DD271427A3 - Verfahren zur herstellung von griseofulvin auf fermentativer basis - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Griseofulvin durch mikrobiologische Synthese. Das Verfahren wird in der pharmazeutischen Industrie angewendet. Das Produkt dient zur Behandlung von Mykosen. Ziel der Erfindung war es, ein moeglichst einfaches, gegenueber dem Stand der Technik verbessertes Verfahren zu entwickeln. Dieses Ziel wurde durch eine neuartige Steuerung der mikrobiellen Griseofulvinsynthese in Form von Zufuhr assimilierbaren Stickstoffs unter Beruecksichtigung des unterschiedlichen Substratbedarfs in der Tropho- und Ideophase bzw. in den Uebergangsphasen erreicht. Die Raum-Zeit-Ausbeute ist gestiegen.
Description
Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur industriellen Herstellung von Mykoantibiotika, insbesondere von Griseofulvin. Es ist in der pharmazeutischen Industrie bei Vorhandensein entsprechender Fermentationsanlagen anwendbar. Griseofulvin selbst ist seit Jahrzehnten be' nt und wird als wichtiges antifungicides Antibiotikum in der Human-, Veterinär- und Phytotherapie eingesetzt.
Zur biologischen Synthese von Griseofulvin und seiner Derivate durch Fermentation mit c'an Stämmen der Gattungen Penicillium und Nigrospora sind bereits zahlreiche Verfahren bekannt, denen jedoch allen kompliziert? Fermentationsbedingungen ohne Regelung der Biosynthese und nicht die der genetischen i'otenz der Stämme entsprechenden Ausbeute beziehungsweise Stabilität und Wirtschaftlichkeit gemeinsam sind. Damit werden die allgemein bekannten Prämissen für mikrobiologische Produktsynthesen, wie Einsau won Stämmen mit hoher und genetisch stabiler Potenz zur Synthese des gewünschten Produktes und Schaffung von Fermentationsbedingungen, die zu den im Bereich der genetisch fixierten Leistungsgrenze des verwendeten Mikroorganismus liegenden Ausbeuten führen, nicht erfüllt.
In der GB-PS 784.618 oder in der SU-PS 458.577 werden Stämme beschrieben, die eine relativ geringe Leistungshöhe zeigen. Lösungen zur Ausbeutesteigerung enthalten unter anderen die GB-PS 934.526 (Einsatz von Methyldonatoren), 934.527 (Verwendung von Gemischen verschiedener organischer und anorganischer Stickstoffquellen als Stickstoffsubstrate) sowie 868.958 (Nachdosierung von Kohlenhydraten, bovorzugt Lactose unter Nutzung des pH-Wertes als FührungsgroiJe) oder die NL-OS 7303.676 (Weitere Abwandlung des Nährmediums in den einzelnen Kultivierungsstufen) sowie die DD-PS 53.273 (Verwendung von durch Mutation erhaltenen Griseofulvin-bildenden Hochleistungsstämmen).
Die Raum-Zeit-Ausbeute ist mit Ausnahme eines Beispiels der GB-PS 934.528, wo ein Höchstwert von 14000mg/l nach 10tägiger Fermentation angegeben wird, unbefriedigend. Gemäß den Angaben der Patente muß die Stabilität in den Ausbeuten angezweifelt werden. Dns soll durch folgende Angaben belegt werden:
Als Stickstoffsubstrate für die mikrobielle Biosynthese des Griseofulvins werden ausschließlich organische Stoffgemische, bevorzugt Maisquellwasser, eingesotit, die in Anlehnung an Erkenntnisse der Griseofulvin-Biosynthese (vgl. Rhodes, Α.: Progr. Ind. Microbiol.4 (1963], 165-178; Harris,C.M., u.a.: I. Am. Chem.Soc. 98:17,18 [19761,5380-5363; Sato, Y. a dT. Oda: Tetrahedron Lett. 31 (1976), 2695-2698 und andere) Lieferanten essentieller Bausteine für Metaboliten sind, wie zum Beispiel Methylgruppendonatoren.
