EP0563010A2 - Verfahren zur Herstellung von Nukleosiden - Google Patents

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EP0563010A2
EP0563010A2 EP93810184A EP93810184A EP0563010A2 EP 0563010 A2 EP0563010 A2 EP 0563010A2 EP 93810184 A EP93810184 A EP 93810184A EP 93810184 A EP93810184 A EP 93810184A EP 0563010 A2 EP0563010 A2 EP 0563010A2
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EP
European Patent Office
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group
alcohol
solution
carbon atoms
base
Prior art date
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EP93810184A
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English (en)
French (fr)
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EP0563010B1 (de
EP0563010A3 (en
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Wolfgang K. D. Dr. Brill
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Novartis Pharma GmbH
Novartis AG
Original Assignee
Ciba Geigy AG
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Publication date
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Publication of EP0563010A3 publication Critical patent/EP0563010A3/de
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing natural or synthetic nucleosides, nucleoside analogs or oligonucleotides with at least two identical or different such nucleoside monomers.
  • oligonucleotides with a defined sequence are synthesized using the phosphite triester method.
  • an oligonucleotide is successively synthesized from its 3'-terminus in the 5'-direction.
  • the synthesis begins with the binding of the 3'-terminal nucleoside, which carries a protective group on its 5'-hydroxyl group and, if necessary, on its nucleoside base, to a chemically inert solid phase.
  • the 5'-hydroxy protecting group is then split off.
  • the internucleotide bond is formed by reacting with a 3'-phosphoramidite of an adequately protected nucleoside.
  • the resulting phosphite triester is then oxidized to the desired internucleotide bond.
  • the next synthesis cycle can be initiated with the cleavage of the 5'-terminal protective group of the dinucleotide immobilized on the solid phase.
  • the synthesis cycles are repeated until one arrives at the finished oligonucleotide bound to the solid phase.
  • the synthesis ends with the elimination of the protective groups on the nucleoside bases, hydroxyl groups and the internucleotide bonds (Caruthers, MH, Science 230; 281-285, 1985).
  • the nucleoside or oligonucleotide used contains, for example, the groups of the formulas
  • the problem with this synthetic process is the condensation reaction between the phosphoramidite and the free hydroxyl group of the nucleosides or oligonucleotides immobilized on the solid phase. During this reaction step, the most embarrassing exclusion of water must be observed. Even through the use of absolute solvents, the absence of water is not completely guaranteed. Therefore, in the coupling step of solid phase oligonucleotide synthesis, considerable amounts of nucleoside phosphoramidite are converted into nucleoside phosphoramidite hydrolyzate, for example the nucleoside cyanoethyl hydrogen phosphonate.
  • Bschreibinger (Bauchinger, M.P., thesis, Eidgenössische Technische Hochhoff, ETH No. 9377, 1991) causes the hydrolyzate of a methyl phosphoramidite of a nucleoside analogue to react with sodium hydroxide solution to form the nucleoside analogue with a free hydroxy group. Under the hydrolysis conditions he uses, however, the protective groups of the nucleoside bases are split off.
  • the predvoditelev et al. (Predvoditelev, D.A., Tyuganova, M.A., Nifant'ev, E.E., Rogovin, Z.A., Zh. Prikl. Khim. 40: 171-177, 1967), Nifnt'ev et al. (Nifnt'ev, EE, Predvoditelev, DA, Fursenko, LV., Zh. Obsh. Khim. 51: 2435-2441, 1981), Troev and Simeonov (Troev, K., Simeonov, M., Phosphorus and Sulfur 19: 363-367, 1984) and Westheimer et al.
  • Another process is the Lewis acid-catalyzed transesterification with terakis-benzyloxy-titanium, which is carried out at 40 ° C. in moderate yields within 72 hours and is particularly disadvantageous to the hydrolysis sensitivity of the titanate (Froneman, M., Modro, TA, Synthesis 201-204, 1991).
  • the present invention now provides a process for converting nucleoside hydrogen phosphonates or hydrogen phosphinates into nucleosides which have a free hydroxyl group at the position at which the hydrogen phosphonate or phosphinate function was located.
  • the selectivity of the cleavage can in some cases be so great that even after several days of exposure under the given reaction conditions, the protective groups of the nucleoside bases are not cleaved off. This reaction also gives high yields.
  • the method according to the invention enables for the first time the recycling of the nucleoside excesses that occur during nucleotide coupling according to the usual phosphite triester method during the routine continuous operation of manual or automated oligonucleotide synthesis.
  • the present invention relates in particular to a process for the production of natural or synthetic nucleosides, nucleoside analogs or oligonucleotides from at least two such nucleosides and / or nucleoside analogs, the basic structure of which is an optionally substituted residue of a nucleic base B and a protected hydroxyl group of the formula R 1 -O-, wherein R 1 stands for a protective group, contains, or which are bonded to a solid support material directly or via a bridging group with the oxygen atom of a hydroxyl group, from nucleoside monomers or from oligonucleotides, on the backbone of which, in addition to said radicals, a group of the formulas I, Ia or Ib is bound by converting the group of the formulas I, la or Ib into a hydroxyl group -OH, by reacting the nucleosides or oligonucleotides, optionally in an inert organic solvent, with an excess of an ali
  • the groups of the formulas I, Ia and Ib can be bound in the 3'- or 5'-positions of the nucleosides or oligonucleotides, the group R 1 O- or the solid support material in the 5'- or 3'-positions is bound.
