DD271128B5 - Verfahren zur Gewinnung von Ubichinonen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Ubichinonen aus mikrowellen Biomassen und kann in der Biotechnologie und pharmazeutischen Industrie angewendet werden.

Für die Ubichinone, die zur Gruppe der in der Natur weit verbreiteten Biochinone gehören und am Elektronentransportsystem der Atmungskette beteiligt sind, wurden zahlreiche pharmakologische Wirkungen gefunden. Besonderes Interesse besitzt das Ubichinon-10, da es auch im menschlichen Gewebe vorhanden ist.

Bevorzugtes Ausgangsmaterial für die Gewinnung der Ubichinone sind mikrobielle Biomassen, besonders solche, die Ubichinon-10 in relativ hoher Menge enthalten. Die Gewinnung der Ubichinone erfolgt im allgemeinen durch Extraktion der Trockenbiomassen mit organischen Lösungsmitteln. Verseifung der Lipidextrakte und Isolierung der Ubichinone aus der unverseifbaren Fraktion. Bei Verwendung der für die Lipiextraktion üblichen Lösungsmittelsysteme, beispielsweise Chloroform/ Methanol-Gemischen, werden die Ubichinone unselektiv zusammen mit den anderen Lipiden und einem bestimmten Anteil an hydrophilen Zellbestandteile gelöst. Die Ubichinone liegen somit im Extrakt in entsprechend niedriger Konzentration vor, so dass die nachfolgende Isolierung einen hohen Aufwand an Chemikalien, Arbeitszeit und Energie erfordert.

Stand der Technik sind weiterhin Verfahren zur Gewinnung der Ubichinone, bei denen durch die Verwendung spezieller Lösungsmittelsysteme eine bevorzugte Extraktion der Ubichinone und damit eine Anreicherung im Extrakt erfolgt. Beispiel hierfür sind die Verwendung von Acetonitril nach JP- 53-121996 A, der Einsatz von Aceton nach DD 154 448 A1 und nach DE 28 34 952 A1 sowie von Aceton/Wasser-Gemischen nach DD 229 152 A1 als Extraktionsmittel.

Abgesehen davon, dass die Selektivität der Extraktion und die erreichte Ausbeute an Ubichinonen teilweise nicht befriedigt, haben die bekannten Verfahren zur Gewinnung von Ubichinonen den entscheidenden Nachteil, dass bei der Extraktion der Biomassen große Mengen von Lösungen anfallen. Aus diesen Lösungen müssen die ubichinonhaltigen Extrakte destillativ abgetrennt und die organischen Lösungsmittel zurückgewonnen, regeneriert oder vernichtet werden. Ebenso müssen die organischen Lösungsmittel aus der Biomasse vor deren Weiterverwendung entfernt werden. Die Vielstufigkeit der notwendigen Isolierungs- und Reinigungsoperationen verursacht hohe Kosten, begünstigt Betriebsstörungen und kann zu Qualitätsminderungen führen.

Ziel der Erfindung ist es, den Aufwand für die Gewinnung von Ubichinonen aus mikrobiellen Biomassen zu senken. Dabei lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Ubichinone aus mikrobiellen Biomassen selektiv, nahezu vollständig und mit einer geringen Zahl an erforderlichen Arbeitsstufen abzutrennen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass eine ubichinonhaltige Bakterienbiomasse einer Hochdruckextraktion mit Kohlendioxid und einem Selektivlösungsmittel unterworfen wird und aus dem beladenen Extraktionsmittel ein 2 bis 10 Ma.-% Ubichinone enthaltender Extrakt abgeschieden wird.

Als Ausgangsmaterial werden Ubichinone enthaltende Bakterienbiomassen eingesetzt, die auf Methanol als Substrat in kontinuierlicher Kultur erzeugt wurden. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Bakterienbiomassen im Anschluss an eine Produktbildungsphase, beispielsweise von Bakterienbiomassen auf Basis von Methanol nach der Nutzung zur Gluconsäureproduktion aus Glucose. Die Bakterienbiomasse kann erforderlichenfalls vor der Extraktion einem Zellaufschlussverfahren unterworfen werden.