Die Substitution der organischen Stickstoff-Komplexstoffe durch definierte organische Stoffe, wie Harnstoff oder Ammoniumacetat oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumhydroxid oder Ammoniumchlorid, bewirkte auch in den verschiedensten Kombinat'onen geringere Ausbeuten. Auch bei Nachdosierung der stickstoffhaltigen Komplexsubstrate Com steep liquor und Diatilles solubles in Verbindung mit Kaliumchlorid wie in der GB-PS 934.528, resultiert zwar eine Verbesserung der Ausbeute (Maximalwert: 11700mg Griseofulvin/I nach 12tägiger Kultivierung im Schüttelkolben) aber nicht der unter bevorzugter Verwendung von Maisquellwasser erzielte Wert.
Dadurch, daß ein Gesamtstickstoffüberschuß von 0,3 Gew.-% als Vorteil für die Produktionssynthese ausgewiesen wird, obwohl die eingesetzten Komplexsubstrate bekanntlich schon chargenbedingte Qualitätsunterschiede aufweisen und oben genannte Prinzipien der Kulturführung (Zugabe von organischen stickstoffhaltigen Stoffgemischen und Zulassen eines relativ großen Stickstoffüberschusses während der Griseofulvinsynthese) angewendet wurden, läßt sich unter Berücksichtigung der Literatur zur Regulation des Sekundärstoffwechsels (vgl. Bormann, E.-l.: Biol. Rdsch. 7,5 (1969), 193-204) ableiten, daß die Fermentation ohne eine gezielte Regulation der Griseofulvinbiosynthese durchgeführt wurde und folglich die Stabilität als für Produktionsverfahren unzureichend gekennzeichnet werden muß. Damit wird die Wirtschaftlichkeit der Verfahren in Frage gestellt.
Schließlich sind z. B gemäß DD-PS 151574 technische Lösungen bekannt, wonach der für die Fermentation benötigte Stickstoff in Form von Ammoniak dem Belüftungsstrom zudosiert wird, in Konzentrationen von 0,1-1,2 Vol.-%. Damit wird eine verbesserte Stickstoffversorgung der Mikroorganismen ohne zusätzliche Wasserbelastung erreicht.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, ein ökonomisch günstiges Verfahren zur fermentation Herstellung von Griseofulvin zu entwickeln, das sich sowohl hinsichtlich der Ausbeute als auch der Qualität des Griseofulvins auszeichnet, und eine volle Ausschöpfung der genetischen Potenz der Stämme zur Produktbildung gestattet
Damit sollen die Mängel der bereits bekannten technischen Lösungen überwunden werden.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Es besteht daher die Aufgabe, eine Lösung zu finden, die es gestattet, auf einfache Art und unter technischen Bedingungen die, bisher nur in reiner Form oder über stickstoffhaltige Komplexsubstrate zugeführten, für die Griseofulvinsynthese essentiellen Bausteine intermediär im Zuge des Stoffwechsels zu erzeugen und dem mikrowellen Griseofulvinaufbau zuzuführen. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die mikrobiologische Synthese von Griseofulvin neben dem üblicherweise verwendeten Maisquellwasser als N-Quelle und den anderen bekannten Nährlösungsbestandteilen bzw. Fermentationsparametern, wie Druck, Temperatur, Belüftung in den für Schimmelpilze zutreffenden Bereichen, auch Ammonium und Ammoniumsalze als alleinige N-Quelle für die Griseofulvinsynthese mit einer bisher nur für H-^ Substrat Maisquellwasser beschriebenen Produktbildungsrate (kp) abläuft und auf Grund der besseren Steuerbarkeit des definierten Stickstoffanteils im Dosie.-ungssubstrat sogar eine Steigerung der Griseofulvinbildungsgeschwindigkeit und damit der Ausbeute bei gleichzeitiger Stabilisierung des Prozesses und geringeren Kosten erreicht wird.
