DD273064A1 - Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Oligonukleotiden, von Desoxy- und Ribonucleotiden nach der Phosphotriestermethode, wobei der Kondensationsschritt zur internucleotidischen Phosphatbindung mittels neuartiger spezifischer Reagenzien vorgenommen wird. Es wird ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden nach der Phosphotriestermethode beschrieben, bei welchem als Kondensationsreagenzien zur Herstellung der internucleotidischen Phosphatbindung Chloride oder Azolide der Durensulfosaeure, insbesondere Durensulfo-1-oxy-6-nitrobenzo-1,2,3-triazol zur Verwendung gelangen.
Description
Weiter zeigte sich erfindungsgemeß, daß vergleichbar gute Ergebnisse erhalten werden, wonn statt der Kombination Durensulfochlorid/I-Methyürnidazol das 1-Oxy-6-nitro-benzo-1,2,3-triazolid der Durensulfonsäu'e als Kondensationsmittel verwendet wird (Formel 3). Das hierfür benötigte 1-Hydroxy-6-nitro-benzo-1,2,3-triazol zeichnet sich gegenübarden anderen in der Nucleotidsynthese verwendeten Azolen wie 1,2,4-Triazol,3-Nitro-1,2,4-triäzol,Tetrazol sowie tlucrmethylierten und höher nitrierten 1-Hydroxy-benzo-1,2,3-ti iazolen dadurch aus, daß es speziell in der Kombination mit Durensulfonsäuren ein hochaktives spezifisches Kondensationsmittel liefert, das zudsm eine gute Haltbarkeit aufweist. Ein weiterer Vorteil des Durensulfo-1 -oxy-6-nitro-benzo-i ,2,3-triazoles besteht darin, daß seine Azolkomponente im Gegensatz zu den meisten anderen verwendeten Azolen bequem und gefahrlos aus 2,4-Dinitrochlorbenzen dargestellt werden kann.
Mb = 4-Methoxybenzyl Cp = 2-Chlorphenyl Dmtr = Dimethoxytrityl Tea+ = Triethylammonium Ce = Cyanoethyl
— Durensulfochlorid
Fp.: 970C (Lit.: 98-990C)
— 1 -Hydroxy-6-nitro-benzo-i ,2,3-triazol Fp.: 2060C (Zers.) (Lit,: 2060C [Zers.])
— Durensulfo-i-oxy-e-nitro-benzo-I^.S-triazol Fp.: 1580C (Zers.)
C16H18N4O5S (376,39)
Bar.: C: 51,05% H:4,28% N: 14,89%Gef.: C: 51,07% H:4,22% N: 14,97%
— Durensulfonyltetrazol Fp.: 910C (Zers.) C11H14N4O2S (266,32)
Ben: C: 49,61% H: 5,30% N: 21,04% Gef.: C: 49,32% H: 5,39% N: 20,83%
- Nucleotidderivate
Nucleotidderivat
(0C) Rf a'
(ppm) Elementaranalyse (#)
Ber.: Gef.:
,3s -OKb (1)
DmtrO -0-P-O" Tea+ N I· OCp
95-96
0,10 -6,2 C: 64.17 H: 5,76 N: 7,74
64,06 5,91 7,65
DmtrO
,Bz -OMb (2)
0 -O-P-0 TeaH
102-104 0,27 -5,7
OCp C: 64,49 H: 5,58 N: 5,28
64,52 5,72 5,37
DmtrO
-OLIb 0 -O-P-0
Il
OCp
(3)
118-120 0,06 -8,3 C: 62,66 63,03 H: 5,99 6,19 N: 4,38 4,50
KO
,Bz
-OBs (4) 140-142 0,19
-OBz C: 62,52 62,16 H: 4,20 4,31 IJ: 11,76 11,47
a: CH2CI2/Me0H (95:5, V/V) auf Kieselgel 60 F2M (Merck)b: gemessen in CHCI, gegen H1PO4 (85%ig) als externen Standard
Aus den Rausteinen (1), (2) und (4) wird nach den genannten Arbeitsprinzipien der Nucleotidtriestörsynthese, jedoch unter Anwendung von Durensulfonyltetrazoi bei den einzelnen Kupplungsschritten, das geschützte Oligonucleotid (5) aufgebaut.
DmtrO
,Bz
-OMb 0
Il
-0-P-0
OCp
.,Bz -OMb
Il
-0-P-0.