  • the group of the formula is preferably bound in the 5'-position, the group of the formula Ib in the 3'-position and the group of the formula Ia in the 3'- or 5'-positions.
  • nucleosides, nucleoside analogs or oligonucleotides which are suitable for the process according to the invention and preferably have a secondary OH group which serves to link the nucleotide bond are known and are described in the specialist literature, for example in Townsend (Townsend, LB, ed., Chemistry of Nucleosides and Nucleotides 1 , Plenum Press, New York, 1988) or can be produced by known processes. They can generally be an open-chain C skeleton which may be interrupted by -O- or -S- or a carbacyclic or O- or S-heterocyclic skeleton with a nucleus base B.
  • the open-chain carbon skeleton can contain, for example, 3 to 12, preferably 3 to 6, carbon atoms.
  • the carbacyclic and heterocyclic backbones can be, for example, monocyclic ring systems with 3 to 12, preferably 3 to 8 and particularly preferably 4 or 5 ring carbon atoms. It can also be bicyclic to tetracyclic systems with, for example, 5 to 16, preferably 8 to 16 carbon atoms.
  • the backbones can contain further substituents, for example protected OH groups.
  • nucleus base B represents a purine residue or an analogue thereof, it can be residues of the formulas II, Ila, Ilb, IIc, Ild or Ile, in which R 7 represents H, Cl, Br, NH 2 or OH, and R 8 , R 9 and R 10 independently of one another H, OH, SH, NH 2 , NHNH 2 , NHOH, NHOalkyl with 1 to 12 C atoms, F, Cl, Br, alkyl or hydroxyalkyl or aminoalkyl or alkoxy or alkylthio having 1 to 12 carbon atoms, the hydroxyl and amino groups being unsubstituted or substituted by a protective group, phenyl, benzyl, primary amino having 1 to 20 carbon atoms or Secondary amino having 2 to 30 carbon atoms, and R 11 is H or C 1 -C 4 alkyl.
  • the primary amino preferably contains 1 to 12 and particularly preferably 1 to 6 C atoms, and the secondary amino preferably 2 to 12 and particularly preferably 2 to 6 C atoms.
  • alkyl, alkoxy, alkylthio, hydroxyalkyl and aminoalkyl which preferably contain 1 to 6 carbon atoms, are methyl, ethyl and the isomers of propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl and dodecyl , and corresponding alkoxy, alkylthio, hydroxyalkyl and aminoalkyl radicals.
  • the alkyl, alkoxy, alkylthio, hydroxyalkyl and aminoalkyl particularly preferably contains 1 to 4 carbon atoms.
  • Preferred alkyl, alkoxy, alkylthio, hydroxyalkyl and aminoalkyl radicals are methyl, ethyl, n- and i-propyl, n-, i- and t-butyl, methoxy, ethoxy, methylthio and ethylthio, aminomethyl, aminoethyl, hydroxymethyl and Hydroxyethyl.
  • the primary amino and secondary amino can be, for example, radicals of the formula R 14 R 15 N, in which R 14 is H or independently has the meaning of R 15 , and R 15 is C 1 -C 20 -, preferably C 1 - C 12 and particularly preferably C 1 -C 6 alkyl, aminoalkyl, hydroxyalkyl; Carboxyalkyl or carbalkoxyalkyl, the carbalkoxy group containing 2 to 8 carbon atoms and the alkyl group 1 to 6, preferably 1 to 4 carbon atoms; C 2 -C 20 -, preferably C 2 -C 12 - and particularly preferably C 2 -C 6 alkenyl; Phenyl, mono- or di- (C 1 -C 4 alkyl- or - alkoxy) phenyl, benzyl, mono- or di- (C 1 -C 4 alkyl- or -alkoxy) benzyl; or 1,2-, 1,3- or 1,4-imidazolyl-C 1
  • alkyl examples have been given previously.
  • Examples of aminoalkyl are aminomethyl, aminoethyl, 1-aminoprop-2-yl or 3-yl, 1-amino-but-2-yl or -3-yl or -4-yl, N-methyl- or N, N- Dimethyl- or N-ethyl- or N, N-diethyl- or N-2-hydroxyethyl- or N, N-di-2-hydroxyethylaminomethyl or -aminoethyl or -aminopropyl or -aminobutyl.
  • Examples of hydroxyalkyl are hydroxymethyl, 1-hydroxy-eth-2-yl, 1-hydroxy-prop-2- or -3-yl, 1-hydroxy-but-2-yl, -3-yl or -4-yl.
  • Examples of carboxyalkyl are carboxymethyl, carboxyethyl, carboxypropyl and carboxybutyl, and examples of carbalkoxyalkyl are these carboxyalkyl groups esterified with methyl or ethyl.
