аї., Апаїуїса! Віоспетівігу, що стосуються векторів, які експресують ДНК, і ін. Див. також публікації М/О 98/33510; ди еї аї., ріарейюіодіа, 41: 736-739, 1998 (лентивірусна експресуюча система); Запіога еї а!., 0.5. Раї. Мо. 4,945,050; Різспраснеї аї. (Іпігасе!); УМО 90/01543; НРобіпзоп еї аї., хетіпагїв іп Іттипоіоду мої. 9, рр. 271-283 (1997), (системи ДНК-векторів); 520оКа еї аі!., Патенті США Мо 4,394 448 (спосіб вставки ДНК у живі клітини); МеСоптіск еї аІ., Патенті США Мо 5,677,178 (застосування цитопатичних вірусів); і

Патенті США Мо 5,928,913 (вектори для доставки генів); а також інших згаданих авторами документах.

Терміни "регуляторний елемент" і "елемент контролю експресії" застосовуються взаємозамінно й стосуються молекул нуклеїнових кислот, які впливають на експресію функціонально зв'язаної кодуючої послідовності у конкретному організмі-хазяїні. Ці терміни застосовуються в широкому розумінні й охоплюють усі елементи, що сприяють транскрипції або регулюють її, включаючи промотори, основні елементи, необхідні для фундаментальної взаємодії РНК-полімерази й факторів транскрипції, розташовані проти ходу транскрипції елементи, енхансери й елементи відповіді. Типовими регуляторними елементами в прокаріотах є промотори, операторні послідовності й ділянки зв'язування рибосом. Регуляторні елементи, застосовувані в еукаріотичних клітинах, можуть включати, крім інших, транскрипційні й трансляційні контрольні послідовності, такі, як промотори, енхансери, сигнали сплайсингу, сигнали поліаденілування, термінатори, сигнали руйнування білка, елемент внутрішньої посадки рибосоми (ІКЕ5), 2А послідовності й т.п., які забезпечують та/(або регулюють експресію кодуючої послідовності, талабо утворення кодованого поліпептиду в клітині-хазяїні.

У контексті даного опису термін "промотор" означає нуклеотидну послідовність, що забезпечує можливість зв'язування РНК-полімерази й направляє транскрипцію гена. Як правило, промотор розташований у 5'- некодуючій ділянці гена, наближеній до сайту ініціації транскрипції гена.

Елементи послідовності в межах промоторів, які виконують функцію ініціації транскрипції, часто характеризуються консенсусними нуклеотидними послідовностями. Прикладами промоторів, крім інших, можуть бути промотори з бактерій, дріжджів, рослин, вірусів і ссавців (включаючи людину).

Промотор може бути індуцибельним, репресованим та/або конститутивним. Індуцибельні промотори ініціюють підвищений рівень транскрипції із ДНК під їх контролем у відповідь на деякі зміни в умовах культивування, наприклад, зміну температури.

У контексті даного опису термін "енхансер" стосується типу регуляторного елемента, який може підвищувати ефективність транскрипції, незалежно від відстані або орієнтації енхансера щодо сайту початку транскрипції.

Утворення вірусного вектора може здійснюватися із застосуванням будь-яких підходящих технологій інженерії, загальновідомих серед фахівців у даній галузі, включаючи, крім інших, стандартні технології розщеплення рестрикційної ендонуклеази, лігування, трансформації, очищення плазміди й секвенування ДНК, наприклад, як описується в публікації Затбгоок еї аї. (Моїіесшіаг Сіопіпд: А ІГарогаїогу Мапиаї. Соїа 5ргіпу Нагбог І арогаїогу Ргезв, М.У. (1989)).

Крім того, даний винахід забезпечує спосіб одержання РРМ МР, як описується авторами, що включає трансфекцію клітини, переважно клітини комахи, бакуловірусом, як описується авторами.

Композиції, у випадку потреби, можуть бути представлені в упаковці або дозуючому обладнанні, яке може містити одну або декілька одиничних лікарських форм, що містять активний інгредієнт. Упакування може включати, наприклад, металеву або пластикову плівку, наприклад, блістерна упаковка. До впакування або дозуючого обладнання можуть додаватися інструкції із введення, переважно щодо введення тваринам, зокрема, свиням. До контейнера(ів) може додаватися записка у формі, що пропонується урядовим органом, що регулюють виробництво, використання або продаж фармацевтичних або біологічних продуктів, причому в записці відображається дозвіл даного органу на виробництво, використання або продаж з метою введення людині.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, причому принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРМ) і принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РЕК) містяться разом в одному контейнері або відділені один від одного простором, переважно містяться у двох або більше окремих контейнерах.

В іншому аспекті даний винахід стосується комплекту, що включає імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію, як розкривається й заявляється авторами.

В іншому аспекті даний винахід стосується комплекту, як розкривається й заявляється авторами, у якому принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРУ) і принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РЕК5Б) містяться окремо один від одного у двох або більше окремих контейнерах, переважно незалежно один від одного в ліофілізованій або замороженій формі, і комплект також включає інструкцію з посібником зі змішування розділених простором принаймні одного антигену РРМ і принаймні одного антигену вірусу РЕК5, причому така інструкція з керівництвом переважно містить вказівки з комбінування вмісту контейнера(ів), що містить(ять) принаймні один антиген РРУ, із вмістом контейнерац(ів), що містить(ять) принаймні один антиген вірусу РРК5, причому така інструкція з керівництвом більш переважно містить вказівки про те, що принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРМУ) і принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РЕКЗ) повинні вводитися суб'єктові одночасно, більш переважно окремо одночасно в одному або різних місцях введення, послідовно (у будь-якому порядку), та/або з регулюванням за часом.

В іншому аспекті даний винахід стосується комплекту, як розкривається й заявляється авторами, причому комплект також включає вказівки з лікування та/або профілактики захворювань у свиней та/або також включає вказівки з лікування та/або профілактики інфекцій вірусу РРМ та/або вірусу РКК5, причому такий комплект переважно також включає вказівки із асоційованого застосуванню компонента РРУ (переважно як окремий компонент комплекту) і компонента РКК5М (переважно як окремий компонент комплекту) імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як розкривається й заявляється авторами, і включені в такий комплект.

Термін "асоційоване застосування" у рамках даного винаходу стосується застосування двох вакцин або компонентів вакцини РКК5М і РРМ (кожний з яких незалежно від інших також вказується як "окремий компонент комплекту") шляхом змішування двох вакцин перед введенням в одному місці ін'єкції або введенням двох вакцин у деякий час, але в різних місцях введення. Переважно такі дві вакцини вводять одночасно, більш переважно окремо одночасно в одному або різних місцях введення, послідовно (у будь-якому порядку), та/або з регулюванням за часом.

В іншому аспекті даного винаходу РРМ та/"або РКК5ЗМ відповідно до даного винаходу був інактивований, у результаті чого був отриманий цільний інактивований вірус із вірусним білком 2 (МР2), як описується авторами.

З погляду даного винаходу може застосовуватися будь-який традиційний спосіб інактивації.

Таким чином, інактивація може виконуватися із застосуванням способів хімічної та/або фізичної обробки, які відомі фахівцям у даній галузі. Переважні способи інактивації включають додавання циклізованого бінарного етиленаміну (ВЕЇ), що включає додавання розчину /-2- бромоеєетиленамінгідроброміду (ВЕА), який був циклізований до бінарного етиленаміну (ВЕЇ). Кращі додаткові засоби хімічної інактивації включають, крім інших, Топ Х-100, дезоксихолат натрію, бромід цетилтриметиламонію, В-пропіолактон, тимеросал, фенол і формальдегід (формалін).

Однак інактивація також може включати етап нейтралізації. Кращі засоби нейтралізації включають, крім інших, тіосульфат натрію, бісульфат натрію й т.п.

Кращі умови інактивації формаліном включають концентрацію формаліну приблизно від 0,02 95 (об'єм/об'єм) до 2,0 95 (об'єм/об'єм), більш переважно - приблизно від 0,1 95 (об'єм/об'єм) до 1,0 95 (об'єм/об'єм), ще більш переважно - приблизно від 0,15 95 (об'єм/об'єм) до 0,8 95 (об'єм/об'єм), ще більш переважно - приблизно від 0,16 95 (об'єм/об'єм) до 0,6 95 (об'єм/об'єм), і найбільш переважно приблизно від 0,2 95 (об'єм/об'єм) до 0,4 95 (об'єм/об'єм). Час інкубації залежить від резистентності

РРМ та/або РККЗ5У. Як правило, процес інактивації виконують доти, поки не перестане виявлятися ріст РРМ та/або РЕКЗУ у відповідній системі культивування.

Переважно інактивований РРМ та/або РКК5М відповідно до даного винаходу інактивують формаліном, переважно із застосуванням описаної вище концентрації.

Переважно інактивований РРУ та/або РКЕКЗМ відповідно до даного винаходу є інактивованим циклізованним бінарним етиленаміном (ВЕ), включаючи додавання розчину -(.2- бромоеєетиленамінгідроброміду (ВЕА), який був циклізований до бінарного етиленаміну (ВЕЇ).

Інактивований РРУ та/або РКК5М відповідно до винаходу може бути включений у ліпосоми із застосуванням відомої технології, такий, як описувана в публікаціях Маїциге, 1974, 252, 252-254 або

УЧоигпаї ої Іттипо!іоду, 1978, 120, 1109-1113. В іншому варіанті здійснення винаходу інактивований

РРМ відповідно до винаходу може бути кон'юЮптгований з підходящими біологічними сполуками, такими, як полісахариди, пептиди, білки й т.п., або їх комбінація.

Термін "імунізація" стосується активної імунізації шляхом введення імуногенної композиції суб'єктові, що підлягає імунізації, таким чином, щоб викликалася імунна відповідь проти антигену, включеного в таку імуногенну композицію.

Переважно в результаті імунізації забезпечується зниження частоти випадків конкретної інфекції РРУ та/"або РКК5ЗМУ у череді або зменшення тяжкості клінічних ознак, які викликаються або пов'язаних з конкретною інфекцією РРУ та/або РКК5БМУ.

Крім того, результатом імунізації суб'єкта, який її потребує, імуногенними композиціями, забезпечуваними даним винаходом, є запобігання зараження суб'єкта інфекцією РРМУ та/або

РАККЗБУ. У ще більш кращому варіанті результатом імунізації є ефективна, тривала імунологічна відповідь проти інфекції РРМ та/або РКК5БУ. Слід розуміти, що вищезгаданий період часу повинен тривати більше 1 місяця, переважно понад 2 місяці, більш переважно - понад 3 місяці, більш переважно -- понад 4 місяці, більш переважно -- понад 5 місяці, більш переважно -- понад 6 місяців.

Слід розуміти, що імунізація може не бути ефективною у всіх імунізованих суб'єктів. Однак термін вимагає, щоб значна частина суб'єктів у череді була ефективно імунізована.

Переважно в контексті даного винаходу передбачається череда суб'єктів, у якій у нормальних умовах, тобто, без імунізації, проявляються клінічні ознаки викликуваних або пов'язаних з а РРУ та/або Інфекція РКК5ЗМУ. Чи ефективно імунізовані суб'єкти череди, можна визначити без зайвих зусиль із боку фахівців у даній галузі. Переважно імунізація вважається ефективною, якщо клінічні ознаки в принаймні 33 95, принаймні 50 95, принаймні 60 95, принаймні 70 95, принаймні 80 95, принаймні 90 95, ще більш переважно - у принаймні 95 95, найбільш переважно -- в 100 95 суб'єктів даної череди знижуються за частотою або тяжкістю принаймні на 10 95, більш переважно - принаймні на 20 95, ще більш переважно - принаймні на 30 95, ще більш переважно - принаймні на 40 965, ще більш переважно - принаймні на 50 95, ще більш переважно - принаймні на 60 95, ще більш переважно - принаймні на 7095, ще більш переважно - принаймні на 80 95, ще більш переважно - принаймні на 90 95, ще більш переважно - принаймні на 95 95, найбільш переважно -- на 100 95, у порівнянні із суб'єктами, які або не були імунізовані, або були імунізовані імуногенною композицією, яка була в наявності до даного винаходу, але згодом були інфіковані конкретним

РРУ.

В іншому аспекті даний винахід стосується застосування імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації або комплекту, як описується й заявляється авторами для приготування медикаменту, переважно вакцини.

В іншому аспекті даний винахід стосується застосування імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації або комплекту, як описується й заявляється авторами, для лікування та/або профілактики інфекції вірусу РРМ та/або вірусу РКК5, зниження, профілактики або лікування клінічних ознак, викликаних інфекцією РРМУ та/або вірус РКК5, або для лікування та/або профілактики захворювання, викликаного інфікуванням РРМУ та/або вірус РКК5.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу імунізації суб'єкта, що включає введення такому суб'єктові імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу лікування та/або запобігання клінічних ознак, які викликаються інфекцією вірусу РРМ та/або РЕК5, переважно свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому, переважно у свиней, у суб'єкта, який цього потребує, причому спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу зниження репродуктивної недостатності в суб'єкта в порівнянні із суб'єктом неімунізованої контрольної групи того ж виду, причому спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу зниження смертності ембріона й плода в суб'єктові в порівнянні із суб'єктом неімунізованої контрольної групи того ж виду, причому спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу активної імунізації племінних свиней (свиноматок і свинок) для захисту ембріонів і плодів від інфекції свинячого парвовірусу, причому спосіб включає введення таким свиням (свиноматкам і свинкам) терапевтично ефективної кількості імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами.

В іншому аспекті даний винахід стосується способів, як описується й заявляється авторами, причому вищезгаданий суб'єкт вибирають із групи, до якої належать свині, велика рогата худоба, кішки або собаки, переважно свиня, більш переважно свиноматка та/або свинка.

В іншому аспекті даний винахід стосується способів, як описується й заявляється авторами, згідно з якими імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію (або окремі компоненти комплекту) вводять однократно або двома або більше дозами.

В іншому аспекті даний винахід стосується способів, як описується й заявляється авторами, причому імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію (або окремі компоненти комплекту) вводять внутрішньом'язово.

В іншому аспекті даний винахід стосується способів, як описується й заявляється авторами, причому імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію (або окремі компоненти комплекту) вводять свинкам та/або свиноматкам, переважно свинкам та/або свиноматкам принаймні З3-тижневого віку, більш переважно свинкам та/(або свиноматкам перед вагітністю, ще більш переважно -- свиноматкам під час вагітності й лактації.

В іншому аспекті даний винахід стосується способів, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) є безпечною для свинок та/або свиноматок під час вагітності й лактації й свинок перед вагітністю.

В іншому аспекті даний винахід стосується способів, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) є безпечною для свиноматок та/або свинок після 30 днів вагітності, переважно після 40 днів вагітності.

В іншому аспекті даний винахід стосується способів, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) включає від 0,1 мкг до 50 мкг антигену РРМ МР2, переважно від 0,5 мкг до 10 мкг антигену РРМ МР, більш переважно -- від 1,0 мкг до 10 мкг антигену РРМ МРАО та/або від 3,9 до 7,0

Іодіо ГСІО о вірусу РКК.

В іншому аспекті даний винахід стосується способів, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) захищає від гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження РРУ та/або гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження вірусом РКК5.

В іншому аспекті даний винахід стосується способів, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) захищає від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами РРМ та/або від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами вірусу РКК5.

В іншому аспекті даний винахід стосується способів, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) забезпечує перехресний захист від північноамериканських та/або європейських ізолятів

РРМ та/або забезпечує перехресний захист від північноамериканських та/або європейських ізолятів вірусу РЕК5.

В іншому аспекті даний винахід стосується способів, як описується й заявляється авторами, причому в результаті виконання вищезгаданого способу забезпечується поліпшення принаймні одного параметра ефективності вибраного із групи, до якої належать: знижена перехідна лейкопенія й репродуктивна недостатність, що характеризуються інфікуванням і загибеллю ембріона та/або плода, або їх комбінації, у порівнянні із суб'єктом неімунізованої контрольної групи того ж виду.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування згідно зі способом імунізації суб'єкта, що включає введення вищезгаданої імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту) такому суб'єктові.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування згідно зі способом лікування та/або запобігання клінічних ознак, які викликаються інфекцією вірусу РРМ та/або РКК5, переважно свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому, переважно у свиней, у суб'єкта, який цього потребує, причому спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості вищезгаданої імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту).

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування згідно зі способом зниження репродуктивної недостатності в суб'єкта в порівнянні із суб'єктом неімунізованої контрольної групи того ж виду, причому спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості вищезгаданої імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту).

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування згідно зі способом зниження смертності ембріона й плода в суб'єкта в порівнянні із суб'єктом неімунізованої контрольної групи того ж виду, причому спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості вищезгаданої імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту).

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування згідно зі способом активної імунізації племінних свиней (свиноматок і свинок) для захисту ембріонів і плодів від інфекції свинячого парвовірусу, причому спосіб включає введення таким свиням (свиноматкам і свинкам) вищезгаданої імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту).

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування, як описується й заявляється авторами, причому вищезгаданий суб'єкт вибирають із групи, до якої належать свині, велика рогата худоба, кішки або собаки, переважно свині, більш переважно - свиноматки та/або свинки.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) вводять однократно або двома або більше дозами.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування, як описується й заявляється авторами, причому імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію (або окремі компоненти комплекту) вводять внутрішньом'язово.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування, як описується й заявляється авторами, причому імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію (або окремі компоненти комплекту) вводять свинкам та/або свиноматкам, переважно свиноматкам, принаймні З-тижневого віку, більш переважно - свиноматкам перед вагітністю, ще більш переважно - свиноматкам під час вагітності й лактації.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) є безпечною для свинок та/або свиноматок під час вагітності й лактації.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) є безпечною для свинок та/або свиноматок після 30 днів вагітності, переважно після 40 днів вагітності.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) включає від 0,1 мкг до 50 мкг антигену РРМ МР2, переважно від 0,5 мкг до 10 мкг антигену РРМ МР2, більш переважно -- від 1,0 мкг до 10 мкг антигену РРМУ МР, та/або від 3,9 до 7,0 ІсдіоТСіІЮОвзо вірусу РКН5.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) захищає від гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження РРМУ та/або захищає від гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження вірусом РКНА5.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) захищає від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами РРУ та/або захищає від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами вірусу РЕК5.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту) забезпечує перехресний захист від північноамериканських та/або європейських ізолятів РРУ та/або забезпечує перехресний захист від північноамериканських та/або європейських ізолятів вірусу РКК5.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації (або окремих компонентів комплекту), як описується й заявляється авторами, для застосування, як описується й заявляється авторами, причому в результаті виконання вищезгаданого способу забезпечується поліпшення принаймні одного параметра ефективності вибраного із групи, до якої належать: знижена перехідна лейкопенія й репродуктивна недостатність, що характеризуються інфікуванням і загибеллю ембріона та/або плода, або їх комбінації, у порівнянні с суб'єктом неімунізованої контрольної групи того ж виду.

Термін "лікування та/або профілактика" стосується зниження частоти випадків конкретної інфекції РРУ та/або інфекції РКАЕ5М у череді або зниження тяжкості клінічних ознак викликуваних або пов'язаних з конкретною інфекцією РРУ та/"або РКК5У. Таким чином, термін "лікування та/або профілактика" також стосується зменшення кількості тварин у череді, інфікованих конкретним РРУ та/"або РЕК5М (- зниження частоти випадків конкретної інфекції РРУ та/або інфекції РЕКЗМ) або зниження тяжкості клінічних ознак, звичайно пов'язаних з інфекцією РРМ та/(або РКК5У, або що викликаються нею, у групі тварин, які одержали ефективну кількість імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, як передбачено в даному описі, у порівнянні із групою тварин, які не одержували такої імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації. "Лікування та/або профілактика" як правило, включає введення ефективної кількості імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації відповідно до даного винаходу суб'єктові або череді суб'єктів, які потребують такого лікування / профілактики, або для яких таке лікування / профілактика є сприятливими. Термін "лікування" стосується введення ефективної кількості імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації після того, як суб'єкт або принаймні деякі тварини із череди вже були інфіковані таким РРУ та/або РАККЗУ, і такі тварини вже проявляли деякі клінічні ознаки викликуваних або пов'язаних з такою інфекцією РРМ та/або РЕК5БМУ.

Термін "профілактика" стосується введення суб'єктові перед будь-яким інфікуванням такого суб'єкта РРМ та/або РКК5М або ситуацію, коли хоча б така тварина або жодна із тварин у групі тварин не проявляє ніяких клінічних ознак, які викликаються інфікуванням таким РРМ, або пов'язаних з ним та/або РКК5У. Терміни "профілактика" і "запобігання" застосовуються в цій заявці взаємозамінно.

Термін "ефективна кількість" у контексті даного опису означає, крім іншого, кількість антигену, яка викликає або здатна викликати імунну відповідь у суб'єкта. Така ефективна кількість здатна знижувати частоту випадків конкретної інфекції РРМУ та/або інфекції РЕКЗМ у череді або знизити тяжкість клінічних ознак конкретної інфекції РРУ та/або інфекції РКК5ЗМ.

Переважно клінічні ознаки знижуються за частотою або тяжкістю принаймні на 10 95, більш переважно - принаймні на 20 95, ще більш переважно - принаймні на 30 95, ще більш переважно -- принаймні на 40 95, ще більш переважно - принаймні на 50 95, ще більш переважно - принаймні на 60 95, ще більш переважно - принаймні на 70 95, ще більш переважно - принаймні на 80 95, ще більш переважно - принаймні на 9095, ще більш переважно - принаймні на 95 95, найбільш переважно - на 100 95, у порівнянні із суб'єктами, які не одержували лікування або одержували імуногенну композицію, або комбінована вакцина або комбінація яка була в наявності до даного винаходу, але згодом були інфіковані конкретним РРМ та/або РКК5БМУ.

Термін "клінічні ознаки" у контексті даного опису стосується наявності в суб'єкта ознак інфекції

РРМ та/або РКК5БУ. Клінічні ознаки інфекції залежать від вибраного патогену. Приклади таких клінічних ознак включають, крім інших, знижена перехідна лейкопенія й репродуктивна недостатність, що характеризуються інфікуванням і загибеллю ембріона та/або плода, або їх комбінації Приклади прямо спостережуваних клінічних ознак включають зменшений розмір приплоду, підвищену муміфікацію ембріона або плода на приплід, аутолізацію ембріона або плода, зменшений розмір ембріона або плода, зменшену вагу ембріона або плода й т.п., або їх комбінації.

Інші приклади таких клінічних ознак включають, крім інших, підвищену віремію, підвищене вірусне навантаження в тканинах-мішенях і крові, підвищену передачу / поширення РРУ на тварин одного приплоду і т.п., або їх комбінації.

Переважно клінічні ознаки, які знижуються за частоті випадків або тяжкості в підданого лікуванню суб'єкта в порівнянні із суб'єктами, які або не піддавалися лікуванню, або піддавалися лікуванню імуногенною композицією, яка була в наявності до даного винаходу, але згодом були інфіковані конкретним РРМ та/або РКК5М, стосуються перехідної лейкопенії й репродуктивної недостатності, що характеризуються інфікуванням і загибеллю ембріона та/або плода, або їх комбінації.

Термін "який потребує" або "потребує" у контексті даного опису означає, що введення / лікування зв'язане зі стимулюванням або поліпшенням стану здоров'я або клінічних ознак або будь- яким іншим позитивним медичним впливом на здоров'я тварин (включаючи їх ембріони й плоди), які одержують імуногенну композицію відповідно до даного винаходу.

Термін "зниження" або "знижений" або "зменшення" або "зменшувати" застосовуються в цій заявці взаємозамінно. Термін "зниження" означає, що клінічна ознака знижується принаймні на 95, більш переважно - принаймні на 20 95, ще більш переважно - принаймні на 30 95, ще більш переважно - принаймні на 40 95, ще більш переважно - принаймні на 50 95, ще більш переважно -- принаймні на 60 95, ще більш переважно - принаймні на 70 95, ще більш переважно - принаймні на 80 95, ще більш переважно - принаймні на 90 95, ще більш переважно - принаймні на 95 95 найбільш переважно -- на 100 95 у порівнянні із суб'єктами, не підданими лікуванню (імунізації), але згодом інфікованими конкретним РРУ та/або РКК5МУ.

В одному аспекті даного винаходу імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація (або окремі компоненти комплекту), як описується й заявляється авторами вводять однократно. Слід розуміти, що разову дозу вводять лише один раз.

Об'єм дози на суб'єкта залежить від способу вакцинації й віку суб'єкта. Переважно разова доза має загальний об'єм приблизно від 0,2 мл до 2,5 мл, більш переважно - приблизно від 0,2 мл до 2,0 мл, ще більш переважно - приблизно від 0,2 мл до 1,75 мл, ще більш переважно - приблизно від 0,2 мл до 1,5 мл, ще більш переважно - приблизно від 0,4 мл до 1,25 мл, ще більш переважно -- приблизно від 0,4 мл до 1,0 мл, причому найбільша перевага віддається разовій дозі 0,5 мл або 1,0 мл. Найбільш переважно разова доза має загальний об'єм 0,5 мл, 1 мл, 1,5 мл або 2 мл.

В одному аспекті даного винаходу імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію (або окремі компоненти комплекту), як описується й заявляється авторами, вводять двома або більше дозами.

Однак імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація може вводитися двома або більше дозами, причому першу дозу вводять перед введенням другої (бустерної) дози.

Переважно другу дозу вводять принаймні через 15 днів після першої дози. Більш переважно другу дозу вводять між 15 і 40 днями після першої дози. Ще більш переважно другу дозу вводять принаймні через 17 днів після першої дози. Ще більш переважно другу дозу вводять між 17 і 30 днями після першої дози. Ще більш переважно другу дозу вводять принаймні 19 днів після першої дози. Ще більш переважно другу дозу вводять між 19 і 25 днями після першої дози. Найбільш переважно другу дозу вводять принаймні через 21 день після першої дози. Ще більш переважно другу дозу вводять приблизно через 21 день після першої дози або через 21 день після першої дози. У кращому аспекті дворазового режиму введення й першу, і другу дози імуногенної композиції вводять в однаковій кількості. Переважно кожну дозу вводять у вказаній вище переважній кількості, причому найбільш переважною є доза 1 мл або 2 мл для першої й другої дози. Крім режиму першої й другої дози, альтернативний варіант здійснення включає додаткові наступні дози. Наприклад, у цих аспектах може вводитися третя, четверта або п'ята доза. Переважно наступні третю, четверту й п'яту дози в цьому режимі вводять у такій же кількості, що й першу дозу, з інтервалом часу між дозами, відповідним до часу між вищезгаданими першої й другий дозами. Вищезгадані режими введення переважно застосовують тільки до свинок. Свиноматкам переважно вводять тільки імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію у формі однократного введення.

В одному аспекті даного винаходу суб'єкт вибирають із групи, до якої належать свиня, велика рогата худоба, кішка й собака.

Переважно суб'єктом є свиня. Слід розуміти, що свиню розуміють як тварину як жіночої, так і чоловічої статі. Сперма може містити РРМ, тому самки й самці племінних тварин охоплюються визначенням "свиня". Таким чином, визначення "свиня" включає тварин чоловічої статі, таких, як кнури, а також тварин жіночої статі, таких, як свинки й свиноматки.

Термін "свинка" у контексті даного опису переважно стосується свині до й під час першої поросності / вагітності. На відміну від нього, термін "свиноматка" у контексті даного опису переважно стосується свині після першого опоросу - як позитивного результату її першої поросності / вагітності.

Об'єм дози на суб'єкта залежить від способу вакцинації й віку суб'єкта. Переважно загальний об'єм становить приблизно від 0,2 мл до 5 мл, більш переважно - приблизно від 0,5 мл до 3,0 мл, ще більш переважно - приблизно від 1,0 мл до 2,5 мл, ще більш переважно - приблизно від 1,0 мл до 2,0 мл. Найбільш кращий об'єм становить 1 мл, 1,5 мл, 2 мл або 2,5 мл на дозу.

Імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію (або окремі компоненти комплекту) переважно вводять місцево або системно. Підходящими традиційно застосовуваними шляхами введення є пероральне або парентеральне введення, таке, як інтраназальне, внутрішньовенне, внутрішньошкірне, черезшкірне, внутрішньом'язове, внутрішньоочеревинне, підшкірне, а також інгаляція. Однак, залежно від характеру й способу дії сполуки, імуногенна композиція також може вводитися іншими шляхами. Наприклад, до таких шляхів належать внутрішньошкірний, внутрішньовенний, внутрішньосудинний, внутрішньоартеріальний, внутрішньоочеревинний, інтратекальний, інтратрахеальний, внутрішньошкірний, інтракардіальний, внутрішньодольовий, внутрішньомозковий, внутрішньолегеневий, ректальний і вагінальний. Однак більш кращу імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію вводять підшкірно або внутрішньом'язово. Найбільш переважно імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію вводять внутрішньом'язове.

Авторами описуються наступні пункти: 1. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація, яка включає (а) принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРУ), причому принаймні один антиген РРМ є будь-яким антигеном, що міститься в РРМ, і (б) принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК), причому принаймні один антиген вірусу РКК5 є будь-яким антигеном, що міститься у вірусі

РАВ5. 2. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пунктом 1, яка відрізняється тим, що РРМ вибирають із групи, до якої належать: живий атенуйований / модифікований живий вірус РРУ, убитий / інактивований вірус РРМ (наприклад, Рогсіїї Рагуо), убитий / інактивований штам РРМУ 014, німецькі польові ізоляти свинячого парвовірусу РРУ-27а і

РРУ-143а і віруси вакцини свинячого парвовірусу РРУМ-МАОБІ -2 ії РРУ-ІОТ (М5М). 3. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 2, яка відрізняється тим, що принаймні один антиген РРМ являє собою одну або декілька субодиниць РРУ. 4. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 3, яка відрізняється тим, що принаймні одна субодиниця РРМУ являє собою вірусний білок 2 РРУ (МР). 5. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пунктом 4, яка відрізняється тим, що РРМ МРА є єдиним антигеном РРУ. 6. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 4 по 5, яка відрізняється тим, що РРМ МР2 має 1. в амінокислотній позиції 228 глутаміновокислотний залишок або глутаматний залишок, та/або 2. в амінокислотній позиції 414 сериновий залишок, та/або 3. в амінокислотній позиції 419 глутаміновий залишок, та/або 4. в амінокислотній позиції 436 треоніновий залишок, причому нумерація амінокислотних позицій стосується амінокислотної послідовності дикого типу РРМ МР2. 7. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пунктом б, яка відрізняється тим, що РРМ МР2 також має в амінокислотній позиції 25 ізолейциновий залишок, та/або в амінокислотній позиції 36 сериновий залишок, та/або в амінокислотній позиції 37 ізолейциновий залишок.

8. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з б по 7, яка відрізняється тим, що нумерація амінокислотних позицій стосується амінокислотної послідовності, показаної в ЗЕО ІЮО МО: 1. 9. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 4 по 8, яка відрізняється тим, що РРМ УР2 являє собою рекомбінантний РРМ МР. 10. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пунктом 9, яка відрізняється тим, що РРМ МР2 являє собою експресований рекомбінантним бакуловірусом РРУ

УРаг. 11. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 4 по 10, яка відрізняється тим, що РРМ МР2 включає або складається з амінокислотної послідовності, яка має принаймні 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІО МО: 1,

ЗЕО ІЮО МО: 2 та/або БЕО ІО МО: 5-16. 12. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пунктом 11, яка відрізняється тим, що РРМ МР2 включає або складається з амінокислотної послідовності, яка має принаймні 90 95, принаймні 91 95, принаймні 92 96, принаймні 93 95, принаймні 94 95, принаймні 9595, принаймні 9695, принаймні 97 956, принаймні 9895, принаймні 99 95, принаймні 99,1 об, принаймні 99,2 95, принаймні 99,3 95, принаймні 99,4 95, принаймні 99,5 95, принаймні 99,6 95, принаймні 99,7 95, принаймні 99,895, або принаймні 99,995 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО 1ЮО МО: 1, ЗЕО ІО МО: 2 та/або 5ЕО ІО МО: 5 - 16. 13. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пунктом 12, яка відрізняється тим, що РРМ МР2 включає або складається з амінокислотної послідовності зЗЕО ІЮ

МО: 1, ЗЕО ІО МО: 2 або 5ЕО ІЮО МО: 5 - 16 або включає або складається з будь-якого фрагмента, який має принаймні 210, принаймні 250 або принаймні 300 суміжних амінокислотних залишків з

ЗЕОІЮ МО: 1, ЗЕО ІЮО МО: 2 або ЗЕО ІЮ МО: 5 - 16. 14. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пунктом 13, яка відрізняється тим, що РРМ МР2 включає або складається з амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ

МО: 1, ЗЕО ІО МО: 2 або 5БЕО ІЮ МО: 5 - 16. 15. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 4 по 14, яка відрізняється тим, що РРМ МР2 кодується нуклеотидною послідовністю, що кодує амінокислотну послідовність, яка має принаймні 90 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 2 та/або 5ЕО ІЮО МО: 5 - 16. 16. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пунктом 15, яка відрізняється тим, що РРМ МР2 кодується нуклеотидною послідовністю, що кодує амінокислотну послідовність, яка має принаймні 9095, принаймні 91 95, принаймні 92 95, принаймні 93 95, принаймні 94 95, принаймні 95 95, принаймні 96 96, принаймні 97 95, принаймні 98 95, принаймні 99 у, принаймні 99,1 95, принаймні 99,2 95, принаймні 99,3 96, принаймні 99,4 95, принаймні 99,5 95, принаймні 99,695, принаймні 99,7 95, принаймні 99,8 95, або принаймні 99,9 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 1, ЗЕО ІО МО: 2 та/"або ЗЕО ІЮО МО: 5 - 16. 17. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пунктом 16, яка відрізняється тим, що РРМ МР2 кодується нуклеотидною послідовністю, що кодує амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 1, ЗЕО ІО МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 5 - 16. 18. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 16, яка відрізняється тим, що вірус РЕК5 вибирають із групи, до якої належать: вірус РЕНКН5 генотипу 1, вірус РКК5 генотипу 2, вірус РКК5 генотипу 1, що включає геном, який кодується нуклеотидною послідовністю, яка має принаймні 90 95, принаймні 91 95, принаймні 92 95, принаймні 93 95, принаймні 94 95, принаймні 9595, принаймні 96 95, принаймні 97 95, принаймні 98 95, принаймні 99 95, принаймні 99,1 95, принаймні 99,2 95, принаймні 99,3 95, принаймні 99,4 95, принаймні 99,5 95, принаймні 99,6 95, принаймні 99,7 956, принаймні 99,8 95, принаймні 99,9 95, або 100 95 ідентичності з нуклеїновокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 17 (послідовністю І еїузіай дикого типу), вірус РЕК5 генотипу 2, що включає геном, який кодується нуклеотидною послідовністю, яка має принаймні 9095, принаймні 91 95, принаймні 92 95, принаймні 93 95, принаймні 94 95, принаймні 95 95, принаймні 96 96, принаймні 97 95, принаймні 98 95, принаймні 99 у, принаймні 99,1 95, принаймні 99,2 95, принаймні 99,3 96, принаймні 99,4 95, принаймні 99,5 95, принаймні 99,6 95, принаймні 99,7 95, принаймні 99,8 95, принаймні 99,9 95 або 100 95 ідентичності з нуклеїновокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 18 (послідовністю МК2332 дикого типу). 19. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пунктом 18, яка відрізняється тим, що вірус РКК5 вибирають із групи, до якої належать: живий атенуйований / модифікований живий вірус РКК5, живий атенуйований / модифікований живий вірус РЕК5, генотип типу 1 (наприклад, Рогсіїв РКК5, Опізігаїп РКК5, Атегу/ас РКК5Б), живий атенуйований / модифікований живий вірус РККЗ5, генотип типу 2 (наприклад, Іпдемас?» РКК5 МІМ, Еовіега

РЕКЗ5), живий атенуйований / модифікований живий вірус РКК5 штам 94881 Кгенотип 1),

КергоСус? РЕК5 ЕІ, убитий / інактивований вірус РЕКЗ5, убитий / інактивований вірус РЕК,

генотип типу 1 (наприклад, Ргодгезвіз), убитий / інактивований вірус РКК, генотип типу 2, штам вірусу Геїувіай (С0ОІ-МІ-2.91, Іпвійшї Равіеиг, Париж, Франція, номер депонування 1-1102), субодиниця(ї) вірусу РКК5, або інші штами, такі, як депоновані під номерами доступу ЕСАСС 04102703, ЕСАСС 04102702, ЕСАСС 04102704, номером доступу СМСМ 1-1140, номером доступу

СМСМ 1-1387, номером доступу СМСМ І-1388, АТОС УА 2332, УА 2385, МА 2386, МА 2429, УВА 2474, і МК 2402; СМСМ 1-1102, СМОМ 1-1140, СМОМ 1І-1387, СМОМ І-1388, або ЕСАСС У93070108, північноамериканський вірус РКК5 ртТ7РІ29А (номер доступу АТСС 203488), під номером депонування АТС МК-2332, АТОС УВ-2368; АТОС МА-2495; АТОС УА 2385, АТСС УВА 2386, АТОС

УК 2429, АТСС МУК 2474, і АТСС МУК 2402. 20. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 19, яка відрізняється тим, що принаймні один антиген РРМ являє собою одну або декілька субодиниць РРУ, у якій переважно принаймні один антиген РРУ являє собою вірусний білок 2 РРМ (МР2), більш переважно - РРМ МУР є єдиним антигеном РРУ, і принаймні один антиген вірусу РЕК5 являє собою живий атенуйований / модифікований живий вірус РКК5, переважно живий атенуйований / модифікований живий вірус РКК5, генотип типу 1 (наприклад, Рогсіїз РАБ,

Опівзігап РЕК5, Атегуас РЕК5), більш переважно живий атенуйований / модифікований живий вірус РЕК5, штам 94881 І(генотип 1), БРергоСус? РЕНЗ ЕЦІ і живий атенуйований / модифікований живий вірус РЕК, генотип типу 2 (наприклад, Іпдемасе РАВН5 МІ М, Ровієга РАНФ5). 21. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 20, яка відрізняється тим, що імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію рецептують для введення у формі разової дози або двома дозами. 22. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 21, яка відрізняється тим, що імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію вводять внутрішньом'язово. 23. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 22, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація є безпечною для свинок та/або свиноматок під час вагітності й лактації. 24. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пунктом 23, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація є безпечною для свинок та/або свиноматок після 30 днів вагітності, переважно після 40 днів вагітності. 25. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 24, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація також включає принаймні один фармацевтично прийнятний носій. 26. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пунктом 25, яка відрізняється тим, що принаймні один фармацевтично прийнятний носій є карбомером. 27. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 4 по 26, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація включає від 0,1 мкг до 50 мкг антигену РРУ УР2, переважно від 0,5 мкг до 10 мкг антигену РРМ МР2, більш переважно -- від 1,0 мкг до 10 мкг антигену РРМ МР, та/або від 3,9 до 7,0 Ісд'оТСіІЮзо вірусу

РАВ5. 28. Імуногенна композиція або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 27, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінація є вакциною. 29. Іімуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 28, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація захищає від гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження вірусом РРУ та/або гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження вірусом РАН5. 30. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 29, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація захищає від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами

РРМ та/або від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами вірусу РЕК5. 31. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 30, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація забезпечує перехресний захист від північноамериканських та/або європейських ізолятів РРМУ та/або забезпечує перехресний захист від північноамериканських та/або європейських ізолятів вірусу

РАВ5. 32. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 31, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація ефективна для лікування та/або профілактики клінічних ознак, які викликаються інфекцією вірусу

РРМ та/або РКК: у суб'єкта, який цього потребує. 33. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 31, яка відрізняється тим, що принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРУ) і принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК5) містяться разом в одному контейнері або відділені один від одного простором, переважно містяться у двох або більше окремих контейнерах. 34. Комплект, що включає імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію за будь-яким з пунктів з 1 по 33. 35. Комплект за пунктом 34, який відрізняється тим, що принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРМ) і принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РЕК) містяться окремо один від одного у двох або більше окремих контейнерах, переважно незалежно один від одного в ліофілізованій або замороженій формі, і комплект також включає інструкцію з посібником зі змішування розділених простором принаймні одного антигену

РРМ їі принаймні одного антигену вірусу РКК5, причому така інструкція з керівництвом переважно містить вказівки з комбінування вмісту контейнерай(ів), що містить(ять) принаймні один антиген РРМ, із вмістом контейнера(ів), що містить(ять) принаймні один антиген вірусу РРК5, причому більш переважно рідкий вміст контейнера(ів), що містить(ять) принаймні один антиген РРМУ, використовують як розріджувач для ліофілізованого вмісту контейнера(ів), що містить(ять) принаймні один антиген вірусу РРЕ5. 36. Комплект за будь-яким з пунктів з 34 по 35, який відрізняється тим, що комплект також включає вказівки з лікування та/"або профілактики захворювань у свиней та/(або також включає вказівки з лікування та/або профілактики інфекцій вірусу РРМ та/або вірусу РКК5, причому такий комплект переважно також включає вказівки із асоційованого застосуванню компонента РРМ і компонента РКК5М імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації за будь-яким із пп. з 1 по 33. 37. Застосування імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації за будь-яким з пунктів з 1 по 33 або комплекту за будь-яким з пунктів з 34 по 36 для приготування медикаменту, переважно вакцини. 38. Застосування за пунктом 37 для приготування медикаменту для лікування та/або профілактики інфекції вірусу РРМ та/або вірусу РКК5, зниження, профілактики або лікування клінічних ознак, викликаних інфекцією РРМ та/або вірусом РКК5, або для лікування та/або профілактики захворювання, викликаного інфікуванням РРМУ та/або вірусом РЕК5Б. 39. Спосіб імунізації суб'єкта, що включає введення такому суб'єктові імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації за будь-яким з пунктів з 1 по 33. 40. Спосіб лікування та/або запобігання клінічних ознак, які викликаються інфекцією вірусу РРМ та/або РКК5, переважно свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому, переважно у свиней, у суб'єкта, який цього потребує, причому спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації за будь-яким з пунктів з 1 по 33. 41. Спосіб зниження репродуктивної недостатності в суб'єкта в порівнянні із суб'єктом неімунізованої контрольної групи того ж виду, причому спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації за будь-яким з пунктів з 1 по 33. 42. Спосіб зниження смертності ембріона й плода в суб'єкта в порівнянні із суб'єктом неімунізованої контрольної групи того ж виду, причому спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації за будь-яким з пунктів з 1 по 33. 43. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 42, який відрізняється тим, що вищезгаданий суб'єкт вибирають із групи, до якої належать свині, велика рогата худоба, кішки або собаки, переважно свиня, більш переважно свиноматка та/або свинка. 44. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 43, який відрізняється тим, що імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію вводять однієї або двома або більше дозами. 45. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 44, який відрізняється тим, що імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію вводять внутрішньом'язово. 46. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 45, який відрізняється тим, що імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію вводять свинкам та/або свиноматкам, переважно свиноматкам принаймні З-тижневого віку, більш переважно свиноматкам перед вагітністю, ще більш переважно -- свиноматкам під час вагітності й лактації. 47. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 46, який відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація є безпечною для свинок та/або свиноматок під час вагітності й лактації. 48. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 47, який відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація є безпечною для свиноматок та/або свинок після 30 днів вагітності, переважно після 40 днів вагітності. 49. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 48, який відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація включає від 0,1 мкг до 50 мкг антигену РРМ МР2, переважно від 0,5 мкг до 10 мкг антигену РРМ МР2, більш переважно - від 1,0 мкг до 10 мкг антигену РРМ МР, та/або від 3,9 до 7,0 Ісд1оТСІЮзо вірусу РКК.

50. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 49, який відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація захищає від гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження вірусом РРМ та/або гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження вірусом РКЕК5.

51. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 50, який відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація захищає від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами РРУ та/або від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами вірусу РКК5.

52. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 51, який відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація забезпечує перехресний захист від північноамериканських та/або європейських ізолятів РРУ та/або забезпечує перехресний захист від північноамериканських та/або європейських ізолятів вірусу РКК5.

53. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 52, який відрізняється тим, що в результаті виконання вищезгаданого способу забезпечується поліпшення принаймні одного параметра ефективності вибраного із групи, до якої належать: знижена перехідна лейкопенія й репродуктивна недостатність, що характеризуються інфікуванням і загибеллю ембріона та/або плода, або їх комбінації, у порівнянні із суб'єктом неімунізованої контрольної групи того ж виду.

54. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 53, який відрізняється тим, що принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРМ) і принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК) вводять суб'єктові одночасно, переважно окремо одночасно в одному або різних місцях введення, послідовно (у будь-якому порядку), та/або з регулюванням за часом.

55. Спосіб за будь-яким з пунктів з 39 по 54 для активної імунізації племінних свиней (свиноматок і свинок) для захисту ембріонів і плодів від інфекції свинячого парвовірусу, що включає введення таким свиням (свиноматкам і свинкам) імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації за будь-яким із пп. з 1 по 33.

56. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування згідно зі способом імунізації суб'єкта, що включає введення вищезгаданої імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації такому суб'єктові.

57. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування згідно зі способом лікування та/або запобігання клінічних ознак, які викликаються інфекцією вірусу РРМ та/або РКК5, переважно свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому, переважно у свиней, у суб'єкта, який цього потребує, причому спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості вищезгаданої імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації.

58. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування згідно зі способом зниження репродуктивної недостатності в суб'єкта в порівнянні із суб'єктом неімунізованої контрольної групи того ж виду, причому спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості вищезгаданої імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації.

59. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування згідно зі способом зниження смертності ембріона й плода в суб'єкта в порівнянні із суб'єктом неімунізованої контрольної групи того ж виду, причому спосіб включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості вищезгаданої імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації.

60. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування за будь-яким з пунктів з 56 по 59, яка відрізняється тим, що вищезгаданий суб'єкт вибирають із групи, до якої належать свині, велика рогата худоба, кішки або собаки, переважно свиня, більш переважно свиноматка та/або свинка.

61. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування за будь-яким з пунктів з 56 по 60, яка відрізняється тим, що імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію вводять однократно або двома або більше дозами.

62. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування за будь-яким з пунктів з 56 по 61, яка відрізняється тим, що імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію вводять внутрішньом'язово.

63. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування за будь-яким з пунктів з 56 по 62, яка відрізняється тим, що імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію вводять свинкам та/або свиноматкам, переважно свиноматкам принаймні З-тижневого віку, більш переважно - свиноматкам перед вагітністю, ще більш переважно - свиноматкам під час вагітності й лактації.

64. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по

33 для застосування за будь-яким з пунктів з 56 по 63, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація є безпечною для свинок та/або свиноматок під час вагітності й лактації. 65. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування за будь-яким з пунктів з 56 по 64, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація є безпечною для свинок та/або свиноматок після 30 днів вагітності, переважно після 40 днів вагітності. 66. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування за будь-яким з пунктів з 56 по 65, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація включає від 0,1 мкг до 50 мкг антигену РРМ

МР2, переважно від 0,5 мкг до 10 мкг антигену РРМ МР2, більш переважно -- від 1,0 мкг до 10 мкг антигену РРМ МР, та/або від 3,9 до 7,0 Ісд1оТСІЮзо вірусу РКК. 67. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування за будь-яким з пунктів з 56 по 66, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація захищає від гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження вірусом РРМ та/або захищає від гомологічного та/або гетерологічного провокаційного зараження вірусом РКЕК5. 68. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування за будь-яким з пунктів з 56 по 67, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація захищає від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами РРМУ та/або захищає від провокаційного зараження північноамериканськими та/або європейськими ізолятами вірусу РКК. 69. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування за будь-яким з пунктів з 56 по 68, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація забезпечує перехресний захист від північноамериканських та/або європейських ізолятів РРМ та/або забезпечує перехресний захист від північноамериканських та/або європейських ізолятів вірусу РКЕК5. 70. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування за будь-яким з пунктів з 56 по 69, яка відрізняється тим, що в результаті виконання вищезгаданого способу забезпечується поліпшення принаймні одного параметра ефективності вибраного із групи, до якої належать: перехідна лейкопенія й репродуктивна недостатність, що характеризуються інфікуванням і загибеллю ембріона та/або плода, або їх комбінації, у порівнянні із суб'єктом неіїмунізованої контрольної групи того ж виду. 71. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування за будь-яким з пунктів з 56 по 70, яка відрізняється тим, що принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРУ) і принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК) вводять суб'єктові одночасно, переважно окремо одночасно в одному або різних місцях введення, послідовно (у будь-якому порядку), та/або з регулюванням за часом. 72. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пунктів з 1 по 33 для застосування згідно зі способом активної імунізації племінних свиней (свиноматок і свинок) для захисту ембріонів і плодів від інфекції свинячого парвовірусу, який включає введення вищезгаданої імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації такими свиням (свиноматкам і свинкам).

Другий розгляд даного винаходу

В одному аспекті даний винахід стосується способу одержання імуногенної композиції, що включає рекомбінантний білок, причому спосіб включає етапи в наступному порядку: (І) забезпечення / одержання суміші, що включає першу рідину, рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, і вектор, що включає нуклеїновокислотну послідовність, що кодує вищезгаданий рекомбінантний білок; (І) додавання другої рідини до суміші з етапу (ї), причому друга рідина відрізняється від першої рідини; (ІП) промивання й, необов'язково, остаточне концентрування рекомбінантного білка та/або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків у суміші шляхом додаткового додавання другої рідини до суміші, отриманої в результаті виконання етапу (І), і видалення частини першої та/або другої рідини з такої комбінованої суміші; (ІМ) інактивацію вектора шляхом додавання інактивуючого агента до суміші, отриманої в результаті виконання етапу (ПІ); (у) нейтралізацію інактивуючого агента шляхом додавання нейтралізуючого агента до суміші, отриманої в результаті виконання етапу (ІМ).

З погляду даного винаходу "перша рідина" стосується рідких, водних або текучих середовищ, як правило, використовуваних у комбінації із клітинами, антигенами, імуногенними композиціями, вакцинами й т.п. Переважно перша рідина включає середовища з антигенної композиції; більш переважно перша рідина включає або переважно складається із середовищ для культивування клітин, застосовуваних для одержання рекомбінантних білків у культивованих клітинах-хазяїтнах.

Вищезгадані культивовані клітини-хазяї можуть бути бактеріями, дріжджами, клітинами комах, клітинами тварин і клітинами ссавців, причому особливо кращими є клітини комах і ссавців. Таким чином, перша рідина може включати або складатися із середовищ для культивування бактерій, дріжджів, клітини комах, клітин тварин або клітин ссавців. Переважно середовище для клітин являє собою безсироваткове середовище для клітин, найбільш переважно культуральним середовищем є безсироваткове середовище Ехсеї! 420 при використанні клітин комах. "Друга рідина" відповідно до даного винаходу означає будь-яку рідину, звичайно використовувану в комбінації із клітинами, антигеном, імуногенними композиціями, вакцинами й т.п., яка відрізняється від першої рідини. Переважно друга рідина являє собою водяний розчин, ще більш переважно - фармацевтично прийнятний розчин, ще більш переважно - буфер, такий, як сольовий розчин або фосфатний буфер і т.п. Найбільш переважно друга рідина характеризується відсутністю віроцидності для будь-якого живого вірусу або живих бактерій, при культивуванні або зберіганні живого вірусу або живих бактерій у такій рідині. "Частина" з погляду даного винаходу означає будь-яка кількість, яка не включає вся кількість.

Наприклад, частина рідини у всякому разі повинна становити менше, ніж 100 95 об'єму цієї рідини, наприклад, 90 95 рідини, 80 95 рідини, 70 95 рідини, і будь-яка кількість, більше, ніж 0 95, і менше, ніж 100 Фо. "Рекомбінантний білок" з погляду даного винаходу означає будь-який рекомбінантний білок, переважно білок РРМ МУР2, більш переважно -, що включає або складається з послідовності, яка має принаймні 70 95, принаймні 75 95, принаймні 80 95, принаймні 85 95, принаймні 90 95, принаймні 91 95, принаймні 92 95, принаймні 9395, принаймні 94 95, принаймні 9595, принаймні 96 95, принаймні 97 95, принаймні 98 95, принаймні 99 95, принаймні 99,1 95, принаймні 99,2 95, принаймні 99,3 96, принаймні 99,4 956, принаймні 99,5 95, принаймні 99,6 95, принаймні 99,7 95, принаймні 99,8 95, принаймні 99,9 95, або 100 95 ідентичності з послідовністю 5ЕО І МО: 1, 5ЕО ІЮ МО: 2 та/або ЗЕО ІЮ МО5 5 - 16. "Четвертинні структури" а також "четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків" з погляду даного винаходу означають тривимірне розташування безлічі вищезгаданих рекомбінантних білків, таких, як вірусоподібні частинки та/або гомотримери. "Вектор", а також "вектор, що включає нуклеїновокислотну послідовність, що кодує вищезгаданий рекомбінантний білок" з погляду даного винаходу означає підходящий вектор експресії переважно вектор експресії бакуловірусу, який, у свою чергу, використовують для трансфекції або, у випадку вектора експресії бакуловірусу, для інфікування клітини-хазяїна для одержання білка або поліпептиду, що кодується ДНК.

Вектори й способи одержання та/або застосування векторів (або рекомбінантів) для експресії можуть бути ідентичними або аналогічними до способів, що розкриваються в: патентах США МоМо 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235, 382,425, публікаціях РСТ УМО 94/16716, УМО 96/39491, УМО 95/30018; Раосіейі, "Арріісайопв ої рох міги5 месіог5 юю массіпаййоп: Ап ирдаїє, "РМА5 ОА 93: 11349- 11353, Осіорег 1996; Моз5, "СепеїісаПйу епдіпеегей рохмігизе5 ог гтесотбріпапі депе ехргезвзіоп, массіпайоп, апа заїейМу, " РМАБ ОА 93: 11341-11348, Осіобег 1996; публікації тій еї аї., Патенті

США Мо 4,745,051 (рекомбінантний бакуловірус); Кіспагазоп, С. О. (Еайог), Меїпод» іп МоіІесшаг

Віоіоду 39, "Васшоміги5 Ехргеввіоп Ргоїосоїв" (1995 Нитапа Ргезз Іпс.); зтйй еї аї., "Ргодисійоп ої

Нитап Веїа Іпіепегоп іп Іпзесі СеїЇв5 Іптесіед м/йй а Васиіомігиз Ехргеззіоп Месіог", МоіІесшаг апа

СеїІшаг Віоіоду, Оесетрбрег, 1983, Мої. 3, Мо. 12, р. 2156-2165; РеппоскК еї аї., "Зігопд і Кедшаїейд

Ехргезвіоп ої ЕзеНегісніа соїї В-Саїіасіовзідазе іп Іптесі Се м/йй а Васиїоміги5 месіог, "МоІесшаг апа

СеПаг Віоіоду Магсі 1984, Мої. 4, Мо. З, р. 406; ЕРАО 370 573; заявці США Мо 920,197, поданої 16 жовтня 1986 р.; Патентної публікації ЕР Мо 265785; Патенті США Мо 4,769,331 (рекомбінантний герпесвірус); Коії2тап, "Пе їшпсійоп ої Пегрез зітрієех міги5 депев: А ргітег їог депеїйїс епдіпеегіпуд ої поме! месіої5, " РМАБ БА 93: 11307-11312, Осіорег 1996; Апагеап5Ку еї аї!., "Пе арріїсайоп ої депеїїсаїу епдіпеегейд Пегрез зітріех мігизев5 0 Пе ігеаїтепі ої ехрегітепіа! Ббгаїп їштогв, " РМА5

БА 93: 11313-11318, Осіорег 1996; Нобенізоп еї аї., "Ерзівїп-Ваїт міги5 месіогз їог депе аеїїмегу ю В

Іутрпосуїе", РМАБ ОБА 93: 11334-11340, Осіорег 1996; ЕгоїЇом еї аї., "АІрнамігиз-базей ехргеззіоп месіогв: 5ігагедієз апа арріїсанйоп5, " РМАБ ОБА 93: 11371-11377, Осіорег 1996; Кіїзоп еї аї., У. Мікої. 65, 3068-3075, 1991; патентах США МоМо 5,591,439, 5,552,143; МО 98/00166; акцептованих заявках

США, сер. МоМо 08/675,556 і 08/675,566, обидві з яких були подано З липня 1996 р. (рекомбінантний аденовірус); публікації Сгипнаиз еї аї., 1992, "Адепомігив аз сіопіпуд месіог5, " Зетіпаг5 іп Мігоїоду (Мої. 3) р. 237-52, 1993; Ваїау еї аї. ЕМВО доитгпаї, мої. 4, р. 3861-65, Станат, Тіріесні 8, 85-87, Аргі,

1990; Ргемес еї аї., У. Сеп Мігої. 70, 42434; РОСТ МО 91/11525; РеІдпег еї а. (1994), У. Віої. Спет. 269, 2550-2561, Осіепсе, 259: 1745-49, 1993; ії МеСіетепів еї аї., "Іттипігайоп уп ОМА массіпе5 епсодіпод діусоргоївіп О ог аіусоргоївіп В, аіопе ог іп сотбіпаїййоп, іпдисе5 ргоїесіїме іттипйу іп апітаї тоде!5 ої Негрез 5ітріех мігив-2 аізеазе", РМАБ ОА 93: 11414-11420, Осіорег 1996; і патентах США

МоМо 5,591,639, 5,589,466, і 5,580,859, а також УМО 90/11092, УУМО93/19183, УУО94/21797,

М/095/11307, УМО95/20660; публікаціях Тапо еї аї., Маїиге, і Голій еї аї., Апауйса! Віоспетівігу, що стосуються векторів, які експресують ДНК, і ін. Див. також публікації УМО 98/33510; ди еї аї., ріареюіодіа, 41: 736-739, 1998 (лентивірусна експресуюча система); Запіога еї аІ., Патент США Мо 4,945,050; Різспраснеї аї. (Іпігасеї!); УМО 90/01543; Нобіпзоп еї а!., Зетіпагзв іп Іттипоіоду мої. 9, рр. 271-283 (1997), (системи ДНК-векторів); 520оКа еї аІ., Патент США Мо 4,394,448 (спосіб вставки ДНК у живі клітини); МеСогтіск еї аІ., Патент США Мо 5,677,178 (застосування цитопатичних вірусів); і

Патент США Мо 5,928,913 (вектори для доставки генів); а також інших згаданих авторами документах.

Кращими клітинами є сприйнятливі до інфікування відповідним рекомбінантним вірусним вектором, які містять ДНК рекомбінантного білка й експресують рекомбінантний білок. Переважно клітини є клітини комах, більш переважно до них належать клітини комах, які продаються під торговельної маркою 5Е-- (Ргоївіп Зсіепсез5 Согрогайоп, Мегідеп, СТ). Переважно клітинні культури мають число клітин приблизно 0,3 - 2,0 х 106 клітин/мл, більш переважно - приблизно 0,35 - 1,9 х 105 клітин/мл, ще більш переважно - приблизно 0,4 - 1,8 х 105 клітин/мл, ще більш переважно -- приблизно 0,45 - 1,7 х 105 клітин/мл, і найбільш переважно - приблизно 0,5 - 1,5 х 109 клітин/мл.

Кращі вірусні вектори включають бакуловірус, наприклад, ВасцосСоїй (ВО Віозсіепсе5

РІпаптіпдеп, Зап Оіедо, СА), зокрема, за умови, що продукуючі клітини є клітинами комах. Хоча перевага віддається бакуловірусній системі експресії, фахівцям у даній галузі стане зрозуміло, що інші системи експресії, включаючи вищеописані, також можуть застосовуватися відповідно до цілями даного винаходу, тобто, для експресії рекомбінантного білка.

Відповідні середовища для росту також можуть визначатися фахівцями в даній галузі, причому кращими середовищами для росту є безсироваткові середовища для клітин комах, такі, як ЕхсеїЇ 420 КН Віозсіепсезв, Іпс., І епеха, КБ) і т.п.

Рекомбінантний вірусний вектор, що містить послідовності ДНК рекомбінантного білка, переважно має множинність зараження (МОЇ) приблизно 0,03 - 1,5, більш переважно - приблизно 0,05 - 1,3, ще більш переважно - приблизно 0,09 -- 1.1, і найбільш переважно - приблизно 0,1 - 1,0, при використанні для інфікування сприйнятливих клітин. Переважно вищезгадані показники МОЇ стосуються 1 мл рідини для культивування клітин. Переважно описуваний авторами спосіб включає інфекцію 0,35 - 1,9 х 105 клітин/мл, ще більш переважно - приблизно 0,4 - 1,8 х 105 клітин/мл, ще більш переважно - приблизно 0,45 - 1,7 х 106 клітин/мл, і найбільш переважно - приблизно 0,5 - 1,5 х 105 клітин/мл, рекомбінантним вірусним вектором, що містить ДНК рекомбінантного білка й експресує рекомбінантний білок, що має МОЇ (множинність зараження) приблизно 0,03 - 1,5, більш переважно - приблизно 0,05 - 1,3, ще більш переважно - приблизно 0,09 - 1,1, і найбільш переважно - приблизно 0,1 - 1,0.

Частина першої рідини може бути вилучена з комбінованої суміші з етапу (І), що містить рекомбінантний білок, на етапі фільтрації із застосуванням фільтра. Однак може застосовуватися будь-який інший спосіб, відомий фахівцям у даній галузі, для видалення частини будь-якої рідини, включаючи першу й, у відповідних випадках, частина другої рідини, з комбінованої суміші з етапу (ПП). Такий спосіб, наприклад, включає, крім іншого, центрифугування та/або хроматографію. Однак фільтрація є найбільш кращою. Кращий спосіб фільтрації для видалення вищезгаданої частини першої рідини або будь-якої іншої рідини, у відповідних випадках, включає ультра- та/або діафільтрацію. Ультра- і діафільтрація є стандартними способами, відомими фахівцям у даній галузі, докладно описуваними, наприклад, у публікації Ргоївіп Ригійсайоп Меїпоа5-А Р"гасіїіса

Арргоасі - едітоге: Е.С.М. Нагтіз апа 5. Апдеї, ОхТога Опімегейу Ргез5 1995 (зміст і ідеї якої включені в даний опис шляхом посилання). Зокрема, у Главі З цього посібника описується декілька способів і типів устаткування, які можуть застосовуватися фахівцями в даній галузі, у якості прикладів застосування відповідно до даного винаходу. "Інактивуючий агент" з погляду даного винаходу стосується будь-якого агента, який може застосовуватися відповідно будь-якому традиційному способу інактивації. Інактивація може виконуватися із застосуванням способів хімічної та/"або фізичної обробки, які відомі фахівцям у даній галузі. Переважні способи інактивації включають додавання циклізованого бінарного етиленаміну (ВЕЇ), що включає додавання розчину 2-бромоетиленамінгідроброміду (ВЕА), який був циклізований до бінарного етиленаміну (ВЕЇ). Кращі додаткові засоби хімічної інактивації включають, крім інших, Тійоп Х-100, дезоксихолат натрію, бромід цетилтриметиламонію, рД- пропіолактон, тимеросал, фенол і формальдегід (формалін). "Нейтралізуючий агент" з погляду даного винаходу означає будь-який агент, здатний нейтралізувати описувані авторами інактивуючі агенти, таким чином, щоб інактивуючий агент втрачав здатність до інактивації вектора. Агентом, що нейтралізують інактивуючий агент,

переважно є тіосульфат натрію, бісульфат натрію й т.п.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, причому суміші з етапу (ї) одержують із застосуванням процедури, що включає етапи (а) інфікування сприйнятливих клітин у культурі вектором, що включає нуклеїновокислотну послідовність, що кодує вищезгаданий рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, причому вищезгаданий рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, експресуються вищезгаданим вектором, (б) наступного відновлення рекомбінантного білка та/або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, із клітинної культури, причому клітинний дебрис переважно відокремлюють від рекомбінантного білка та/або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків через етап відділення, що переважно включає мікрофільтрацію через принаймні один фільтр, більш переважно два фільтри, причому принаймні один фільтр переважно має розмір пор, більший, ніж рекомбінантний білок та/(або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, зокрема, має розмір пор від приблизно 0,1 мкм до приблизно 4 мкм.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким клітинну культура на етапі (а) підтримують при 27:52 "С, переважно під час експресії рекомбінантного білка та/або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, вищезгаданим вектором, та/або витяг на етапі (б) відбувається через 6-8 днів, переважно 8 днів після інокуляції клітин вектором.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, у якому етап відділення включає або складається з: мікрофільтрації через принаймні один фільтр, що має розмір пор приблизно 2 мкм до приблизно 4 мкм, та/або мікрофільтрації через принаймні один фільтр, що має розмір пор приблизно 0,1 мкм до приблизно 0,8 мкм.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким вищезгадана перша рідина включає частину середовища для культивування клітин або складається із середовища для культивування клітин, і середовище для культивування клітин переважно є середовищем для культивування клітин комах.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким вищезгаданий рекомбінантний білок вибирають із групи, до якої належать: білок РРМ МР2, що переважно включає або складається з послідовності, яка має принаймні 7095, принаймні 7595, принаймні 8095, принаймні 8595, принаймні 90 95, принаймні 91 95, принаймні 92 95, принаймні 93 95, принаймні 94 95, принаймні 95 95, принаймні 96 95, принаймні 97 У6, принаймні 98 95, принаймні 99 95, принаймні 99,1 95, принаймні 99,2 96, принаймні 99,3 95, принаймні 99,4 95, принаймні 99,5 95, принаймні 99,6 95, принаймні 99,7 95, принаймні 99,8 95, принаймні 99,9 95, або 100 95 ідентичності з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 2 та/або 5ЕО

ІО МОБ: 5 - 16.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким вищезгадані четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків є вірусоподібними частинками, або вищезгадані четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, є гомотримерами.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким вектор є рекомбінантним вірусом, переважно бакуловірусом, та/або нуклеїновокислотна послідовність є послідовністю ДНК.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким вектор, що включає нуклеїнову кислоту, Що кодує вищезгаданий рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, є рекомбінантним бакуловірусом, причому вищезгаданий бакуловірус включає послідовність ДНК, що кодує вищезгаданий рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким на етапі (Ії) вищезгаданий рекомбінантний білок та/"або вищезгадані четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, промивають, використовуючи принаймні 2х, переважно від 2х до Зх, другої рідини й необов'язково доводять до кінцевої концентрації в порівнянні з первинним об'ємом вищезгаданого рекомбінантного білка та/або вищезгаданих четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків у суміші з етапу (). Більш переважно на етапі (І) такий(ї) етап(и) промивання, тобто, процес діафільтрації виконують при температурі нижче 37 "С., більш переважно при температурі нижче 30 "С, ще більш переважно - при температурі нижче 20 "С, ще більш переважно - при температурі нижче 10 "С, наприклад, при температурі від 4 "С до 29 с,

наприклад, 27 "С або 4 "С. Таким чином, ступінь осадження (агрегації) значно знижується.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким на етапі (І) частину першої та/або другої рідини видаляють із суміші шляхом фільтрації причому переважно застосовують фільтр або порожній фільтр, що включає напівпроникну мембрану, що має середній розмір пор, менший, ніж вищезгаданий рекомбінантний білок та/або вищезгадані четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, талабо що перешкоджають проходженню більшості, переважно практично усіх білків розміром від 20 кДа до 500 кДа, крізь напівпроникну мембрану.

Фільтр може бути будь-яким традиційним фільтром, застосовуваним у даній галузі. Переважно вищезгаданий фільтр включає напівпроникну мембрану. В іншій кращій формі вищезгадана напівпроникна мембрана має середній розмір пор, менший, ніж рекомбінантний білок, що перешкоджає проходженню принаймні 9095 вищезгаданого рекомбінантного білка крізь пори вищезгаданої напівпроникної мембрани й дозволяє втримувати рекомбінантний білок за допомогою фільтра.

У ще одному аспекті вищезгаданий фільтр має середній розмір пор, що перешкоджає проходженню принаймні 9095 білків розміром від 20 кДа до 500 кДа, більш переважно вищезгаданий фільтр має середній розмір пор, що перешкоджає проходженню принаймні 90 95 білків розміром від 50 кДа до 400 кДа, і найбільш переважно вищезгаданий фільтр має середній розмір пор, що перешкоджає проходженню принаймні 90 95 білків розміром від 75 кДа до 300 кДа.

Цей розмір пор кращий, коли рекомбінантний білок проводиться як цільний вірус або вірусоподібні частинки. У ще одному аспекті вищезгадана напівпроникна мембрана включає матеріал, вибраний із групи, до якої належать полісульфон, поліефірсульфон і регенерована целюлоза. Однак може застосовуватися й будь-який інший матеріал, що дозволяє видаляти частину першої рідини й, у випадку багатоетапного процесу, видаляти суміш першої й другої рідини з рекомбінантного білка.

Вищезгаданий фільтр може бути вибраний із групи, до якої належать картридж для ультрафільтрації з половолоконною мембраною, плоскі листи або касета, причому особливо кращий картридж для ультрафільтрації з половолоконною мембраною.

Переважно другою рідиною, використовуваною згідно з будь-яким з описаних способів, є буфер, переважно фізіологічно прийнятний буфер, причому особливо кращий сольовий розчин.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким друга рідина є буферним розчином, переважно промивним фосфатно-буферним сольовим розчином (М/РВ5).

Етап концентрування й етап додавання рідини згідно зі способом, як описується авторами, виконують по суті одночасно або, в альтернативному варіанту, етап концентрування й етап додавання рідини виконують послідовно.

Якщо етап концентрування й етап додавання рідини виконують послідовно, порядок етапів не має значення. Наприклад, у ще одному аспекті етап додавання рідини виконують перед вищезгаданим етапом концентрування, а в альтернативному аспекті етап концентрування виконують перед вищезгаданим етапом додавання рідини. Етап додавання рідини й етап концентрування, незалежно від порядку, у якому їх виконують, можуть виконуватися багаторазово.

Наприклад, кожний із цих відповідних етапів може виконуватися принаймні два, принаймні три, принаймні чотири, принаймні п'ять, принаймні 10, і стільки раз, скільки необхідно. В одному аспекті етап концентрування й етап додавання рідини виконують принаймні двічі. В іншому аспекті й етап концентрування, і етап додавання рідини виконують принаймні тричі.

Етап концентрування згідно пропонованим авторами способам виконують таким чином, щоб рекомбінантний білок концентрувався від ЗХ до 50Х у порівнянні з об'ємом вищезгаданої першої рідини. Більш переважно вищезгаданий етап концентрування виконують таким чином, щоб рекомбінантний білок концентрувався від 4Х до 20Х у порівнянні з об'ємом вищезгаданої першої рідини. Найбільш переважно вищезгаданий етап концентрування виконують таким чином, щоб рекомбінантний білок концентрувався від 7Х до 10Х у порівнянні з об'ємом першої рідини.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким об'єм другої рідини, що додається на етапі (Ії), приблизно дорівнює об'єму першої та/або другої рідини, що віддаляється на етапі (І). Інакше кажучи, етап концентрування не виконується та/або не потрібно.