Die Besonderheit des Verfahrens besteht darin, daß der assimilierbare Stickstoff über die gesamte Fermentationsdauer so gesteuert wird, daß in der Wachstumsphase bis zu 2,0g N/l zugeführt werden, in der Produktbildungsphase jedoch nur eine aktuelle Konzentration an assimilierbarem Stickstoff von maximal 20mg/l aufrecht erhalten wird. Damit wird der phasenbedingte unterschiedliche Stickstoffbedarf der Kultur gedeckt und bei ständiger Zellsubstanzsynthese eine maximale Griseofulvinbildung garantiert.
Die erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe war nicht vorauszusehen, weil in Fachkreisen als bestätigt gilt, daß zwar anorganische als auch organische Stickstoffquellen für die Griseofulvinsynthese geeignet sind (vgl. Rehm: Industrielle Mikrobiologie, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York 1967 S. 199), aber erst nach Nutzung komplexer organischer Substrate eine ökonomisch vorteilhafte Synthese des Griseofulvins erfolgt (vgl. WEIDE und AURICH: Allgemeine Mikrobiologie, VEB Gustav-Fischer-Verlag, Jena, 1979, S.416), hierbei jedoch auf Grund der Heterogenität in der Zusammensetzung der Komplexsubstrate eine quantifiziert untersetzte Steuerung der Stickstoffzufuhr und damit der Biosynthese unmöglich ersc'iien. Außerdem ist es nicht gelungen, die mikrobielle Synthese von Griseofulvin auf Basis anorganischer Stickstoffreaktanten nit im Vergleich zu organischen Einsatzstoffen erzielten Raum-Zeit-Ausbeuten durchzuführen. Insbesondere war nicht zu erwarten, daß die hier eingesetzten Stämme auch auf anorganische N-Quelle mit annähernd gleicher Geschwindigkeit wachsen, da der Nährstoffbedarf von Art zu Art bzw. St&mmzu Stamm verschieden ist.
Es wurde weiter gefunden, daß die Stabilität der mikrobiologischen Griseofulvinsynthese mit hohen Ausbeuten und ökonomischer Substratverwertung durch eine exakte Steuerung des verwertbaren Stickstoffs erreicht wird. Das kann Amino- und/oder Ammoniumstickstoff sein. Dabei sind selbstverständlich die Besonderheiten in den Hauptphasen der Fermentation, Trophophase, Induktionsphase und Ideophase zu berücksichtigen. In der Trophophase erreichen die verwendeten Stämme der Gattung Penicillium urticae nach einer Startkonzontration bis zu 1,9g Gesamtstickstoff/I Kultursuspension und einem assimilierbaren Überschuß von 0,32-0,16g N/l, insbesondere 0,24g N/l, 70-6,5g Monozucker/I (Glucose oder Laktose in'Form technischer Produkte), bevorzugt 18g Glucose/1,1,0-1,2g Cl"/I als NaCI, Cu+", K+, Zn++, Fe++, Mn++ und Leitungcwasserspurensalzen eine spezifische N-substratabhängige Wachstumsrate von μ™* = 0,065 rT1. Das Maximum wird mit solchen Kcmplexsubstraten wie Caseinpepton, Hefeautolysat, Sojabohnenmehl, bevorzugt aber mit Maisquellwasser erzielt.
Es ist von Vorteil für den gesamten Verlauf der Fermentation, wenn die Kultur in der Trophophase mit einer möglichst hohen Wachstumsrate wächst. Das wird durch Verwendung eines Substratgemisches von organischem und anorganischen Stickstoff im Assimilationsstickstoffverhältnis von 1:1 bis 1:30, bevorzugt 1:6 erreicht. Unter den genannten Bedingungen besitzt die Kultur nach 62-75 h eine mittlere Zelltrockenmasse von 35g/l und die Fähigkeit, Griseofulvin zu synthetisieren.