  • Examples of alkenyl are allyl, but-1-en-3-yl or - 4-yl, pent-3- or 4-en-1-yl or -2-yl, hex-3- or -4- or -5 -en-1-yl or -2-yl.
  • alkyl and alkoxyphenyl or benzyl are methylphenyl, dimethylphenyl, ethylphenyl, diethylphenyl, methylbenzyl, dimethylbenzyl, ethylbenzyl, diethylbenzyl, methoxyphenyl, dimethoxyphenyl, ethoxyphenyl, diethoxyphenyl, methoxybenzyl, dimethoxybenzyl, diethoxybenzyl, ethoxybenzyl.
  • imidazolylalkyl in which the alkyl group preferably contains 2 to 4 carbon atoms, are 1,2-, 1,3- or 1,4-imidazolylethyl or -n-propyl or -n-butyl.
  • R 16 preferably represents H, methyl or ethyl.
  • Preferred examples of primary amino and secondary amino are methyl, ethyl, dimethyl, diethyl, allyl, mono- or di- (1-hydroxy-eth-2-yl) -, phenyl- and benzylamino, acetylamino and benzoylamino.
  • R 7 represents hydrogen.
  • R 10 represents hydrogen.
  • R 8 and R 9 denote un depending on one another, H, F, Cl, Br, OH, SH, NH 2 , NHOH, NHNH 2 , methylamino, dimethylamino, benzoylamino, methoxy, ethoxy and methylthio.
  • purine series analogs are adenine; N-methyladenine, N-benzyladenine, 2-methyladenine, 2-methylthioadenine, 2-aminoadenine, 3-carbaadenine, 7-carbaadenine, 1-carbaadenine, 6-hydroxypurine, 2-amino-6-chloropurine, 2-amino-6- methylthiopurine, 2-amino-6-hydroxypurine, 3-carba-6-chloropurine, guanine, 2-methylguanine.
  • Adenine, 2-aminoadenine and guanine are particularly preferred.
  • nucleic base B represents an analogous pyrimidine residue, it is preferably uracil, thymine and cytosine residues of the formulas III, Illa and Illb, wherein R 11 is H or C 1 -C 4 alkyl, and R 12 , R 13 and R 30 independently of one another have the meaning previously given for R 8 , including the preferences, and the hydrogen atoms of the NH 2 group in formula IIIb C 1 -C 6 alkyl or benzoyl may be substituted, as well as the dihydro derivatives of the radicals of the formulas III, Illa and Illb.
  • R 12 preferably represents H, C 1 -C 6 -alkyl or hydroxyalkyl, F, Cl, Br, NH 2 , benzoylamino, mono- or di-C 1 -C 6 -alkylamino and R 13 preferably represents H, C 1 - C 6 alkyl or alkoxy or hydroxyalkyl, F, Cl, Br, NH 2 , benzoylamino, mono- or di-C 1 -C 6 alkylamino.
  • R 11 preferably represents H or methyl.
  • R 12 preferably denotes H, F, Cl, Br, NH 2 , NHCH 3 , N (CH 3 ) 2 or C 1 -C 4 alkyl.
  • R 13 preferably represents H, C 1 -C 4 alkyl, especially methyl, or NH 2 , NHCH 3 or (CH 3 ) 2 N.
  • pyrimidine analogs are uracil, thymine, cytosine, 5-fluorouracil, 5-chlorouracil, 5-bromouracil, dihydrouracil, pseudouracil, 1-methylpseudouracil, 5-methyluracil, 3-methylcytosine and 5-methylcytosine.
  • protective groups mean protective groups which are generally known in the art. Examples of such protecting groups are; C 1 -C 8 alkyl; mono- or bicyclic C 7 -C 12 aralkyl; mono- or bicyclic C 7 -C 12 aralkoxy; mono- or bicyclic C 7 -C 12 haloalkyl; Diphenylmethyl; Diphenylmethyl substituted with 1 to 4 methyl or methoxy; Triphenylmethyl; Triphenylmethyl substituted with 1 to 6 methyl or methoxy, or 1 to 3 tert-butyl; Xanthenyl substituted with phenyl or naphthyl; -Si (R 4 ) (R 5 ) (R 6 ), wherein (R 4 ) (R 5 ) and (R s ) independently of one another are C 1 -C 20 alkyl, benzyl or phenyl; RC (O) -, wherein RC 1 -C 6 alky
  • C 1 -C 8 alkyl are methyl, ethyl, n- and i-propyl, n-, i- and t-butyl; for a monocyclic C 7 -C 12 aralkyl are benzyl, methylbenzyl, dimethylbenzyl; for a mono- or bicyclic C 7 -C 12 aralkoxy are methoxybenzyl, dimethoxybenzyl; for a mono- or bicyclic C 7 -C 12 haloalkyl is bromobenzyl; for a substituted diphenylmethyl are di (methylphenyl) methyl, di (dimethylphenyl) methyl, di (methoxyphenyl) methyl, di (dimethoxyphenyl) methyl; for a substituted triphenylmethyl are tri (methylphenyl) methyl, Tri (dimethylphenyl) methyl, tri (methoxyphenyl) methyl, tri (dimeth
  • the nucleosides and oligonucleotides can be covalently bound to a solid support material via a bridge group.