У випадку, якщо вірусні вектори, такі, як рекомбінантний поксвірус, аденовірус або бакуловірус, застосовують для одержання рекомбінантного білка, рекомендується інактивувати вірусну нуклеїнову кислоту шляхом відповідної інактиваційної обробки. Така інактивація може проводитися в будь-який час під час очищення рекомбінантного білка. Таким чином, інактивація може проводитися відразу після збору рідини із клітинною культурою, що містить рекомбінантний білок, або після мікрофільтрації рекомбінантного білка, якщо проводиться мікрофільтрація, до або після етапу очищення, наприклад, до або після гель-фільтрації й до або після аніонообмінної хроматографії, якщо вона проводиться.

Таким чином, інактивація може виконуватися шляхом хімічної та/або фізичної обробки. У кращих формах визначають обсяг зібраних рідин і температуру доводять до приблизно 32 С - 42 б, більш переважно - приблизно 34 "С - 40 "С, і найбільш переважно - приблизно 35 С - 39 76.

Переважні способи інактивації включають додавання циклізованого бінарного етиленаміну (ВЕЇ), переважно в концентрації від приблизно 1 мМ до приблизно 20 мМ, переважно від приблизно 2 мМ до приблизно 10 мМ, ще більш переважно - від приблизно 2 мМ до приблизно 8 мМ, ще більш переважно - від приблизно З мМ до приблизно 7 мМ, найбільш переважно - від приблизно 5 мМ.

Наприклад, інактивація включає додавання розчину 2-бромоєетиленамінгідроброміду (ВЕА), переважно приблизно 0,4 М, який був циклізований до 0,2 М бінарного етиленаміну (ВЕЇ) в 0,3 М

Маон, до рідин для досягнення кінцевої концентрації приблизно 5 мМ ВЕЇ. Переважно рідини потім безупинно перемішують протягом 2 - 96 годин і інактивовані зібрані рідини зберігають замороженими при температурі - 40 "С або нижче або приблизно 1 "С - 7 "С. Після завершення інактивації додають розчин тіосульфату натрію, переважно при 1,0М, для нейтралізації будь-якого залишкового ВЕЇ. Переважно тіосульфат натрію додають в еквівалентній кількості стосовно ВЕЇ, що додається перед інактивацією. Наприклад, у випадку додавання ВЕЇ до кінцевої концентрації 5 ММ додають 1,0М розчину тіосульфату натрію для досягнення кінцевої мінімальної концентрації 5 ММ для нейтралізації будь-якого залишкового ВЕЇ.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким інактивуючий агент є сполукою азиридину, переважно бінарним етиленаміном (ВЕЇ), та/або інактивуючий агент додають у молярному надлишку стосовно вектора.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким нейтралізуючим агентом є тіосульфат натрію, та/або нейтралізуючий агент додають у молярному надлишку стосовно інактивуючого агента.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким вищезгаданий спосіб також включає етап змішування суміші, що залишився після етапу (у), з іншим компонентом, вибраним із групи, до якої належать фармацевтично прийнятні носії, ад'юванти, розріджувачі, інертні наповнювачі і їх комбінації.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким віруцидну активність суміші, отриманої в результаті виконання вищезгаданого способу, знижують принаймні на 1095 у порівнянні із сумішшю, до якої був застосований вищезгаданий спосіб, та/або імуногенна композиція, отримана вищезгаданим способом, викликає втрату менше, ніж 1 Ісд ТСІЮво на мл живого вірусу, коли живий вірус змішують із імуногенною композицією протягом двох або більше годин.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким живий вірус є вірусом свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК).

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким спосіб також включає етап (МІ) збору рекомбінантного білка та/або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, що залишилися після етапу (у), зокрема етап, що також включає, очищення зібраного матеріалу, що включає рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, із застосуванням хроматографічної процедури, переважно ексклюзійної хроматографії.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким спосіб також включає етап комбінування зібраного (очищеного) рекомбінантного білка та/або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, із принаймні одним додатковим антигеном.

В іншому аспекті даний винахід стосується способу, як описується й заявляється авторами, згідно з яким принаймні один додатковий антиген є вірусом свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК5).

У ще одному аспекті спосіб також включає етап збору рекомбінантного білка, отриманого після видалення принаймні частини вищезгаданої першої рідини з вищезгаданого рекомбінантного білка.

У контексті даного опису терміни "збір" або "збирати" стосуються збору або відновлення рекомбінантного білка. Для відновлення рекомбінантного білка може застосовуватися будь-який традиційний спосіб, відомий фахівцям у даній галузі, або при одержанні рекомбінантного білка для застосування у зв'язку зі способами й композиціями відповідно до даного винаходу, або при застосуванні до рекомбінантному білку описаних авторами способів. Згідно з особливо кращим способом збору, частина вищезгаданої першої рідини видаляють із вищезгаданого рекомбінантного білка через етап фільтрації й рекомбінантний білок витягають або збирають із осаду на фільтрі. У більш кращій формі рекомбінантний білок збирають або одержують із осаду на напівпроникній мембрані, що має описаний авторами розмір пор.

Рекомбінантний білок, що залишається після застосування до нього пропонованих авторами способів, переважно після збору з осаду на фільтрі, змішують із іншим компонентом, вибраним із групи, до якої належать фармацевтично прийнятні носії, ад'юванти, розріджувачі, інертні наповнювачі і їх комбінації. Переважно вищезгаданий інший компонент є ад'ювантом, ще більш переважно - вищезгаданий ад'ювант є полімером акрилової або метакрилової кислоти, і ще більш переважно - вищезгаданий ад'ювант є карбомером.

У ще одному аспекті даної заявки вищеописаний спосіб також включає етап змішування рекомбінантного білка, отриманого після етапів інактивації й нейтралізації іншим компонентом, вибраним із групи, до якої належать фармацевтично прийнятні носії, ад'юванти, розріджувачі, інертні наповнювачі і їх комбінації. Перед змішуванням очищеного рекомбінантного білка з ад'ювантом, також рекомендується діалізувати очищений рекомбінантний білок на фосфатно- буферному сольовому розчині, рН 7,4, або будь-якому іншому фізіологічному буфері.

У контексті даного опису "Фармацевтично прийнятний носій" і" прийнятний з ветеринарної точки зору носій" включає будь-які й усі розчинники, диспергатори, покриття, стабілізатори, розріджувачі, консерванти, протимікробні й протигрибкові засоби, ізотонічні агенти, агенти, що сповільнюють адсорбцію й т.п. "Ад'юванти" у контексті даного опису можуть включати гідроксид алюмінію й фосфат алюмінію, сапоніни наприклад, ОцїЇ А, 05-21 (Сатбідде Віоїесп Іпс., Сатбгідде МА), СРІ-0100 (Саепіса

Рпаптасеціісса!5, Іпс., Віптіпдайат, АГ), емульсію типу вода в маслі, емульсію типу масло у воді, емульсію типу вода в маслі у воді. Емульсія, зокрема, може бути на основі легкого рідкого вазелінового масла (згідно з вимогами Європейської фармакопеї); ізопреноїдного масла, такого, як сквалан або сквален; масла, одержуваного в результаті олігомеризації алкенів, зокрема, ізобутену або децену; складних ефірів кислот або спиртів, які містять лінійну алкільну групу, більш конкретно - рослинних олій, етилолеату, пропіленглікольди-(каприлату/капрату), гліцерилтри- (каприлату/капрату) або пропіленглікольдіолеату; складні складних ефірів розгалужених жирних кислот або спиртів, зокрема, складних ефірів ізостеаринової кислоти. Масло застосовують у комбінації з емульгаторами для утворення емульсії. Емульгаторами переважно є неїіонні поверхово-активні речовини, зокрема, складні ефіри сорбіту, маніду (наприклад, ангідроманітолеат), гліколю, полігліцерину, пропіленгліколю й олеїнової, ізостеаринової, рицинолеїнової або гідроксистеаринової кислоти, які необов'язково є етоксилованими, і блокспівполімери поліоксипропілену-поліоксіетилену, зокрема продукти типу Ріпгопіс, насамперед 121. Див. Нипіег єї аІ., Тне Тнеогу апа Ргасіїса! Арріїсайоп ої Адіцмапів (Ед. Зіемап-Тий, О. Е. 5.).

Уоппмеу апа оп, МУ, рр 51-94 (1995) і Тода еї аї., Массіпе 15: 564-570 (1997). Наприклад, існує можливість використання емульсії 5РТ, описаної на сторінці 147 публікації "Массіпе Оеєзідп, Те зЗиЇибипії апа Адіимапі Арргоасі" за редакцією М. РоучеїЇ і М. Мем/тап, Ріепит Ргез5, 1995, і емульсія

МЕ59, описана на сторінці 183 тієї ж книги. Інші підходящі ад'юванти включають, крім інших, ад'ювантну систему КІВІ (Ківі Іпс.), блокспівполімер (СуїЕх, АШМапіа СА), БАЕ-М (Спігоп, Етегуміе

СА), монофосфорил-ліпід А ад'ювант авридин ліпід-амін, термолабільний ентеротоксин з Е. соїї (рекомбінантний або інший), холерний токсин, ІМ5 1314 або мурамілдипептид і багато інші. Серед співполімерів малеїнового ангідриду й алкенільної похідної включаються співполімери ЕМА (Мопзапіо), які являють собою співполімери малеїнового ангідриду й етилену. Розчинення цих полімерів у воді веде до утворення розчину кислоти, що підлягає нейтралізації, переважно до фізіологічного рівня рН, з метою одержання розчину ад'юванта, у яку включають саму імуногенну, імунологічну або вакцинну композицію.

Серед них можна згадати Сагророї 974Р, 934Р і 971Р. Найбільш кращим є використання Сагроро 971Р. "Розріджувачі" можуть включати воду, сольовий розчин, декстрозу, етанол, гліцерин і т.п.

Ізотонічні агенти можуть включати, крім інших, хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт і лактозу.

Стабілізатори включають, крім інших, альбумін і солі лужних металів з етилендіамінтетраоцтовою кислотою. "Консервант" у контексті даного опису стосується агента антимікробіологічної дії, такого, як, наприклад, гентаміцин, мертиолат і т.п. Зокрема, додавання консерванту є найбільш кращим для приготування багатодозової композиції. Агенти антимікробіологічної дії додають у концентраціях, ефективних для запобігання мікробіологічного забруднення досліджуваної композиції або для пригічення будь-якого мікробіологічного росту в межах досліджуваної композиції.

Подальше очищення рекомбінантного білка може досягатися із застосуванням процедур хроматографії, переважно двоетапної процедури хроматографії. Якщо рекомбінантний білок збирають у вірусоподібні частинки (МІ Р), один етап, переважно перший етап, переважно являє собою ексклюзійну (гель-фільтраційну) хроматографію, яка може здійснюватися, наприклад, з використанням матриці Зерпасгу! 5300. У лабораторному масштабі перевага віддається застосуванню колонок НіРгер 26/60 берпасгу! 5ЗООНК. Однак можуть застосовуватися й інші матриці для ексклюзійної хроматографії, відомі фахівцям у даній галузі, що забезпечують можливість відділення МІР рекомбінантного білка від фільтрату або супернатанта культури.

Підходящі матриці описуються, наприклад, у публікації Е.І..М. Наїтіз апа 5. Апдеї! (едв».), Ргоївіп ригіісайоп теїйодвз -- а ргасіїса! арргоаси, ІК. Ргез5 Охіога 1995). Гель-фільтраційну хроматографію виконують, наприклад, шляхом завантаження колонки необробленою композицією, що включає рекомбінантний білок, зі швидкістю потоку 1,0 мл/хв і елюювання колонки з 1,5-кратним об'ємом колонки буфера, що включає 20 мМ Тгтгі5, рН 6,5, 5 мМ ОТТ. Однак рекомбінантний білок також може бути очищений із застосуванням афінної хроматографії, наприклад, шляхом вибіркового зв'язування зі специфічним до іммобілізованого рекомбінантного білка антитілом або із застосуванням будь-якого іншого способу, відомого фахівцям у даній галузі.

Для досягнення більш високого ступеня очищення здійснюють другий етап хроматографії, який відрізняється від першого. Наприклад, якщо перший етап очищення / хроматографії являє собою ексклюзійну (гель-фільтраційну) хроматографію, то другий повинен відрізнятися від нього і являти собою, наприклад, афінну хроматографію, іонообмінну хроматографію й т.п. У кращому варіанті якщо перший етап очищення рекомбінантного білка являє собою ексклюзійну (гель-фільтраційну) хроматографію, то другий етап може являти собою іонообмінну хроматографію, переважно аніонообмінну хроматографію (АІЕХ). Кращою матрицею для аніонообмінної хроматографії є для очищення рекомбінантного білка є О-сефароза. У малому масштабі, приблизно 50 мл, найбільшу перевагу віддають застосуванню 5 мл колонок НіТгар О Зерпагозе НР.

Дана заявка не тільки забезпечує способи одержання імуногенної композиції, що містить рекомбінантний білок, але й стосується імуногенної композиції, що містить рекомбінантний білок.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції, одержуваної із застосуванням способу, як описується й заявляється авторами.

У ще одному аспекті віруцидна активність імуногенної композиції, що містить рекомбінантний білок, одержуваної запропонованими авторами способами, знижується принаймні на 1095 у порівнянні з імуногенною композицією, що містить рекомбінантний білок, до якої не був застосований вищезгаданий спосіб одержання. Більш переважно віруцидна активність імуногенної композиції, що містить рекомбінантний білок знижується принаймні на 5095 у порівнянні з імуногенною композицією, що містить рекомбінантний білок, до якої не був застосований вищезгаданий спосіб одержання. Ще більш переважно віруцидна активність імуногенної композиції, що містить рекомбінантний білок знижується принаймні на 7095 у порівнянні з імуногенною композицією, що містить рекомбінантний білок, до якої не був застосований вищезгаданий спосіб одержання. Ще більш переважно віруцидна активність імуногенної композиції, що містить рекомбінантний білок знижується принаймні на 90 95 у порівнянні з імуногенною композицією, що містить рекомбінантний білок, до якої не був застосований вищезгаданий спосіб одержання.

З погляду даного винаходу термін "віруцидна активність" означає, що рідина, текуче середовище, розчин, композиція й т.п. деякою мірою інактивує або вбиває живі віруси або живі бактерії при змішуванні вищезгаданої рідини, текучого середовища, розчину, композиції й т.п. з такими живими вірусами або живими бактеріями. Таким чином, зниження віруцидної активності рідини, текучого середовища, розчину, композиції й т.п. принаймні на 10 95 означає, що коефіцієнт виживаності живих вірусів або живих бактерій на 90 95 вище в рідині, текучім середовищі, розчині, композиції й т.п., до якої був застосований будь-який з описаних авторами способів одержання, у порівнянні з рідиною, текучим середовищем, розчином, композицією й т. п., до якої не був застосований жоден зі способів одержання.

Імуногенна композиція рекомбінантного білка, одержувана описуваним авторами способом, викликає втрату менше, ніж 1 сд ТСІОво живого вірусу або менше, ніж 1 сд СР на мл живих бактерій, при змішуванні живого вірусу або живої бактерії з імуногенною композицією рекомбінантного білка й інкубації протягом 2 або більше годин, переважно протягом більш 4 годин, ще більш переважно - протягом більш 12 годин, ще більш переважно - протягом більш 24 годин, ще більш переважно - протягом більш 2 днів, ще більш переважно - протягом більш 4 днів, ще більш переважно - протягом більш 7 днів, ще більш переважно - протягом більш 2 тижнів, ще більш переважно - протягом більш 4 тижнів, ще більш переважно - протягом більш 2 місяців, ще більш переважно - протягом більш З місяців, ще більш переважно - протягом більш 4 місяців, ще більш переважно - протягом більш 6 місяців, ще більш переважно - протягом більш 9 місяців, ще більш переважно - протягом більш 12 місяців, ще більш переважно - протягом більш 18 місяців, найбільш переважно - протягом більш 2 років. Більш переважно імуногенна композиція рекомбінантного білка, отримана описуваним авторами способом, викликає втрату менше, ніж 0,9

Іосд ТСІЮОво на мл живого вірусу або менше, ніж 0,9 їсд СЕШ на мл живих бактерій при змішуванні й інкубації живого вірусу або живої бактерії з імуногенною композицією рекомбінантного білка протягом 2 або більше годин, переважно протягом більш 4 годин, ще більш переважно - протягом більш 12 годин, ще більш переважно - протягом більш 24 годин, ще більш переважно - протягом більш 2 днів, ще більш переважно - протягом більш 4 днів, ще більш переважно - протягом більш 7 днів, ще більш переважно - протягом більш 2 тижнів, ще більш переважно - протягом більш 4 тижнів, ще більш переважно - протягом більш 2 місяців, ще більш переважно - протягом більш З місяців, ще більш переважно - протягом більш 4 місяців, ще більш переважно - протягом більш б місяців, ще більш переважно -- протягом більш 9 місяців, ще більш переважно - протягом більш 12 місяців, ще більш переважно -- протягом більш 18 місяців, найбільш переважно - протягом більш 2 років. У ще більш кращому варіанті імуногенна композиція рекомбінантного білка, отримана описуваним авторами способом, викликає втрату менше, ніж 0,7 Ісд ТСІОзо на мл живого вірусу або менше, ніж 0,7 їд СР на мл живих бактерій при змішуванні й інкубації живого вірусу або живої бактерії з імуногенною композицією рекомбінантного білка протягом 2 або більше годин, переважно протягом більш 4 годин, ще більш переважно - протягом більш 12 годин, ще більш переважно -- протягом більш 24 годин, ще більш переважно - протягом більш 2 днів, ще більш переважно - протягом більш 4 днів, ще більш переважно - протягом більш 7 днів, ще більш переважно - протягом більш 2 тижнів, ще більш переважно - протягом більш 4 тижнів, ще більш переважно -- протягом більш 2 місяців, ще більш переважно - протягом більш З місяців, ще більш переважно -- протягом більш 4 місяців, ще більш переважно - протягом більш 6 місяців, ще більш переважно -- протягом більш 9 місяців, ще більш переважно - протягом більш 12 місяців, ще більш переважно -- протягом більш 18 місяців, найбільш переважно - протягом більш 2 років. У ще більш кращому варіанті імуногенна композиція рекомбінантного білка, отримана шляхом виконання етапів описуваного авторами способу викликає втрату менше, ніж 0,5 Ісд ТСІОзо на мл живого вірусу або менше, ніж 0,5 їсд СР на мл живих бактерій при змішуванні й інкубації живого вірусу або живої бактерії з імуногенною композицією рекомбінантного білка протягом 2 або більше годин, переважно протягом більш 4 годин, ще більш переважно - протягом більш 12 годин, ще більш переважно -- протягом більш 24 годин, ще більш переважно - протягом більш 2 днів, ще більш переважно - протягом більш 4 днів, ще більш переважно - протягом більш 7 днів, ще більш переважно - протягом більш 2 тижнів, ще більш переважно - протягом більш 4 тижнів, ще більш переважно -- протягом більш 2 місяців, ще більш переважно - протягом більш З місяців, ще більш переважно -- протягом більш 4 місяців, ще більш переважно - протягом більш 6 місяців, ще більш переважно -- протягом більш 9 місяців, ще більш переважно - протягом більш 12 місяців, ще більш переважно -- протягом більш 18 місяців, найбільш переважно - протягом більш 2 років. У ще більш кращому варіанті імуногенна композиція рекомбінантного білка, отримана описуваним авторами способом, викликає втрату менше, ніж 0,3 Ісд ТСІЮзо на мл живого вірусу або менше, ніж 0,3 їсд СЕР на мл живих бактерій при змішуванні й інкубації живого вірусу або живої бактерії з імуногенною композицією рекомбінантного білка протягом 2 або більше годин, переважно протягом більш 4 годин, ще більш переважно - протягом більш 12 годин, ще більш переважно - протягом більш 24 годин, ще більш переважно -- протягом більш 2 днів, ще більш переважно - протягом більш 4 днів, ще більш переважно - протягом більш 7 днів, ще більш переважно - протягом більш 2 тижнів, ще більш переважно - протягом більш 4 тижнів, ще більш переважно - протягом більш 2 місяців, ще більш переважно - протягом більш З місяців, ще більш переважно - протягом більш 4 місяців, ще більш переважно - протягом більш 6 місяців, ще більш переважно - протягом більш 9 місяців, ще більш переважно - протягом більш 12 місяців, ще більш переважно - протягом більш 18 місяців, найбільш переважно - протягом більш 2 років. Показник ТСІЮОхо на мл оцінюють із застосуванням стандартного іп міо аналізу з титруванням, що дозволяє оцінювати кількість живого вірусу.

Показник СРО на мл також визначають із застосуванням стандартного іп міо аналізу з титруванням, що дозволяє оцінювати кількість живої бактерії. Термін "на мл" переважно стосується кількості на 1 мл текучого середовища. Такий очищений рекомбінантний білок не тільки демонструє знижену віруцидну активність, як визначається авторами, але й демонструє підвищену імуногенність у порівнянні з неочищеним рекомбінантним білком, як визначається авторами, причому переважно такий рекомбінантний білок підвищує клітинну та/або антитілоопосередковану імунну відповідь принаймні на 10 95, переважно принаймні на 20 95, більш переважно - принаймні на 30 95, ще більш переважно - принаймні на 40 95, ще більш переважно - принаймні на 50 95, ще більш переважно - принаймні на 75 95, найбільш переважно - принаймні на 100 95 у порівнянні із клітинною та/або антитілоопосередкованою імунною відповіддю, що викликається контрольною імуногенною композицією, що включає неочищений рекомбінантний білок.

Імуногенні композиції, що включають очищений рекомбінантний білок, переважно одержувані із застосуванням описаних авторами способів, характеризуються підвищеною імуногенністю в порівнянні з імуногенною композицією, що не включає такий очищений рекомбінантний білок.

Крім того, терміни "підвищена імуногенність" або "поліпшена імуногенність" у контексті даного опису означають, що імунна відповідь, яка викликається імуногенною композицією, що включає досліджуваний антиген, є підвищеним у порівнянні з контрольною імуногенною композицією, що включає інший антиген або антиген іншого ступеня чистоти, чи є ця імунна відповідь клітинноопосередкованим або антитілоопосередкованою імунною відповіддю. Відповідно до кращого варіанта здійснення, терміни "підвищена імуногенність" або "поліпшена імуногенність" означають, що антитілоопосередкована імунна відповідь, яка викликається імуногенною композицією, що включає досліджуваний антиген, підвищується в порівнянні з контрольною імуногенною композицією, що включає інший антиген або антиген іншого ступеня чистоти. Щодо цього антитілоопосередкована імунна відповідь означає, що вироблення антитіл, які специфічні до досліджуваного антигену, підвищується в порівнянні з виробленням антитіла, викликуваним контрольною імуногенною композицією, що включає інший антиген або антиген іншого ступеня чистоти.

Термін "підвищений" означає, що клітинну та/або антитілоопосередковану імунну відповідь підвищується принаймні на 10 95, переважно принаймні на 20 95, більш переважно - принаймні на 96, ще більш переважно - принаймні на 40 95, ще більш переважно - принаймні на 50 95, ще більш переважно - принаймні на 75 95, найбільш переважно - принаймні на 100 95 у порівнянні із клітинною та/або антитілоопосередкованою імунною відповіддю, що викликається контрольною імуногенною композицією, що включає рекомбінантний білок або рекомбінантний білок іншого ступеня чистоти.

Фахівцям у даній галузі добре відомі способи виміру клітинного та/або антитілоопосередкованої імунної відповіді. Зокрема, фахівцям у даній галузі відомо, що можна порівнювати клітинноопосередковану імунну відповідь досліджуваної імуногенної композиції із клітинноопосередкованою імунною відповіддю контрольної композиції або антитілоопосередкована імунна відповідь досліджуваної імуногенної композиції з відповіддю контрольної композиції, але не можна порівнювати клітинноопосередковану імунну відповідь досліджуваної імуногенної композиції з антитілоопосередкованою імунною відповіддю контрольної композиції, або навпаки. Більше того, клітинноопосередкована імунна відповідь може бути виміряна, наприклад, шляхом виміру активації итотоКсичнихХ Т-клітин досліджуваною імуногенною композицією / антигеном.

Антитілоопосередкована імунна відповідь може бути виміряна, наприклад, шляхом виміру кількості специфічних до антигену антитіл, вироблених внаслідок введення тварині імуногенної композиції, що включає такий антиген. Клітинну та/або антитілоопосередковану імунну відповідь може бути виміряна, наприклад, з використанням мишачої моделі. Відповідно до даного винаходу, мишачу модель використовують як контрольний спосіб.

Термін "імуногенна композиція" означає, крім іншого, композицію матеріалу, що включає принаймні один антиген, який викликає клітинну та/або антитілоопосередковану імунну відповідь у хазяїна проти досліджуваного антигену. Як правило, "їімунна відповідь" включає, крім іншого, один або декілька з наступних ефектів: вироблення або активації антитіл, В-клітин, хелперних Т-клітин, супресорних Т-клітин та/або цитотоксичних Т-клітин та/або гамма-дельта-Т-клітин, специфічно спрямованих на антиген або антигени, які включені в досліджувану композицію або вакцину.

Переважно хазяїн повинен демонструвати терапевтичний або захисна імунна відповідь, наприклад, підвищення резистентності до нової інфекції та/або зниження клінічної тяжкості захворювання. У такому випадку імуногенна композиція є "вакциною". Такий захист повинен демонструватися через зниження або відсутність симптомів, що звичайно проявляються інфікованим хазяїном, більш швидке видужання та/або знижений вірусний титр в інфікованого хазяїна.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція також включає атенуйований живий вірус, переважно атенуйований вірус свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК5) або атенуйовану живу бактерію. "Живий" вірус або бактерія з погляду даного винаходу означає вірус або бактерію, здатні до реплікації в організмі хазяїна. Кращим живим вірусом і кращою живою бактерією відповідно до даного винаходу є вірус РКК5 і бактерія Мусоріазта пуорпешитопіа, відповідно. Однак термін "живий вірус" або "жива бактерія" не обмежуються РККЗ5 і Мусоріазта пурпешйтопіає, відповідно.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції, як описується й заявляється авторами, у якій атенуйований живий вірус є вірусом свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РЕК).

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція викликає захисну імунну відповідь проти патогену, переважно патогену, що включає рекомбінантний білок, як описується й заявляється авторами, після введення однієї дози імуногенної композиції.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції, як описується й заявляється авторами, причому імуногенна композиція викликає захисну імунну відповідь проти вірусу РКЕК5 після введення однієї дози імуногенної композиції.

Імуногенна композиція рекомбінантного білка, одержувана відповідно до вищеописаного способу, або рекомбінантний білок, застосовуваний на етапі Ї)) вищеописаного способу, може комбінуватися із принаймні одним додатковим антигеном, переважно вірусним або бактеріальним антигеном, ще більш переважно - вірусним або бактеріальним антигеном із принаймні одного іншого зухвалого захворювання організму у свиней. Додатковим антигеном може бути будь-який з розкритих в міжнародній патентній заявці УМО2007/094893 (зміст і ідеї якої включені в даний опис шляхом посилання). Загалом, додатковими антигенами можуть бути антигени будь-яких інших організмів, що викликають захворювання у свиней. Переважно "інші організми, що викликають захворювання" у свиней вибрані із групи, до якої належать: Асііпорасійй5 ріеигорпештопіа (1); аденовірус (2); альфавірус, такий, як віруси східного кінського енцефаломиелита (3); Вогаеїейа

Бгопспізеріїса (4); Вгаспузріга 5рр. (5), переважно В. пусдуепійетгіає (6); В. ріовісоїї (7), Вгисеїа взців, переважно біовари 1, 2 і З (8); вірус класичної чуми свиней (9); Сіовіпаішт 5рр. (10), переважно СІ. аййісіе (11), СІ. репііпдеп5 типів А, В ї С (12), СІ. помуї (13), СІ. взеріїсит (14), СІ. їеїапі (15); коронавірус (16), переважно респіраторний коронавірус свиней (17); Ерегуїйпго2ооповів 5ців (18);

ЕгузіреІоїйгіх "нзіораїтіає (19) ЕзсПенгісніа сої (20); Наеторнпйи5х рагазиі5, переважно підтипів 1, 7 і 14 (21) вірус гемаглютинуючого енцефаломієліту (22); вірус японського енцефаліту (23); І амхзопіа іпігасейПІшіагів (24) І еріозріга 5рр. (25), переважно І еріозріга аизігаїї5 (26); І еріозріга сапісоїа (27);

І еріозріга дгірроїурпоза (28); І еріозріга істегонаетогадісає (29); і Іеріозріга іпіепгодап5 (30);

І еріозріга ротопа (31); І еріозріга Гагаззомі (32); Мусобасіегійт 5рр. (33) переважно М. амішт (34),

М. іпігасеїІмІаге (35) ії М.роміз (36); Мусоріаєта Ппуорпештопіає (37); РавівшгеМПа тийпосіда (38); свинячий цитомегаловірус (39); свинячий парвовірус (40); вірус свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (41); вірус псевдосказу (42); ротавірус (43); ЗаітопеМйа 5рр. (44), переважно 5. (ШФупіптигішт (45) і 5. споЇІегаезиів (46); єтарі. Нуїсив (47); Зіарпуіососсив 5рр. (48) переважно 5ігеріососсиз 5рр. (49), переважно 5ігер. зці5 (50); вірус свинячого герпесу (51); вірус свинячого грипу (52); свинячий поксвірус (53); свинячий поксвірус (54); вірус везикулярного стоматиту (55); Вірус везикулярної екзантеми свиней (56); Іеріозріга Нагаро (57); та/або

Мусоріазта Ппуозупоміає (58).

В іншому аспекті даний винахід стосується комплекту, що включає контейнер, який містить імуногенну композицію, як описується й заявляється авторами.

В іншому аспекті даний винахід стосується комплекту, як описується й заявляється авторами, який також включає принаймні один додатковий контейнер, що містить принаймні один додатковий антиген, вибраний із групи, до якої належать атенуйований живий вірус, переважно атенуйований вірус РЕК, і атенуйована жива бактерія.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції, як описується й заявляється авторами, для застосування як медикамент, переважно як вакцина.

В іншому аспекті даний винахід стосується імуногенної композиції, як описується й заявляється авторами, та/або комплекту, як описується й заявляється авторами, для застосування згідно зі способом зниження одного або декількох клінічних симптомів інфекції патогену у тварини в порівнянні із твариною, що не одержувала вищезгаданої імуногенної композиції.

Термін "зниження частоти випадків або тяжкості клінічних ознак" означає, що частота випадків або тяжкість будь-якої з таких ознак знижується у тварин, яким вводили вакцину, у порівнянні з " контрольною групою" тварин, коли обидві групи одержували інфекцію або провокацію патогену, від якого відбувається імунологічно активний компонент(и) у вакцині, і контрольній групі не вводили вакцину або імуногенну композицію. У цьому контексті термін "зменшення" або "зниження" означає зниження принаймні на 10 95, переважно на 25 95, ще більш переважно - на 50 95, найбільш переважно - більш ніж на 100 95, у вакцинованій групі в порівнянні з невакцинованою контрольною групою.

У контексті даного опису "клінічні симптоми" або "клінічні ознаки" означають ознаки інфікування патогенами, які прямо спостерігаються в живої тварини, такі, як симптоми. Типові приклади залежать від вибраного патогену, але до них належать такі явища, як виділення з носа, виражена млявість, кашель, підвищена температура, збільшення або втрата ваги, зневоднювання, діарея, набрякання, кульгавість і т.п.

У контексті даного опису "захисна імунна відповідь" означає зниження частоти випадків або зниження тяжкості клінічних, патологічних або гістопатологічних ознак або симптомів інфікування досліджуваним патогеном, до повного виключення таких ознак або симптомів.

Термін "патологічні ознаки" стосується ознак інфекції, які спостерігаються на мікроскопічному або молекулярному рівні через біохімічне дослідження або неозброєним оком після розтину.

Термін "гістопатологічні ознаки" стосується ознак змін тканин у результаті інфекції.

Терміни "клінічні симптоми" або "клінічні ознаки" визначаються вище.

Авторами описуються наступні пункти: 1. Спосіб одержання імуногенна композиція, що включає рекомбінантний білок, причому спосіб включає етапи в наступному порядку: () забезпечення / одержання суміші, що включає першу рідину,

рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, і вектор, що включає нуклеїновокислотну послідовність, що кодує вищезгаданий рекомбінантний білок; (І) додавання другої рідини до суміші з етапу (ї), причому друга рідина відрізняється від першої рідини; (ІП) промивання й, необов'язково, остаточне концентрування рекомбінантного білка та/або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків у суміші шляхом додаткового додавання другої рідини до суміші, отриманої в результаті виконання етапу (ІЇ), і видалення частини першої та/або другої рідини з такої комбінованої суміші; (ІМ) інактивацію вектора шляхом додавання інактивуючого агента до суміші, отриманої в результаті виконання етапу (ПІ); (у) нейтралізацію інактивуючого агента шляхом додавання нейтралізуючого агента до суміші, отриманої в результаті виконання етапу (ІМ). 2. Спосіб за пунктом 1, який відрізняється тим, що суміші з етапу (ї) одержують із застосуванням процедури, що включає етапи (а) інфікування сприйнятливих клітин у культурі вектором, що включає нуклеїновокислотну послідовність, що кодує вищезгаданий рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, причому вищезгаданий рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, експресуються вищезгаданим вектором, (б) наступного відновлення рекомбінантного білка та/або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, із клітинної культури, причому клітинний дебрис переважно відокремлюють від рекомбінантного білка та/або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків через етап відділення, що переважно включає мікрофільтрацію через принаймні один фільтр, переважно два фільтри, причому принаймні один фільтр переважно має розмір пор, більший, ніж рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, зокрема, має розмір пор від приблизно 0,1 мкм до приблизно 4 мкм. 3. Спосіб за пунктом 2, який відрізняється тим, що клітинну культуру на етапі (а) підтримують при 2712 С, переважно при експресії рекомбінантного білка та/"або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, вищезгаданим вектором, та/або витяг на етапі (б) відбувається через 6-8 днів, переважно 8 днів після інокуляції клітин вектором. 4. Спосіб за пунктами 2 або 3, який відрізняється тим, що етап відділення включає або складається з: мікрофільтрації через принаймні один фільтр, що має розмір пор приблизно 2 мкм до приблизно 4 мкм, та/або мікрофільтрації через принаймні один фільтр, що має розмір пор приблизно 0,1 мкм до приблизно 0,8 мкм. 5. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 4, який відрізняється тим, що вищезгадана перша рідина включає частину середовища для культивування клітин або складається із середовища для культивування клітин, і середовищем для культивування клітин переважно є середовище для культивування клітин комах. б. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 5, який відрізняється тим, що вищезгаданий рекомбінантний білок вибирають із групи, до якої належать: білок РРМ МР2, що переважно включає або складається з послідовності, яка має принаймні 7095, принаймні 7595, принаймні 8095, принаймні 8595, принаймні 90 95, принаймні 91 95, принаймні 92 95, принаймні 93 95, принаймні 94 95, принаймні 95 95, принаймні 96 95, принаймні 97 У6, принаймні 98 95, принаймні 99 95, принаймні 99,1 95, принаймні 99,2 96, принаймні 99,3 95, принаймні 99,4 95, принаймні 99,5 95, принаймні 99,6 95, принаймні 99,7 95, принаймні 99,8 95, принаймні 99,9 95, або 100 95 ідентичності з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 1, 5ЕО ІЮО МО: 2 та/або 5ЕО

ІО МОБ 5 - 16. 7. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 6, який відрізняється тим, що вищезгадані четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, є вірусоподібними частинками, або вищезгадані четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, є гомотримерами. 8. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 7, який відрізняється тим, що вектор є рекомбінантним вірусом, переважно бакуловірусом, та/або нуклеїновокислотна послідовність є послідовністю ДНК. 9. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 8, який відрізняється тим, що вектор, що включає нуклеїнову кислоту, що кодує вищезгаданий рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, є рекомбінантним бакуловірусом, причому вищезгаданий бакуловірус включає послідовність ДНК, що кодує вищезгаданий рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків.

10. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 9, який відрізняється тим, що на етапі (ІІІ) вищезгаданий рекомбінантний білок та/"або вищезгадані четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, промивають, використовуючи принаймні 2х, переважно від 2х до Зх, другої рідини, і необов'язково доводять до кінцевої концентрації, у порівнянні з первинним об'ємом вищезгаданого рекомбінантного білка та/"або вищезгадані четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків у суміші з етапу (Її).

11. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 10, який відрізняється тим, що на етапі (ІІ) такий(і) етап(и) промивання, тобто, процес діафільтрації, виконують при температурі нижче 37 "С, більш переважно при температурі нижче 30 "С, ще більш переважно - при температурі нижче 20 "С, ще більш переважно - при температурі нижче 10 "С, наприклад, при температурі від 4 С їі 29260, наприклад, 27 "С або 4 26.

12. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 11, який відрізняється тим, що на етапі (ІІ) частину першої та/або другої рідини видаляють із суміші шляхом фільтрації, причому переважно застосовують фільтр або порожній фільтр, що включає напівпроникну мембрану, що має середній розмір пор, менший, ніж вищезгаданий рекомбінантний білок та/або вищезгадані четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, та/або що перешкоджають проходженню більшості, переважно практично всіх білків розміром від 20 кДа до 500 кДа, крізь напівпроникну мембрану.

13. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 12, який відрізняється тим, що друга рідина являє собою буферний розчин, переважно промивний фосфатно-буферний сольовий розчин (М/РВ5).

14. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 13, який відрізняється тим, що об'єм другої рідини, що додається на етапі (ІЇ), приблизно дорівнює об'єму першої та/або другої рідини, що віддаляється на етапі (ПІ), тобто, етап концентрування не виконується та/або не потрібно.

15. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 14, який відрізняється тим, що інактивуючий агент являє собою сполуку азиридину, переважно бінарний етиленамін (ВЕЇ), та/або інактивуючий агент додають у молярному надлишку стосовно вектора.

16. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 15, який відрізняється тим, що нейтралізуючий агент являє собою тіосульфат натрію, та/або нейтралізуючий агент додають у молярному надлишку стосовно інактивуючого агента.

17. Спосіб за будь-яким з пунктів з 1 по 16, який відрізняється тим, що вищезгаданий спосіб також включає етап змішування суміші, що залишився після етапу (у), з додатковим компонентом, вибраним із групи, до якої належать фармацевтично прийнятні носії, ад'юванти, розріджувачі, інертні наповнювачі, і їх комбінації.

18. Спосіб за будь-яким із пп. з 1 по 17, який відрізняється тим, що віруцидна активність суміші, отриманої в результаті виконання вищезгаданого способу, знижується принаймні на 1095 у порівнянні із сумішшю, до якої не був застосований вищезгаданий спосіб, та/або імуногенна композиція, отримана вищезгаданим способом, викликає втрату менше, ніж 1 юд ТСІЮв5о на мл живого вірусу, коли живий вірус змішують із імуногенною композицією протягом двох або більше годин.

19. Спосіб за пунктом 18, який відрізняється тим, що живий вірус є вірусом свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК).

20. Спосіб за будь-яким із пп. з 1 по 19, який відрізняється тим, що спосіб також включає етап (МІ) збору рекомбінантного білка та/"або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, що залишилися після етапу (у), і зокрема етап, що також включає, очищення зібраного матеріалу, що включає рекомбінантний білок та/або четвертинні структури, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, із застосуванням хроматографічної процедури, переважно ексклюзійної хроматографії.

21. Спосіб за будь-яким із пп. з 1 по 20, який відрізняється тим, що спосіб також включає етап комбінування зібраного (очищеного) рекомбінантного білка та/"або четвертинних структур, що складаються із багатьох вищезгаданих рекомбінантних білків, із принаймні одним додатковим антигеном.

22. Спосіб за пунктом 21, який відрізняється тим, що принаймні один додатковий антиген є вірусом свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК).

23. Імуногенна композиція, одержувана способом за будь-яким із пп. з 1 по 22.

24. Імуногенна композиція за пунктом 23, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція також включає атенуйований живий вірус, переважно атенуйований вірус свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК), або атенуйовану живу бактерію.

25. Імуногенна композиція за пунктом 23 або 24, яка відрізняється тим, що атенуйований живий вірус є вірусом свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК).

26. Імуногенна композиція за будь-яким з пунктів з 23 по 25, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція викликає захисну імунну відповідь проти патогену, переважно патогену, що включає рекомбінантний білок за пунктом 6, після введення однієї дози імуногенної композиції.

27. Імуногенна композиція за будь-яким з пунктів з 23 по 26, яка відрізняється тим, що імуногенна композиція викликає захисну імунну відповідь проти вірусу РКК5 після введення однієї дози імуногенної композиції. 28. Комплект, що включає контейнер, що містить імуногенну композицію за будь-яким з пунктів з 23 по 27. 29. Комплект за пунктом 28 який також включає принаймні один додатковий контейнер, що містить принаймні один додатковий антиген, вибраний із групи, до якої належать атенуйований живий вірус, переважно атенуйований вірус РЕК, і атенуйована жива бактерія. 30. Імуногенна композиція за будь-яким з пунктів з 23 по 29 для застосування як медикамент, переважно як вакцина. 31. Імуногенна композиція за будь-яким з пунктів з 23 по 29 та/або комплект за будь-яким з пунктів 28 або 29, для застосування згідно зі способом зниження одного або декількох клінічних симптомів інфекції патогену у тварини в порівнянні із твариною, що не одержувала вищезгаданої імуногенної композиції.

ПРИКЛАДИ

Наступні приклади представлені нижче для пояснення конкретних варіантів здійснення даного винаходу. Ці приклади є лише пояснювальними, їх не слід розглядати як такі, що обмежують обсяг або принципи, що лежать в основі даного винаходу.

ПРИКЛАД 1:

Одержання свинячого парвовірусу (РРМУ) 27а МР2 - апстрім-процесинг

РРМ 27а МР2 одержують в інфікованих бакуловірусом клітинах 5Е-- і інактивують ВЕЇ у процесі, що нагадує процес для РСМ2 ОКЕ2 (документ МО 2006/072065; Приклади з 1 по 3). Однак для РРУ 27а МР2 використовують інший бакуловірусний остов, що позначається як "ОіатопавВас" (Зідта

Аїагісп, О6192) (замість більш старого остову Васцобоїа, використовуваного для РСМ2 ОКЕ2).

Нуклеотидну послідовність свинячого парвовірусу (РРМ) 27а МР2 одержують від Сепбрапк під номером доступу АУб84871.1. Кодуюча ділянка РРМ 27а МР2 була піддана зворотній трансляції й кодон-оптимізована для ЮОгозорпіЇа із застосуванням програмного забезпечення ЗсіТосі5Ф Мер

Тоо!5 від Іпієдгаїеда ОМА Тесппоіодіеєз. Кодон-оптимізований ген РРМУ 27а УМР2 піддавали подальшій модифікації для вставки двох сайтів рестрикційних ферментів Сіа! у ділянку, що кодує, МР2, разом з додаванням сайтів рестрикційних ферментів Ватні і Мої! на 5'- і 3-кінцях, відповідно. Сайти Сіаї вставляють таким чином, щоб не переривалася кодуюча ділянка УР2. Вставка сайтів Сіа! включає три головні амінокислотні зміни в прогнозованій амінокислотній послідовності 27а МР2.

Амінокислотні зміни, що виникають у результаті вставок СіаіЇ, відбуваються в позиціях 25 (гліцин - ізолейцин), 36 (аланін - серин) і 37 (гліцин -» ізолейцин). Кодон-оптимізований ген РРМ 27а-Сіаї

УРА хімічно синтезували й потім клонували в стандартну клоновану плазміду, РОС57, в Іпіедгаїтейд

ОМА ТесНпоіодіез (РРУ27а-Сіа! 38320377). Ген РРМ 27а-Сіа! потім вирізали з наданої Іпієдгаїейд

ОМА ТесппоЇІодіез плазміди рРОС57 шляхом розщеплення рестрикційними ферментами Ваптні і Мої! і ген РРМ 27а-Сіа! субклонировали у відповідні сайти ферменту бакуловірусного вектора переносу рмі 1393 (ВО РПпаптіпдеп, 21486Р). Плазміду рміІ 1393, що містить Ген РРМ 27а-СіаІ! ампліфікували в ОНба Б. соїї (Іпмйгодеп'ї МАХ ЕйЙісіепсу"М), а потім витягали й очищали із застосуванням комплекту серійного виробництва для очищення плазмід (комплект Оіаргер бріп Міпіргер, Оіадеп).

Очищену плазміду рМ!/ 1393, що містила Ген РРМ 27а-Сіа| і лінеаризований остов бакуловірусу

ОіатопаВаст? котрансфікували в клітини комах 519, використовуючи реагент для трансфекції

Езсоп'"м (Зідта Аїагісн, Е9770) для утворення рекомбінантного бакуловірусу. Виконували граничне розведення для одержання запасу очищеного рекомбінантного бакуловірусу, що містить ген РР 27а-СіІа! МР2, під контролем поліедринового промотору. Систему бакуловірусного вектора експресії (ВЕМ5) застосовують для того, щоб суспензійна культура клітин комах (5Еж) могла виробляти рекомбінантний антиген, що складається з білка РРМ 27а МР2. Для цього продукту інфіковані клітини 5Е- культивують у періодичному режимі протягом приблизно семи днів, а потім обробляють для видалення клітинного дебрису й компонентів середовища.

ПРИКЛАД 2:

Одержання свинячого парвовірусу (РРМУ) 27а МР2 - даунстрім-процесинг

Даунстрім-процесинг складається із двох послідовних етапів. Видалення клітинного дебрису виконують у процесі, що називається "освітленням", а видалення компонентів середовища досягають із використанням двох об'ємів промивного фосфатно-буферного сольового розчину (МУРВ5), і цей процес називається "діафільтрацією".

Бакуловірусний вектор РРМ 27а МР2 роблять у біореакторах. Середовище в біореактор додають попередньо стерилізованим або підданим стерильній фільтрації. Середовище додають із клітинами ЗЕ, узятими з культур для розмноження. Клітини одночасно інокулюють (поєднана інфекція) після внесення з посівом бакуловірусу РРМ 27а МР2. Протягом усього періоду розмноження вірусу температуру підтримують при 27:52 "С і відслідковують рівень рН. Розчинений кисень (200) регулюють шляхом барботажу очищеним стисненим повітрям і киснем (О2). Вікно збору з'являється через 6-8 днів після інфікування вірусом і по досягненню критерію збору «х 20 95 життєздатності клітин. При зборі рідини з антигеном РРМ 27а МР2 освітлюють із застосуванням двох наборів фільтрів: фільтра попереднього очищення з розміром пор 2,0-4,0 мкм і фільтра кінцевого очищення з розміром пор 0,1-0,8 мкм. Фільтровані зібрані рідини збирають у резервуар.

Очищені рідини з антигеном РРМ 27а МР потім "діафільтрують", використовуючи » два об'єми (2х-2.5Х) ММРВ5 (із застосуванням половолоконного фільтра з відсіченням за номінальною молекулярною масою (ММУУС 300000-500000 кілодальтон (кДа))| при температурі від 4 "С до 29 76.

Після діафільтрації температуру антигену РРМ 27а МР2 підвищують до 3752 "С для інактивації шляхом додавання бінарного етиленаміну (ВЕЇ) до кінцевої концентрації 5 мМ. Антиген інкубують при 37-2"С і змішують протягом 72-96 годин. Залишковий ВЕ! нейтралізують молярним надлишком розчину тіосульфату натрію протягом принаймні 30 хвилин. Рідини з антигеном РРМ 27а МР2 переносять у пакети для зберігання при 453 "С до змішування вакцини.

Дані, представлені нижче в Таблицях ТА і 1В, показують, що вакцина РРМ 27а МР2 є невіроцидною для вакцини КергоСус? РЕБ5 ЕИШ і вакцини Іпдемас? РЕК5З МІУ, відповідно, при змішуванні протягом періоду до 8 годин (одного робочого дня).

Таблиця 14А: Дві (2) серії КергоСус РЕК5 ЕШЄ, номери партій 3910003А (10 доз) і 3910004А (50 доз), зберігали при 5 "С хз 3 "С у пакувальних матеріалах до використання для дослідження. Дві (2) серії РРМ 27а МР2, номера партій 7600016А (10 доз) і 76000188 (50 доз), використовували як розріджувач для Іпдеїмас РергоСус? РЕВБ5 Би партії 3910003А (10 доз) і 3910004А (50 доз), відповідно. Ці дві партії зберігали при 5 "С х 3 "С у пакувальних матеріалах до використання для дослідження. Вакцину КергоСус? РЕБ5 БЕ, після відновлення вологовмісту (або в розріджувачі, що містить Сагбророї, в групі 1, або рідка вакцина проти РРМ 27а МР2 у групі 2), зберігали при кімнатній температурі (15-25 "С) протягом максимального періоду 8 годин і випробовували на титр на початку відліку часу, через дві, чотири й 8 годин. Результати титрування вірусу в Групі 1 (0910

ТСІО50/2 мл дозу), представлені нижче в Таблиці ТА для ТО, 12, Т4 і Т8, продемонстрували стійкість вірусу до 8 год. Результати титрування вірусу в Групі 2 (0910 ТСІО50/2 мл дозу) на асоційованому продукті для ТО, Т2, Т4 і Т8, продемонстрували, що вакцина РРМ 27а МР2 не має віруцидної активності проти РергоСус? РРЕ5 ЄИШ до 8 год.

Таблиця 1А му Дослідження (год.)

Р 012148 3910003А

КергоСус? РАВ5 808001 ЗА Контроль 5,8 5, 5, 5, 1 ЕЦ ях розріджувач КергоСус? РАН5 3910004А

Саторої! БО рені 8080019А нЖЕЖрнинининининининининнинниннншшш

Визначення

РРУ 27а МР? 4 3910003А | стабільності після 2 | Вергосус? РАН5 4 для заявлено 5, | 59) 5,8 | 58 о 760016 асоційованого застосування

Таблиця 18: Дві (2) серії Іпдемас РКК5 МІУ, номера партій 2451189А (10 доз) і 2451188А (50 доз), зберігали при 5 "С хз 3 "С у пакувальних матеріалах до використання для дослідження. Дві (2) серії РРМ 27а МР2, номери партій 7600016А (10дозе) і 76000188 (50дозе), використовували як розріджувач для Іпдеїмас? РКК5З МІУ, партії 2451189А (10 доз) і 2451188А (50 доз), відповідно. Ці дві партії зберігали при 5 С т 3 "С у пакувальних матеріалах до використання для дослідження.

Вакцину Іпдеїмас? РККЗ МІМ, після відновлення вологовмісту (або в розріджувачі, що містить

Сагророї, в групі 1, або рідка вакцина проти РРМ 27а МРО2 у групі 2), зберігали при кімнатній температурі (15-25 "С) протягом максимального періоду 8 годин і випробовували на титр (ТСІО5О на 2 мл дозу) на початку відліку часу, через два, чотири й 8 годин. Результати титрування вірусу в

Групі 1 (0910 ТСІЮО50/2 мл дозу), представлені нижче в Таблиці 1В для ТО, Т2, Т4 і Т8, продемонстрували стійкість вірусу до 8 год. Результати титрування вірусу в Групі 2 (0910

ТСІО50/2 мл дозу) на асоційованому продукті для ТО, Т2, ТА і Т8, продемонстрували, що вакцина

РРМ 27а МР не має віруцидної активності проти Іпдемасе РКК5 МІМ до 8 год.

Таблиця 18

Група Діюча речовина Ціль Год910 ТСІО50/2 мл дозу помер о | 2 || 8

Іпдемас? РАН5 МІ М 2451189А | Контроль в розріджувач ж Іпдемас? 61 62 6,3 4 Саторої 8080019А | РАН5 МІ М 2451188А 8080019А нин

РРМ 27а МР2 2451189А | Визначення

Іпдемас? РАН5 МІ М ж стабільності після 6,1 7600016А | розкриття й 2АБІТВВА | заявленого 76000188 асоційованого 6,4 6,3 6,5 6,5 застосування

ПРИКЛАД 3:

Ефективність вакцини РЕК5М-ЕИШ при змішуванні вакцини РЕКЗМ-ЕО з вакциною РРМ МР2

Тридцять шість (36) невагітних свинок статевозрілого віку рандомізовано розподіляли по трьом експериментальним групам, кожна з яких включала дванадцять свинок. Група ТО1 одержувала контрольний продукт М/РВ5 (промивний фосфатно-буферний сольовий розчин) (контроль) на початку відліку часу й на 21-й день (00, 021). Група Т02 одержувала КергоСус? РАВ5 Є) (РАНБ, штам 94881), 3,9 Іс910 ТСІОво на дозу, і вакцину від свинячого парвовірусу, РРУ-27а МР, 10 мкг на дозу (змішана) в ОО і РРУ-27а МР2, 10 мкг на дозу, тільки в 021. БергоСус? РЕКЗ ЕІ ліофілізованій таблетки піддавали відновленню вологовмісту з використанням рідини РРУ-27а МР2. Група ТОЗ3 одержувала КергоСус? РАН Би (окремо) в 00. Лікування було розроблено таким чином, що свинки одержували РергоСус? РЕ БИ у мінімальній імунізуючій дозі й РРУ-27а МР2 при максимальній відносній активності. Свинки одержували провокуючі дози 5,5 Іо0діо!СіЮвоє мл загальної дози (2 мл внутрішньом'язово й 2 мл у кожну ніздрю) гетерологічний РККЗМ ЕИШ ізолят 190136 через чотири тижні після первісної вакцинації (028) і зразки сироватки збирали в наступні дні: 031, 035, 038, 042 і 049. Віремію РКК5М випробовували шляхом кількісної ПЛР (кКПЛР)

ІЗапага ВеміПа-Регпапае? еї аї., доигпаї! ої Мігоїодіса! МеїШоаз 126 (2005) 21-30). Провокуючий вірус європейський вірус РКК5 ізолят 190136 спочатку одержували із тканини легені немовляти поросяти з ферми, на якій виявлялися типові відтворені ознаки РКК5М (викидні у свиноматок і ослаблені новонароджені поросята) під час спалаху в Нижній Саксонії, Німеччина, у квітні 2004 р.

Лікуючі ветеринари направляли зразки легенів в Віобсгееп (зразок прибув 21 квітня 2004 р.) на діагностичне дослідження. Провокуючий вірус розмножували в клітинах АК-МА104 і двічі пересівали перед провокацією.

Після провокації обидві групи ("змішана" і "окрема" демонстрували ефективність проти вірулентного РККЗМ з показниками площі під кривій (АОС) для кількісного вірусного навантаження з 028 по 049 24,36 СЕ/мл (СЕ - геномниеє еквіваленти) для "змішаної" (р-0,0002) і 32,54 СЕ/мл для "окремої" (р-0,0045) у порівнянні з 50,85 СЕ/мл у контрольній групі. Ці дані представляють приблизно 50 95 зниження в динаміці системно циркулюючого вірусу у свиней для "змішаної" групи й приблизно 40 95 зниження для групи, що одержувала тільки КергоСус? РЕН5 ЕІ (Фігура 1), демонструючи значний захисний ефект в "змішаної" і "окремої" групах. Крім того, кількісний аналіз

КПЛР середнього РКК5ЗМ продемонстрував значне зниження вірусного навантаження РККЗМ для "змішаної" групи в 035 (р«0,0001) і в 038 (р-0,0052) і в "окремій" групі в 035 (р«0,0001) у порівнянні з контрольною групою, демонструючи значний захисний ефект в "змішаної" і "окремої" групах.

Аналіз КПЛР продемонстрував значне зниження пропорції позитивних свинок в 035 для "змішаної" (р-0,0013) ії "окремої" (р-0,0046) і в 038 для "змішаної" (р-0,0137) у порівнянні з контрольною групою. Хоча вона не є статистично значимою, чисельна тенденція до зниження середнього вірусного навантаження й пропорції КПЛР-позитивних на РЕК5М спостерігався в "змішаній" групі в р42 і 049. Подібні тенденції спостерігалися для "окремої" групи із чисельним зниженням середнього вірусного навантаження в 049 і пропорції КПЛР-позитивних в 042 і 049.

Застосування вакцини КергоСус? РАН5 ЕІ, окремо або змішаною з вакциною РРУ-27а МР, виявилося ефективним проти вірулентного штаму РКК5М-БЕО для провокаційного зараження, демонструючи початок імунітету протягом чотирьох тижнів. З даних, представлених на Фігурі 1 і

Фігурі 2, стає очевидним, що змішування вакцини КергоСус? РЕБ5 БІ з РРУ-27а МР2 поліпшує ефективність. Результати демонструють відсутність взаємних перешкод між РЕКЗМ-компонентом і

РРУ-компонентом в "змішаній" групі демонструючи переваги можливості асоційованого застосування шляхом змішування.

ПРИКЛАД 4:

Ефективність вакцини РРМ УРІ2 при змішуванні вакцини РЕКК5М-ЕІ з вакциною РРМ МР2

Оцінка ефективності комбінованих вакцин: ефективність асоційованого застосування обох вакцин (КергоСус? РЕК ЕІ (РЕБ5, штам 94881) і РРУ-27а МРІЇ оцінюють на експериментальних інфекціях РРУ.

Ефективність проти експериментальної провокації диким штамом РРУ: ефективність комбінованої вакцини проти РРМ оцінюють на основі інфекції РРМ у плодів. Вакцина вважається ефективною, якщо г 80 95 плодів у кожній експериментальній групі є серонегативними на РРУ.

Догляд за тваринами: тварини перед початком дослідження мають гарний стан здоров'я й аліментарний статус. Перед включенням і процедурою рандомізації проводять медичне обстеження. Протягом усього дослідження використовують нелікарський корм. Раціон харчування підбирають згідно з віком, станом і видом досліджуваної тварини відповідно до затвердженої в центрі стандартної робочої процедури. Воду забезпечували ай Ійбійшт протягом усього дослідження.

Оцінка ефективності асоційованого застосування вакцин РРМ ії РКК5М після провокації гетерологічним штамом РРУ: на початку відліку часу (00) звичайних невагітних свинок у віці 5-6 місяців рандомізовано на рівних умовах розподіляють по трьом експериментальним групам. Група

ТО1 одержує 2 мл ІМ контрольного продукту (розріджувач РВ5-Сагбророї (Іпргап РІ ЕХУ) на початку відліку часу й на 21-й день (00, 021). Група Т02 одержує 2 мл ІМ КергоСусб РКК Б) (РЕК, штам 94881) і вакцину від свинячого парвовірусу, РРУ-27а МР2, в СО ії РРУ-27а МР тільки в 021.

Для Групи Т02 ліофілізовану таблетку КергоСсус? РКЕК5 БІ піддають відновленню вологовмісту розчином вакцини РРУ-27а МР2. Група ТОЗ3 одержує 2 мл ІМ вакцини свинячого парвовірусу, РРУ- 27а МР2, (1 мкг/дозу) в БО ї в 021. Свинок спостерігають щодня на загальний стан здоров'я.

Тваринам вводять провокуючу дозу між 39-м і 42-м днями вагітності, використовуючи гетерологічний штам РРМ 401/09 (198669), отриманий від Віоб5сгееп (Мюнстер, Німеччина), узятий із тканини муміфікованого поросяти 15 червня 2004 р. і відправлений у Лейпцігський університет,

Німеччина (провокуючий вірус розморожують і розводять в ОМЕМ (1х, бібсо, Кей 1966-025, І сія 1632505) до заданої дози 6,0 Іс910 ТСІЮОвоє мл дозу). Плоди збирають (стандартна процедура) приблизно на 90-й день вагітності й оцінюють на наявність РРМ за допомогою ПЛР (Моїйног ТУМ еї а|., Чоитаї ої Мігоіодіса! Меїнодз 1991, 32: 201-211) зразків їх органів або тканинних рідин, а також на їх стан, розмір і масу. Лікування розробляють таким чином, щоб свинки одержували КергоСус?

РККЗ БО (РКК5, штам 94881) і вакцину від свинячого парвовірусу, РРМ-27а МР2, при максимальній імунізуючій дозі КергоСсус? РАВН5 БІ (1070 ТСІОзог мл дозу; середнє геометричне) і вакцину від свинячого парвовірусу, РРУ-27а МУР, при мінімальній відносній активності (1 мкг/ дозу).

Дослідження було дійсним згідно з Монографією Європейської фармакопеї 8.0 04/2013:0965, оскільки вакцина забезпечувала захист 95,7 95 (група ТОЗ) і 94,3 95 (група Т02), тоді як у групі ТО1 (контроль) було 91,4 95 позитивних плодів (див. Таблицю 2).

Таким чином, вакцинація вакциною проти РРУ, окремо або в суміші з КергоСус?б РКК5 ЕМ, є безпечною при виконанні вакцинації за три тижні до спарювання.

Таблиця 2

Відсоток позитивних плодів на групу тоне Дена ПТН ЕН

Група Кількість свинок |Кількість плодів : і плодів групах 1 Кількість РРУ-позитивних плодів / кількість плодів на групу.

ПРИКЛАД 5:

ПРИГОТУВАННЯ СУБОДИНИЧНОЇ ВАКЦИНИ ПРОТИ РРМ

Антиген РРМ МР2 вибирають для експресії в інфікованих бакуловірусом клітинах комах на основі німецького ізоляту РРМ 27а. Нуклеотидну послідовність свинячого парвовірусу (РРМ) 27а

МР2 одержують від СепрапкК під номером доступу АУб84871.1. Кодуюча ділянка РРМ 27а МР2 є піддана зворотній трансляції й кодон-оптимізованою для Югозорпйа (ЗЕО ІЮ МО: 4 ї 5ЕО ІЮО МО: 3).

Кодон-оптимізований ген РРМ 27а МРІ2 хімічно синтезований в Іпіедгаїед ОМА Тесппоодіе5. Ген

РРМ 27а потім субклонують у бакуловірусний вектор переносу рмі 1393 і спільно трансфікують з лінеаризованим остовом бакуловірусу ОЮОіатопаВас? у клітини комах 519 для генерації рекомбінантного бакуловірусу, що містить ген РРМ 27а МР2, під контролем поліедринового промотору.

При експресії в клітинах комах 519 РРМ МР2 самоорганізується в безоболонковний МІ Р (дані не показані).

Антиген РРМ МР2 доповнюється карбомером як ад'ювант (Сагророї).

ПРИКЛАД 6:

РАННЯ СТАДІЯ КЛІНІЧННОГО ДОСЛІДЖЕННЯ ВАКЦИНИ ПРОТИ РРМУ

У всіх дослідженнях на тварин тварини мають гарний стан здоров'я й аліментарний статус перед початком дослідження. Перед процедурою рандомізації проводять медичне обстеження.

Нелікарський корм використовують протягом усього дослідження. Раціон харчування підбирають згідно з віком, станом і видом досліджуваної тварини відповідно до затвердженої для центру стандартної робочої процедури. Воду забезпечували ай Ірйшит протягом усього дослідження.

Ціль цього дослідження провокаційної вакцинації полягає в забезпеченні доказу ефективності концепції визначення дози для перед спарюванням субодиничної вакцини проти свинячого парвовірусу (РРУ) (див. Приклад 5). Свинок вакцинують і осіменяють перед провокацією ізолятом живого вірулентного РРМ (РРМ 002346-5; північноамериканський штам) приблизно після 40 днів вагітності (а). Плоди оцінюють на наявність інфекції РРМ приблизно після 90 ас.

План дослідження описується в Таблиці 3.

Таблиця З

План дослідження . . Запліднен- Оцінка .

ІМ 4. 2 мл на 021 лев. (4040) РРМ)| (79045)

ТЗ |Позитивний контроль шия ІМ 002346-5 (цільноклітинний прав. шия ІМ інактивований РРМ) ІМ совується з9аас

МТХ « Контроль без лікування / провокації; ІМ « інтраназальне;

ІМ - внутрішньом'язове; а0 - днів вагітності.

Використовують шістдесят сім свинок із череди, раніше випробуваної на відсутність РРМ, з відсутньою історією захворювань репродуктивної системи або вакцинації проти РРМ. Свинок рандомізовано розподіляють по б експериментальних групах (Т) п-9, об'єднаних в З ряди, що одержують вакцинацію на ро і стимуляцію на 021: Т1 МС (негативний контроль, що одержує воду для ін'єкцій), Т2 РРМ 10 мкг, ТЗ РС (позитивний контроль; цільний, інактивований свинячий парвовірус (РРУ), Егузіреіоїйгіх гпизіораїпіає, Іеріозріга сапісоїа, Г. дгірроїурпоза, ГІ. Нагдіо, 1. істегопаєтоггпадіає і Ї. Ротопа; серійного виробництва; застосовуються відповідно до інструкції виробника). Включають трьох, що не одержували лікування контрольних (МТХ) свинок, по одній на ряд. Після вакцинації свинок синхронізують (шляхом введення Маїйіх?; айгеподеві, Іпіегуеї

ЗсПегпіпа-Ріоцдн Апітаї! Неакй; згідно з маркуванням протягом 14 послідовних днів, з 018 по ОЮЗ1), а потім спарювали між О35 і 042. П'ятдесят чотири з 67 свинок завагітніли. На 080 (приблизно 40ас),

МТХ-свинок піддають розтину, а інших свинок інокулюють б мл штаму РРМ РРУ002346-5 (північноамериканський штам) у кількості 4,25 ІосдіоГСіІЮОво на дозу (2 мл внутрішньом'язово й 2 мл у кожну ніздрю інтраназально). У свинок щотижня брали кров, за винятком періодів синхронізації й спарювання (035 - 070). Серологічне дослідження виконують на зразках сироватки, узятих на 00, 07, 014, 0021, 0028 і 073; серологічне дослідження й полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) (як описується в публікації Уогмік еї а. 2009; доигпа! ої Сепега! МігоІоду, 90, 2437-2441) на віремію виконують на зразках сироватки, узятих на 080, 087, 094, 0101, 0108, 0115, 0122 і 0128. Свинок піддають розтину на 0129 або 0130 (приблизно 9045). При розтині кожний репродуктивний тракт витягають і записують позицію плода в матці, стан плода, його розмір і вагу. Збирають зразки торакального промивання й легень кожного плода. Зразки торакального промивання збирають в асептичних умовах з кожного плода. Загалом, З мл стерильного РВ5 шляхом ін'єкції вводять у грудну порожнину за допомогою стерильної голки й шприца. Рідину відсмоктують назад у шприц і вводять у відповідну стерильну 551 (пробірку для відділення сироватки) підходящого розміру.

Зразки торакального промивання досліджують на наявність РРМУ за допомогою ПЛР і на наявність антитіла РРМ за допомогою інгібування гемаглютинації (НІ). Легеневу тканину зберігають у замороженому вигляді.

Віремія свинок (РРМ)

Усі свинки є негативними на віремію РРУ перед провокацією на ОО, 073 (дані не показані) і 080 (Таблиця 4). Усі негативні контрольні тварини є віремічними на 087, і 4/7 є віремічними на 094.

Поствакцинаційні свинки ТЗ сероконвертуються після бустерної вакцинації. 72 виявляє серологічну відповідь на первинну вакцинацію й залишається серопозитивним після бустерної вакцинації. Контрольні свинки Т1 залишаються серологічно негативними у відношенні РРМ до провокації. Після провокації всі негативні контрольні свинки є віремічними на 087 (через сім днів після провокації). Одна свинка ТЗ є віремічною на 087. Усі інші свинки не є віремічними в ці моменти часу (див. Таблицю 4).

Свинки МТХ залишалися серологічно негативними, і їх плоди були негативними на РРМУ згідно із

ПЛР на зразках торакального промивання.

Таблиця 4

Розподіл частоти РРМ-позитивних свинок (ПЛР), що одержали провокаційну дозу РРМ після 40 днів вагітності (ас) на 080.

Лікування / опис

Позитивний контроль

ТЗ (цільноклітинний 0/9 1/9 0/9 0/9 0/9 0/8 0/8 0/8 інактивований РРУ)

Результати плодів

Усі плоди МТХ вважаються нормальними згідно з розтином на 080 (Таблиця 5). При остаточному розтині на 0129 і 0130 22,5 95 плодів Т1 (негативний контроль) є нормальними, і при цьому 98,39 95 плодів в ТЗ і 97,62 95 плодів в Т2 є нормальними. Середній розмір і вага плодів Т1 (негативний контроль) становить 11,5 см і 168,8 г, відповідно, тоді як середній розмір і вага плодів в

Т2 становить 17,5 см і 590,1 г, відповідно.

Усі плоди ТА (МТХ) є негативними на РРМУ згідно із ПЛР на зразках торакального промивання (див. Таблицю 3). Інфекція РРМ підтверджується в 67/80 негативних контрольних плодів Т1 (83,75 95). Шістдесят два з 67 негативних контрольних плодів, підтверджених як інфіковані РРУ, є муміями. На відміну від них, інфекція РРУ підтверджується лише в 0,79 95 плодів Т2.

На основі визначальних параметрів ефективності, як вказується в Європейській фармакопеї (монографія 01/2008:0965), усі вакцини (включаючи Позитивний контроль (цільноклітинний інактивований РРМУ)) відповідають критеріям захисту від інфекції (80 95 плодів, негативних на

РРУ).

Таблиця 5

Деталі приплоду: кількість, розмір, вага й стан плодів і лабораторне підтвердження інфекції

РРУ (ПЛР на зразках торакального промивання). інактивований РРМУ) свинок | 5 | 8 1 77777779 7777771 заг бплодів | 80 | 126 | 7777777777717171711112411111111111111с1 приплоду

Станплода:ї//1Ї11111111111111111

Мумї 777 1162 | 3 1 щЩщЩщ777/72 10 (Середнійрозмір(см) | 11,5 | 175 | 178 /|60

ЖРРМяплоди.// | 67 | 1 | (БЙЙфЩфЩДЙ 3 г щЩщ ( 0 оббпозитивних |83,75| 079 | 77242710 (ббзахищених (1625 | 9921 | 779758 77111, "Розтин плодів МТХ після 50 днів вагітності

МС - Негативний контроль

Висновок: Вакцина проти РРМ відповідно до даного винаходу продемонструвала захист плодів після провокації вірулентним гетерологічним РРУ. Результати дослідження показують, що вакцина безпечна при введенні в період перед спарюванням і ефективна для істотного зниження віремії й трансплацентарної інфекції плодів. Крім того, було продемонстровано, що вакцина захищає від гетерологічного північноамериканського штаму РРМ для провокаційного зараження. Крім того, було продемонстровано, що субодиничний білок РРМУ УРА є настільки ж ефективним, як і цільний убитий вірус.

ПРИКЛАД 7:

УСТАНОВЛЕННЯ МІНІМАЛЬНОЇ ІМУНІЗУЮЧОЇ ДОЗИ ВАКЦИНИ ПРОТИ РРМ - ЗАХИСТ ВІД

ГЕТЕРОЛОГІЧНОГО ПІВНІЧНОАМЕРИКАНСЬКОГО ШТАМУ РРУ

Ціль цього дослідження провокаційної вакцинації полягає у встановленні мінімальної імунізуючої дози (МІФ) для вакцини проти свинячого парвовірусу (РРМ). Свинкам вводять провокуючу дозу ізоляту живого вірулентного РРМ серотипу 1 (РРМ 002346-5) приблизно після 40 днів вагітності (45). Вакцина вважається ефективною, якщо 280 95 плодів у вакцинованій групі є негативними на РРМ після провокації. До підтверджувальних параметрів належать розмір, вага й стан плода, статус віремії свинок після провокації й серологічний статус свинок.

Свинок (з відсутньою історією захворювань репродуктивної системи або вакцинації від РРМ) рандомізовано розподіляють по експериментальних групах: ТО1 - негативний контроль (відповідне до продукту плацебо (РМР)) і Т02-1,0 мкг РРУ/2 мл дозу). Свинок без лікування / провокації (МТХ) рандомізовано розподіляють по загонах як контрольні тварини для загального стану здоров'я.