Es wurde weiterhin gefunden, daß die für eine industrielle Nutzung erforderliche Überproduktion an Griseofulvin und die Stabilität des Prozesses erfolgt, wenn nach Abschluß der Wachstumsphase eine 4-10stündige extracellular C-Limitation induziert wird und danach nur so viel Kohlenhydrate angeboten werden, daß der Energiehaushalt des Organismus und die Synthese des Griseofulvins sowie die Einhaltung eines optimalen pH-Bereiches von 5,5 bis 6,4 ermöglicht werden. In der Produktbildungsphase wird die Konzentration von technischen Monozuckern so gesteuert, daß Werte von 20g/l unmittelbar nach der Zugabe nicht überschritten werden.
Die Steuerung der Zufuhr von verwertbarem Stickstoff erfolgt in Form von organischen stickstoffhaltigen Komplexverbindungen, wie zum Beispiel Maisquellwasser und/oder anorganischen definierten Verbindungen, wie zum Beispiel Ammoniumhydroxid.
Die Konzentration muß klein gehalten werden, weil nur im niedrigen Konzentrationsbereich die für eine stabile, kostengünstige Griseofulvinsynthese erforderliche Wachstumszunahme und mit ihr solche Prozesse, wie die oxidative Desaminierung oder der Monosaccharidabbau zur Herstellung der essentiellen Intermediate für Griseofulvin reguliert werden. Die eriindungsgemäße Dosiermenge liegt bei 170 mg N/I.d über weite Strecken der Fermentation. Deshalb kann der in der GB-PS 934.527 herausgestellte Vorteil, daß Stickstoffüberschüsse bis zu 3 g/l die Griseofulvinsynthese stimulieren, nicht akzeptiert werden. Die Nacharbeit des dort vorgeschlagenen Prinzips ergab eine ungeordnete Fermentation und im Vergleich zu der erfindungsgemäßen Lösung aeringere Ausbeuten. Demgegenüber werden nach dem oben dargelegten Prinzip Ausbeuten bis zu 15000mg Griseofulvin/I Kuuursuspension erzielt, was einer überraschenden Ausbeutesteigerung um mindestens 25% gegenüber der Kontrollvariante (2 intermittierende Maisquellwasserzugaben während der Fermentation) mit Hochleistungsstammaterial entspricht.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist, daß als alleinige Stickstoffquelle für die die Griseofulvinsynthese begleitenden Stoffwechselreaktionen Ammoniumhydroxid ohne Ausbeuteminderung eingesetzt werden kann. Dieses Substrat ist im Vergleich zu Maisquellwasser nicht nur billiger und chemisch einheitlicher, sondern auch einfacher handhabbar.
Erfindungsgemäß werden in r<jr Wachstumsphase anorganischer Stickstoff von mindestens 0,7g N/l sowie im ersten Teil der Produktbildungsphase bis zu insgesamt 1 g N/l jeweils als Ammoniakwasser über das Belüftungssystem nachdosiert. Die Sterilisation des verwendeten 25%iger. Ammoniakwassers ist nicht mehr erforderlich.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist weiterhin dadurch charakterisiert, daß eine in der technischen Mikrobiologie gebräuchliche Sporensuspension des verwendeten Stammes der Gattung von Penicillium urticae zur Beimpfung der als Rührkultur ausgewiesenen 1. Stufe verwendet wird, die Kultivierung über 68 h bei 26°C erfolgt und mit der Kultivierungssuspension 2 Rührkulturen beimpft werden, die bis zum Erreichen der angestrebten Myzeltrockenmasse von 32-36g/l mit einer Wachstumsrate von 0,04-0,06h"1 wachsen. Die Beimpfung der Biosynthesestufe erfolgt unmittelbar nach Beendigung der Zwischenkultur.