  • Suitable carrier materials are, for example, silica gels, controlled pore glass, polystyrene, polyacrylamide, polyurethanes, polyolefins, melamine, polyamides, polyester, polyethers, polyalcohols, cyclodextrin, cellulose and etherified or acylated cellulose derivatives, glycogen, starch, chitin and chitosan.
  • the bridging group can be derived, for example, from dicarboxylic acids, diurethanes or alkoxysilyl urethanes.
  • the process according to the invention can optionally be carried out in the presence of an additional solvent.
  • additional solvent the alcohol, the polyol or the polymeric polyol used in the process according to the invention, if liquid, is the solvent.
  • additional solvents are those solvents which do not compete with the base, alcohol, polyol or polymeric polyol in the respective reaction mixture. They can be used alone or in mixtures of at least two solvents.
  • solvents or solution additives which make the alcohol groups accessible to the process according to the invention by swelling the polyol.
  • solvents are selected from the group consisting of ethers, halogenated hydrocarbons, carboxamides, lactams, sulfoxides, sulfones; aromatic hydrocarbons, nitriles, aliphatic and cycloaliphatic hydrocarbons, especially ethers, halogenated hydrocarbons, nitriles, carboxamides and lactams.
  • Solution additives in the context of the present invention can advantageously be salts, for example ammonium acetates and ammonium hydrogen carbonates.
  • ethers are dibutyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, ethylene glycol diethyl and dimethyl ether, diethylene glycol dimethyl ether, diethylene glycol diethyl ether or triethylene glycol dimethyl ether, in particular methyl t-butyl ether, dibutyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran or dioxane.
  • halogenated hydrocarbons are methylene chloride, chloroform, 1,2-dichloroethane, 1,1,1-trichloroethane and 1,1,2,2-tetrachloroethane.
  • N-alkylated or N-dialkylated amides are advantageously used.
  • Typical representatives are, for example, N, N-dimethylformamide, N, N-diethylformamide, N, N-dimethylacetamide, tetramethylurea and hexamethylphosphoric triamide
  • Preferred lactams are selected from the group consisting of y-butyrolactam, s-caprolactam, N-methylpyrrolidone, N-acetylpyrrolidone and N-methylcaprolactam.
  • Suitable solvents in the context of the present invention are, for example, dimethyl sulfoxide, dimethyl sulfone, diethyl sulfone, trimethylene sulfone, tetramethylene sulfone, benzene, substituted benzene, in particular chlorobenzene, o-dichlorobenzene, 1,2,4-trichlorobenzene, nitrobenzene, toluene and xylene, acetonitrile, propionitrile Benzonitrile, phenylacetonitrile, pentane, petroleum ether, hexane, cyclohexane and methylcyclohexane.
  • acceptors The aliphatic, cycloaliphatic, araliphatic or aromatic alcohol used in the process according to the invention, the polyol or the polymeric polyol are referred to below as acceptors.
  • An alkanol having 1 to 20 carbon atoms, preferably having 1 to 12 carbon atoms, in particular having 1 to 6 carbon atoms, is advantageously used, for example a representative of the group consisting of methanol, ethanol, n- and i-propanol, n-, i- and t-butanol, pentanol, hexanol, ethylene glycol, diethylene glycol monomethyl and monoethyl ether.
  • a preferred subgroup of the alcohols used in the process according to the invention are C 1 -C 4 alkanols.
  • Methanol is particularly preferably used.
  • cycloalkanol with 5 to 12 ring carbon atoms, preferably with 5 to 8 ring carbon atoms, for example selected from the group consisting of cyclopentanol, cyclohexanol, methylcyclohexanol, cycloheptanol and cyclooctanol.
  • acceptors examples include araliphatic alcohols having 7 to 30 carbon atoms, in particular having 7 to 20 carbon atoms, preferably selected from the group consisting of un-, alkyl- or alkoxy-substituted benzyl alcohol and ⁇ -phenylethanol; aromatic alcohols having 6 to 30 carbon atoms, in particular having 6 to 12 carbon atoms, preferably selected from the group be consisting of phenol and un-, alkyl- or alkoxy-substituted naphthol; Polyols with 2 to 20 carbon atoms, preferably selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, butanediol, pentanediol, hexanediol, cyclohexanediol, dihydroxymethylcyclohexane, diethylene glycol, triethylene glycol, polyethylene glycol, trimethylolpropane, pentaerythritol, dipentaerythri
  • saccharides are understood as acceptors, for example mono- and oligosaccharides such as mono-, di-, tri-, tetra- and pentasaccharides.
  • mono- and oligosaccharides are aldoses or ketoses.
  • the monosaccharide is aldopentoses, aldohexoses, ketopentoses or ketohexoses.
  • aldopentose examples include D-ribose, D-arabinose, D-xylose or D-lyxose; for an aldohexose D-Allose, D-Altrose, D-Glucose, D-Mannose, D-Gulose, D-Idose, D-Galaktose or D-Talose; for a ketopentose D-ribulose or D-xylulose; for a ketohexose D-psicose, D-fructose, D-sorbose or D-tagatose.