Свинки одержують 2 мл відповідного лікарського препарату внутрішньом'язово на ро ії 021.

Після вакцинації свинок спарюють між 037 і 050, а потім оцінюють стан вагітності на 074. На 081 вагітним свинкам вводять провокуючу дозу 6,77 Іосд10ГСІЮвовє мл РРМ серотипу 1 внутрішньом'язово й інтраназально. У свинок щотижня беруть кров, за винятком періодів синхронізації й спарювання (036-073). Аналізи інгібування гемаглютинації (НІ) виконують на зразках сироватки, узятих на 07, 014, 021, 0028 і 035; НІ ї полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) (див. Приклад б) на віремію виконують на зразках сироватки, узятих на 0-3, 074, 080, 088, 0095, 0102 ії 0127. Свинок піддають розтину на 0128 і 0129 (приблизно 90 ас). При розтині репродуктивний тракт кожної свиноматки витягають і записують позицію плода в матці, стан плода, його розмір і вагу. Зразки торакального промивання (див. Приклад б) збирають із кожного плода й досліджують на наявність РРМ за допомогою ПЛР.

Віремія свинок (РРМ)

Вакцини вважаються безпечними, оскільки у тварин не виявляється відхилень температури тіла через 24 години або 48 годин після вакцинації, аномальних місцевих реакцій, обумовлених дією вакцини, і клінічних ознак, пов'язаних з вакцинацією (дані не показані).

Усі свинки є негативними на віремію РРМУ перед вакцинацією, перед провокацією на 074 їі на 080. Таким чином, після вакцинації клінічні ознаки, пов'язані із введенням вакцини, не спостерігаються. На 088 усі десять свинок ТО1 є віремічними, і всі вакциновані свинки є негативними. Усі інші зразки крові, узяті на 095, 0102 і 0127, є негативними на віремію РРМ для всіх експериментальних груп (Таблиця 6).

Таблиця 6

Розподіл частоти РРМ-позитивних свинок (ПЛР), що одержали провокаційну дозу РРМ після -40 днів вагітності (а5) на О81

Лікування / опис

" в2 свинок було діагностовано відсутність вагітності, і, таким чином, вони були виключені із групи

Результати плодів

При остаточному розтині на 0128 і 0129, 38 95 із плодів ТО1 (негативний контроль) знаходяться у нормальному стані, тоді як у вакцинованій групі в нормальному стані перебувають 95 95 плодів.

Середній розмір і вага плодів ТО1 (негативний контроль) становлять 14,4 см і 245,9 г, відповідно, тоді як середній розмір і вага плодів у вакцинованих свиней становить 19,3 см і 550 г, відповідно (Таблиця 7).

Таким чином, вакцинована група відповідає критеріям захисту від інфекції РРУ, оскільки згідно з визначальним параметром для ефективності проти РРМУ, установленому в РИ. Еиг. 01/2008:0965, становить 280 95 плодів в експериментальній групі повинні бути негативними на РРУ.

Інфекція РРМ підтверджується в 113/146 негативних контрольних плодів (ТО1) (77 95). Однак інфекція РРМУ у вакцинованій групі (Т02) становить усього 10 95.

Таблиця 7

РРМ (ПЛР на зразках торакального промивання) оФзахищенихо/////7777777777111111111111111111111111111111111111111111111111190961

Висновок: Субодинична вакцина проти РРМ МР2 відповідно до даного винаходу демонструє захист плодів після провокації вірулентним гетерологічним РРМУ. Результати цього дослідження виявляють, що вакцина є безпечною й ефективною для запобігання віремії у свинок і інфекція РРУ у плодів при застосуванні всього 1 мкг субодиничної вакцини РРМ МР2. Крім того, продемонстровано, що вакцина захищає від гетерологічного північноамериканського штаму для провокаційного зараження.

ПРИКЛАД 8:

ГЕТЕРОЛОГІЧНОГО ЄВРОПЕЙСЬКОГО ШТАМУ РРМ

Ціль цього дослідження полягає в оцінці початку імунітету, забезпечуваного вакциною від свинячого парвовірусу (РРМ МР2, далі називаною вакциною проти РРМ). Крім того, безпеку й ефективність оцінюють із застосуванням плану рандомізованого, сліпого дослідження з негативним контролем, що включає вакцинацію й провокацію.

Свинок рандомізовано розбивають на три групи. У групах 1 і 2 свинок вакцинують двічі, із тритижневим інтервалом (на БО ї 021). Другу дозу вводять за три тижні до спарювання. Усі лікарські препарати вводять внутрішньом'язовим (ІМ) шляхом в об'ємі 2 мл. Група 2 одержує вакцину проти РРМ, тоді як група 1 є плацебо-групою, що одержує стерильний розріджувач як контрольний продукт, і група З служить як строгий контроль, без якого б не було якого-небудь лікування.

Свинок синхронізують по еструсу й через три тижні після другої вакцинації штучно осіменяють.

Тварини, що завагітніли, на 084 між 39-м і 42-м днями вагітності одержують провокуючу дозу вірулентного, гетерологічного штаму РРУ.

На 0132-135, приблизно після 90-го для вагітності, свинок умертвляють, піддають розтину й досліджують плоди.

Таблиця 8

План дослідження

Група 1-е лікування 00 (2 | 2-е лікування 021 Провокація Ю84 Розтин мл у праву сторону (2 мл у ліву сторону) 6,0 од1іоГСіІОвов мл) доза шиї ІМ) шиї ІМ) (-4040) 2 мл прав. шия ІМ і 2 мл у кожну ніздрю інтраназально контроль) продукт продукт 198669 р1із5 198669 р1із5 ше 100202 2 1 ОО контроль)

Оцінка віремії РРУ у свинок до й після провокації за допомогою ПЛР:

Усі тварини є негативними на РРМУ згідно із ПЛР на 0-6 і 0-1 перед вакцинацією, що відповідає критеріям включення. Після вакцинації всі тварини в групах строгого контролю й контрольного продукту є негативними на антиген РРУ до провокації, і, таким чином, інфекція РРМУ до провокації може бути виключена.

Віремію досліджують на 7 (090), 14 (097) і 21 (0104) дні після провокації й у день розтину. Після провокації у вакцинованих тварин віремія не виявлялася, віремія має місце тільки в невакцинованих контрольних тварин.

На 090, (через 7 днів після провокації) уже 9595 невакцинованих контрольних тварин є позитивними на РРУ. На 0097 60 95 цих тварин усе ще мали позитивний результат, тоді як на 0104 усі дослідні тварини виявилися негативними на РРУ. На відміну від них, у вакцинованій групі всі тварини, випробувані на 090, 097 або 0104, є негативними на РРУ.

Таблиця 9

Кількість тварин з віремією після провокації

Ши ен Гете ро р97 р1іт104

Результати плодів

Відсоток інфікованих РРМ плодів становив 91,4 95 у контрольній групі, але лише 4,3 95 у групі

РРМ (див. Таблицю 10).

Таблиця 10

Відсоток позитивних плодів на групу й розмір приплоду с. о. Кількість позит. Середній

Кількість | Кількість . позит. позит.

Група : позит. (ПЛР) розмір . . свинок плодів й . плодів на | плодів на плодів плодів по | приплоду й й і приплід приплід групах

РРМ Її 719 | 231 | 10 | 43 | 122 | 0 | го

Кількість РРУ-позитивних плодів / Кількість плодів на групу. М Загальна кількість

Оцінка стану плодів

Усі плоди оцінювали на їх стан і розділяли на три категорії: нормальні, муміфіковані й аутолізовані.

Більшість муміфікованих і аутолізованих плодів виявляється в контрольній групі. Лише 39,8 95 плодів у цій групі знаходяться у нормальному стані, тоді як у вакцинованих групах 97,4 95 (РРУ- група) плодів мають нормальний стан (див. Таблицю 11).

Таблиця 11

Стан плода (М (заг.))

Висновок: Вакцина проти РРМ відповідно до даного винаходу демонструє захист плодів після провокації вірулентним гетерологічним РРМ, що свідчить про те, що вакцина є безпечною й ефективною для профілактики віремії й інфікування плода РРМ при застосуванні всього 1 мкг вакцини. Крім того, продемонстровано, що вакцина також захищає від гетерологічного європейського штаму для провокаційного зараження РРУ. Таким чином, вакцина має широкий спектр захисту, оскільки вакцина захищає від гетерологічних північноамериканських, а також гетерологічних європейських штамів для провокаційного зараження.

Усі композиції й способи, які розкриваються й заявляються авторами, можуть бути отримані й виконані без зайвих експериментів з урахуванням представленого опису. Хоча композиції й способи згідно із даним винаходом були описані на прикладах кращих варіантів здійснення, фахівцям у даній галузі стане зрозуміла можливість внесення змін у композиції й способи й етапи або послідовність єтапів описаного авторами способу без відхилення від ідеї, суті й обсягу винаходу. Більш конкретно, стане очевидно, що деякі агенти, які є хімічно й фізіологічно спорідненими, можуть заміщати описані авторами агенти при досягненні таких же або подібних результатів. Усі подібні заміщення й модифікації, що є очевидними для фахівців у даній галузі, вважаються такими, що охоплюються суттю, об'ємом і ідеєю винаходу, які визначаються представленою нижче формулою винаходу.

ПРИКЛАД 9:

Підтвердження концепції свинячого парвовірусу (РРУ) / Визначення дози вакцини субодиничної комбінованої вакцини проти РРМ з Егузіреїоїйгіх гпизіораїйіає та/або вірусом свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому у свинок спарювального віку

Ціль цього дослідження провокаційної вакцинації полягає в забезпеченні даних із асоційованого застосуванню Іпдеїмас? РКК5М МІМ з експериментальної субодиничної комбінованою вакциною проти свинячого парвовірусу (РРМУ) з бактерином Егузіреоїйгіх гпизіораїніає (Егу) і у визначенні дози на підтвердження концепції ефективності для комбінованої вакцини проти РРУ з бактерином

Егу у свинок 5-6-місячного віку.

Шістдесят сім свинок брали із череди, попередньо обстеженого на відсутність РРМ без захворювання РРМ в анамнезі або вакцинації. Свинок рандомізовано розподіляли по 6 експериментальних групах п-9, змішаним в З загонах, що одержували вакцинацію на 0О і стимуляцію на 021: Т1 Негативний контроль, Т2 РРМ 10 мкг, ТЗ РРМ 0,1 мкг я Егу 10 Іодз, Т4 РРМ 1,0 мкг ї- Егу 10 Іод5, Т5 РРМ 10 мкг я Егу 10 Іодз, Тб Позитивний контроль (Раггожзиге? (ЗОЇ 0).

Включали трьох, що не одержували лікування контрольних (МТХ) свинок, по одній на ряд. Крім того, десять свинок поміщали в окремому будинку, і вони одержували Т7 РРМ 10 мкг к Егу 10 Ісд5 для регідратації Іпдеїмас? РКЕК5М МІМ для оцінки ефективності РРУ при комбінації з вакциною, що серійно випускається, проти свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому (РКК5). 17 представляє досліджувану групу для цього Прикладу 9.

Свинок вакцинували й спаровували; 54 з 67 свинок завагітніли. Приблизно після 40 днів вагітності (45) свинок МТХ піддавали розтину, а інших свинок інокулювали б мл штаму РРМУ

РРУ0О02346-5 у кількості 4,25 ІсдіоТСІЮво на дозу (2 мл внутрішньом'язово й 2 мл у кожну ніздрю інтраназально. У свинок щотижня брали кров, за винятком періодів синхронізації й спарювання (035-070), і сироватку випробовували, як описується в Таблиці 12.

Таблиця 12

Зразки й лабораторне дослідження, свинки ро, 080, 087, 094, 0101, 0108, 0115, 0122, Серологія свинок з р108, 0115, 0122, 0128 РРУ

Свинок піддавали розтину в 0129 або 0130 (- 90 ас). При розтині репродуктивний тракт кожної свинки витягали й записували позицію плода в матці, стан плода, його розмір і вагу. Збирали зразки торакального промивання й легень з кожного плода. Зразки торакального промивання випробовували на наявність РРМ за допомогою ПЛР і на наявність антитіла РРМ за допомогою інгібування гемаглютинації (НІ). Легеневу тканину зберігали в замороженому вигляді.

Свинки Т7 демонстрували серологічну реакцію на вакцинацію й не були віремічними після провокації. При розкритті 97,37 95 (111/114) із плодів Т7 були в нормальному стані, і тільки один плід виявився позитивним на РРУ. На відміну від них, Усі свинки Т1 були серонегативними під час фази вакцинації й сероконвертувались і ставали віремічними після провокації. При розтині тільки 22,50 95 (18/80) плодів Т1 були в нормальному стані, а 83,75 95 (67/80) виявилися позитивними на інфекцію РРУ, згідно із ПЛР рідини торакального промивання. Таким чином, комбінована вакцина (РРМ 10 мкг «з Егу) з Іпдемас РКК5 МІМ була ефективною для запобігання віремії й інфекції РРМ плодів на 4046.

План дослідження:

Таблиця 13

РРМ 0,1 мкг ж (без РКК5М) шия ІМ і ІМ во

ЕгУу |РРМ'ОМмкоЕ|9 з доле

СО

РРМ 10 мкг х 10 т7 Егу-Іпдеїмас

РАВ5 МІУ совується совується

Я - кількість; МТХ -« контроль без лікування / провокації; ІМ - інтраназальне; ІМ - внутрішньом'язове; дО - днів вагітності

Матеріали:

Контрольний продукт: контрольний продукт, який уводили негативним контрольним (Т1) тваринам, був стерильним розріджувачем (партія 2240), приготовленим з використанням води для ін'єкцій (МУРІ) з очищеної води в ВІМІ, 5. дозерп МО, США. Контрольний продукт поставлявся в об'ємі наповнення 100 мл у пластикових пляшках. 2 мл дозу вводили в правий шийний м'яз в СО з 2 мл бустерною дозою, яку вводили в лівий шийний м'яз в 021.

Вакцина: досліджуваною комбінованою вакциною для Т7 була експериментальна субодинична комбінована вакцина проти РРМ з бактерином Егу, використовуваним для регідратації ІпдеїмасФ

РАК МІМ. Сірий. 2Ж311-171 направляли в кількості 10 мкг/дозу для РРМ у комбінації з 10 Іод/дозу вбитого бактерина Егу, що поставляється співробітником лабораторії в пластикових пляшках, що містили 20 мл (10 доз). Одну пляшку Сірий. 2311-1711 використовували для регідратації однієї пляшки комерційної серії Іпдемас? РКК5 МІ М, одержуваної від дослідника, Сірий. 2245-853.2 мл дозу вводили в правий шийний м'яз в СО з 2 мл бустерною дозою, яку вводили в лівий шийний м'яз в 021.

Матеріал для провокації: матеріал для провокації проводився співробітником лабораторії, ВІМІ -

КУО, Атез ІА, перед здійсненням провокації. РРМ, штам 002346-5, направляли в кількості 5

Іоа'"ТСІО5о на дозу, 6 мл доза (партія Ж354-021) і тримали на льоді під час виконання провокації.

Титри провокації визначали шляхом аналізу ТСІОзо на утримуваному матеріалі після провокації, який зберігали при 4 "С. Кінцевий титр матеріалу для провокації становив 3,47 Іод/мл або 4,25 Іод/б мл дозу. В 080 усіх свинок інокулювали 2 мл матеріалу для провокації в кожну ніздрю, а також 2 мл внутрішньом'язово в правий шийний м'яз.

Способи:

Розтин й Оцінка плода: в Ю79 усіх свинок МТХ умертвляли шляхом внутрішньовенної ін'єкції барбітурату, а в 0129 ії 0130 умертвляли всіх свинок, що залишилися. Для кожного розтину витягали репродуктивний тракт і плоди діставали в асептичних умовах шляхом кесарева розтину.

Плоди ідентифікували за допомогою ідентифікатора плодів, що складається з ідентифікаційного номера свинки з наступною вказівкою букви (К для " правої труби" або ГІ для лівої труби) і числа, оскільки плід з'являється з розгалуження матки. Записували стан плода (нормальний або мумія), його розмір і вагу.

Збір зразків плодів: щоб уникнути перехресного забруднення зразків застосовували всі відповідні технології для стерилізації або очищення робочих зон і інструмента між маніпуляціями з кожним плодом і кожним зразком, як при розкритті, так і в лабораторії. Зразки маркували, указуючи ідентифікатор плода, тип зразка, день дослідження й день збору. Якомога раніше в день збору зразки доставляли на льоді співробітникові лабораторії. Співробітник лабораторії або призначена особа обробляли кожний зразок із застосуванням відповідних технологій щоб уникнути перехресного забруднення при аліквотуванні кожного зразка по пробірках належного розміру й з належним маркуванням. Одну аліквотну частину відправляли в ІЗО-МОЇ. Наявність вірусу вимірювали в кожному зразку за допомогою ПЛР. Інші аліквоти зберігали при -70 "С в ВІМІ-НЯО -

Атез.

Збір торакального промивання: у максимально асептичних умовах дослідник збирав торакальну промивання з кожного плода. Загалом, З мл стерильного РВ5 шляхом ін'єкції вводили в грудну порожнину за допомогою стерильної голки й шприца. Якнайбільше рідини відсмоктували назад у шприц, а потім уводили в 551 відповідного розміру.

Статистичні способи:

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ОДИНИЦЯ: свинка була експериментальною одиницею для Т1-16. У випадку порівнянь із Т7 приміщення було експериментальною одиницею в тому розумінні, що розміщення 17 було окремим від інших експериментальних груп.

Обгрунтування числа тварин: згідно з Європейською фармакопеєю, потрібно принаймні сім вакцинованих свинок і п'ять контрольних свинок для введення провокуючих доз (ЕРП 01/2008:0965).

У запасі передбачалося дев'ять або десять свинок на кожну групу, з урахуванням свинок, які можуть не завагітніти.

Рандомізація: перед початком дослідження статистик одержував ідентифікаційні номери свинок і рандомізовано розподіляв свинок по загонах і експериментальним групам на повністю випадковій основі. Три свинки були рандомізовано включені в групу МТХ, десять свинок були рандомізовано включені в групу 17, а інші свинки були рандомізовано нарівно розподілені по групах Т1, Т2, Т3, Т4,

Т5 їі Т6. Свинки Т1-6 і свинки МТХ були нарівно розподілені по трьох загонах у Сараї 1. Свинки Т7 були розміщені по одній у загонах у Сараї 2.

Критерії сліпого режиму: протягом усього дослідження від будь-якого персоналу, задіяного в зборі даних або виконанні лабораторних аналізів, був схований розподіл свинок по експериментальних групах Т1, 12, Т3, Т4, Т5 і Т6. Оскільки свинки 17 і МТХ були розміщені окремо, і сироватку випробовували на антитіло РКК5МУ, сліпий режим у відношенні цих двох груп не міг бути застосований для персоналу. Препарати вводилися особою, що не приймала участі у зборі даних.

Керування даними: статистичний аналіз даних здійснювався статистиком. Усі дані імпортували в 5А5 версії 9.2 (Сагу, ОБА/Мопй Сагоїїпа, БАЗ Іпзійше Іпс.) для обробки й аналізу.

Результати:

У зведенні цього дослідження представлені тільки порівняння для негативного контролю (Т1) із групою, що одержувала РРМ 10 мкг ї- Егу 10 Іод для регідратації Іпдеїмас?ю РЕКЗМ МІМ (17), |і представлені дані для груп 11, Т7 і МТХ.

Результати свинок: в СО Усі свинки були серологічно негативними на РКК5М згідно ЕГІ5А. В р21, 080 ї 0128 Усі свинки Т7 були серопозитивними на РЕК5М. В 073 Усі свинки Т7 були серопозитивними, і свинки в усі інших експериментальних групах були серонегативними.

Середнє геометричне титрів РРМ НІ для Т7 ставало й залишалося серопозитивним після бустерної вакцинації в 021, тоді як середнє геометричне титрів РРМ НІ для груп Т1 і МТХ залишалося серологічно негативним («х100) протягом фази вакцинації. Після 080, коли свинки ТІ і

Т7 одержували провокуючі дози РРУ, обидві групи були серопозитивними.

Усі свинки були негативними на віремію РРУ перед провокацією в СО, 073 (дані не показані) і рво (0). Усі негативні контрольні тварини були віремічними в 087, і 4/7 були віремічними в 094.

Таблиця 14

Розподіл частоти РРМ-позитивних свинок (ПЛР), що одержали провокаційну дозу РРМ після 40 днів вагітності (ас) на 080. 77771111 Деньдослідження(аС едніввагітност).7//:/60СС

Негативний

РРУЛЕУ/РАВ5

МА - не застосовується; Егу-10 Іод бактерину Егузірепіоїнгіх ппизіораїйіає; РЕБ5-ІпдеМмас?

РАН5 МІУ

Результати плодів: усі плоди МТХ вважалися нормальними згідно з розтином в О80 (0). При остаточному розтині на 0129 і 0130 22,5 95 плодів Т1 (негативний контроль) були нормальними, тоді як в Т7 99,12 95 плодів були нормальними. Середній розмір і вага плодів Т1 (негативний контроль) становив 11,5 см і 168,8 г, відповідно, тоді як середній розмір і вага плодів в Т7 становив 17,8 см і 576,3 г, відповідно.

Усі плоди МТХ були РРМУ-негативними згідно із ПЛР на зразках торакального промивання.

Інфекція РРУ підтверджувалася в 67/80 негативних контрольних плодів Т1 (83,75 95). Шістдесят два з 67 негативних контрольних плодів, у яких була підтверджена інфекція РРУ, були муміями. Усі 18 плодів нормального виду були з одного виводка, і тільки в п'яти із цих 18 плодів підтверджувалася наявність РРУ. Для 17 тільки одна свиня була інфікована з рівнем інфекції «1 95.

Таблиця 15

РРМ (ПЛР на зразках торакального промивання).

Кільвстьсвинок.о///Ї77777777111171511111111 11111183 (Загальна ількістьплодів.д | 80777777 Ї7111111414 71114400

Станплода:ї//777771111111111111111Ї11111111Ї111111 (захищених 7777777 77777 13016259) | ліз(99лаз) | -:Х (уЗШ "Розтин плодів МТХ після 50 днів вагітності

РРМУ/Егу/РКК5-10 мкг РРМУ--10 Іод бактерину Егузіреїіоїйнгіх гпизіорафіає, использ. для регідратації Іпдемас? РККЗ МІ М

ОБГОВОРЕННЯ / ВИСНОВОК

Свинки МТХ залишаються серологічно негативними, і всі їх плоди були РРУ-негативними згідно із ПЛР на зразках торакального промивання.

Свинки, яким уводили Т7 (10 мкг РРМАЕгу«РККЗМ), проявляли серологічну реакцію на первинну вакцинацію й залишалися серопозитивними після бустерної вакцинації. Жодна зі свинок

Т7 не була віремічною у дні щотижневого забору зразків після провокації. При розкритті 97,37 95 (111/114) плодів 17 були в нормальному стані, і тільки один плід виявився позитивними на інфекцію

РРМ згідно із ПЛР рідини торакального промивання. На відміну від них, свинки, яким уводили Т1

(Негативний контроль) були серонегативними під час фази вакцинації й після провокації, Усі свинки сероконвертувались і ставали віремічними. Середній розмір і середня вага плодів Т1 були значно меншими, чому в середньому в групі Т7. При розтині тільки 22,50 95 (18/80) із плодів Т1 були в нормальному стані, і 83,75 95 (67/80) виявилися позитивними на інфекцію РРУ, згідно із ПЛР рідини торакального промивання.

Таким чином, комбінована вакцина (РРМ 10 мкг ї- Егу) з РКК5 МІМ була ефективною для запобігання віремії й інфекції РРМ плодів на 4045.

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

5ЕО ІЮО МО: 4 являє собою кодон-оптимізовану нуклеотидну послідовність РРМ 27а МР2, яка була піддана подальшій модифікації таким чином, щоб включати два сайти рестрикційного ферменту СіаїЇ (в амінокислотній позиції 25 знаходиться ізолейциновий залишок, в амінокислотній позиції 36 знаходиться сериновий залишок, в амінокислотній позиції 37 знаходиться ізолейциновий залишок), щоб примикати до кодуючої ділянки УР2, що складається із гліцинових повторів. Однак сайти Сіа! включали таким чином, щоб не переривати кодуючу ділянку МР2. 5ЕО ІО МО: 2 являє собою білкову послідовність, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 4. 5БЕО ІО МО: З являє собою кодон- оптимізовану нуклеотидну послідовність РРМ 27а МР2 (без сайтів рестрикційних ферментів Сіаї).

ЗЕО ІО МО: 1 являє собою білкову послідовність, що відповідає ФЕО ІЮО МО: 3. 5ЕО ІО МО: 5 - 16 представляють інші білкові послідовності РРМ МР2 з (ЗЕО ІЮ МО: 5-10) або без (5ЕО ІЮ МО: 11-16) сайтів Сіа!. 5ЕО ІЮ МО: 17 відповідає послідовності дикого типу РАН5БМУ І еіузіайд, і 5ЕО ІЮ МО: 18 відповідає послідовності дикого типу РАНОМ УН2332.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 Воепгіпдек Іпдеі1іпПеїт Уестедіса стрн «1205 ВАКЦИНА ПРОТИ СВИНЯЧОГО ПАРВОВІРУСУ І ВІРУСУ СВИНЯЧОГО

РЕПРОДУКТИВНОГО І РЕСПІРАТОРНОГО СИНДРОМУ І СПОСОБИ

ІІ ОДЕРЖАННЯ

«1305 01-3229 «1605 18 «1705 РабепсІпПп версія 3.5 «2105 1 «2115 579 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 Ж 1

Мем Бек бі Авп Уаі1! сі біп Нів Авп Рго І1е АБп Аї1а сіу ТПг с1ц 1 З 10 15 теп Бек Аїа ТПг с1іу АБп бій Бек б1у б1у б1у бШ1у 0Ш1у Шу сш1у .1У зо сіу Агу біу Аїа сіу сіу Маї б1у Ма1ї Бек ТпПг б1у Бек Рпе Авп Авп сіп ТПпгЕ бі Рпе сіп Туг Гей б1у бій б1у Гей Уаі Агу Іїе ТПг А1а

ЗО зо бо

Нів Аїа Бек Агуд Гец І1е НівБ Гей АвБп Месє Рго б1і1ц Нів сіц ТіПг тус 65 7о 75 80

Тпув Агуд ч11е Нів Уаї гей АвБп Бек бі Бек с1іу Маі1і Аїа с1у сб1іп Меє

85 90 935 уаї б1іп Авр Авр Атїа Нів ТПпг о біп Меє Уа1 ТПг Рго Тер Бек Іец І1е 100 105 110

Авр Аї1а АБп Аїа Тгр б1у Маі Тгр Рпе А5зп Рго Аїа Авр Тгр сіп Гец 115 120 125

І1е Бек АБп АБп Меєсє ТПг біц І1е АБп Гей Уаі Бек Рпе б1п сбіп сіи 130 135 140

І1е Рпе АвБп Уаї Уаї гей пув ТПг чІ1е ТПг сій Бек Аїа ТПг Бек Рго 145 150 155 160

Рго ТПг пув І1е Туг Авп Авп Авр Гей ТПг Аза бек Гей Мес Уаї А1а 165 170 175

Те Авр ТПг АБп о АвБп о ТПг о Тей Рго Туг ТПг Рго Аза Аїа Рго Аг 5ег 180 185 190 сій ТпПг Гец сіу Рпе Туг Рго Тер Гей Рго ТПг Гув Рго ТПг сіп Туг 195 200 205

Ага Тук Тук Пец Бек Сув ТПг Агуд Абвп оГецй Авп о Рго Рго ТПг Тук ТП 210 215 220 сі1у бі1іп Бек сі біп І1е ТПпг Авр Бек І1е сіп ТПг сіу Гей Нів Бег 225 230 235 240

Авр чІ1е Месє Рпе Туг ТПг І1їе біц АБп Азїа Уаї Рго І1їе Нів Іецй Іецй 245 250 255

Агуд ТП с1у Авр біц Рбе Бек ТПг сіу І1е Туг Нів Рпе Авр ТПг Гув 260 265 270

Рго Ггец Ппув Ітец ТПг Нів Бек Тгр біп ТПпг АвБп Агуд бБеє теп С1Уу Гей 275 280 285

Рго Рго Ппув Іец Іїец ТПг біц Рго ТПг ТПпг сі с1у Авр біп Нів Рго 290 295 300 сі1у ТПпг Гей Рго Аза АТа АБп о ТПг Агу пув с1у Туєк Нів біп ТПг т1е 305 310 315 320

Авп о АБвп обБекг Туг ТПг бі Аїа ТПг Аза І1е Агуд Рго Аїа сіп Уаі щЩ1Уу 325 330 335

Тук Авп ОТП Рго Туг Мес Ап РпПе біц Тук Бек АвБп б1у с1у Рго РПе

340 345 З50 тей ТПг Рго Іїе Уаії Рго ТПпг Аза Авр ТПпг о біп Туг АБп Авр АБр с1и 355 З6о 365

Рго АБп сіу Аїа І1е Агуд Рбе ТПг Меє с1у Тук сіп Нів б1у сіп Гей 370 375 зво

ТПгЕ ТПг Бек Бек сіп сіц Ге біц Агуд Туг ТПг Рпе АвБп Рго біп б5ег 385 390 395 400 пув Сув б1у Агуд Аїа Рго пув біп бі1іп Рпе АвБп біп біп Бек Рго Гей 405 410 415

Авп опе біп Авп о ТПг АБп о Азп осіу ТПг о Гей Гей Рго бБег Ар Рго Пе 420 425 430 сі1у б1у Ппув ТПг Авп Меє Нів Рпе Меє Авп ТПг Гей Авп ТПг Ту Щ1У 435 440 445

Рго Ппей ТПг Аза тей АвБп Авп ТПг Аза Рго Уаії Рпе Рго Ап с1у сіп 450 455 460

І1е Тгр АвБр туз бі1ц Тец АвБр ТПг АБр тей пув Рго Агуд Те Нів Уаї 465 470 475 480

ТПгЕ Атїа Рго Рпе УМаї Сув Ппув Авп Авп Рго Рго сіу біп Гей РПпе Уаї1ї 485 490 495 пув Іїе Аза Рго Ап Гей ТПг Авр Авр Рпе АБп Аза АБр бек Рго сіп

З0о 05 з10 сіп Рго Агуд Іїе Іїе ТПг Туг Бек Авп Рпе Тгр Тгр ув с1у ТПг Гей з15 з20 25

ТПЕ Рпе ТПг Аза пув Мес Агуд Бек Бек Авп Мес Тгр АБп РГО І1е сіп з3о з35 з40 біп Нів ТПг Тпс ТтТпг АтТа бій АвБп о ч1І1е с1у Авп Туг І1е Рго ТПг Авп з5о 35 збо

І1е с1у с1у І1е пув Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд зЗ65 зЗ7о0 зЗ75 пув 'гец Туг «2105 2

«2115 579 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 2

Мем Бек бі Авп Уаі1! сі біп Нів Авп Рго І1е АБп Аї1а сіу ТПг с1ц 1 5 10 15 теп Бек Аїа ТПг с1іу АБп бій Бек І1е б1у б1у б1у 01у с1у сш1у .Щ1У сіу Агуд біу Бек Іїе сіу Маї б1у Ма1ї Бек ТпПг с1у Бек Рпе Авп Авп сіп ТПпгЕ бі Рпе сіп Туг Гей б1у бій б1у Гей Уаі Агу І1їе ТПг А1а бо

Нів Аїа Бек Агуд Гец І1е НівБ Гей АвБп Месє Рго б1і1ц Нів сіц ТіПг тус 65 70 75 80

Тпув Агуд ч11е Нів Уаї гей АвБп Бек бі Бек с1іу Маі1і Аїа с1у сб1іп Меє 85 90 935 уаї б1іп Авр Авр Атїа Нів ТПпг о біп Меє Уа1 ТПг Рго Тер Бек Іец І1е 100 105 110

І1е Рпе АвБп Уаї Уаї тей пув ТПг І1е ТПг сій Бек Аїа ТПг Бек Рго 145 150 155 160

Тук Авп ОТП Рго Туг Мес Ап РпПе біц Тук Бек АвБп б1у с1у Рго РПе 340 345 350 тей ТПг Рго Іїе Уаії Рго ТПпг Аза Авр ТПпг о біп Туг АБп Авр АБр с1и 355 360 365

Рго АБп сіу Аїа І1е Агуд Рбе ТПг Меє с1у Тук сіп Нів б1у сіп Гей 370 375 380

З0о 05 з10 сіп Рго Агуд Іїе Іїе ТПг Туг Бек Авп Рпе Тгр Тгр Гув сіу ТПг Гей з15 з20 25

ТПЕ Рпе ТПг Аза пув Мес Агуд Бек Бек Авп Мес Тгр АБп РГО І1е сіп з3о з35 з40 біп Нів ТПг Тпс ТтТпг АтТа бій АвБп о ч1І1е с1у Авп Туг І1е Рго ТПг Авп 45 з5о 35 збо

І1е с1у с1у І1е пув Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд зЗ65 зЗ7о0 зЗ75 пув 'гец Туг «2105 З «2115 1760 «2125 ДНК «213» Свинячий парвовірус «4005 З ччдаєссдсса ссаєдеЕссда даасдсддад садсасаасс сдасааасдс аддсасадад бо сЕДЕСЯОдсда сЕддсааєда дадсддаддс ддаддсддсд даддаддесдд асдсддсдса 120 часоадчадеЕду дсдЕЕЕсдас сддаадсссс аасаассааа ссдадесссса дгассгдддс 180 чадчздЧчЕєєда єдсоодаєвсас ддсісасдсуд Ссссдассда СбСасассссаа гаєсдссодад 240 саєчадасся асаадсдєає ссасдссссд аасссддаас сдддсдісдс соддесадаєд Зоо

ЧдЕССаачаєд аєдсесавас ссадасддаєд асасссоідда дсссдасада сдссаасдса збо

ЕдвдддсЧєдЕ ддЕєсаассс сдсддаєссдуа садссдасаа дсаасаасає дасадаааєс 420 ааЕгєєддеЕва дЯяЕеесдадса ададасассс аасдссдсдс Сдаааассає сасадададс 480 чдссасдадсс ссссддасудаа дасссасаас аасдассода сддсдсссЕє даєддссдсс 5:40

Еєддасасаа асаасасссе сссдсрасасс сссдсддссс сссдсадсда дассстгдддс бо гЕЄєваєссся додсеєдсссас саадссаасуд садсаєссдсс ассасссдад Есдсасасва бо аарєєдааєс содссддасасба сассддссад сСсддадсада Ссасддасад саєєссааасд 720 чЧдассЕдсасе ссдаєаєсає дЕсссасасуд асададаасуд садсасссає ссасстдстд 780 садабасодддач аєчадеЕєссс дассддсаєс бассассссд асасаааасс сеЕєДдаааєтд 840 асдсасадеє додсааассаа Ссдсссдссд ддсссдсссс сааадессдес дасддаассс 900 ассассдадуд дедассааса сссаддсассї сіссссдсад сааасасссу саадддстає 960 саєсааасда єсаасаасад ссасассдад дссассдсса Сссддссадс асаддсддада 1020 басаасасас сеЕсСасаєдаа сЕсСсдаасас сссаасуддсуд дсссдеЕЕссе дассссдаєба 1080