Die Hochdruckextraktion erfolgt in an sich bekannter Weise bei einem Druck im Bereich von 7 bis 35 MPa und einer Temperatur im Bereich von 30 bis 70 °C. Als Extraktionsmittel wird das physiologisch unbedenkliche, nichtbrennbare und billige CO₂ eingesetzt. Die Hochdruckextraktion wird in Gegenwart eines Selektivlösungsmittels vorgenommen. Das Selektivlösungsmittel kann entweder direkt dem CO2 zudosiert werden oder dem Ausgangsmaterial zugemischt und aus diesem im Verlauf der Extraktion zusammen mit dem CO2 ausgetragen werden. Reste von Selektivlösungsmittel können aus der Biomasse durch eine Nachextraktion mit CO2 entfernt werden. Als Selektivlösungsmittel wird ein Alkohol oder Keton und/oder Wasser in Mengen von 1 bis 15 Ma.-% bezogen auf CO2 eingesetzt.

Die Abscheidung des Extraktes erfolgt in bekannter Weise in einer seperaten Stufe durch Dichteerniedrigung des beladenen Extraktionsmittels. Die Dichteerniedrigung kann durch Entspannung oder Druckabsenkung und /oder Temperaturänderung erfolgen. Ebenso kann sie in mehreren Stufen erfolgen, besonders wenn mehrere Extrakte mit unterschiedlicher Zusammensetzung gewonnen werden sollen. Abgeschiedene Anteile an Selektivlösungsmittel werden destillativ entfernt.

Der erfindungsgemäß gewonnene Extrakt enthält etwa 2 bis 10 Ma.-% Ubichinone. Bei einem durchschnittlichen Ubichinongehalt in der Biomasse von etwa 0,1 Ma.-% erfolgt damit durch das erfindungsgemäße Verfahren eine Anreicherung der Ubichinone um bis zu 2 Größenordnungen. Vergleichsweise enthält mit Hilfe bekannter Verfahren gewonnener Extrakt, beispielsweise bei Anwendung von Chloroform/Methanol-Gemischen als Extraktionsmittel,< 1 Ma.-%

Ubichinone. Außerdem ist in den erfindungsgemäß gewonnenen Extrakten der Gehalt an den die weitere Aufarbeitung störenden Phospolipiden im Vergleich zu den üblichen Extrakten vernachlässigbar gering.

Die Ubichinone können aus dem Extrakt mit Hilfe bekannter Verfahren, beispielsweise durch Verseifung des Extraktes in Gegenwart eines Antioxidationsmittels und nachfolgende säulenchromatographische Abtrennung der Ubichinone aus der unverseifbaren Fraktion mit vermindertem Aufwand gewonnen werden.

Das Extraktionsmittel ist ohne weitere arbeits- und energieintensive Reinigung direkt in den Kreislauf zurückführbar. Zu seiner erneuten Einführung in die Extraktionsstufe wird lediglich die zur Abscheidung vorgenommene Dichteänderung wieder rückgängig gemacht. Die Kreislaufführung des Extraktionsmittels bietet die Möglichkeit, den Verfahrensablauf zu automatisieren und besonders wirtschaftlich zu extrahieren.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht folglich darin, dass Ubichinone aus mikrowellen Biomassen mit einer geringen Zahl an Arbeitsstufen sowie mit vermindertem Aufwand an Hilfsstoffen, Arbeitszeit und Energie und unter Vermeidung jeglicher Umweltbelastung gewonnen werden können.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Eine Bakterienbiomasse des Stamms Acetobacter methanolicus IMET B 346 wurde durch kontinuierliche Kultivierung auf Methanol erzeugt, aus dem Fermentationsmedium abgetrennt und lyophilisiert.