Il \
OCp >
Bz -OBz
-OBz
Bei den jeweiligen Kupplungsschritten wurden Ausbeuten von >80% erreicht und chromatographisch reine Produkte erhalten.
Fp.: 72-740C FV10,49
R,b) 14,31 min UV/VIS (MeOH): AnllJI.225nm,277nm
^„.255 nm
a: CH2C!2/Me0H (95:5, V/V) auf Kieselgel 60 F2H (Merck)
b: HPLC: RP 18-Säule (100 x 2,1 mm), Druck: 40 · 103kPa bei40'C Durchfluß0,4ml/min, Elutionsmittel: 0.05M NH4-acetat-Lsg. pH 7 gegen einen MeOH-Gradienten.
Unter Verwendung der Bausteine (1M4) mit Einsatz von Durensulfo-1-oxy-6-nitro-benzo-1,2,3-triazol als Kupplungsreagenz
werden zunächst die geschützten Dinucleotide (6) und (7) aufgebaut.
„Bz
,Bz
DmtrO
-O-P-0 it OCp
,Bz
-OMb 0
Il
Lo-P-OCe
DmtrO
-OMb
-0-P-O. OCp
-OBz -OBz
(6) (7)
Diese werden dann au' dem gleirhe Wege in hoher Ausbeute zum geschützten, chromatographisch reinen Tetranucieotid (8) kondensiert.
DmtrO.
,Bz
-OMb 0
Il
-0-P-O
OCp
,3z -OMb
-o-p-a
OCp N
-OMb
-O-P-0, H \
OCp N
,Bz
-OBz
-03z
Fp.: 65-68TR,110,44
R,bl 14,35 min UV/VIS (MeOH): Xm,«.226nm,265nm Amin. 243 nm
a: Angaben wie bei a) Beispiel b: Angaben wie bei b) Beispiel
Ausgehend von nem Dinucleotidderivat (6) und dem Ti inucleotidderival (5) wird unter Einsatz von Ourensulfochlorid/1 -Methylimidazol als Kupplungsreagenz das geschützte Pentanucleotid (9) in chromatographisch reiner Form und einer Ausbeute von >90% gewonnen.
DnrfcrO.
-OMb
0 Ii
-0-P-O II OCp
-OMt»
-0-P-O. OCp
'\J
,Bz -OLIb
-0-P-0
OCp
,Bz -OMb
-0-P-O.
Bz -OBz
-OBz
(9)
Fp.: 69-720C
R(bl 14,64 min
Xm,n.250nm
a: Angaben wie bei a) Beispiel 1
b: Angaben wie bei b) Boispiel 1.
Formelschema
51
O (ORS)
-Ρ·0 I X
VY
9 cor)
Cl
Dmtr = Dimethoxytrityl
X = Arensulfonyl Y z.B. = Acyl R z.B. = Tetrahydropyranyl
DmtrO
HX
FORM E L1
NQ2
N-
-N
N-SO
0=P-0(5')-R 00 0
CH.
f Cf-
FO RM E". 2
CH3 CH3
NO-
FORMJLUL
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden, von Desoxy- und Ribonukleotiden nach der Phosphotriestermethode, dadurch gekennzeichnet, daß Chloride oder Azolide, wie z.B. TetrazoI, 1-Hydroxybenzo-1,2,3-triazol und deren Substitutionsprodukte, die abgeleitet sind von 2,3,5,6-Tetramethylbenzensulfonsäure (Durensulfosäure) als Kondensationsmittel für die Herstellung der internucleotidischen Phosphatbindung verwendet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für den genannten Zweck Durensulfo-1-oxy-6-nitro-benzo-1,2,3-triazol zur Anwendung gelangt.
Hierzu 2 Seiten Formeln
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Desoxyribo- und Ribonucleotlden nach der Phosphotriestermethode, wobei der Kondensationsschritt zur internucleotidischen Phosphatbindung mittels neuartiger spezifischer Reagenzien vorgenommen wird.
Charakteristik der bisher bekannten technischen Lösungen
Für den Aufbau von Desoxyribo- oder Ribonucleotiden ist die Phosphotriestermethode ein bewährtes Arbeitsprinzip, bei welchem die 3'-OH-Gruppe eines geschützten Nucleosides in tun voll maskiertes 3'-Phosphotriester-Derivat überführt und nach Freilegung sowie Aktivierung einer Phosphat-OH-Gruppe desselben die internucleotidische Bindung mit der 5'-OH-Gruppe eines zweiten Nucleosidbaustei.ies hergestellt wird (Prinzip Formel 1).