ЧдЕєссдассу ссдасасеса дсасаасдасє дасдадссда асддсдссає саддеЕєтасс 1140 асдддссаєс адсасуддіса ассдасаасе ссудссдсаад аасєддаасуд стасасаєсс 1200 аасссеЕсада деаадедедар ссдддсассс ааасаасадсо Ссаассадса асссссастд 1260 аассеєдсада асассаасаа Сддсасдссд ссдссаєсссд ассссассдуд аддааадасс 1320 аасаєдсаєс єсасдаасас дссдаасаса сбасддассас Сдассдссст даасаасасс 1380 дсасссудєсс Ессстааєсдуа ссадаєссду даєааададс Сддасасдда ссеЕдаадссс 1440 сдасеєссасуд ЕдасеЕдсдсес сЕСсСЕдсєдЕдс аааааєсаасс сассдддуаса ДФЕЕДЕЕСЄС 1500 аааасадссс ссаасеєдас сдасдасссс аасдсадаса дсссісадса дссдсдаатсс 1550 ассасстаєс сдаасесстд деЕддаадддс асодссдассє Єсасддстаа даєдсдсесд 1620 адсаасаєдс ддаасссаає ссадсаасає ассасаассуд ссдаааасає Сддсааєсас 1680 асссссасда асасаддсдуд аасааацчаєд ЕЕсссоудаде асесссадсе сарсссасдс 1740 аадсєдсаєс аадсддссдс 1760 «2105 14 «2115» 1760 «2125 ДНК «213» Свинячий парвовірус «4005 4 ччдаєссдсса ссаєдеЕссда даасдсддад садсасаасс сдасааасдс аддсасадад бо сЕДЕСЯОдсда сЕддсааєда ассдаєссддс ддаддсддадсдд даддаддедд асодсоддаєсд 120 аєсододчадеду дсдЕсЕсдас сддаадсссс аасаассааа ссдадесссса дгассгдддс 180 чадчздЧчЕєєда єдсоодаєвсас ддсісасдсуд Ссссдассда СбСасассссаа гаєсдссодад 240 саєчадасся асаадсдєає ссасдссссд аасссддаас сдддсдісдс соддесадаєд Зоо

ЧдЕССаачаєд аєдсесавас сСсадасддаєд асасссоідда дсссдасада гсдссаасдса збо

ЕдвдддсЧєдЕ ддЕєсаассс сдсддаєссдуа садссдасаа дсаасаасає дасадаааєс 420 ааЕгєєддеЕва дЯяЕеесдадса ададасассс аасдссдсдс Сдаааассає сасадададс 480 чдссасдадсс ссссддасудаа дасссасаас аасдассода сддсдссссс даєддссдсс 5:40

Еєддасасаа асаасасссе сссдсрасасс сссдсддссс сссдсадсда дассстгдддс бо гЕЄєваєссся додсеєдсссас саадссаасуд садсаєссдсс ассасссдад Есдсасасва бо аарєєдааєс содссддасасба сассддссад сСсддадсада Ссасддасад саєєссааасд 720 чЧдассЕдсасе ссдаєаєсає дЕсссасасуд асададаасуд садсасссає ссасстдстд 780 садабасодддач аєчадеЕєссс дассддсаєс бассассссд асасаааасс сеЕєДдаааєтд 840 асдсасадеє додсааассаа Ссдсссдссд ддсссдсссс сааадессдес дасддаассс 900 ассассдадуд дедассааса сссаддсассї сіссссдсад сааасасссд саадддстає 960 саєсааасда єсаасааєсад ссасассдад дссассдсса Сссддссадс асаддсддада 1020 басаасасас сеЕсСасаєдаа сЕсСсдаасас сссаасуддсуд дсссдеЕЕссе дассссдаєба 1080

ЧдЕєссдассу ссдасасеса дсасаасдасє дасдадссда асддсдссає саддеЕєтасс 1140 асдддссаєс адсасуддіса ассдасаасе ссудссдсаад аасєддаасуд стасасаєсс 1200 аасссеЕсада деаадедедар ссдддсассс ааасаасадсо Ссаассадса асссссастд 1260 аассеєдсада асассаасаа Сддсасдссд ссдссаєсссд ассссассдуд аддааадасс 1320 аасаєдсаєс єсасдаасас дссдаасаса сбасддассас Сдассдссст даасаатасс 1380 дсасссудєсс Ессстааєсдуа ссадаєссду даєааададс Сддасасдда ссеЕдаадссс 1440 сдасеєссасуд ЕдасеЕдсдсес сЕСсСЕдсєдЕдс аааааєсаасс сассдддуаса ДФЕЕДЕЕСЄС 1500 аааасадссс ссаасеєдас сдасдасссс аасдсадаса дсссісадса дссдсдаатєс 1550 ассасстаєс сдаасессвд деЕддаадддс асодссдассє Єсасддсєсаа даєдсдсесд 1620 адсаасаєдс ддаасссаає ссадсаасає ассасаассуд ссдаааасає Сддсааєсас 1680 асссссасда асасаддсдуд аасааацчаєд ЕЕсссоудаде асесссадсе сарсссасдс 1740 аадсєдсаєс аадсддссдс 1760 «2105 15 «2115 5:79 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 15

Мем Бек бі Авп Уаі1! сі біп Нів Авп Рго І1е АБп Аї1а сіу ТПг с1ц 1 З 10 15 теп Бек Аїа ТПг с1іу АБп бій Бек І1е б1у б1у б1у 01у с1у сш1у .Щ1У

Зо сіу Агуд біу Бек Іїе сіу Маї б1у Ма1ї Бек ТпПг с1у Бек Рпе Авп Авп сіп ТПпгЕ бі Рпе сіп Туг Гей б1у бій б1у Гей Уаі1і Агу І1е ТПг А1а зо зо бо

Нів Аїа Бек Агуд Гец І1е НівБ Гей АвБп Месє Рго б1і1ц Нів сіц ТіПг тус 65 70 75 8о

Тпув Агуд ч11е Нів Уаї гей АвБп Бек бі Бек с1іу Маі1і Аїа с1у с1іп Меє 85 90 535 уаї б1іп Авр Авр Атїа Нів ТПпг о біп Меє Уа1 ТПг Рго Тер Бек Іец І1е 100 105 110

Авр Аї1а АБп Азїа Тгр б1у Маі Тгр Рпе А5зп Рго Аїа Авр Тер сіп Гец 115 120 125

І1е Бек АБп АБп Меє ТПг біц І1е АБп Гей Уаії бек Рпе бій сіп Аїа 130 135 140

Те Авр ТПг АБп о АвБп о ТПг о Тей Рго Туг ТПг Рго Аїа Аза Рго Аг 5ег 180 185 190 сій ТпПг Гец сіу Рпе Туг Рго Тер Гей Рго ТПг Гув Рго ТПг сіп Туг 195 200 205

Ага Тук Тук Пец Бек Сув Іїе Агуд Авп Гей Авп о Рго Рго ТПг Тук ТПг 210 215 220 сі1у бі1іп Бек сі біп І1е ТПпг Авр Бек І1е сіп ТПг сіу Гец Нів Бег 225 230 235 240

Рго Рго Ппув Іец Іец ТПг біц Рго ТПг ТПпг сій с1у Авр біп Нів Рго 290 295 300 сі1у ТПпг Гей Рго Аза АТа АБп о ТПг Агуд пув с1у Тук Нів біп ТПг тс 305 310 315 320

Авп о АБвп обБек Туг ТПг біц Аїа ТПг Аза чІ1е Агуд Рго Аїа сіп Уаі щЩ1Уу 325 330 335

Тук Авп ОТП Рго Туг Мес Ап РпПе біц Тук Бек АвБп б1у с1у Рго РПе 340 345 350 тей ТПг Рго Іїе Уаії Рго ТПпг Аза Авр ТПпг біп Туг Авп Авр АБр с1и 355 360 365

Рго АБп сіу Аїа І1е Агуд Рбе ТПг Меє АБр Туг сіп Нів б1у сіп Гей 370 375 380

ТПгЕ Атїа Рго Рпе УМаї Сув Ппув Авп Авп Рго Рго сіу біп Гей РПпе Уаї1ї 485 490 495 пув Іїе Аза Рго Ап Гей ТПг Авр Авр Рпе АБп Аза АБр бек Рго сіп 500 505 510 сіп Рго Агуд Іїе Іїе ТПг Туг Бек Авп Рпе Тгр Тгр Гув сіу ТПг Гей 515 520 525

ТПЕ Рпе ТПг Аза пув Мес Агуд Бек Бек Авп Мес Тгр АБп РГО І1е сіп 530 535 540 біп Нів ТПг Тпс ТтТпг АтТа бій АвБп о ч1І1е с1у Авп Тук І1е Рго ТПг Авп 545 550 555 560

І1е с1у б1у І1е Акуд Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд 565 570 575 пув 'гец Туг «2105 6 «2115 579 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус

«4005 б

Мем Бек бі Авп Уаі1! сі біп Нів Авп Рго І1е АБп Аї1а сіу ТПг с1ц 1 5 10 15 теп Бек Аїа ТПг с1іу АБп бій Бек І1е б1у б1у б1у 01у с1у сш1у .Щ1У сіу Агуд біу Бек Іїе сіу Маї б1у Ма1ї Бек ТпПг с1у Бек Рпе Авп Авп сіп ТПпгЕ бі Рпе сіп Туг Гей б1у бій б1у Гей Уаі1і Агу І1е ТПг А1а бо

Тпув Агуд ч11е Нів Уаї гей АвБп Бек бі Бек с1іу Маі1і Аїа с1у с1іп Меє 85 90 935 уаї б1іп Авр Авр Атїа Нів ТПпг о біп Меє Уа1 ТПг Рго Тер Бек Іец І1е 100 105 110

Ага Тук Тук Пец Бек Сув ТПг Агуд Абвп оГецй Авп о Рго Рго ТПг Тук ТП 210 215 220 сі1у бі1іп Бек сі біп І1е ТПпг Авр Бек І1е сіп ТПг сіу Гец Нів Бег 225 230 235 240

Авр чІ1е Месє Рпе Туг ТПг І1їе біц АБп Азїа Уаї Рго І1їе Нів Іецй Іецй

245 250 255

Рго Рго Ппув Іец Іїец ТПг біц Рго ТПг ТПпг сій с1у Авр біп Нів Рго 290 295 300 сі1у ТПпг Гей Рго Аза АТа АБп о ТПг Агу пув с1у Туєк Нів біп ТПг т1е 305 310 315 320

Авп о АБвп обБекг Туг ТПг бі Аїа ТПг Аза І1е Агуд Рго Аїа сіп Уа1і щЩ1Уу 325 330 335

Тук Авп ОТП Рго Туг Мес Ап РпПе біц Тук Бек АвБп б1у с1у Рго РПе 340 345 350 тей ТПг Рго Іїе Уаії Рго ТПпг Аза Авр ТПпг о біп Туг АБп АвБр АБр с1и 355 360 365

ТПгЕ ТПг Бек Бек сіп сіц Ге біц Агуд Туг ТПг Рпе АБп о Рго біп б5ег 385 390 395 400 пув Сув б1у Агуд Аїа Рго пув біп бі1іп Рпе АвБп біп біп Бек Рго Гей 405 410 415

Авп опе біп Авп о ТПг Авп Азп осіу ТПг о Гей Гей Рго бБег Ар Рго Пе 420 425 430 сі1у б1у Ппув ТПг Авп Меє Нів Рпе Меє Авп ТПг Гей Авп ТПг Ту Щ1У 435 440 445

І1е с1у с1у І1е пув Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд 565 570 575 пув 'гец Туг «2105 17 «2115 579 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 7

І1е Бек АБп АБп Меєсє ТПг біц І1е АБп Гей Уаі Бек Рпе б1п сбіп сіи

130 135 140

Рго Рго Ппув Іец Іец ТПг біц Рго ТПг ТПпг сі с1у Авр б1іп Нів Рго 290 295 300 сі1у ТПпг Гей Рго Аза АТа АБп о ТПг Агу пув с1у Туєк Нів біп ТПг т1е 305 310 315 320

Авп о АБвп обБекг Туг ТПг бі Аїа ТПг Аза І1е Агуд Рго Аїа сіп Уа1і щу 325 330 335

Тук Авп ОТП Рго Туг Мес Ап РпПе біц Тук Бек АвБп б1у с1у Рго РПе 340 345 350

Рпе І1е Рго І1е Маії Рго ТПг Аза Авр ТПг сіп Туг АвБп АБр АБр 1 355 360 365

Рго АБп о сбіу біу І1е Агуд Рбе ТПг Меє с1у Тук сіп Нів б1у сіп Гей 370 375 380

І1е ТПг Бек Бек біп бі Уаі сій Агуд Тук ТПг Рпе Авп Рго сбіп Агд

385 390 395 400 пув Сув б1у Агуд с1іу Аїа пув біп бі1іп Рпе АвБп біп біп Бек Рго Гей 405 410 415

Авп от11е біп АБп о ТПг Авп Авп осіу ТПг о ч11е Гей Рго бБег Ар Рго Пе 420 425 430 сі1у б1у Ппув ТПг Авп Меє Нів Рпе Меє Авп ТПг Рго АвБп ТПг Ту Щ1У 435 440 445

Рго Ппейп ТПг Аза Маї Абзп Азп ТПг Аза Рго Уаії Рпе Рго Ап с1у сіп 450 455 460

І1е с1у с1у І1е пув Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд 565 570 575 пув 'гец Туг «2105 8 «2115 579 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 8

Тец Нів ТПг Авп Авп о ТпПс о Тей Рго Туг ТПг Рго Аза Аїа Рго Агуд Бег 180 185 190 сій ТпПг Гец сіу Рпе Туг Рго Тер Гей Рго ТПг Гув Рго ТПг сіп Туг 195 200 205

Ага Тук Тук Пец Бек Сув Іїе Агуд Авп Гей Авп о Рго Рго ТПг Тук ТПг 210 215 220 сі1у бі1іп Бек сі біп І1е ТПпг Авр Бек І1е сіп ТПг сіу Гей Нів Бег 225 230 235 240

Рго Ггец Ппув Ітец ТПг Нів Бек Тгр біп ТПпг АвБп Агуд бБеє теп С1Уу Гей

275 280 285

Тук Авп ОТП Рго Туг Мес Ап РпПе біц Тук Бек АвБп б1у с1у Рго РПе 340 345 350 тей ТПг Рго Іїе Уаії Рго ТПпг Аза Авр ТПпг о біп Туг АБп АвБр АвБр с1и 355 360 365

Рго АБп сіу Аїа І1е Агуд Рбе ТПг Меє АБр Туг сіп Нів б1у Нів ей 370 375 380

ТПгЕ ТПг Бек Бек сіп сіц Ге біц Агуд Тує ТПг Рпе Ап Рго біп б5ег 385 390 395 400 пув Сув б1у Агуд ТП Рго пув біп бі1іп Рпе АвБп біп біп Бек Рго Гей 405 410 415

Авп опе біп Авп о ТПг АБп о Азп осіу ТПг о Гей Гей Рго Бек АвБр Рго Пе 420 425 430 сі1у б1у Ппув ТПг Авп Меє Нів Рпе Меє Авп ТПг Гей Авп ТПг Ту Щ1У 435 440 445

Рго Ппей ТПг Аза тей АвБп Авп ТПг Аза Рго Уаії Рпе Рго АБп с1у сіп 450 455 460

ТПЕ Рпе ТПг Аза пув Мес Агуд Бек Бек Авп Мес Тгр АБп РГО І1е сіп

530 535 540 біп Нів ТПг Тпс ТтТпг АтТа бій АвБп ч1І1е с1у Ппув Тук І1е Рго ТПг Авп 545 550 555 560

І1е с1у с1у І1е пув Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд 565 570 575 пув 'гец Туг «2105 13 «2115 579 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 19

Мем Бек бі Авп Уаі1! сі біп Нів Авп Рго І1е АБп Аї1а сіу ТПг с1ц 1 5 10 15 теп Бек Аїа ТПг сіу АБп бій Бек І1е б1у б1у 01у с1у с1у с1у .Щ1У сіу Агуд біу Бек Іїе сіу Маї б1у Ма1ї Бек ТпПг с1у Бек Рпе Авп Авп сіп ТПпгЕ бі Рпе сіп Туг Гей б1у бій б1у Гей Уаі1і Агу І1е ТПг А1а бо

Тук Авп ОТП Рго Туг Мес Ап РпПе біц Тук Бек АвБп б1у с1у Рго РПе 340 345 350 тей ТПг Рго Іїе Уаії Рго ТПпг Аза Авр ТПпг о біп Туг АБп Авр АвБр с1и 355 360 365

ТПгЕ ТПг Бек Бек сіп сіц Ге біц Агуд Тує ТПг Рпе Ап Рго біп б5ег 385 390 395 400 пув Сув б1у Агуд Аїа Рго пув біп бі1іп Рпе АвБп біп біп Бек Рго Гей 405 410 415

Авп опе біп Авп о ТПг АБп о Азп осіу ТПг о Гей Гей Рго бБег Авр Рго Пе 420 425 430 сі1у б1у Ппув ТПг Авп Меє Нів Рпе Ме Бек ТПг Гей Авп ТПг Ту Щ1У 435 440 445

ТПгЕ Атїа Рго Рпе УМаї Сув Ппув Авп Ап Рго Рго сбіу біп Гей РПпе Уаї1ї 485 490 495 пув Іїе Аза Рго Ап Гей ТПг Авр Авр Рпе АБп Аза АБр бек Рго сіп 500 505 510 сіп Рго Агуд Іїе Іїе ТПг Туг Бек Авп Рпе Тгр Тгр Гув сіу ТПг Гей 515 520 525

ТПЕ Рпе ТПг Аза пув Мес Агуд Бек Бек Авп Мес Тгр АБп РГО І1е сіп 530 535 540 біп Нів ТПг Тпс ТтТпг Аза бій АвБп о тч1І1е с1у Авп Туг І1е Рго ТПг Авп 545 550 555 560

І1е с1у с1у І1е пув Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд 565 570 575 пув 'гец Туг «2105 10 «2115 579 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 10

Мем Бек бі Авп Уаі1! сі біп Нів Авп Рго І1е АБп Аї1а сіу ТПг с1ц 1 5 10 15 теп Бек Аїа ТПг с1іу АБп бій Бек І1е б1у б1у б1у 0Ш1у ЩШ1у сш1у .Щ1У сіу Агуд біу Бек Іїе сіу Маї б1у Ма1ї Бек ТпПг с1у Бек Рпе Авп Авп сіп ТПпгЕ бі Рпе сіп Туг Гей б1у бій б1у Гей Уаі1і Агу І1е ТПг А1а бо

Нів Аїа Бек Агуд Гец І1е НівБ Гей АвБп Месє Рго б1і1ц Нів сіц ТіПг тус 65 70 75 80 їпув Агуд ч11е Нів Уаї тей АвБп Бек бі Бек с1іу Маі1і Аїа с1у с1іп Меє 85 90 935 уаї б1іп Авр Авр Атїа Нів ТПпг о біп Меє Уа1 ТПг Рго Тер Бек Іец І1е 100 105 110

Рго Рго Ппув Іец Іїец ТПг біц Рго ТПг ТПпг сі с1у Авр біп Нів Рго 290 295 300 сі1у ТПпг Гей Рго Аза АТа АБп о ТПг Агуд пув с1у Тук Нів біп ТПг тс 305 310 315 320

Авп опе біп Авп о ТПг АБп о Азп осіу ТПг о Гей Гей Рго бБег Авр Рго Пе 420 425 430 сі1у б1у Ппув ТПг Авп Меє Нів Рпе Меє Авп ТПг Гей Авп ТПг Ту Щ1У 435 440 445

ТПгЕ Атїа Рго Рпе УМаї Сув Ппув Авп Авп Рго Рго сбіу біп Гей РПпе Уаї1ї 485 490 495 пув Іїе Аза Рго Ап Гей ТПг Авр Авр Рпе АБп Аза АБр бек Рго сіп 500 505 510 сіп Рго Агуд Іїе Іїе ТПг Туг Бек Авп Рпе Тгр Тгр Гув с1у ТПг Гей 515 520 525

І1е с1у с1у І1е пув Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд 565 570 575 пув 'гец Туг «2105 11 «2115 579 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 11

Мем Бек бі Авп Уаі1! сі біп Нів Авп Рго І1е АБп Аї1а сіу ТПг с1ц 1 5 10 15 теп Бек Аїа ТПг с1іу АБп бій Бек б1у б1у б1у б1у 0Ш1у ЩШ1у сш1у .1У сіу Агу біу Аїа сіу сіу Маї б1у Ма1ї Бек ТпПг б1у Бек Рпе Авп Авп сіп ТПпгЕ бі Рпе сіп Туг Гей б1у бій б1у Гей Уаі Агу Іїе ТПг А1а бо

ТПгЕ Атїа Рго Рпе УМаї Сув Ппув Авп Авп Рго Рго сбіу біп Ггецй РПпе Уаї1ї 485 490 495 пув Іїе Аза Рго Ап Гей ТПг Авр Авр Рпе АБп Аза АБр бек Рго сіп 500 505 510 сіп Рго Агуд Іїе Іїе ТПг Туг Бек Авп Рпе Тгр Тгр Гув с1у ТПг Гей 515 520 525

ТПЕ Рпе ТПг Аза пув Мес Агуд Бек Бек Авп Мес Тгр АБп РГО І1е сіп 530 535 540 біп Нів ТПг Тпс ТтТпг АтТа бій АвБп о ч1І1е с1у Авп Туг І1е Рго ТПг Авп 545 550 555 560

І1е с1у б1у І1е Акуд Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд 565 570 575 пув 'гец Туг «2105 12 «2115 579 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 12

Мем Бек бі Авп Уаі1! сі біп Нів Авп Рго І1е АБп Аї1а сіу ТПг с1ц 1 5 10 15 теп Бек Аїа ТПг с1іу АБп бій Бек б1у б1у б1у бШ1у 0Ш1у Шу сш1у .1У сіу Агу біу Аїа сіу сіу Маї б1у Ма1ї Бек ТпПг б1у Бек Рпе Авп Авп сіп ТПпгЕ бі Рпе сіп Туг Гей б1у бій б1у Гей Уаі Агу Іїе ТПг А1а бо

Нів Аїа Бек Агуд Гец І1е НівБ Гей АвБп Месє Рго б1і1ц Нів сіц ТіПг тус 65 70 75 80 їпув Агуд ч11е Нів Уаї гей АвБп Бек бі Бек с1іу Маі1і Аїа с1у сб1іп Меє 85 90 935 уаї б1іп Авр Авр Атїа Нів ТПпг о біп Меє Уа1 ТПг Рго Тер Бек Іец І1е 100 105 110

Тук Авп ОТП Рго Туг Мес Ап РпПе біц Тук Бек АвБп б1у с1у Рго РПе 340 345 350 тей ТПг Рго Іїе Уаії Рго ТПпг Аза Авр ТПпг о біп Туг АБп Авр АБр с1и 355 З6о 365

ТПгЕ Атїа Рго Рпе УМаї Сув Ппув Авп Авп Рго Рго сбіу біп Ггецй РПпе Уаї1ї 485 490 495 пув Іїе Аза Рго Ап Гей ТПг Авр Авр Рпе АБп Аза АБр бек Рго сіп

І1е с1у с1у І1е пув Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд зЗ65 зЗ7о0 зЗ75 пув 'гец Туг «2105 13 «2115 579

«2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 13

Мем Бек бі Авп Уаі1! сі біп Нів Авп Рго І1е АБп Аї1а сіу ТПг с1ц 1 5 10 15 теп Бек Аїа ТПг с1іу АБп бій Бек б1у б1у б1у бШ1у 0Ш1у Шу сш1у .1У сіу Агу біу Аїа сіу сіу Маї б1у Ма1ї Бек ТпПг б1у Бек Рпе Авп Авп сіп ТПпгЕ бі Рпе сіп Туг Гей б1у бій б1у Гей Уаі Агу І1їе ТПг А1а бо

Рпе І1е Рго І1е Маії Рго ТПг Аза Авр ТПг сіп Туг АБп АБр АБр б1ц 355 360 365

І1е ТПг Бек Бек біп бі Уаі сій Агуд Тук ТПг Рпе Авп Рго сбіп Агд 385 390 395 400 пув Сув б1у Агуд с1іу Аїа пув біп бі1іп Рпе АвБп біп біп Бек Рго Гей 405 410 415

Авп от11е біп АБп о ТПг АБп о Авп осіу ТПг о ч11е Гей Рго бБег Авр Рго Пе 420 425 430 сі1у б1у Ппув ТПг Авп Меє Нів Рпе Меє Авп ТПг Рго АвБп ТПг Ту Щ1У 435 440 445

Рго Ппейп ТПг Аза Маії Авп Азп ТПг Аза Рго Уаії Рпе Рго Ап с1у сіп 450 455 460

ТПгЕ Атїа Рго Рпе УМаї Сув Ппув Авп Авп Рго Рго сбіу біп Гей РПпе Уаї1ї 485 490 495 пув Іїе Аза Рго Ап Гей ТПг Авр Авр Рпе АБп Аза АБр бек Рго сіп 500 505 510 сіп Рго Агуд Іїе Іїе ТПг Туг Бек Авп Рпе Тгр Тгр ув с1у ТПг Гей 515 520 525

І1е с1у с1у І1е пув Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд 565 570 575 пув 'гец Туг «2105 14 «2115 579 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 14

Мем Бек бі Авп Уаі1! сі біп Нів Авп Рго І1е АБп Аї1а сіу ТПг с1ц 1 5 10 15 теп Бек Аїа ТПг с1іу АБп бій Бек б1у б1у б1у б1у 01у с1у сш1у .Щ1У сіу Агу біу Аїа сіу сіу Маї б1у Ма1ї Бек ТпПг б1у Бек Рпе Авп Авп сіп ТПпгЕ бі Рпе сіп Туг Гей б1у бій б1у Гей Уаі Агу І1їе ТПг А1а бо

Тец Нів ТПг Авп Авп о ТпПг о Тей Рго Туг ТПг Рго Аза Аїа Рго Агуд Бег 180 185 190 сій ТпПг Гец сіу Рпе Туг Рго Тер Гей Рго ТПг Гув Рго ТПг сіп Туг 195 200 205

Ага Тук Тук Пец Бек Сув Іїе Агуд Авп Гей Авп о Рго Рго ТПг Тук ТП 210 215 220 сі1у бі1іп Бек сі біп І1е ТПпг Авр Бек І1е сіп ТПг сіу Гей Нів Бег 225 230 235 240

ТПгЕ ТПг Бек Бек сіп сіц Ге біц Агуд Туг ТПг Рпе АвБп Рго біп б5ег 385 390 395 400 пув Сув б1у Агуд ТП Рго пув біп бі1іп Рпе АвБп біп біп Бек Рго Гей 405 410 415

ТПгЕ Атїа Рго Рпе УМаї Сув Ппув Авп Авп Рго Рго сіу біп Гей РПпе Уаї1ї 485 490 495 пув Іїе Аза Рго Ап Гей ТПг Авр Авр Рпе АБп Аза АБр бек Рго сіп 500 505 510 сіп Рго Агуд Іїе Іїе ТПг Туг Бек Авп Рпе Тгр Тгр Гув сіу ТПг Іей 515 520 525

ТПЕ Рпе ТПг Аза пув Мес Агуд Бек Бек Авп Мес Тгр АБп РГО І1е сіп 530 535 540 біп Нів ТПг Тпс ТтТпг АтТа бій АвБп ч1І1е с1у Ппув Тук І1е Рго ТПг Авп 545 550 555 560

І1е с1у с1у І1е пув Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд 565 570 575 пув 'гец Туг «2105 15 «2115 579 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 15

Мем Бек бі Авп Уаі1! сі біп Нів Авп Рго І1е АБп Аї1а сіу ТПг с1ц 1 5 10 15 теп Бек Аїа ТПг с1іу АБп бій Бек б1у б1у б1у б1у 01у с1у сш1у .Щ1У сіу Агу біу Аїа сіу сіу Маї б1у Ма1ї Бек ТпПг б1у Бек Рпе Авп Авп сіп ТПпгЕ бі Рпе сіп Туг Гей б1у бій б1у Гей Уаі1і Агу І1е ТПг А1а бо

Ага Тук Тук Пец Бек Сув ТПг Агуд Абвп оГецй Ап о Рго Рго ТПг Тук ТПг 210 215 220 сі1у бі1іп Бек сі біп І1е ТПпг Авр Бек І1е сіп ТПг сіу Гей Нів Бег 225 230 235 240

Авр чІ1е Месє Рпе Туг ТПг І1їе біц АБп Азїа Уаї Рго І1е Нів Іецй Іецй 245 250 255

Авп опе біп Авп о ТПг АБп о Азп осіу ТПг о Гей Гей Рго бБег Ар Рго Пе 420 425 430 сі1у б1у Ппув ТПг Авп Меє Нів Рпе Ме Бек ТПг Гей Авп ТПг Ту Щ1У 435 440 445

І1е с1у с1у І1е пув Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд 565 570 575 пув 'гец Туг «2105 16 «2115 579 «2125 РЕТ «213» Свинячий парвовірус «4005 16

Авр чІ1е Месє Рпе Туг ТПг І1їе біц АБп Азїа Уаї Рго І1їе Ні Іецй Іецй 245 250 255

Рго Ггец Ппув ІТец ТПг Нів Бек Тгр біп ТПпг АвБп Агуд бБег ІТец С1Уу Гей 275 280 285

Рго Рго Ппув Іец Іїец ТПг біц Рго ТПг ТПпг сі с1у Авр біп Нів Рго 290 295 300 сі1у ТПпг Гей Рго Аза А1а АБп о ТПг Агуд пув с1у Тук Нів біп ТПг тс 305 310 315 320

З0о 05 з10 сіп Рго Агуд Іїе Іїе ТПг Туг Бек Авп Рпе Тгр Тгр Гув сіу ТПг Гей з15 з20 з25

ТПЕ Рпе ТПг Аза пув Мес Агуд Бек Бек Авп Мес Тгр АБп РГО І1е сіп з3о з35 з40 біп Нів ТПг Тпс ТтТпг АтТа бій АвБп о ч1І1е с1у Авп Тук І1е Рго ТПг Авп 45 з50 35 збо

І1е с1у с1у І1е пув Месє Рпе Рго сій Тугк бек сіп Гей І1І1е Рго Агд зЗ65 зЗ7о0 зЗ75 пув 'гец Туг «2105 17 «2115 15111 «2125 ДНК «213» Вірус свинячого репродуктивного і респіраторного синдрому «4005 17 аєчаєдеЕдва додраєсєссс ссгасасбаса сдасассссс адсдЕссувд гассеЕєддад бо чЧсЯдЕдддеєас адссссудссс сассссссдуа ссссгдесссо адсссаасад драрсстєсе 120 сСЕСЕСОдддс дадеЕдсдссу сссдссдссс ссссдсадсуд ддааддассо сссддадтаєє 180

Ессододададс ассеЕдсееєса сдддасссісс ассссссаас сасдсссддуа асдеЕссьссс 240 чаєдсаєдед сассссуддсеЕ дсссдддабає сссддаасдс сддссаадес ЕЕЕгсдсасас Зоо

ЧдаєЧдЕСЕСад ЄдсуУсСУЧдДЕСЕ сСЕСсСссссссС сададсссса ддасассдас сеЕсддеЕдсад збо гЕгЧдЧсСЕвдДЕЄ єсасаадсся адддасаадс Сссассддаа адсссстаєс ддсаєрссстьс 420 аддєддааєд басеЕссаєсс доадсдссдеЕс ддсссссадс СЯЕСССсссЕ Еєддсосатга 480

Едассеєссудуд сааєсасаас ССсссссаас дасссдсдаа ддссдседає ЯяєеЕеедгсасс 5:40 чЧчЕЧасадеЕєд сеЕєддсасся сдасассссс дсдаасссса адсссасдад сдсддседса бо асєЕддбассс даєсасдддад сссдесдсссу ддасдддеЕсс деЕссдсдаас сссаєдсасд бо

Баєссдасса дссдЕєсссЕ ддедссассс асдсдссдас Саасссдсесе Егдссесаас 720 аздсЕєдеЕСсСу дсадссудєсс сдсссасссдд аддаддссса Ссссадсдесд гасадаєддва 780 ачаааєєсєєдЕ дае есасу дасссссіссс сСсаасддісуд ассссдсаєд аєдсддасдас 840 сддааєссда єдаєєсадсс дсссгіддадд Сбассассдсс Сдадссадаа сдуєсадддесд 900 аааєссеєсає єсоудцЧчадеЕєсє сседсссасс асссідссда ссгддссдас гдоададсеса 960 сЕдадссссс Едадаасуддеі ЕЕСЕССсССсса асасдуссса СЕСЕсСдсудудє сассесдесс 1020 адаассссда сЯясдЕЄєсдає ддасаадсдсеЕ дадсссЕсссуд ссЕЕссСодддс садесддаеєсд 1080 аадеЕдсдсвд ссасдаддаа сасстадстд асдссеєсду ЄсСассааасс аадсддаддасд 1140

Едсаєддбаа деассессад сдсаддсеЕєс аадсссодсда сарєсуєоасе деадссдаєс 1200 сЕдаєддеЕсс сасссасуєе даадсудседЕ сЕєЄдссссса дДдЕСЕсСдддаєс аддсассвда 1260 сЕСсЕддаєда ЕдаєсєдеЕсасс ссаддасссу ЕЕсдссеєдас ассссесдс асрдсдссда 1320 асасададсс бассасеєссс соудасєсеЕсеЕс ддєссоддадс дсаєаадедуа гаєддсдсеєд 1380 ссддсааасуд додсЕсЧдЕдсЕ аадсдсдссуд ссаааадсда дааддасссуд дсесссассс 1440 ссааддеЕєдс сссдссудес сссасссдеєд даассассас ссасесссса ссдасадасд 1500 даЕСсСЕСсдЕЯдЯ Еєддсасдес сеЕсСдссдсса саасдаассу даєдасааає ддедасьсса 1550 сдЕссссЕсСс дасссадсас аасадассад аддаєдаєсу ддсеЕсєсеЕдає саєсдасєс є 1620

Ессаддсдає єсааєдссса сдаседсстьуд стассуєдудає Ссуддааєсдсес дсседеЕсссга 1680 асдссаадса ссссаєаааа сеЕсСаасддад ЕЕСсСасеєддда ддсададаєд аддеЕстсддаа 1740

УГддсСЕсСсСЕсСуд сесссЕсссЕ содсдааєсдєд СодеЕсСоддсуаЯє ЄСодсЕСЄдаа ЧддСсЕдСсЕсС 1800 сассдссЕса Ессадсадас дддстасста аасдєдсасе сдаддссстуд десуаєстдесе 1860 асадассасс сеЕССЧассдеЕ деЕсСсадссстуд драссдуссда сЕЕссеЕрдсеЕ аарссасссс 1920 сегсаддааєс седдассссс дасаааасуде Єдассесссс дгсассадад сддеЕссддсе 1980

ЕсЕСвадЕС десасаааєса свраєстададд СЕдДЕссСссдса ааааєдсудд: дссасдддаад 2040

ЧдадсЕСЕСсСає сврасдссдеє дададдаєде сдааддассуд Сссдадсссс ааасаддсса 2100 гЄддсссЕЕсс додсаааааєє ааадеєссає ссеЕСсаааддс сссуєстдсд ссссеєддасд 2160 азЕдеЕссссс тасуддасдеє Есадссдасе ссдадссадс ассесаддаа аддссссааа 2220 дЕсссддсдс гдсСЕдЕсСдДЕсС сеЕдеЕдеЕсСсас суддаєдсааа ададсссдад даадсадссс 2280 сддаадаадс саадададе ддссасаадд ссдсссасес СдсассссеЕ дссдадддес 2340 ссаасааєда дсаддбасад деЕддеЕсдссу дЕДадсаасе даадсссоадс дядЕсдЕодеЕ 2400

Еддсадесодуд даасдсссає дааддеЕдсеЕс СддЕсЕсадс ЄддЕССааєсє аассеєддгад 2460 чсодддчдааввєє деЕссссстса дассссаєбда аадаааасаєс дсісаасадс сдддаадасд 2520 аассассдда єссСдЕсСссаа ссадсассад сеЕсссасаас дасссебдЕд адададсааа 2580 сасссдасаа сссаддессе дасдссдудвд сссоссссує сассудєєсда даасстдесс 2640 сдасддддсес гасасессдеЕ сасдеЕєдадс асеєдсуддсас ддадссдддс дасадсадсе 2700 сдссЕСсСсууда Ессаєссдає дсдсааассс Сддассадсс ЄСсаааєсса ссссеєддссд 2760 сЕсддссадс дадддссасс дсдссеЕдасс сгддсЕдддЕ ссасуддбадуа сдсдадссвд 2820