39,5 g des Bakterientrockenproduktes mit einem Gehalt von 0,050 % Ubichinon-10 wurden in den Extraktionsbehälter gefüllt und 1,25 Stunden mit einem Gemisch aus 86,5 Ma.-% CO₂ und 13,5 Ma.-% Ethanol bei 20 MPa und 47⁰C extrahiert. Die spezifische Durchsatzmenge an Extraktionsmittelgemisch betrug 7,5 g/g Einsatzprodukt. Anschließend wurde die Biomasse zur Entfernung des restlichen Ethanols 1,25 Stunden mit CO2 nachextrahiert.

Im Abscheidebehälter wurde durch Entspannung des beladenen Extraktionsmittels ein ethanolhaltiger Extrakt abgeschieden.

Nach destillativer Abtrennung des Ethanols fielen 0,42 g Extrakt mit einem Ubichinongehalt von 2,9 % (62% der in der Biomasse enthaltenen Ubichinonmenge) ab. Der P-Gehalt des Extraktes betrug 0,14 %.

Vergleichsweise wurden 100 g Biomassetrockenprodukt nach Vorbeck und Marinetti (J. Lipid Res. 6,3, 1965) 3-mal mit je 11 Chloroform/Methanol (2:1) extrahiert. Aus der Extraktionslösung wurden die Lösungsmittel destillativ abgetrennt und aus dem Rückstand wurde die hexanlösliche Fraktion hergestellt. Es fielen 6,2 g Extrakt mit einem Ubichinon-Gehalt von 0,74 % und einem P-Gehalt von 2,2 % an.

Beispiel 2

Eine Charge Bakterienbiomasse gemäß Beispiel 1 wurde durch Behandlung in einem Vibrationshomogenisator mechanisch aufgeschlossen und anschließend lyophilisiert.

23,8 g der vorbehandelten Biomasse mit einem Ubichinon-Gehalt von 0,058 % wurden mit 14,5 g/g des oben beschriebenen Extraktionsmittelgemischs 2,5 Stunden bei 20 MPa und 65 ° C extrahiert. Anschließend erfolgte 1,5 Stunden eine Nachextraktion mit CO2.

Der analog Beispiel 1 gewonnene Extrakt enthielt 2,2 % Ubichinon-10. Das Ubichinon-10 war vollständig aus der Biomasse abgetrennt.

Beispiel 3

Eine auf Methanol kultivierte Bakterienbiomasse von Acetobacter spec, wurde zur mikrowellen Produktion von Gluconsäure aus Glucose nach DD-WP 246 334 verwendet, anschließend aus dem Fermentationsmedium abgetrennt, mit Wasser gewaschen und lyophilisiert.

35,3 g des Biomassetrockenproduktes mit einem Ubichinon-Gehalt von 0,061 % wurden 1,25 Stunden mit 8,5 g/g eines Gemischs aus 89,8 Ma.-% CO₂ und 10,2 Ma.-%Ethanol bei 20 MPa und 53 ° C extrahiert und 0,5 Stunden mit CO₂ nachextrahiert.

Im Abscheidebehälter erfolgte bei 5,8 MPa und 25 ° C die Abscheidung des Extraktes. Das Extraktionsmittel wurde in den Kreislauf zurückgeführt. Es wurden 0,24 g Extrakt mit einem Ubichinon-Gehalt von 8,3 % (92 % der Ubichinonmenge) gewonnen.

Claims (4)

1. Verfahren zur Gewinnung von Ubichinonen dadurch gekennzeichnet, dass eine ubichinonhaltige Bakterienbiomasse, die auf Methanol als Substrat in kontinuierlicher Kultur erzeugt wurde, einer Hochdruckextraktion mit Kohlendioxid und einem Selektivlösungsmittel unterworfen wird, und die Ubichinone aus dem 2 bis 10 Ma. -% Ubichinone enthaltrenden Extrakt in bekannter Weise gewonnen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Biomasse vor der Extraktion einem Zellaufschlussverfahren unterwirft.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Biomasse unmittelbar nach Abschluss einer Produktbildungsphase einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine auf Methanol kultivierte Biomasse nach mikrobieller Produktion von Gluconsäure aus Glucose nach Abtrennung aus dem Fermentationsmedium einsetzt.