  • Examples of a disaccharide are trehalose, maltose, isomaltose, cellobiose, gentibiose, sucrose or lactose.
  • Raffinose may be mentioned as an example as trisaccharide.
  • polysaccharides examples include cellulose, starch, dextrans, glycogen, fructans, inulin, mannans, xylans and arabinans.
  • the inorganic base used in the context of the present invention is preferably a representative of the group consisting of basic metal oxide, heavy metal oxide and hydroxide, preferably Si0 2 or basic aluminum oxide.
  • suitable inorganic bases are those which can catalyze the transesterification nucleophilically and can be part of a buffer system. They are preferably metal or ammonium fluorides, metal or ammonium aldehydes, ketoximates, hydroxomates, sulfates, phosphates, phosphonates, phosphates, sulfamates, nitrites, nitrates, sulfonates which are soluble in alcohols or the reaction mixture , where metal is preferably an alkali metal ion, for example Na + , Li + , K + , Rb + and Cs + .
  • the Metallaldoximate, -ketoximate, -hydroxomate, -sulfamate, -sulfonate and phosphonate can H-atoms or unsubstituted or with halogen, C 1 -C 4 alkyl, C 1 -C 4 alkoxy, cyano or nitro substituted C i -C Contain 6 alkyl groups or phenyl groups.
  • the ammonium fluorides are preferably tetra (C 1 -C s -alkyl) ammonium fluoride, for example tetra (n-butyl) ammonium fluoride.HF.
  • a representative of the group consisting of aromatic amine, aromatic N-heterocycle and NC 1 -C 4 alkylmorpholine is advantageously suitable as the organic nitrogen base.
  • Typical representatives are imidazole, pyridine, N-methylmorpholine, aniline and o-diaminobenzene, and polyvinylpyridine.
  • the amount of base used in the process according to the invention ranges from a catalytic amount to higher amounts, for example up to equivalent amounts or an excess.
  • a catalytic amount in the context of the present invention is in the range from 0.01 to 20 mol%, advantageously from 0.1 to 10 mol%, in particular from 0.1 to 5 mol%, based on 1 mol of nucleoside or oligonucleotide.
  • An excess of at least 100 molar equivalents and up to 1000 molar equivalents or more of the hydroxyl groups of the acceptor per molar equivalent of groups of the formula is preferably used in the process according to the invention.
  • the method according to the invention can be achieved by the additional use of Lewis acids in amounts of preferably 0.01 to 20 mol%, advantageously 0.1 to 10 mol%, in particular 0.1 to 5 mol%, based on 1 mol nucleoside or oligonucleotide be significantly accelerated.
  • the high reaction speed that can be achieved is a considerable advantage.
  • metal salts (LiCl), boric acid esters or organic metal complexes can be used as Lewis acids.
  • the joint use of organic nitrogen base, nucleophilic inorganic base and Lewis acid in the process according to the invention is particularly advantageous since a high selectivity is achieved.
  • the process is advantageously carried out at a temperature of from -20 ° C. to 55 ° C., particularly preferably at a temperature of from 15 ° C. to 35 ° C., in particular at room temperature.
  • the process according to the invention can, for example, be carried out by adding a nucleoside or oligonucleotide with residues of the formulas I, Ia and Ib to a solution or mixture of alcohol and base and allowing this reaction mixture to react completely.
  • a nucleoside or oligonucleotide with residues of the formulas I, Ia and Ib to a solution or mixture of alcohol and base and allowing this reaction mixture to react completely.
  • insoluble constituents may first be filtered off, if appropriate, and then the solvent be steamed.
  • the residue can be purified using conventional methods such as crystallization or chromatography.
  • runoff solutions of the oligonucleotide synthesis are run directly into a solution or mixture of alcohol and base in order to recover the nucleoside building blocks used in large excess.
  • the effluent solution which contains a compound with a radical of the formulas I, la and Ib, is transferred into the reaction solution or the reaction mixture, a very large base excess occurring at the start of the reaction and acidic constituents of such effluent solutions being able to be neutralized.
  • the amount of base decreases in the course of the reaction and can be replaced if necessary.
  • These acidic components can preferably be tetrazole or other acids which effect the nucleotide condensation according to the phosphite triester method.
  • the phosphites formed can be worked up using conventional oxidizing agents, for example 1 2 / H 2 0 / pyridine or S 8 / pyridine to give the corresponding phosphates or thiophosphates.
  • conventional oxidizing agents for example 1 2 / H 2 0 / pyridine or S 8 / pyridine to give the corresponding phosphates or thiophosphates.
  • cyanoethanol is used as the acceptor if the nucleosides or oligonucleotides are bound to a solid support material and contain an H-phosphonate or H-phosphinate group and are reacted in the presence of an organic nitrogen base.
  • Biscyanoethyl phosphite or cyanoethyl methyl phosphinate are formed here, which are irreversibly reacted with weakly basic polymeric ion exchangers.