ЕЄСсСЕЕєдсааа дссссдааає дессеЕссссву аєддсдассс адсссеєсад СЕсододддадес 2880 гсЕссСеЕдааєс садсеЕссдеЕс аєсдадестуд ассдддасааа адаєдссссу дсдадЕсСдасд 2940 ссссеЕдссда сеЕсдасдасе Есдаасдадд сссссеЕСсСсдЕеЕ адессдаєссє сссддааєтсд Зоо ссдаасссаа дсдсссдсдЕ ЕЕЄСсСЕсСсдсас аадссттаає Єдассдаддс ддЕссасеєд зо6о ссдаєдеЕсса гдсаааааса аадаассудудд басаєдааса деЕдсссссаа дсЕсдЕдадс 3120 ссддбадесуд єдсаасссса дссассаддуа адсддсссда сааааєсдеєда часаддЧчедд 180 асаєдаааас Есддсдседс ассесдсадеі ссаадссду Ссудсасєсев дсдесссеса 3240 аасеєссессс Едасаєдаєсе саадасасас судссесссдЕ Ссссаддаад аассдадсса Зоо

ЧдЕдасааєдс сддссеєдаад саасрддсдуд сасадсддда Саддаааєсдд адсдсдассс 3360 сссссссааа ассуддЕсдудд ссадедсевуд ассадаєсудє сссеЕссудссе асдддатаєсс 3420 адсаадаада гдссассссс Ессдаєдддсе сассссаєдс дссуудаєсссє сстадссдад заво

Едадсасддуд содддадесдуа аааддсесева сдсссЕссдда сасссуєсес дсодддадесса 3540

Есадссадсуд ссссаєдаса єчддадчЕсЕсеЕву аадесеЕЕссес ссассіссса дсеЕсстаєсде збо

ЕсасасеЕсес сеЕсдссдсудуа ддсесвтаєсудуа сеЕссаддєда ЄСОДЕСЯЄСЕЕ дсаддасдес збо

ЕсерасеЕвус ЕСССЕУДСЕС ЕДССУІЄСсСсСЕЄ асссдатрасе сдуддасєдсссє сссеЕсаєт9а 3720

ЧЕДФЕСЕЕЕЄС КОД ЕЕССССУ сСудсуєдеЕС ДЕССОЯЧУУЄЯЧЄ СЕЕСОДЕССЕ Соодасоддсесе 378О

ЕсоасеЕЯДсавс єссасєсссу ассссассса асссадесуду СЕСЕСсСЕСдЄ дассасдасяе 3840 сдссоддадед Есаєсдссдад сЕсееуддсеЕсС ЕЕдадсадсу ссаасеєєсду даасстдесдс 900 дсоддссЕвЯДЕ дадассуддсесссс гЕСсСадудссесСЕ Саєдсдеєсає сєсеЕєддсаад ЄСасєсддЧчед 3960 дадЕсасудєса ЕСССсСЕддсає дЕССЕССТас дЕЄСаєдсає дсеЕєЄдсадає сСддсссесе 4020

СЕСЕЄЯДЕЄса ЕЧдсддЕдДЕСсСсС садудддсдЕє дЕСасаадєд Ссдодддааад Сдіасааддвда 4080 садсеЕсстдс ддаддеЕддсеЕ сЕСааєдсає сЕссЕЕсСЕсС дсдсдссасс судЕдесессс 4140

Есдрасссес дедсдассда єсссааасудс саааадддде Сдаєсстдсд сасеєсддсаа 4200 саддЧдЕєдоасоа содддєдсвда сдсддсдада дссссассса Ссаассасас саааадссса 4260 бадсеЕсаєдс сааєєєддає даааадаааа СдЕсЕдссса аасудсддеЕє дсеЕдссссає 4320 асдаєсссад Есаддссаєс ааасдсссда аадссседса ддсодддадду дссаєсдае да 4380 ассадсстас ассеєдаддес дЕсСсудєдЕдЕ ссдадаєссс сЕЕсСссадсс ссассевссс 4440 саавадсєсс адссаассса дассдсаддд СЕдЧсдЧднада ЄСсуддасасе ЄСЕЧдедосд 4500 сЯддЕєсдсвд соддеЕсасссу асадсасаас сддДдЕсседауд ссддддсаас СЕЕдссааді 45560 баааєсадас сссссссадуд аасессаєссеє ссассаааас дасєддеддд дссЕсеЕтаса 4620 сСссСЕБЄДСсСЕЯдДЕ додсссаадесуд ЕССддсусдда сЕССЕдЕсса СЕЕСсСасссес ддасссевовЧе 4680

Есасаєссасс ЕсаадедсдЕ ддссдаддаа ссудсеєдассс асуддсдеЕєса аасрссеЕесе 4740 сасаєсстас срасддсессс ддаддЕдесує дсеЕссесссу асЕєсдєдесд ссеЕдссдасд 4800 чадЕСасссс дссаурєдеЕсєс Есадссудєда сасаасессс сддєададад дЕддддассе 4860

ЕСсаЕсссудс дсссуєсісс єЕсдаседсьс сддсссассу саєддесесее ааддсадаса 4920

ЄдеЕкадусудс асЕсссудсЕ ЕССЕЧЧЕдДсСЕеЄ асдсседдсс саєдадсессс СддеЕСсСвааєсь 4980

ДФСЕКСЕЕЕсСсС гасасесесвуд аадесдддеЕва сссоссассс СсеЕсбастаєд сЕєсддаедс 5040 асеЕсасєссес чдсдЕССссдеЕ седссадсад ссддсаєсст сеЕсассадудд асаассддсс з100

ЕсССсСЕЄсСдддс аассддссдсе ЕссСасссадда ЕЕдссудаає Саєсасасся Саєрдасаєсс з160 ассадсасас сеЕСссдддсса сдсддеЕдсад сеЕдссдЕдудс сасадсссса дааддсассє з220 асаєддссдс сдсссодада дссдсЕссаа седддсдаас ЄСсаассьсс ассссдаєсвд 5з280 садеЕєддаєс сссссеЕсдаа ддасдсЕссса ддасссасаа ассссдссеЕє аасассдєда з340 асдЕєдсадда сЕссЕсссЕЕ ддассссодад доддеЕсеЕссас саєєдаєддс адаадаасеід 5400

ЕсдЕСасеЕдс Едсссасдсд єсдаасддсуд асасадссад адссассддсе дасеЕсстаса 5160 ассдсаєдса сасеєєсєсаад ассааєдудеуд аєсаєдсестд деЕсссаєдсе даєдаседдас зО20 адддсдЕєдс сссеЕдеЕддес ааддеЕєдсда аддддрассуд сддЕсдЕдсс Сасеєддсааа 5580 саєсаасвєдд Едссдаассс ддасаєсаєту додаадддддеЕє сдссессстьде сеЕрасеаасие 53640 чдсддсдаєеєс доаддЕсассс деЕСсаєсссад ааєссдудеєда ЄсЕвассдда асссасассд 5700 дЕссааасаа асссуудесєсе ддасєсеЕсдесда саассссода аддддадасс Сдсассаєса з76О0 аадааассаа дсссЕСсСсдас сЕсСсссадас асгєєссдсадуа сссаадсуеєс ссеЕСЕЄсСодад з820 асаєєсаааєс дадсессддсес ассаєссстд аєдсаасаєс саєеєссддадеі дасеєсддсає З880 сдсЕСССТадс сЕССДдЄСсСссСЕ деадеддаад дсоддссеЕссс дассуєєссва ссЕЕсЧє9Чєд 5940

ЕСЕЕЕСССсСсСЄ ЕСССЕДдсдс аєдаєдддес аєдсстддас асссастдеЕє дссдєсдддсе бо

ЕСЕЕЕСеЧдсс дааєдааасє сеЕсссадсад ЕЕССддудЕссу адссуусєдееє ссЕсстсдсас 6бОобо

ЕСЕЕсЧдЄЧдсс єдсаєдддес асссссодуде сеЕдсасадудЕ дЕєЧаєдаєт адассссьса 6120 сддсассеЕсс саассдсаас аадзсеЕсссеЕс сддсдеЕєсса сдсасссоддуа ддЕдЕсаєсд 6180 дЕсЕддсадс Едаааєсдддуч ассеЕеєсдсву дсадаєєдеЕс сдаассдесо саадусесесе 6240 сдасасасед сеЕссеЕсассяе адддессевд стаєсдассад СЕДЕдДЕЕсСсс ассаєссаєса 63О00

Есддеєддассі ссасасссеєс ддасдеЕЧдастєс єдеЕддЕсаєє сааасассуда Сдссоссаса 636о асаєдсєдає єдосдаєсдадуд азссЕссаа дсудссЕссССЕЕ сстасддсає єЕседсадад 6420 дсааєсссад ааааддсдеЕ Есасадесся деЕддсаєдаа Єаасдадесс ссаасддсесєд 6480 сСЕстадсесд саадеЕєдсса саддсєдасс сЕЧДасЕсЕсєє дЕссадсста асдаасесса 6540 азсЕдсссЕвудс асссдсссса аасаєдаааа асдссдссдуд ссадсасаєє даадсадсде бо асдссааддс ссгдсдссаа дадесддссеЕ сеЕСсСадесса даєсєєдасааа асдаааддад 6бо6бо

Есе дсссаа дсссдаддес ЕЄсСдсеЕдааа садссасссс дссссссдас асаддасдасд 6720

ЕдаЕгсєдеЕсс дсссддддсаа сасссьсасу даєссаєсся сдагаєссаає дсддоаддасед 6780 аааддаааас ЕдсдЕсСсдсд саададассс дчдадсстада сддссссааа СусадеЕдссяе 6840 чЧдсасеєдеЕсудсЄ деЕссаасаса сссудуддасуд ссесСдассуду саєсссасес садасассаа 6900 сСсссСЕСсСЕЕСС єдадаасдде ссдсдесаєс дсадсддадда адасдаєсеє ааадссдада 6960 чддаєдаадаа асаседсдса ЕєсссеЕсддсЕ сссасаасає сааєддсааа дЕЄсСаседса 7020 аааєєсдудда саадеіссасс дадасдасассе СЕрасасудда Єдаєсєсссдуа басасссаад 7080 ассаєдсЕсєс Есаддасадуд гсадссдасеі асададасад ддассаєдад ддеЕдсдсааа 7140 ссасссссса асадуддассє дасссааадеі сеЕдааасссс єдДдЕєДдсасе дДдеЕсдеЕдаєсд 7200 чдсддбєаєтас деасаасадд гассеєдаєса ааддсаадда ддЕЕстЕддес сссаадссяд 7260 асаассдссс Едаадссдсс аадседсссс сЕдадсаадс СсЕСЯДСсСтдудуд асдддссааа 7320 сЕсдсдассо гасадссдсес даддеддааа адссааадсуд саєсассадеі саасеєссаад 7Зво дЕсЕЧдассас гдаасаддсее ЕсааассдеЕсє адссдссадс ддсЕєЄдассс дсеЕдсддссд 7440 сддсддссва дЕсСдЕЧдассд ааасуддсудді аааааєсаєба ааасассаса дсадаасеЕсе 7500 сассеЕсаддс сссстадасс гаааадссас ЕЕСсСсдаддєд даддсааада аассаасеєда 7560 дсадддссас дссдЕєЄдЕдуа сааасеєсаєд ЕЕСсСсСддЕдЕС ассесдаєда дассосассс 7620 ассуЕсссЕс деЕсдасдеЕєс єЕссеЕдааасс суддасеєдас асаасасссуд дсаєссаасс 7680 адддсаєддад дссдуддааса єдддсудсдда судессстаєсє сдддасєссд ааассдсасс 7740 сасаааддса даасссдадеі гасссаадса аасааєссаа дсаєдсдаад ЄсСаддсдсдд 7800 ддасдссссуд аассессаас СсссеЕрасаа дсеЕССаєссе дссадддоадуа асссеєдадсд 7860 дсасаааддс сдссЕсаєса асассаддеЕє сддадаєсста ссеЕсбасаааа сЕссссаада 7920 сассаадесс дсааєссасу суддсЕсдЕвд сседсасссс аасддддсесс ссаєдеЕсвєда 7980 гддеаааєсс асастаддсба ссасеЕсссса асасддеЕсесс дадсестаєд єссссасеьде 8040 дсссвбасадс деЕсаєддаде ассеЕєдаєтс асдсссеєдас ассссевста сСдеєдсассаа 8100 асаєддсасе єссааддссд ссдсададда ссіссааааа Сбасдасстає ссасссаадд 8160 асстдсссьд сссдудддеЕсс гасудсссаде асдсадассс ассеЕссуддсес агаєссдддеаа 8220 дадсдссдсеса ЕЕдДЕЕсСсосСс сассаасста ссссдесаад аасессасда садддаєсаа 8280

Еддссададд Ессссаасаа аддасудсєсєса дадсагассе дааассєдаєд аааєдеЕдесдс 8340 ссдсдсЕдЕеЕсС ааддадаає ддсааассдЕ дасассеЕсдс асссесаада аасадсасед 8400

Есссаадссс аааассадда ссассссдуддд сассаасаас ЄСтаєсдссо сддсеЕсасад 8460 ассддсдсес адсддеЕдсса сссаддсаєс саєдаадаад дсЕсддаадеі ссссааєєсдс 8520 сЕсддддааа аасааассса аддадссдса сЕдсаседеЕс дссоддсаддае дЕСЕсСдаддс 8580 сдасеєсддсес ЕСссЕдеЕдасс дсадсасссс сддссаєєдса адаєдаєсь седссаасся 8640 ссЕдбсаєдаа сеЕсСдсаддає дЕдаададта сеЕсЄдссвтадс Саєдсдсеста аседседсса 8700

Едассссуєд дсаасасадуд абддедссьс сасаааасудс ддЕддсссдЕ сдЕССсСдддада 8760 ссссудссасс адсдеЕдссса асассусбатвта сЕсаседдса асесаєсдссс адсасаєдаддае 8820 ассєдеЕсддсес ЕєЄдааааєда деЕсаєдааає ЄоддсесеЕсаад СЕСсСсссдадда аасадсесаа 8880 дЕссдаддас сеЕсСсЕєЄдааа Ессадсстає дЯеЕєЄддтасас СсеЕЧЯЧаєдаєс СеЕдеЕсЕвдрДса 8940 сдсЕДдааада сссасасссс ссааєсасса сеЕддсЕдддЕс дадсассстд ассеєдаєдсе 9000 чадЕссСсада асддасссаа адаааассує саєааседає ааасссадсес ссеЕсддсед 9060 сачдаассдад дсадддсдас адсстадсссс саассудсдас сдсассссдуа сеЕдсссеЕсдс 9120 асаєсасаєд ааддсдсада асдссеєсада деасстаєдсу СсеЕДдссдссуд сааєссьдає 9180 ччаєеєсаєде дсссдсаєсуд ассаєдассс Єдадеддсає даддасссса СсеЕдсддадбає 9240

ЕдсссуддеЕдс дсссдссадуа абддеєбасад сеЕссссадудеЕ ссуддсаєсєвє сСсаєдессає 9300 чЧЕдддадаад сєдадаадсс асааєдаадуд даадааассс сдссастдсуд дсаєстдсда 9360 сдссааадсс дасстаєдсує ссдссеєдеЕду дсеєсдаєсссьту сЯяесдЕсССсСсС асдсасссе 93420

Есаєсаасас ЕдсссеЕдсса сЕСЕдадсвд суддссассає дссоудеЕєсаа аддааєдесс 3480 чдсадедеЕсад ЕсассеЕдессд доддсеЕддсад арссссеЕсеЕЕ даєдссудєдс Саааасааає 9540

Ессабасааа сссссеЕсдба седессассає дааддедддЕ аагаааасаа сддсессесда 9600

Ессддддадда бассадсссс деЕсдаддесе сдєсдсадесс аададдддба Есдсаддсаа 9660

Едаадесеєдас сеЕссседаєд дддассасса адсддеЕдссеЕ сЕЕссСдссда сЕєдсааада 9720 сасааасаєд деЕдааддєдд сеЕсСдсааєудє ассасесадс аадесссасад Садддссасс 9780 аддЕєссуда аадассассе ддсстассдад ссаадессад дасчдаєдаєд Ссаєстсасас 9840 асссасссає садасвтаєдеЕ Есдавасадеі садсдсеєсес ааадесстдса ддрасесссає 9900

Ессаддадсс Есаддассісс сЕсСссссасс асссдссада СссодддссЯає доадЕсСаддсе 9960 баєеєдссадс додадсасдссс сеЕддссдаде аєсасбассес даєдаддстд датастєдсаа 10020

Есаєєссддас асссеЕсадас гЕдсеЕсссаа аасассссеє дЕдЕдЕвда деЕДассьсса 10080 дсаассссас сссдЕСддсЕ ЕЄДдаєєсєсста сеЕдссаєдед сссдаєсада Сдссісадаа 10140 дсадссдасс ассаєєсаса дассєвєддсесс саасаєссдс дсадссаєсс адсесеєдеєса 10200 садддадааа сеєсдаассса аддссаддаа сассадддєд ЯЕЕЕеЕсСсасса сссддсесе де 10260 дассЕсСсдуасЄ саддедссда сассасбасса сааадаєсдс ассуддсеЕстд сдаєаассає 10320 ачдаєєсаєсс садддддсса ссссеЕЧдасрає сдеєдасассуд саєссассає сдссааадесс 10380 сстааасааа гсссдадсас єЕсдсадссає сасссудддса адасасуддудає СЄдеЕсЄсСаєєеса 10440

Едасссесає аассадсссс аддадЕсеЕс саасесаасс ссеЕдадсдса сеЕдастєдсаа 10500 сСсСЕЕЧДсдДЕЄС адссудєдоадоа аєдадссдудЕ адессеЕдаає дсуддаєсааєсд садссасаас 105560

Едсадсдаад дсссЕєЄдада саддессаєс ссдаєєсєсда дсаєсадасс сдаддедсаа 10620 дЕсСЕСССЕва дссудсЕсдДЕЕ сдддссадесе додаадддадс Сдіасдссас Сассдсаадеі 10680 дадсасасаас сеЕдддадЕссеЕ ассЕвссссс ддасадесса асаєссдсас сеЕСссдссааа 10740 ачадеЕсддсд ссасаєсддс садсддесас ссассадаає аассодддсдЕ ддссеєдаєсд 10800 асЕЕдссуссі адсаєдсдсес саастєдаєсудс ссдссасадс аадссааєдуа ЄсддеЕдсад 10860 чдсеаєдсддеЕс дддссудссса сссеесссуд сасссседудє дЕддсдЕСає астаєссьсас 10920 ассасасаєс аддддєЕдадс сссаддссесЄ дссадаааса сесдссЕсаа садддсддває 10980 адссасадає єдссдддаде ассссдасудс додассдаддаа даддсадсаа аадаастссс 11040 ссасдсаєеєс аєсдудсдаєд єсаааддсрас сасддеЕєддау дддеЕдеЕсаєс асаєсасаєс 11100 аааасасста сссаддессс гЕдсстаадда сЕССдДЕЄДдсс дсадессоддад Саадсссдсс 11160 сддсадддсс дссааадссу Едсдсасеісео сассдаєдед Сассоссссуд аасессуддесес 11220 асаєссдсаа сссдадасудуд сассааааєд седдааассс аааєсадасоі єсадддасае 11280 ссдассааєд дЕСсддааад дадссассудс стасєєссад Ссддааддде Стасаєдддес 11340 чдасдссдссс дасстаєдсса ддсєвтассса дсеєдсссаад даєдссуєтд Сагасаєєда 11400

Ессудєдсаса ддассуддсаа садссаассу сСааддесдєд сдаассасад аседдсддадес 11460 сдасссддса деЕдасассудє аєдаєсасудддад сЄдсссадаас асєссдасаа садсстддсяе 11520 сдаддассес доаддссдсаде ддаачассєє додддсєдсад сссеЕєЄсСаддс дадсасеє 9 11580 сЕсЕдаааас ассдаддасє дддсаасссє сдсасудссує асдааєсдасу дсааддасса 11640 сасеЕдастає аассддаасе дДдЕдсЕсдада асдсссасас дссаєсстасду ддсдєдсесд 11700

Едассасасуд бассарсссєд сссстддсас адаассдсад дсададссад дсааассссд 11760 дсЕдссдссе доддсаадсдс сдсдаасссу додсдаєдса асддддеЕсас СдЕддадеаа 11820 аассадссад сеЕдесЕсуєдуа асдсесеЕссас ЄдадеЕсссеєЕ деЕсадедеєда ЕєЧчасаєсдес 11880 саЕфєесссес дссагаседеЕ ЕсдДДЕСсССсСас сдЕсдсадда СддеЕсассдда СсЕссстссе 11940 сачадзсддеЕс Едссссдсудсес ЕссСЕССсСДЕЕСсС дсудсеЕседсс асусасестс ссдаастаєс 12000 чааддесста гдааддсссд Есдсссаасеі дсадассуддда СдЕСсСссасаа СЕЕдсадесса 12060 адсасссаєс доадсаєдеЕсє єддсасаєдс дадесеєссса сЕєЧдЧаєтєдає дадасодесе 12120 сеЕсдЕсдсає Есассадасс аєддаасаєє саддссаадс ддссєддаад саддєдачЕєд 12180 чЧЕдаддссас Есссасдаад сеєдссадддс СсдасавтадеЕ басесасрсєсс саасасст ду 12240 ссдсадеЕдда доадсуддасєссе гЕдссудссЕЕсС ссадсесасу асеЕсдєдаєд сгааааааєс 12300

Есдссдсєвдуа сааєдедадс ссбасадсаса асассасдєе ддассдсдЕє дадсссаєсе 12360

Ессссасусс аддсасдадд сссаадссда ссдастєєссад асаасддсес ассадедесдс 12420 асдсеєсссас єеЕсесЕсСсЕсСЕ деддсеЕсСсає сеЕдссассеє деЕсСсасадеьд сЕЕсддеесс 12480 чаареєссадс ЕссСасудсстає дяссеЕЕсдудЕє сссаєвддес сасуддсааса саєсаєєсда 12540 дсЕдассаєс аассасасса гасдсасдсес сЕдссстасс адссаадсда сссдссааад 12600 дсЕсдадссс додссудєааса єдсддЕдсаа аасадддсає дасаддедеЕд аддадсдєда 12660 ссаєдчаєдад ЕЄдеЕсааєсудс ссаєсссудєс судддбасдас аассссааас СеЕдаддадеЕса 12720

ЕсСаьдсеЕуд сЕддсеЕсссє ЕдСсСсСЕСсеЕсС свЕасдсддес сааєсссаєс сддадеЕрдцсяе 12780 сддчасаддд аасдеЕдссдс дсдЕсЕссудє ддаасаадсда сассадеЕсса СЕЕдсдссда 12840 чдсаєдаєдда сасааєссаа ссдбаєсстас суддасасаас ассессудсає багасдсддас 12900 асаєсассас сассааасад асдддддсаа ЄЕДДЯДЕєССсСає Ссддааєдде Сдсддссасе 12960

СЕЕЕССЕСсСсС ЕЧ9ДСЕДДЄДсС Есаасасбаєс асгдуаєсстд аддсдеЕєсдсес сеЕдсаадссс 13020 гдЕЕЕСсСЕСсда содсаєссаєс адасаєсдад ассаасасда ссдсддсессдс сддЕсєсСсаєд 13080 дЕссЕсСсадуд асаєсаассуд єссСссдассе сасддуддесе садсадсдса ададаааваасе 13140

ЕЄссЕєсддаа адссудеєссса асдеісудсдаа дссдісуддсра сеЕссссадста саєсасддаєба 13200 асддссаасуд Едассдасда аєсагасссд Сасаасудсдуч асседсеєдає дсЕсЕсстдсд 13260 гдсСсСЕСЕЕсСс асдссеєсада аасдадсдад аааддсеєсса аадесаєсес сдоддааєдес 13320

ЕСЕЧДУЧСсСУЧЄС4 ЕЄССЕЧДСЕСУ Едссаасьєєс асадаєсаєд Сддсессаєсде дасссаасає 13380 асссадсадс аєсаєссддеЕ аассдаєсас агссуддеЕєдс Сдсассєєсся дасассаєсе 13440 чдсааєдаддс доддстасаас састдсссує єЕдесссдсса СЕСсСЕСЕвддс аагсасдадає 13500 дЕссеЕсасаа асссудудачдсуеє єссЕЕЧасес судсасеЕсссу сеЕсссудеуд се сдс 13550

ЕдеЕЧдсассуд сеЕсдеЕсстдуд Ессе сдссу аєддсаасудуа сдасадсссуд асасассаає 13620 асаєгасаєаа сеЕсдасдаєа гдсдадссда асдддассда ссддЕсСдЕсс адссасе с 13680

ЧдЕсдддсаде сдадассеЕсе дедсеЕссасс суддесдссас Ссабаєсстс Ссассдоддее 13740

ЕссеЕСасаас аадссасеєсе єссдасдсдс суддеЕсесда сдсєдсаєсс асеЕдсаддає 13800

ЕсдЕєддсоад дсоддтасдба сЕССдсадсу Сстгасуддсдс ЄЕСДЕдДсСЕССссС дсадсдеє єс 13860 расгдеЕсеЕвує сасссусдсе дссаааааєє дсасддсестд ссудссаєдсс сдрасссдаде 13920

ЕсСассаасес сассдеєддас дассддддуча дадсссаєсуд асддаадестї ссаасадед 13980 бадаааааєс доддсааадсс даадссдаєуд дсаассеєсуЄ сассаєссааа саєдссдесс 14040

Есдааддддє гааадсссаа сссеЕєдасда ддасеЕссддс Сдадсаасдуа даддсстада 14100 счавЕєссєвєдс аасдаєссса Есдссдсаса ааадсесуєд ссадссеЕста дсаєссасаєба 14160 сасассстаса аєдаєсасасуд сссеЕгаадде дЕсасдсддс сдасссссдуа додсеєдеЕєдса 14220 саєсссааса ЕссСсеЕДДдаасе дЕСССсСЕСсСтТас арссддасас асдасатаєд Сдсасевсса 14280 асссассаас судсдЕСЯдсас ЕсСассссудудд ддассдЕсдеЕСсС дссссеЕСвЯДЕ доаоддєдЕЄса 14340 садсЕссаса дадссаєсдда адсстассас сСеЕССсСадаєдс адасєсдасдесе дссеЕсддссд 14400 дсдаєасаєс седдссссвд сссаєсасує адааадедсе дсаддесссс асааєссіс 14460 адсдЕссддс аассдадсає асдсєдсдад ааадсссудда ссаасаєсад Сдаасддсас 14520

Ессадсасса ддасеЕєсдда дссеЕсдсдсЕ доддсдудсааа сдадссдсса аасддаддадеі 14580 даЕсаассес дЕСаадсаєд дссддєаааа ассададсса даадааааад аааадсасад 14640 сеЕссдаєддауд даасддссад ссадесааєс аассдеЕдсса дДдЕєдссддчЕ дсаасдаєаа 14700 адесссадсд ссадсаассі аддуддаддас аддссааааа дааааадсс дадаадссас 14760 асссссссо додссдссдаа дасдасаєсс дддсассасст сасссадасе даасдсессс 14820

ЕсеЕдсссдса аєсдаєссад асддсєссса ассааддсдс аддаастдсуд Ссудсеєесає 14880 ссадсдддаа дадссадеЕсеЕс саддеЕєдадеі Етасдсеєдсс ддЕєдсЕСсСає асадсдсдсс 14940

Едаєсєсдсудє дасеєссаса Ессдссадес адддеЕдсаад Ссаасстєдас адесаддадеєда 15000 асддссдсда ЕєддсЯєсдЕд дссЕсеЕдадеі сасссаєсса ассадддсда Ссасасоддад 15060 дЕсаєбасеєса аєсаддсадуд аассаєдеда ссдаааєсаа аааааааааа а 15111 «2105 18 «211» 15182 «212» ДНК «213» Вірус свинячого репродуктивного і респіраторного синдрому «4005 18 гЕєСсСЕССасс ссЕЄваасса СдссСсдддає асссдаєсда сдсасдсдта сссссааєдс бо садздЧчєдЧеЕє аєддсооададд дссаадссса ссдсасасда Сдссісадсд сасуддесесе 120 ссЕЄсСсссвд аассеЕссаад ССсССсСсдадсо сддддедсса ддсстассс асаддсссда 180 ачадссасес соддеддасдЕ Сдссасудсдс ассссссасі деЕсдадсдсе сссссдсс9д 240

ЧдассЕдсСЕдУЧ сЕСЕСЕдсаа СсСЕсСсСссаає сдсасдааєд ассадсддаа асседаасьє Зоо ссаасааача аєчаєасуддд Ссдсадссда дсссСсасада дссддссадс гсасссстдс збо азЕСЕєдаад дсЕСтасаад СССсасдаасуд дддЕсдссдс Сддсасссса ЕгДдЕсддасес 420

Едссссвдда дчЕддссЧдЕсЕ асдссаассс ссгасасудєд адсдасааас сЕєссссо9а9а 480 адсаасеєсас деЕдЕеЕєдасса ассгідссдсс сссдсадада сссаадсстд аадасеЕєевд 5:40 сСсссСЕЄЕєЧад ЕЧЕЧДСтаєдуд ссассдссса сСдасассддудс саєсдасдссу гсаєдтаєде бо чассдааадд ааааєсеєсся дддссссісуд бддсдддадає даадсдааає Есдаадсев де бо ссссоддоададч ЄєЧчададеєєда сСсдсдаассуд дсіссдсасс Ссссссссдес сссассасас 720 адеддасаєд Есваадеєсу ссесСсасадс сссгдддєсде дасдеЕссста єдсодаеєда 780 асдссаасас дудсЕєдссЕсс ссдссдасас Сдісссгдаа ддсаассдсеЕ дагддадсьє 840 чЧЕЄєЧасесу сеЕєссасвдуа аадсссадаа сааадааасс сдссасдста ассаваєєтє99 900 сеЕассадасс аадсаєдудєд СсЕссддсаа дсасссасад сддаддседс аадесааєдд 960

ЕсеЕсСсдадса деаасеєдасс гааасуддасс баєсдЕсдба садсасеЕссея ссдєсааддвда 1020 чадеЕєддаєс сдссаєссда аассддсуддау адаасссадс Сасеєссдддає СЕдаддассяе 1080 ссеЕсадааса адддеЕєдадс ссаасасудуєс дссаєтєддсе дасааддаад аагааваєєссе 1140 ссддЕссдодс адссасааді ддсасоддсудс Сддааадада дсаадаааад сасдсєсе є 1200

Едсдасєдсс асадеЕсдссд дссудсдсЕвЕ дЕССЯдЕЄсСудЄ дааасссдде аддссаадда 1260 чсасчаддеє дссддсдсса асааддссда дсассісааа сассассссс сдсстгдссда 1320 ачдчаасвдс доассддсасє дсаєесссудс саєсдссаас суддасдаєда асссааасєсяе 1380

Едааассасс сЕсСсссдааа дадедадасс сссадаєдас Сдддссастд асдаддаєсе 1440

ЄдеЕдаасудсес аєссаааєсс гсадассссс сдсддсессса дасаддаасу дЕдссєдсас 1500 бадсдссаад басдстассса адссддаадд Сдадсаєсду асеєдесассд Єддсссст да 1550 часєдеЕссссє ЕСсСЕсСтусссс сЕСЕЕЧдааєд СдЕсСсадддсес ЄДЕєДДсдддс асаадддас4д 1620

ЄЕсЕгЧддЕєсСсС ссадаєдсад Есдаддесес судасєтєєдас ссеЕдсстдсс СеЕдассоддсе 1680 часЕЧдадудєд аєдсасстідс срадсадсдс Саєсссадсс дсеЕСєддссу аааєдессьд9д 1740 сдаєеєссдає сусссудсее сеЕссуддесас сассуєдєду асЕдссеЕсдс адуусссеЕввсдс 1800 ссдЕСсасадс ддададддааєс ассстдаєса адедсдсєса ддадааааєса Ссадсесеє є 1860

Есаддєдаєс даддассдсеЕ дссдеЕсссса даасаааасс аассдудучєса ссссдддаддвда 1920 ддЕсдсадса аадаєєдасс єдсассоссу сддсдсааса аассссдаад ааєдсеЕсддас 1980 саддсссдад ааадсдсдсес сдссасдсудє аассдасасс СЕСсСЕСсСЄЧаєт доадасЯаєсве 2040

ЧдсЕССсССсСЕдодд дЕєдаддсда саасссадас дассаадссд ссссаддеса ассадедесд 2100

ГдсЕССдудЕСсС сссдЕєЄдсда сесаааадес сЕсддасдас аасесддесс сссеєдассдс 2160 сСЕсЕссасьд дссаассасе ассассудєдс дсааддедас даадессдєс ассдєдааад 2220 ассаассудсес дЕдсЕССссса адссддаааа ддЕсдЕеЕссда даадаасаєд ддсеЕсаєдсс 2280 аассдадссеЕ ддЕссасуддс ссасассдсс асдсдддссс дасдаассса аадассадає 2340 чдаддаддас ЕЄдсЕдаадс гддстаасудс ссадасдасе Ссоудасаєда Сддссгдддс 2400 адеЕсдадсад дЕєЧдасстаа ааасссдддс саадаассас ссдсддсдда сассассасс 2460 сссЕссудсса ааадеЕєсадс сссдааааас даадссодсс аададсссдс сододададааа 2520 дссЕДСсссс дссссодсдса додаададеєсддуд деЕсСсдаєсдеЕ ддсадсссду ЄСЕСаєстсаду 2580 сддсдаєдеЕс ЕССсСаасадее дододаадасєтєс додссдЕсСадеі адссссеЕстуд ассесссдас 2640 сссассєдад ссддсаасас сеЕсСсаадеєда дсеЕддеЕЧдасє деЕдессеЕсас сдсааєдсає 2700 сеЕссаддссуд дсдасасссої Едадедадсс дудссссааєе сссдсассес дсоддаасе ді 2760 дЕсЕСдассуд деЕдасасссе Едадедадсс даєсссьдсд сссдсассдс ддсдєсаадсе 2820

Есадсаддєд аааачаєєда деЕссддсддс ддсаасссса ссдсассада асдадссссе 2880 чдчавЕєєсдЕСС дсссссссас адассдааса СдаддссЕссе сссссадсас сдссдсадад 2940 саддаддасЧЕ ссододдадсад аддддсаєда адссдаддаа ассссдадсд аааєстссодда Зоо саєдеЕсддає аасаєтсааас седсдЕссує дЕСсассаадс адсеЕссеЕсдЕ ссадсдєдад зо6о ааєсасасудс ссаааасасе садсссаадс сассассдас Ссдддсддадс сстедсаде 99 3120 дсаєссссаа даддсааадуд ааасаєдссе садсдеЕсаєд сдсдаддсає деЕдасдсдас 180

Єаадсссєдає дасссеєдсса сдсаддааєуд дясЕсссеЕсдс асдеєддчаєс доадеЕддасає 3240 дсЕдасеєсєдуд сдсаасасудє сеЕдЕєсасса додасдаєєсєсдс ассеЕсадаєд дсаддеЕтааа Зоо дЕссссссса ааааєдасас сСсдадасасс дссдссссає ссдєдеЕдадеі СЕЧдеєдаєдає 3360 дссеЕсасасуд сссбдсассееє ссдсаддедс ддададсдас сеЕтгассастуд дсеЕсадеЕсдс 3420 басеЕдаадає деЕсСссасудса Ессгсдадаа аасадаааає дгЕсддсдада Сддссаасса заво чадасссЕвєд дссссссссу аддаєсааасс ддєадаєдас саасеєсдЕса асдасссссд 3540 чаєаєсдесу сододаддссод асдададсас ассадссссд Сссдсаддса саддгсддсдс збо сСоДдсСЕСЕКЕСС ассддаєсєсдс сдссеЕссада сддсдсддає асоддасодддад дададдссдее збо