Das für die Vorkulturen eingesetzte Nalirmedium entspricht der in der Wachstumsphase der Hauptkultur verwendeten Zusammensetzung, bevorzugt der Abwandlung, die neben Salzen und Leitungswasser einen assimilierbaren Stickstoffanteil von 0,25g N/l; 50g Glucose/I (in Form von Glucose-Koiisaft mit einem Glucoseanteil von 54-58%) und Antischaummittel enthält, das ein Austragen der Impfsuspension auf die nicht mit Substraten benetzten Teile des Fermentors verhindert.
Erfindungsbeispiele
4 Fermentoren aus nichtrostendem Stahl (Fassungsvermögen 631) werden gleichmäßig mit über zwei Fermentationsstufen hergestellten Inokulum des Stammes Penicillium urticae BAINIER M14/260 beimpft. Der Stamm ist in der DD-PS 53273 beschrieben und beim Institut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften in Jena unter der Nr. IMET PA 125 hinterlegt. Die Fermentoren enthalten je 4Ol Nährlösung, die folgende Zusammensetzung hat:
| Glucose (Glucose-Rohsaft) | GO1O g/l |
| Stickstoff (Maisquellwasser"1) | 1,5 g/l |
| KH2PO4 | 4,0 g/l |
| KCI | 1,0g/l |
| CaCO3 | 8,0 q/l |
in Leitungswasser unter Zusatz von 1 g/l Antischaummittel (pH 5,5/Sterilisafion 60min und bei 0,21 MPa). Die Fermentation erfolgt bei 280C und 0,15MPa und einer Belüftung von 0,5 l/l · min bzw. bei einer Rühiung von 450U/min. Die Kultur wird nach einer Fermentationsdauer von 268 h mit einer Griseofulvinkonzentration von 1320ümg/i beendet, nachoem sie durch 5 Nachschübe Glucose (Glucose-Rohsaft) von täglich 16-21 g/l und einer ab 90. Kultivierungsstunde vorgenommenen kontinuierlichen Versorgung mit assimilierbarem Stickstoff bis zu einer GesamUufuhrmenge von 1,5g N/l im pH-Bereich von 5,5-6,2, davon in der Wachstumsphase von pH 5,5 unter bedarfsmäßigem Einsatz von Antischaummittel kultiviert wurde. Eine entsprechend DD-PS 28811 aufgearbeitete Pp be weist eine Griseofulvinsubstanz aus, die frei von Nebenprodukt ist.
Das über 2 Fermentationsstufen hergestellte Inokulum des Stammes M14/260 wird in 1801 der 60 Minuten bei (1) mit einem Assimilationsstickstoffanteil von 12,4% (kolorimetrische Bestimmung nach der Indophenolblau-Reaktion) 120°C sterilisierten Nährlösung im Verhältnis 1:10 eingebracht und bei einer Startkonzentration von 66g/l Glucose (Glucose-Rohsaft), 1,48g N/l (Gesamtstickstoff des Maisquellwassors mit einem Ammoniumstickstoffanteil von 3g/l Maisquellwasser) und den gemäß Beispiel 1 verwendeten Salzen unter Nachschub von Glucose-Rohsaft, Ammoniumhydroxid und Maisquellwasser fermentiert. Der Rohglucosenachschub erfolgt täglich zwischen dem 4. und 9. Kultivierungstag in einer Dosis zu je 5000ml in Form von Glucoserohsaft. 750ml Ammoniumhydroxid (25%ige wäßrige Lösung) werden zwischen der 12. und 26. Std. (Wachstumsphase) und 6500ml Maisquellwasser ab 96. Std. über einen Zeitbereich von 70Std. kontinuierlich dosiert. Dieser Dosierungsmodus bewirkt, daß die bei 28°C und drucklos geführte Kultur unter einem gestaffelten Rührsystem 0-24h:300U/min; 25-29H:400U/ min; 30h bis Fermentationsende:500U/min., aber einheitlicher Belüftungszugabe von 0,5l/l · mir. mit einer mittleren Wachstumsrate von μ = 0,00295h"' in der Produktbildungsphase wächst und nach 264h 14300mg Griseofulvin/I Kulturuspension besitzt.