  • the resulting phosphorus compound remains bound to the ion exchanger by salt formation and at the same time the acrylonitrile formed is captured by the ion exchanger.
  • the runoff solutions used in Examples 2, 5 and 7 are obtained as follows:
  • the runoff solutions of a solid phase oligonucleotide synthesis reactor are prepared according to the method of Gao et al. (Gao, H., Gaffney, B.L., Jones, R.A., Tetrahedron Lett., In press, 1991).
  • the effluent solutions flow immediately after leaving the reactor for nucleosides separated into a solution of 50 ml methanol / acetonitrile 2: 1.
  • the organic phase is dried over sodium sulfate.
  • the salt and any imidazole residues are filtered off.
  • the crude product is evaporated and separated by flash chromatography (Still, WC, Kahn, M., Mitra, A., J. Org. Chem. 43: 2923, 1978).
  • the product fractions are combined and concentrated. They are then taken up in 50 ml of dichloromethane and extracted with 50 ml of 1 M triethylammonium hydrogen carbonate.
  • the organic phase is dried over sodium sulfate.
  • the salt is filtered off and concentrated to 1 ml in vacuo.
  • the concentrated product solution is precipitated in 50 ml of n-pentane at room temperature.
  • the precipitation is completed by adding 200 ml of n-pentane and then cooling to ⁇ 20 ° C.
  • the precipitate is filtered off, washed with 50 ml of n-pentane and dried in vacuo over P 4 0 10 KOH.
  • the product obtained is 5'-dimethoxytritylthymidine (5'-dimethoxytritylthymidine: 431 mg, 82.5% of the dry weight).
  • Example 2 Representation of 5'-dimethoxytritylthymidine from the drain solution of an oligonucleotide synthesis reactor
  • the organic phases are combined and then subjected to two extractions, each with 100 ml of saturated aqueous sodium bicarbonate solution.
  • the sodium bicarbonate phase is extracted with 50 ml dichloromethane and all organic phases are combined.
  • the combined organic phase is dried over sodium sulfate. This is followed by recrystallization from 5 ml of benzene, which is completed by cooling to -20 ° C. 50 ml of n-hexane are then added and the crystallization is continued at -20 ° C. for 20 hours.
  • the precipitate is filtered off, washed with 50 ml of n-hexane and then dried in vacuo over P 4 0 1O / KOH.
  • the product obtained is 5'-dimethoxytritylthymidine (5'-dimethoxytritylthymidine: 131 mg, 99% of the dry matter with 100% internucleotide coupling in the synthesizer).
  • the organic phase is dried over sodium sulfate.
  • the salt and any imidazole residues are filtered off.
  • the crude product is evaporated and separated by bottle chromatography.
  • the product fractions are pooled and concentrated. They are then taken up in 50 ml of dichloromethane and extracted with 50 ml of 1 M triethylammonium hydrogen carbonate.
  • the organic phase is dried over sodium sulfate.
  • the salt is filtered off and concentrated to 1 ml in vacuo.
  • the concentrated product solution is precipitated in 50 ml of n-pentane at room temperature.
  • the precipitation is completed by adding 450 ml of n-pentane and then cooling to ⁇ 20 ° C.
  • the precipitate is filtered off, washed with 100 ml of n-pentane and dried in vacuo over P 4 0 1O / KOH.
  • the product obtained is 2-i-butyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxyguanosine (2-i-butyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxyguanosine: 577 mg, 90.3% of the dry weight).
  • Extractions with 50 ml of water and sodium hydrogen carbonate follow.
  • the organic phase is dried over sodium sulfate.
  • the salt and any imidazole residues are filtered off.
  • the crude product is evaporated and separated by flash chromatography.
  • the product fractions are combined and concentrated. They are then taken up in 50 ml of dichloromethane and extracted with 50 ml of 1 M triethylammonium hydrogen carbonate.
  • the organic phase is dried over sodium sulfate.
  • the salt is filtered off and concentrated to 1 ml in vacuo.
  • the concentrated product solution is precipitated in 50 ml of n-pentane at room temperature. The precipitation is completed by adding 450 ml of n-pentane and then cooling to -20 ° C.
  • the precipitate is filtered off, washed with 100 ml of n-pentane and dried in vacuo over P 4 0 1O / KOH.
  • the product obtained is 6-benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxyadenosine (6-benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxyadenosine: 562 mg, 85.5% of the dry weight).
  • Example 5 Preparation of 6-benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxyadenosine from the effluent solution of an oligonucleotide synthesis reactor
  • the combined aqueous phase is extracted with 50 ml dichloromethane.
  • the organic phases are combined and then subjected to two extractions, each with 100 ml of saturated aqueous sodium bicarbonate solution.
  • the sodium bicarbonate phase is extracted with 50 ml dichloromethane and all organic phases are combined.
  • the combined organic phase is dried over sodium sulfate.
  • the crude product is evaporated and separated by flash chromatography.
  • the product fractions are combined and concentrated. They are then taken up in 50 ml of dichloromethane and extracted with 50 ml of 1 M triethylammonium hydrogen carbonate.
  • the organic phase is dried over sodium sulfate.