Есддасуддса аааадаааад сєдаааддсеє сеЕсЄсСдассаа сЕдадссудєс адздадЕсеввсвдва 3720 ссеЕСсСудссЕсСс сассессссу єеЕсссеЕссесС асудсесеЕєсєсс сассстддсу деЕдДдессассс 378О

Ессуудуаєдчасєс дода сссу садсеЕеєсстас сстастддсдс сЕсЕсссає деЕсасадеса 3840 сссадссеЕвс ддсасрдсес сссссеЕсууда СДФЕДЕЕЕССЕ д9дЕССЕССсС ддсусЧєєсо 900 аасудодчдЕс ЕСЄСОдДСсССдСсСЕ ЧФУОСЕЧЧУЧСсСЕЕЄ соОссдЕсддЕ сЕДЕсСсаадс сЕдсдЕсСсда 3960 сссадссуддс дссдсеЕсдєд адсесєдасес дссададсде адааасасєсс сСесасессьсе 4020

Едадссссьс ааассеЕсддуд ассстдесссу садссеЕвдсє дсдддсесссу ЄсуддеЕсес9 4080

ЕсЕЕдссаєс сеЕсддсадде гассдддсудда ддсасудсєдс ассеЕддсасе сЕЕЕдсСєетад 4140 дсЕЕЯддсаєс деЕсСдсадасе дсассеЕсдудс СддадсеЕсас дсдсЕсеЕссс ааддсадчед 4200 бааааадедс гЕдддчассьє дсасаадаас Єдсссстєаає дадудссдсеє ввстаасардее 4260

ЄссЕссСсаса судсдсдасса ддссдеєсасе саєсдасстд Сдсдаєсддде СЕЕдсдсодсс 4320 ааааддааєд дассссасеєс єссссдссас Сдоадсддсдс доадЕдссдд ссддассддаад 4380 ссссассдад саассссссуд ааааавсссає судсдЕЕсдсс сааєсддаєд аааадаадає 4440 басуддссадуд ассдеддссуд сссадсстта Сдассссаас саадссудєсаа адеЕдсссдсд 4500 чабаєсдсад дсодддєЕддаа сдаєддаєддс сааддсддеіс ссаааадедуа Ссааддессс 45560 сдсЕДЕссСса ЕЕСсСсдадсес сссссесссс сассддадесд ааадесдасс ссдаєсодсад 4620

ЧдаЕсЯдсдУЧєс дасссеєдаса сеЕсссаседс адсссессуда СсеЕддстасе ссассасааа 4680 ссЕСсСудСсСсСЕСс доасдіадддад асссрдссса дссаааєдда Ссааааасса ддсааваєєссс 4740 саадссеЕєса доаодддаддсес сасаєсссає ддссдссстд саєдессдссе дсеЕсдаєддас 4800

ЕсеЕдсасаєд сеЕсСдсеЕддда Ессаєдсдас сдсддЕдддЕ СсЕєЄдсуддса ссддсассаа 4860 сдасссудєда Едсдсєаасс судсЕЕдссує ссссдудсессас ддасстддсе сЕСЕСтдсас 4920 дЕссадаєєд гдсаєесссс аасасуддссе Сассстдссс ЕсСдЕСадсас, ЄсСоЯддс99д 4980 асссддсраєс саадааасєсу ссссудссуає сеЕсдавєсєєє дчеЕсссаєсу даддсаєддас 5040

ЕсаєгаддеЕєд адсєдеєаадд сєдасасусе дЕДЕДЧЕССС сеЕєдсааєтд ссадстаєде з100

Есодддсбассс сесбсасссуде єосЕЕсУуєдЕеЕ ДЕССССЕСдсС,; СООДЕСдСсСУсСЕ ДЕЕЕСЕСЕСЕ з160 дсасссссес ассаєссстає дассудесдЕЄ СсЕЄСЕЕЧЯас єсеЕЧдеєдааса ЄдссеЕсСсадоу з220 аассеЕсддсс асдурєдеЕссє содеЕЕЕСЕСЕ ЕЕДДУДСЕСЄСЕЕ ддЕСДЄТата сеаасдеєдес 5з280

ГЄддссссдесС ассссссасу асаєєсаєса стасассаде ддсссссдсуд дДдЕДдДЕсСдссдес з340 сЕсддссасс дсассадаєд ддасстасеЕє ддссдсЕдсс сдссдсудсесєсд сдеЕєдасьд9д 5400 ссдсассаєд сеЕдеЕЕсассс судссссадсеє суддЕсСЕсСеЕЕ сЕєдададед ссеЕссадаас 5160

Есдааадссс гсасеєдааса ссдеісааєудє даєсдддесс сСссасдддсе сеЕддсддадвде зО20 дЕсвассаєс дасудддааад ссаадесдсудє аассдссдса саєдесессьса сдддсааєсс 5580 адсЕСсдддеЕс ЕССДддДєЄСЯ дссссааєса аасдсеЕєдас СЕЕЧдасдсаа аддоадачдассяе 53640 сдстассусс дассдсссда асєсддсаадд ддссдссссс аадасссаає СсеЕдсасддда 5700

Еддаєддасеі дадссудєдссе аєєсдудсєсаас асссістьддс дссдаасссду дсдеєсаєт9 з76О0 ааааддаєєсєс дссЕЕссдсЕ Есассдсаєд сддсдаєссс дддеЕссссад Сдаєсассда з820 чдассоддЕдад сеЕсдЕсддсд Ессасасудудд ассдаасааа саадддддду дсаєсдеЕсас З880 дсдссссеЕСса ддссадеЕссе дсааєдсддс асссаєсаад ссаадсдаає Саадсдаасе 5940 сСЕсЕЧдссдодд сссааддесс судсеЕсуддбда сдеЕдааддеіс ддсадссаса Сааєссааада бо сасаадсдад деЕдссЕссад асссЕсусдс сЕЕДСЕвдсЕ дссааассод аасгддаачд 6бОобо аддсесссеЕсс ассудеЕссаас ЕССсСЕЕСУЧЄЧЕ ЯЕСЕСЕЕсСсСЕС сеЕдеддадаа Сдаєддадаса 6120

Єдсседдасуд сссетгоодеЕсу седеЧдадеЕс сеЕсСаьєєсу ааєдаддеєсєс Ссессгдссдае 6180 ссеЕддсссуд аазасдеЕссссе ссссеуддаає ЯдЕЄСдЕдсста Ссседдссса сдссаєсдддес 6240

Едсдсаадес сеєдаєдаєса ддасеЕєссдас адсадсесеє аасаддааса даєддесасе 63О00

ГдсСсСЕСЕЕесС адссесуддед садедассуд СЕЕсдЕСсСдса дасєсеєсдсдаЩ ссасєсаддад 636о дсаєссдЕєсєд саддсадеда єдааєссдад сасстаєдса СЕсссдссес ддаєдаєдаЧе 6420

ЕдеЕдассеса ссадесссад Едаєсасуєд ЄоддсдЕСЧЯдЄд сасссасстуд ссаєсаєеєе 6480 дсасЕсдЕєс аадсассудєд дссеЕдсасса басссЕсдуЕє ддсдаєддад СЯЕЕсСЕсСвдс 6540

ЧЯсСЕЄССЕЄС ЕєЧдадасасоі Еєдссдададау ааадссдадуча дааддддедЕ сдсаасссяд бо сддаасдаасє сасдадесєс ЕдаседдеЕдс ссеЕСдсвсаєуд адасссааєд асддаддассє 6бо6бо дчавЕєсссес аєдааасддда седаєсєсєссаваа дЕД9дСЕЕЕСдДЕЄ СсеЕДсСдЕСсССса асаєдаддаа 6720

Едсадсудуддє саасеєвсаєсу аддсеєдсста сдссааадса сеЕсададсад аасєддссса 6780 дЕсддсасад деЕсСдаєааад Ессдаддсас ЕЕсддссааа сЕЕдаадсеє сСедссдаєвас 6840 сдЕддсЕссс саасесссдс ссудудеЕдасає сдЕсдЕСсСдсЕ сссуддссаса сдсесеЕдеЕє9 6900 садтассеЕєс дасстааадд Есддсадсас саадсарасс сіссаадсса ЄсСдадассад 6960 адЕсСсЕєдсЕ доддЕсСсаааа Сдассдесддс дсдсдісдсс дасссдассс ссасдссссс 7020 асссдсассс деЕдсссаєсс сссосссасс дааадессссд дадаасддсес ссаасуасеєд 7080 чадчоачаєчдад дассдЕєєєда асаадаадаа даддсдсадуд асддаадссс гсдддсаєста 7140

ЕдЕсасдддс додадааааадеі ассадаааєє сеЕдодадасаад аассссодеуд асдеЕдеЕсса 7200

Едаддаддес сасааєсааса садаєдадеуд дчдадеЕдеЕсес ададссддсуд асссодссда 7260 сСЕсЕДЧдасссо дадаадддаа сЕсСЕдЕдЕдуа асасдесасс асєдааааса аддсссасса 7320 гЄдЕЄсасасс Ессссаєсьд деаадаадеє сЕгддеЕсссс дссаасссад адааєддаад 7Зво адеЕєсааєдуда даадсєдсаа адсЕсссудє ддадсаддсес сгтаддсаєда Сдаасдесда 7440 сддсдаасвєд асєдссааад аассддадаа ассдаааада асаассдаса аассссаддад 7500 ссеЕдассаад дадсадсдеє гааасєдста дссдссадсуд асеЕєдасссу сеЕдсддЕсдс 7560

ЧдасддсЕКЯдд ЕЄдДеЕсассда аасадсддра аааасадсса аарсссасаа ссуддассесс 7620 асссеЕдддас сеЕдсдаасс аааадеддсс адеЕдаддеєєд адстаааада сдсоддсєдад 7680 сасаассаас асссудеЕсдс дадассдаєс даєддеЕддад ЄСДЕДдДСсСЕСсСЕЕ дсдеЕссс9сд 7740 дЕссСсессус Есасадасудє сеЕсдаєсісс ддаєдсеЕдаєд саєсссссаа дЕсасеЕрдсс 7800 сассасдддс сдддааасас гдддаєсдає ддсасусссе ддчдассєсда дЕсСсдаадсс 7860 ассааададуд аадссдсасе садесдсдсаа асаасасадд сЕєЕдсдасає Саддсдсддас 7920 часудсссстд ааастуддесе сссетасаад сеЕдсасссод ЄсСаддддсбаа сссеЕдадсдд 7980

ЧЕдаааддад Есссдсадаа басааддеЕс ддадасасас сесбасаааас ссссадедас 8040 ассддаадсс садсдсасдс ддсЕдсседс сеЕбасудссса асдссасссс ддаєдаседає 8100 чадсдсЕссд ЕСсСссддудссас дассаєдссс сссудуддеЕсєсу адесасасде ассдассаєса 8160 ссадсдєсьуд Ессестсдаєта ссессдасссея аддсседасе дсссбаааса дсеЕдасадад 8220 сасуддсєдсуд аадаєдссдс ассдааадас сеЕССстааає асдасевдеЕс сасссаадде 8280

ЕСсЕЧЕсСевТас сеЕддадеЕссья ЕсдссЕсдЕд суддааасасс ЄдДдЕЕЄдссса ЄдеЕаддесаад 8340

Едсссасссуд ЕЄсаєсддес Есстасссас ссеЕдстаада асєссаєддс Сддаасааає 8400 чдоадаасадді Есссаассаа ддасаєссад адсдеіссстд аааєсдасдє СсеЕдсдсдса 8460 саддссдЕдс дадаааассуд дсааассдес ассссеЕєдса сЕСсСЕсСаадаа асадсаєсдес 8520 чадаачаачдча адасвраддас сасасссддс ассаасаасоі Ссассдсасе адсссассда 8580 чсадеЕдеЕєда деЕддЕдессас ссадддсеєєс аєдааааада сдеЕєЄсаасес дсссаєссдсе 8640 сеЕсддааада асаадессаа ддадссасад асєссудесс Сдддсаддед ссеЕєЄдаадсе 8700 чаєсеЕсдсає сссдсдаєсуд асссасдссе дсаастдссс дсЕддеЕЕсдес сдесаасссе 8760 сЕсвтасдаас ЕсєдссЕдЕдс Едаададсає стассуєсує асдєдсеЕдаа сеЕдссдссас 8820 часеЕсасвєдд Есасдсадес сддсдсадед асєсаададад дЕддссЕдЕсС дЕСЄддсдас 8880 ссдаєсассс сеЕдсдЕСссаа сассаєссає адзеЕссоддеда єссаєдсаса дсагасодед 8940 сЕсадессасс єсаааадсду сасссссає ддссссссдЕ ЄсеЕрасаада ссадссааад 9000

Ессдаддаса гдсссааддеЕ Есаасссстд ассдеєстаєє сддасдассе сдеЕдседвсає 9060 дссдадесьс ссассаєсдсес ааастаєсас СоддсдоадЕсдд аасаєсєдаа ЄСЕЧСдасосвд 9120 чадЕссСсада сддасссааа даадасадса агсаасадасе сдссаєсаєтє сСсеаддсесеєде 9180 ачааєсааєсаа аєдддсдсса дссадссссс аассдсдаса ддасссісдс ддсссгсдсс 9240 бассасаєда аддсдадсаа ЕДЕСЕСсСддаа Сассаєдсес садсддссдс аагсасссаєд 9300 часадсеЕдед сЕсСдЕЄсСОдда дсаєдассся даасоддЕеЕссу аадаасеЕсдеЕ адеЕсддаасєса 9360 дсдсадесдсд сссдсаадда сддстасаде СЕЕсСссодддса сдссусЕсес саєдессаєд 93420

Едддааааас гсаддессаа Есасєдаддаа аадаадесда дадеЕдсдсда дсасєдсдадад 3480 дссссддсесс судбасудсстас гдссЕдсддсес сеЕСЯдасудєст дсаєссасса сасссасесс 9540 сассадсаєс деЕссадссас аасстддеЕдЕ ддссаєссад сддадчессссодд ЕЕСсСЕсСдДтаде 9600 чадеЕдсааасє ссссЕдсадуд даааддсаса адсссеЕсЄсад асчдаддедсе ддаасаадесс 9660 ссдЕасаадс ссссасуддас судсєстаєсаєд саєдеддадс адддесесас сссссердає 9720 ссаддсадає ассааасссу ссдсуддаста дЕССсЕдсса ддсдсддаає Саддддааає 9780 чаадесдаас бассадасудд Едаєтасдсе адсассудссе ЄдсЕсСсстас ссдсааадад 9840 ассаасаєдуд ЕсдсЕдссдс Есссаасдра сеЕдсдсадса ддеЕссаєсає сддессассс 9900 чаєдссдудда ааасасассуд дссссЕссаа саддсссадучч асддєдаєдеЕ Сарссасаса 9960 ссаасссасс адассасдсе Едасаєдаєєсє адддсеЕсєсдд ддасдеєдссуд дЕєСаасаєс 10020 ссддсаддса саасудссдса ассссссурс сссоісссдса ссудессдєд ддеЕссдсаєс 10080 ссадссддсд ЧЕсСдДдЕДдДЕсСсС Еддсаадаає Єсссссссад асдаадсадс деаєсдсаає 10140 сассеєсдаєд ЕЕссдаддсеє ЕСсСсСадсааа асрасссєіса ссеЕдЕСТтадуд адасеєєссаад 10200 саасеєссасс садесдддеЕсе єдаєєсссає ЄдссавдеЕєє ссдасаєсає дссесааасе 10260 саасєдаада ссаєсєддад дЕсСсддасад аасасєсьєдеєд асдссудеЕєса дссадаєсас 10320 адддасааас гсасдеЕссає ддссаасаса асссудєдсда сстасудєдда аааасстдсс 10380 аддеасдддс аддессссас сссстассас адддассдад аддасдасдс саєсастасе 10440 часеЕссадес ааддсдссас асссддасуєд дЕсСасаєсдс ассдсссас Сааадаєсса 10500 сссаасаддс ааададсссе ЕдДдссдссаєс ассадддсаа дасасудссає сЕЕсдедсає 105560 чдасссасаса ддсадссдса даадсЕсдЕЕ даєсеЕєсстід сааааддсас асссдесаас 10620 сеЕсдсадедс ассдсдасудуд дсадсєдаєс деЕдссддаса даааєаасаа адааєсдсасд 10680 дЕсдсссадд сеЕСссаддсаа сддуддасааа ЄЕсадддсса садасаадсу СЯдЕсдсадає 10740

ЄсеЕСЕСсСсуусу ссасєєдесдс єдаєссадаа додадссдадсе сеЕссдсЕссс сааддесдса 10800 сасаасеєєдуд дассвасєсє сесасссдає сгаасасадеі Ссдссааасе сссадгсадаа 10860 сЕсдсассес ассддсссудє ддасдасаасс садаасаасуд аааадсддсесс адаєсддсєд 10920 дЕсдссадсс ЕЕсдссстає ссасааасас адссдсдсудЕ дсаєсддбдс сддссатсаєд 10980 дЕдудсссЕс суодЕдДЕСЕСсСЕ аддсассссе додддЕсдсєдЕ сагассаєсоі сасааааєссєе 11040

ЧдЕсаадддсд аддсеЕсаасе дсссссддад асддеЕсєссса дсассддсесу ааєсдаддаєба 11100 часеЕдссуддуд аасаєсссда єдаєсддддаад сдадаадссуд седсдссссе сссасасдсе 11160

Ессаєсдудсуд асдссааадд сасстассЯєсє дчдаддаєдес ассасдеЕсас сеЕссадаєбас 11220 сеЕсссасусуд ЕссеЕЕсСссаа ддааєсадьє дсоддсадссу дддЕсссаад ссссддаааа 11280 дссдсдааад сассдеЕдсас ассдасадає деЕдсассосс садасєсеєсда сдсессаєсіс 11340 сасссуддада сссадеЕссаа дЕдсЕддааа аєчаєдеЕсду асеЕссааада адессдасса 11400 асддЕссдда аадасаааас адсстасеєєс саасеєдаад деЕсдссасєє сасссддесає 11460 садсеЕсдсса дссаєдссесс дсасаєссує деЕсссеЕдсса асеЕссасдуді деасссддас 11520 сссеЕдсаєдд дссссдсссе ЕсЄдсаасадар ададссудссу ддеЕссассса сеЕддддддсе 11580 чассеЕсдсдд Есасссстса єдаєтасуддс дсєааааєса Ссседссвад сдсдбсассає 11640 чдаєдаааєдс сссссудасба саааасєсстьуд дсдсдсдсдуа адесєсессдеє ддаєдассса 11700 дЕсаадсаса аасагасссуд додддЕссСдаа ссодддаєсасад сдтасєстдста Сдадсссасс 11760 ддааасуддеєд аддасєддда ддаєтасаає даєдсдєссс деЕдсдсдсса ддаадддааа 11820 ассвтасаадд ссаседссас садсеЕєдаад ЕЕЕСавреьсєс ссссуддаасєссс СдеЕсаєтдаа 11880 ссаасссвтад дссєдааєсу аааєдаааєд доддсссасдс авадсесЕсев сСтсасаааасєяе 11940 ддссаасЕєс ЕєЧдсодаєдс ЕссСсасддад ЕЕСЕСсуддсдЕ ссаєсдеЕєда Саєсастаєса 12000

ЕСЕЕсдддсса ЕЕСЕЧЧЕсСсдд сеЕсСсассаєс дссодеЕЄдддс СоддЕдЯЧЕСЕЄ Седсаєсада 12060

ЕСсЯдЧЕСЕддсс ссодсудасбасе ссудсбасдсудсес СсеЕдссаєсс асесєдадса ассасадаад 12120 ассеЕсаєдад дссЕЕЕсЕсЕ сссадедсса адсддасаєє сссассрдудад даассаааса 12180

ЄссЕЄсддддадуд авєдсеЕсєсддс ассаєсааддЕ дЕСсаасссотд ассдаєдааа СЄддєЕдсс9асд 12240

Есдаасдрас сдсаєсаєдуа аааавгдсадуд дсаддсєдсс Сддааасадд Сддєдадсда 12300 чдастасудсеєд ЕСсСсСсудсаєса дсадеЕссоода ЄдеЕддЕддсЕ сареєсссадс асссадссдс 12360 саєєдаадсс дадассєдса аасаєєсдудс сеЕСсСссуддсессд сссаєдссас асаасстідсд 12420 саєдасаддс саааєдсаа ссасадсдта саасадсасе Ссдааєсадда СЯ есСдсває 12480 гЕсЕсСсаасс сссдудЕєсссс ддссааадсе Саасдавєсєє садсааєдуає Саасадсе де 12540 асарсєссесс арастєссссе седеЕЕдсаас ЕЕСССдрасьі сеЕЕсссуєву Сооседеодее 12600 дсдддеЕссса асбастасугра сЕдсЕсссуд ЕЕсссуссдуд Ссаддддсаа,ї СЕЕЕССЕЄСС 12660 чаасеєсасад Єдааєсасас ддасдЕдссса ссеЕсдсссса сссуддсаадс адссдсадад 12720 асстасдаас ссддтаддес ЕСсССЕЕддЕдс аддасаддді асдассдаєд Сдаддаддає 12780 чаєсаєсдасуд адссадддеЕє гасддбассу сседдссссЕ ссадсдаадд ссассєдасе 12840 азеЕдеЕссасу сссдуєсдудс дЕССЕвдесСс сЕсадстаса сддсссадсєї ссаєсссдад 12900 асаєєсддадда гаддчдааєде дадесдадьсє саєдеЕєдаса Ссааасаєса асесаєссевдс 12960 дссдаасаєд асдддсадаа сассассеєвуд ссеЕсдЕсаєу асаасаєсєс адссддсдесе 13020 садасстаєс ассаасаєса адссдасуддс ддасааєєдудє СЕсасстада асддсеЕссае 13080

СССЕССЕЕЕС ссссугудеЕЕ ддсЕєсааає дЕССсСЕєдудЕ СЕСЕСаддсуд СЕсСдсседса 13140 аассасдЕеЕсєс садесєсдадеі сеЕсСдсадаєра ссаадассаа сассассдса дсддсаадсе 13200

ЕсдсеЕдЕссо ссаадасаєс адеЕсдссева додсаєсдсда сеЕсддссЕсІ даддсдаєссс 13260 дсаааасссс гсадеЕдссудЕ асддсдаєбад ддасасссує дсаєдеЕвасс ассасадсса 13320 асдеЕдасада Едадааєссає гсасасссьєс сеЕдассеєсст саєдсесессть ссеЕСДсСсЕе 13380

ЕсгтаєдсеЕєс Едадаєдадеі даааадддає сгааддеєддЕ асесддсаає деЕдссаддса 13440

ЕсЯдгддсСЕЧдЧеЕ дЕДЕдЕСсСаає ЕсСассадсе асудсссааса СдЕСсСааддад СЕгасссаас 13500 дсЕСсСсСтгдУЯєЄ ддссдассає дедсуддсєдс сссаєесєсає дасасстдад ассасдадде 13550 чдаддсаасеЕдс ЕЕсСадусссдеЕ вес вдсса СЕССДЕєДдс ааєсдаає ЄСтаадсаєд 13620

Есддадааає дсссдассдс доадсеЕдеЕсас Ссодсаассдс ЕСЕСЕЕс9Є9д дсдтаєссоавд 13680 сСсСЯЕЕСсСЕдЧЕС ЕєдсСЕдсдсЕ содссаасудес адсаасдаса дсадссссса Єсгасадсед 13740 асстасаасс Едасудссаєд єдадсєдаає ддсасадаєє ддссадссаа сааасеєєдає 13800

ЕдддсадеЕдуд ададздеЕсссує сассссссс дЕЄСЄЧасес асаєсдеЕссс стаєддаєдсс 13860 сеЕсассасвса дссареєсссе Едасасадес дсЕсстадсса сеЕдеЕдЕссас сдссддаеЕсе 13920 дЕссасдддс дасаєдессся аадсадсаєс басдсудесеЕ дЕдссстддс Сдсудєсєдасе 13980 гЄдсСЕЄСЯдЕСа ЕєаддЕссдс ааадаастдс ардссседдс дстасдсдеєд Сассадаєває 14040 ассаасеЕвєєс ЕЄєссдддасас гаадддсада сеЕССаєсуаєеЕ ддсддЕсдсс СдеЕсаєсаєба 14100 чадааааддуд дсааадссда ддссдаадді саєсєдаєсу ассєсаааад азуЕссдеЕдссяе 14160 чаєддєсссдд гддсаасссс гасаассада дЕсссадсдуа аасаасддудуд ЄсдеЕссетад 14220 асдасесссьд єсаєдасадс асддсєссас ааааддедсее СЕС Сстаєстасся 14280 асасдссадс дасдаєасає дссстааадд Єдадссдсду ссдассдста доддссєсевдс 14340 ассЕсєсеЧає сеЕсссьдаає ЕдсдсЕсесса ссеЕсСсууддба саєдасьЕстс дсдсасьсос 14400 ададсасааа гааддесдсд сЕсассаєдуа дадсадсадеі Сдсасеєссеє єдоддддЧЕдЕ 14460 асссадссає адааасссдуд аааєєсаєса ссеЕссадасєу ссуєссдсдсес сСеЕдссаддес 14520 дсаадсасає єссддссссЕ дсссассасу СЕдааадсдс сдсаддсесе саєссчаєсд 14580 сддсаааєда гаассасдса ЕсСдЕсдЕсс дудсдЕсссдди сЕссастасу деЕсаасдддса 14640 саєєддЕдсс содддЕсаааа адссеЕсдсдЕ Сдоддсддсад аааадсєдссї ааасадддад 14700

ЕддЕааассс гдссааасає дссааасаас аасддсаадс адсадаасад ааадааддад 14760 чаєддссадс садссаасса дссдеЕдссад асєдссдддса адаєсаєсдс Ссадсаааас 14820 садеЕссадад дсаадддасс дуддааадааа аасаадаада аааасссудда даадссссає 14880

Ессссссвад сдасєдаада єдасдесада саєсасесса ссссвбадесда дсддасааєсд 14940 гЄдЕСЕдДЕСсСУдЄ саасссадас сдссеЕсЄсСаає сааддсудссд ддасссдсас ссеЕдссадає 15000

Есадддадда гаадесасас гдсддадеЕ адеЕссдсесса сдсаєсатас гдЕДдсдссвд 15060 асссдсдЕса садсаєсасс сеЕсадсаєда сдддсеЕддса СЕСЕсСдаддсес ассесадеде 15120

Есдаассддда адааєдєсдеєд деЕдааєддса сеЕдаєєдаса СЕдеЕдссссеЕ аадсастаєса 15180

Се 15182

ПТ УУУМ ЖЖ ли юю я, ей пін

Ко с ТКУ ую

Зоо пи сок ЖЖ

І ніж які СВ ткеужж в ящге ше НВ

М ї ши У енсеккко ге лю дош и Ся кллиєєє кн В Й ТУ юю тУх. я ЕІ в шк АХ

МАО ї ях ОА и. їж ї ди о ОККО

БК тел ХУ сек М ХО оон, ПТ УМжоувхжю я АК ше ОО ща Її й ХК ОО Кк

Ж ї щяУ не С ооо оо м МИ, леж

ОМ Ем пика х МАК. М ж ЖК хЕ й . х Я ХОМ. - ї як ХХ с вв ще ї ших ХО НН по ВК

Жов и у п З ОО ї Ох я ЕКО ях ХХ КМИН КК С с ХО - АВ ї ет Ка МК ОО ПК с ХОМ їх Н и : МКК ОВ ХОМ я ення

Мою Ви ЖК ХО Єжик вкеккх ук мих,

У У В я . й Вау ПАМ

Я юка З В Ж я сок ОКХ о Я і. ферзакж у ВВЕ ту не Он З 0. ї ЖЕ тккт

ВЖАХХХ мії Кк М х Ж з х ах ккд, ХХ пу 2 ел КУ, мк. ОКХ х Ї феод у ККД ІВ Зм

КД служ УМХ ухкк ник ї Кафе ук х ВВ У

ТК тре соккаюнн Е -

ЖЖ т

Я З кози тек ку ту че їі заВІ опе я МиЖУ

ТУ пл ск дккх дови о

МАЕ ви ах ГК То їм

БЖ ше МОБ ірКц 45 ж ЕК: : жо 25 4 г їх

Керюсте ЕК ОО а ТІ Те пла й ік и ВИХ Ту т Фо бук соду зх офі

Коресує РЕЖ ОВ З и: я ГЕ щ зи ї

Каже ЯМ тр зожж полу . ли зла

КоНЕВОдь ща ПЕ У? ах пля ГЕН

Фіг. 1

КИМ яй нини ння КВТ тить тити или титьттитьтьи

НК - нн КАК М ух ххх є - Ти 0 ВЕНИ

В дик ЦЯ ДОН ЩО с Мк 3 Я нт ОО МТ о ву ке Ро ооо ХК

Ж и ЕХ ОО не ЕІ со НВ и дк ДК их суки м.

ВОМУ АНК СЯ 7 ВИН 7 т 5 а В кону ІМ щ 1 ВО с я 2 хх Ро ЗБ 5 МЕ

ОК ом ММ я В ооо юку м КК кВ щ «АКА Ж и НН нин о кккккккя о ко я Ніро ВЕНУ х : І ши по зх ж з т ще Ко пон ще хх

Ж о здтмю и Пенн ХХ КК ср ее фак

Ух цих ж Маки ВВ ЗО Да ух БУ КервхлА ЕНЕХх

ОО Юе ВВВ М З

М 1 гу Сея : паю 1 оди ух кс : Миті лу ї У кти вк ик 1

ОЖентроль РО БЕрКВУЮ Керр.

Е ї ог 2 у хх ї ста я 1 : ВВ У РН

ДУ юку у Ко ХХХ Жук кА отккюнокй їхуї рен х ї раки І сту Н

АК А : С : ам і в п

Втулка

Зіка

Фіг. 2 їх :

КЕ : х : м : ; х

Ж : ех: с є ххх ик ши Я хх ха совок . НЕХВ пункт т жири

ЩЕ : х Б

Ж : во Сх : «й : : ; Я ту в Зк ду ЖЖ КОС х : х Ж хк жк КОХ до чжщ Ж т 7

М не фен Жодне тр т нт тя в Н зх

Ж : х й т х : » Б хе : Я як

Ех і й Р ; З х -к ВЕЖ «Гість тии ит тт ти М тдотииттт ит тт ти тттяттттттттт тт ттяттио К гтллтттти и ттттттт и тттт т т т ттттт ит ттттттти, їх : м Ки ж що 1 з І щ- і Ж ди її : К о

КУ : я М у є

КУ і ее юну сс щ

І ле МО МВВ но ХК Вк во пекжчняяятнт няття «а ПИЙ ш- 2 Б ША ш п: Мк Кн п п шХ пд М МІЖ оОМжущтнохцИ хек кризу їх 15 х х з х Зшо ша. лЕмж о сжме ЗУБ» зе ож жккко ех МЕРТВИХ їх КУ Ух З Ек Мх ЖЖ ММ А ЖИ ТМ ХБАХ. ЛКК ІМ саме ХК хх М її 2 М х х

Дек воглізкевних зані МУК крани в БУТУ

Claims

1. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація, що включає: а) принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРУ), де принаймні один антиген РРУ являє собою одну або декілька субодиниць РРУ, і принаймні одна субодиниця РРУ являє собою вірусний білок 2 РРУ (УР2), де УР2 РРУ складається з амінокислотної послідовності, що має щонайменше 99 або 100 90 ідентичності послідовності до амінокислотної послідовності БЕО ІЮ МО:2, де УР2 РРУ являє собою тільки антиген РРУ, 1 б) принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного та респіраторного синдрому (РЕВ5), де принаймні один антиген вірусу РКК5 являє собою / живий атенуйований/модифікований живий вірус РЕК5, вибраний із групи, яка складається з наступних: живий атенуйований/модифікований живий вірус РЕК5 генотипу типу І, живий атенуйований/модифікований живий вірус РЕВ5 генотипу типу 2, штам 94881 живого атенуйованого/модифікованого живого вірусу РЕК5 1 штам вірусу РКК5 під номером депонування УК-2332.

2. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за п. 1, де імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію рецептують для введення у формі разової дози або двома дозами.

3. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за п. | або 2, де імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація додатково включає принаймні один фармацевтично прийнятний носій, краще карбомер.

4. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пп. 1- 3, де імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація включає від 0,1 до 50 мкг антигену УР2 РРУ, краще від 0,5 до 10 мкг антигену УР2 РРУ, більш краще від 1,0 до 10 мкг антигену УР2 РРУ і/або від 3,9 до 7,0 Іое1іо ТСІЮ5зо живого атенуйованого/модифікованого живого вірусу РЕК5.

5. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пп. 1-4, де принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРУ) і принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного та респіраторного синдрому (РЕК) містяться разом в одному контейнері або відділені один від одного простором, краще містяться у двох або більше окремих контейнерах.

б. Комплект, що включає імуногенну композицію або комбіновану вакцину або комбінацію за будь-яким з пп. 1-5.

7. Комплект за п. б, де принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРУ) 1 принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного та респіраторного синдрому (РЕК5) містяться окремо один від одного у двох або більше окремих контейнерах, краще незалежно один від одного в ліофілізованій або замороженій формі, і де комплект додатково включає інструкцію з посібником зі змішування розділених простором принаймні одного антигену РРУ 1 принаймні одного антигену вірусу РКК5, причому така інструкція з керівництвом краще містить вказівки з комбінування вмісту контейнера(ів), що містить(ять) принаймні один антиген РРУ, із вмістом контейнера(ів), що містить(ять) принаймні один антиген вірусу РРЕ5, причому більш краще рідкий вміст контейнера(ів), що містить(ять) принаймні один антиген РРУ, використовують як розріджувач для ліофілізованого вмісту контейнера(ів), що містить(ять) принаймні один антиген вірусу РРЕ5.

8. Комплект за будь-яким з пп. 6-7, де комплект додатково включає вказівки з лікування та/або профілактики захворювань у свиней та/або додатково включає вказівки з лікування та/Лабо профілактики інфекцій вірусу РРУ та/або вірусу РЕК5, причому такий комплект краще додатково включає вказівки із асоційованого застосуванню компонента РРУ, краще як окремого компонента комплекту, і компонента РКК5У, краще як окремого компонента комплекту, зазначеної імуногенної композиції або комбінованої вакцини або комбінації, 1 включені в такий комплект.

9. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за будь-яким з пп. 1-5 для застосування як медикаменту, краще як вакцини.

10. Комплект за будь-яким з пп. 6-8 для застосування як медикаменту, краще як вакцини.

11. Імуногенна композиція або комбінована вакцина або комбінація за пп. 9-10 для застосування для лікування та/або профілактики інфекції вірусу РРУ та/або вірусу РКК 5, зниження, профілактики або лікування клінічних ознак, викликаних інфекцією РРУ та/або вірусом РЕК5, або для лікування та/або профілактики захворювання, викликаного інфікуванням РРУ та/або вірусом РЕК5, де краще принаймні один антиген свинячого парвовірусу (РРУ) 1 принаймні один антиген вірусу свинячого репродуктивного та респіраторного синдрому (РКК5) вводять суб'єкту одночасно, більш краще окремо одночасно в одному або різних місцях введення, послідовно у будь-якому порядку, та/або з регулюванням за часом.

Даний винахід стосується вакцини проти свинячого парвовірусу й вірусу свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому для захисту суб'єкта, переважно свині, від захворювань, зв'язаних зі свинячим парвовірусом та/або вірусом свинячого репродуктивного й респіраторного синдрому.

Даний винахід також стосується способів одержання імуногенних композицій, а також таких імуногенних композицій, що проявляють знижену віруцидну активність.