1 Fermentor der Firma CHEMAPAG, der mit 1801 Nährlösung, bestehend aus 80g/l Glucose, 1,38g Maisquellwasserstickstoff in der gemäß Beispiel 1 beschriebenen Leitungswasser-Salz-Lösung gefüllt ist, wird mit 20I Inokulum des Stammes M14/260 beimpft und 11 Tage unter C- und N-Steuerung fermentiert. Als C-Quelle wird gemäß Beispiel 2 Glucose-Rohsaft eingesetzt. Am 5., 7. und 9. Kultivierungstag werden pro Liter nachdosiert: 19,20 bzw. 16g Glucose.
Das kontinuierliche, den Phasen angepaßte feeding von 1070 ml Ammoniut nhydroxid = 1,02 g N/l in der Wachstumsphase (12.-30. Stunde) und 0,45 g N/l im Bereich der Produktionsbildungsphase (9(i. Stur de bis 240. Stunde) bei μ = 0,00297 h"1 bzw. kp = 0,0015 h"1) bewirkt eine den C-Katabolismus selbstregulierende pH-Konstant von 6,4 und Ausbeuten von 12457 mg Griseofulvin/I Kultui suspension unter den gemäß Beispiel 2 genannten Fermentationsbedingungen. Die vergleichbare Kontrolle mit diskontinuierlicher Nachdosierung von Maisquellwasser (Dosierung von insgesamt 12kg = 1,5g Gesamtstickstoff/I am 4.
und 6.Tag nach Beginn der Fermentation) ergibt eine Produktkonzentration von 10449mg Griseofulvin/I Kultursuspension.
3 Fermentoren, gefüllt mit 104001 sterilisierter Nährlösung der unter Beispiel 1 beschriebenen Zusammensetzung werden mit je 9001 Inokulum des Stammes M14/260 beimpft und entsprechend Beispiel 3 13 Tage betrieben. Die wäßrige Ammoniaklösung wird entsprechend der Stoffwechselaktivität über das Belüftungssystem zudosiert. Am Ende der Fermentation besitzt die Kultursuspension eine Griseofulvinkonzentration von 13825-14235kg/m3. Der Bezugsansatz nach herkömmlicher Verfahrensweise weist dagegen eine Konzentration von 8460-11565kg/m3 auf.
In einem 63-l-Fermentor (Tank I) erfolgt ein 40-l-Nährlösungsansatz entsprechend Beispiel 1 mit folgenden Abweichungen:
1) anstelle von 1,5g/l Stickstoff als Maisquellwasser kommen nur 0,5g/l zum Einsatz
2) CaCO3 wird um 50% auf 4g/l reduziert.
Zwischen der 4. und 20. Fermentationsstunde werden dem Kulturmedium 1,45g Stickstoff/l in Form von Ammoniumhydroxid zugeführt. Dazu dienen fünf Nachschübe gleicher Menge. Ein parallel laufender Kontroiltank (Tank II) wird mit 1,5g Stickstoff/l (Maisquellwasser) angesetzt und erhält keine Ammoniumhydroxidzuführung. Trotz nahezu gleicher Beimpfungsstärke weisen nach Abschluß der Wachstumsphasen beide Fermentoren unterschiedliche Biomassekonzentrationen auf. Nach 72 Stunden beträgt die Biomasse als Myzeltrockensubstanz im Tank 136,0g/l, während im Tank Il nur 20,5g/l erreicht werden. Mit dieser Biomasse startet der Prozeß in die Produktbildungsphase. Bleibt hierbei die Biomasse konstant und verhält sich die spezifische Produktbildungsrate in beiden Tanks gleich, so ist im Tankt I mit einer etwa 75% höheren Ausbeute zu rechnen. Um den Prozeß weiter zu stimulieren, erfolgten jedoch in beiden Tanks nach Nachschübe der N-Substratquelle. Tank I wird vom 4.-9. Tag kontinuierlich Ammoniumstickstoff in Form von Ammoniakwasser zugeführt (Gesamtnachfütterungsmet je: 0,809g N/l). Tank Il erhält am 4. und 6. Tag jeweils eine Maisquellwasserzugabe von 0,75 g N/l.