  • the salt is filtered off and concentrated to 1 ml in vacuo.
  • the concentrated product solution is precipitated in 50 ml of n-pentane at room temperature.
  • the precipitation is completed by adding 200 ml of n-pentane and then cooling to ⁇ 20 ° C.
  • the precipitate is filtered off, washed with 50 ml of n-pentane and dried in vacuo over P 4 0 1O / KOH.
  • the product obtained is 6-benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxyadenosine (6-benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxyadenosine: 380 mg, 75.5% of the dry matter with 100% internucleotide coupling in the synthesizer).
  • Extractions with 50 ml of water and sodium hydrogen carbonate follow.
  • the organic phase is dried over sodium sulfate.
  • the salt and any imidazole residues are filtered off.
  • the crude product is evaporated and separated by flash chromatography.
  • the product fractions are combined and concentrated. They are then taken up in 50 ml of dichloromethane and extracted with 50 ml of 1 M triethylammonium hydrogen carbonate.
  • the organic phase is dried over sodium sulfate.
  • the salt is filtered off and concentrated to 1 ml in vacuo.
  • the concentrated product solution is precipitated in 50 ml of n-pentane at room temperature. The precipitation is completed by adding 450 ml of n-pentane and then cooling to -20 ° C.
  • the precipitate is filtered off, washed with 100 ml of n-pentane and dried in vacuo over P 4 O 10 / KOH.
  • the product obtained is 4-benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxycytidine (4-benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxycytidine: 527 mg, 83.2% of the dry weight).
  • Example 7 Preparation of 4-benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxycytidine from the effluent solution of an oligonucleotide synthesis reactor
  • the combined aqueous phase is extracted with 50 ml dichloromethane.
  • the organic phases are combined and then subjected to two extractions, each with 100 ml of saturated aqueous sodium bicarbonate solution.
  • the sodium bicarbonate phase is extracted with 50 ml dichloromethane and all organic phases are combined.
  • the combined organic phase is dried over sodium sulfate.
  • the crude product is evaporated and separated by flash chromatography.
  • the product fractions are combined and concentrated. They are then taken up in 50 ml of dichloromethane and extracted with 50 ml of 1 M triethylammonium hydrogen carbonate.
  • the organic phase is dried over sodium sulfate.
  • the salt is filtered off and concentrated to 1 ml in vacuo.
  • the concentrated product solution is precipitated in 50 ml of n-pentane at room temperature.
  • the precipitation is completed by adding 200 ml of n-pentane and then cooling to -20 ° C.
  • the precipitate is filtered off, washed with 50 ml of n-pentane and dried in vacuo over P 4 0 1O / KOH.
  • the product obtained is 4-benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxycytidine (4-benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-deoxycytidine: 163 mg, 91% of dry weight with 100% internucleotide coupling in the synthesizer).
  • Example 8 Preparation of N-methyl, N- (5'-dimethoxytrityl-3'-deoxythymid-3'-yl) - (5'-deoxythymid-5'-yl) acetamide from the effluent solution of an oligonucleotide synthesis reactor.
  • a large amount of a solution of 30 g of iodine, 20 ml of water, 200 ml of pyridine and 750 ml of tetrahydrofuran is added to the reaction mixture until the brown iodine color persists for at least 5 minutes.
  • the reaction mixture is evaporated to a yellowish solid in vacuo. It is taken up in an emulsion of 100 ml of 40% aqueous NaHSO 3 and 50 ml of ethyl acetate.
  • the aqueous phase is separated off and the organic phase is extracted again twice with 50 ml of aqueous sodium bicarbonate solution.
  • the aqueous phases are combined and extracted again with 10 ml of ethyl acetate.
  • Example 9 Preparation of 5'-dimethoxytrityl-N 6 -pivaloyl-2 '(- 1- (2-fluorophenyl) -4-methoxy-piperid-4-yl) adenosine from the effluent solution of an oligonucleotide synthesis reactor.
  • a large amount of a solution of 30 g of iodine, 20 ml of water, 200 ml of pyridine and 750 ml of tetrahydrofuran is added to the reaction mixture until the brown iodine color persists for at least 5 minutes.
  • the reaction mixture is evaporated to a yellowish solid in vacuo. It is taken up in an emulsion of 100 ml of 40% aqueous NaHSO 3 and 50 ml of ethyl acetate.
  • the aqueous phase is separated off and the organic phase is extracted again twice with 50 ml of aqueous sodium bicarbonate solution.
  • the aqueous phases are combined and extracted again with 10 ml of ethyl acetate.
  • Example 10 Preparation of 5'-dimethoxytrityl-2 '(- 1- (2-fluorophenyl) -4-methoxy-piperid-4-yl) uridine from the hydrolyzate of 5'-dimethoxytrityl-2' (- 1- ( 2-fluorophenyl) -4-methoxy-piperid-4-yl) uridin-3'-yl-cyanoetyl-phosphorodiisopropylamidite; Transesterification with methanol and KF, I 2 / H 2 O as a quench solution without 1 2 scavenger during workup.