Für die Aktivierung der Phosphatkomponente (X in Formel 1) und ihrer Kondensation mit der 5'-OH-freien Nucleosidkomponente wurden bisher bevorzugt Mesitylensulfochlorid (MS) oder 2,4,6-Triisopropylbenzensulfochlorid (TPS) in Gegenwart substituierter Imidazole wie z. B. 1 -Methylimidazol als Katalysator verwendet. Alternativ dazu haben sich auch die 1,2,4,-Triazolide,Tetrazolide, 1-Hydroxy-benzo-1,2,3-triazolidesowie3-Nitro-1,2,4-triazolide der genannten Sulfonsäuren bewährt (Prinzip Formel 2). Die dabai gebildeten reaktionsfähigen Intermediate vom Mischanhydrid-Typ reagieren anschließend entweder unmittelbar mit der 5'-OH-Kcmponente zum Nucleotid weiter oder disproportionieren sich zunächst zu Pyrophosphaten, die dann ihrorseits die internucleotidische Bindung ausbilden. Wesentliche Voraussetzung bei dieser Aktivierungsmethode ist es, daß Sulfensäurederivate hochalkylierterArene zur Anwendung gelangen, wodurch eine Spaltung der P-O, nicht aber der S-O-Bindung des M;sch a η hydrides gewährleistet ist und somit Nebenreaktionen an der 5'-OH-Komponente vermieden werden.
Die beiden dem genannten Aktivierungsprinzip zugrunde liegenden, bisher verwendeten Arensulfonsäuren besitzen nun aber den Nachteil, daß sie entweder relativ kostspielig in der Herstellung sind oder den genannten Anforderungen noch nicht optimal Rechnung tragen. Es ist deshalb erwünscht, nach anderen, für den Kondensationsschritt in der Nucleotidsynthese geeigneten Arensulfonsäurederivaten zu suchen.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, das es ermöglicht, die internucleotidische Phosphatbindung bei Oligonucleotidsynthesen nach der Triestermethoda durch neue, verbesnerte Kondensationsreagenzien in hoher Ausbeute und frei von Nebenprodukten herzustellen.
Darlegung de« Wesens der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, neue, leicht zugängliche Reagenzien vom Arensulfbnsäuretyp zu entwickeln, die es ermöglichen, den Kondensationsschritt bei Oligonucleotidsynthesen nach der Triestermethode in hoher Ausbeute und unter Bildung einheitlicher Endprodukte herzustellen. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabenstellung dadurch gelöst, daß aktivierte Derivate der Durensulfonsäure (2,3,5,6-Tetramethyl-benzen-1 -sulfonsäure) zur Anwendung gelangen. Duren als Ausgangsstoff ist ein wohlfeiles Produkt der Steinkohlenteerverarbeitung und läßt sich mit einfachsten Mittein in die Sulfonsäure überführen. Ein besonderer Vorteil dieses Alkyl-arensulfonsäuretypes besteht auch darin, daß durch die Elektronendonatorwirkung und starke sterische Abschirmung der vier Methylgruppen gemäß Formel 2 das aktivierte Intermediat ausschließlich und rasch im gewünschten Sinne reagiert und keinerlei Nebenprodukte an der 5'-OH-Komponente gebildet werden. Auf diose Weise gelingt es, die intornucleotidische Phospha'bindung sehr spezifisch und in hoher Ausboute aufzubauen. Durensulfonsäure läßt sich entsprechend den bekannten Arbeitsweisen sowohl eis Chlorid in Gegenwart von 1-Methylimidazol als Katalysator wie auch in Form eines der gebräuchlichen Azolide mit sehr guten Ergebnissen für die Synthese von Desoxyribo· wie auch Ribonucleotiden einsetzen.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD31690388A DD273064A1 (de) | 1988-06-20 | 1988-06-20 | Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden |
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| DD273064A1 true DD273064A1 (de) | 1989-11-01 |
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ID=5600142
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP2380896A4 (de) * | 2008-09-23 | 2012-02-22 | Suzhou Ribo Life Science Co Ltd | Verfahren zur herstellung eines oligonukleotids |
| CN102827225A (zh) * | 2011-06-14 | 2012-12-19 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法 |
-
1988
- 1988-06-20 DD DD31690388A patent/DD273064A1/de not_active IP Right Cessation
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| CN102827225B (zh) * | 2011-06-14 | 2015-09-23 | 苏州瑞博生物技术有限公司 | 一种核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法 |
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