Die Analyse des Kulturverlaufes zeigt, daß am 9. Kultivierungstag, d. h. nach Abschluß der Stickstoffzuführung im Tank I, ein weiterer Leistungsanstieg von Tank I gegenüber Tank Il zu verzeichnen war. Mit 7,95g Griseofulvin/I gegenüber 4,25g Griseofulvin/I weist Tank I nach diesem Fermentationszeitraum eine um 87% höhere biologische Ausbeute auf.
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von Griseofulvin auf fermentativer Basis durch aerobe Submerskultur der Stämme M5/99 & IMET PA123 oder M14/260 ^ IMET PA125 von Penicillium urticae BAINIER, dadurch gekennzeichnet, daß der insgesamt der Kultur zugeführte assimilierbare Stickstoff über die ganze Fermentationszeit so gesteuert wird, daß für die Wachstumsphase bis zu 2,0g N/l zur Verfügung steht, für die Produktbildungsphase jedoch nur eine aktuelle Konzentration an assimilierbarem Stickstoff von maximal 20 mg/l aufrecht erhalten wird und nach Abschluß der Wachstumsphase eine 4- bis lOstündige C-Limitation erfolgt und anschließand nur so viel Kohlenhydrate angeboten werden, daß der Energiehaushalt des Organismus und die Synthese des Griseofulvins sowie die Einhaltung eines optimalen pH-Bereiches von 5,5 bis 6,4 ermöglicht werden.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verwertbare Kohlenhydratquelle des Nährmediums in der Wachstumsphase eine abnehmende Konzentration von 70 bis 6,5 g/l aufweist, in der Übergangsphaso extrazellulär limitiert und in der Produktbildungsphase nur noch die Zuckermenge angeboten wird, welche zur Aufrechterhaltung des pH-Optimums erforderlich ist.
3. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Dosierung der Kohlenhydratquelle (kontinuierlich oder diskontinuierlich) über die Prozeßführungsgröße pH 5,8 bis 6,2 erfolgt.
4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuckerkonzentration in der Produktbildungsphase unmittelbar nach der Zugabe 20g/l nicht überschreitet.
5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die organische oder anorganische Stickstoffquelle getrennt oder kombiniert in der Wachstums- und Produktbildungsphase dosiert wird.
6. Verfahren nach Punkt 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Substratgemisch von organischem und anorganischem Stickstoff im Verhältnis von 1:1 bis 1:30, bevorzugt 1:6, verwendet wird."
7. Verfahren nach Punkt 1,5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß in der Kultur organischer Stickstoff bevorzugt in Form von Maisquellwasser in einer Konzentration bis zu 1,5g Gesamtstickstoff/I vorliegt und in der Wachstumsphase anorganischer Stickstoff von mindestens 0,7 g N/l sowie im ersten Teil der Produktbildung insgesamt bis zu 1 g N/l jeweils als Ammoniakwasser über das Belüftungssystem nachdosiert werden.
8. Varfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Drehzahl des Rührers während des Prozesses erhöht wird.
9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beimpfung der Biosynthesestufe (Hauptkultur) eine Zwischenkultur mit 32-36g/l Myzeltrockenmasse und einer Wachstumsrate von 0,04-0,06h~1 verwendet wird.
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