  • a large amount of a solution of 30 g of iodine, 20 ml of water, 200 ml of pyridine and 750 ml of tetrahydrofuran is added to the reaction mixture until the brown iodine color persists for at least 5 minutes.
  • the reaction mixture is evaporated to a yellowish solid in vacuo. It is taken up in an emulsion of 50 ml of water and 50 ml of ethyl acetate.
  • the aqueous phase is separated off and the organic phase is extracted again four times with 50 ml of water each time.
  • the aqueous phases are combined and extracted again with 10 ml of ethyl acetate.
  • Example 11 Preparation of 5'-dimethoxytrityl-N 4- benzoyl-2 '- (1- (2-fluorophenyl) -4-methoxy-piperid-4-yl) cytidine from the hydrolyzate of 5'-dimethoxytrityl-N 4 - benzoyl-2 '- (1 - (2-fluorophenyl) -4-methoxy-piperid-4-yl) -cytidin-3'-yl-cyanoetylphosphorodiisopropylamidite
  • a large amount of a solution of 30 g of iodine, 20 ml of water, 200 ml of pyridine and 750 ml of tetrahydrofuran is added to the reaction mixture until the brown iodine color persists for at least 5 minutes.
  • the reaction mixture is evaporated to a yellowish solid in vacuo. It is taken up in an emulsion of 50 ml of water and 50 ml of ethyl acetate.
  • the aqueous phase is separated off and the organic phase is extracted again four times with 50 ml of water each time.
  • the aqueous phases are combined and again extracted with 10 ml of ethyl acetate.
  • Example 12 Preparation of 5'-dimethoxytrityl-N 4- (4-tert-butylphenoxyacetyl) -2'-deoxycytidine from the hydrolyzate of 5'-dimethoxytrityl-N 4- (4-tert-butylphenoxyacetyl) 2'-deoxycytidine -3'-yl-cyanoethylphosphorodiisopropylamidite.
  • the reaction mixture is filtered and then poured onto 100 ml of ice water.
  • the resulting emulsion is extracted three times with 30 ml of ethyl acetate each.
  • the organic phases are combined, extracted with 50 ml of saturated NaCl solution and then dried over 2 g of dry sodium sulfate.
  • the fitrate is evaporated to the dry state in a vacuum.
  • the solid is taken up in 10 ml of ethyl acetate and the solution thus obtained is slowly allowed to flow into 300 ml of n-hexane.
  • the product is obtained as a white amorphous precipitate.
  • Example 13 Transesterification with imidazole, quenching agent with 1 2 / water, working up with citrate buffer: Preparation of 5'-dimethoxytrityl- (3-N-trifluoroacetylaminopropyl) -2'-deoxyuridine from the effluent solution of an oligonucleotide synthesis reactor.
  • a large amount of a solution of 30 g of iodine, 20 ml of water, 200 ml of pyridine and 750 ml of tetrahydrofuran is then added to the reaction mixture until the brown iodine color persists for at least 5 minutes.
  • the reaction mixture is evaporated to a yellowish solid in vacuo. It is taken up in an emulsion of 50 ml of pH: 3-4 buffer and 40 ml of ethyl acetate.
  • the buffer used here consists of 24g NaOH, 117g citric acid and 35g sodium chloride per liter of aqueous solution.
  • the aqueous phase containing imidazole is separated off and the organic phase is extracted again twice with 50 ml of the buffer solution.
  • Example 14 Preparation of 5'-dimethoxytrityl- (propin-1-yl) -2'-deoxyuridine from the drain solution of an oligonucleotide synthesis reactor.
  • a large amount of a solution of 30 g iodine, 20 ml water, 200 ml pyridine and 750 ml tetrahydrofuran is added to the reaction mixture until the brown iodine color persists for at least 5 minutes.
  • the reaction mixture is evaporated to a yellowish solid in vacuo. It is taken up in an emulsion of 50 ml of pH: 3-4 buffers and 35 ml of ethyl acetate.
  • the buffer used here consists of 24g NaOH, 117g citric acid and 35g sodium chloride per liter of aqueous solution.
  • the aqueous phase containing imidazole is separated off and the organic phase is extracted again twice with 50 ml of the buffer solution.
  • Example 15 Preparation of 5'-dimethoxytrityl- (3-trifluoroaminopropin-1-yl) -2'-deoxyuridine from the effluent solution of an oligonucleotide synthesis reactor.
  • a large amount of a solution of 30 g of iodine, 20 ml of water, 200 ml of pyridine and 750 ml of tetrahydrofuran is added to the reaction mixture until the brown iodine color persists for at least 5 minutes.
  • the reaction mixture is evaporated to a yellowish solid in vacuo. It is taken up in an emulsion of 50 ml of pH 3-4 buffer and 40 ml of ethyl acetate.
  • the buffer used here consists of 24g NaOH, 117g citric acid and 35g sodium chloride per liter of aqueous solution.
  • the aqueous phase containing imidazole is separated off and the organic phase is extracted again twice with 50 ml of the buffer solution. This is followed by extraction of the organic phase with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and then with 50 ml of saturated sodium chloride solution. The organic phase is then dried over 2 g of dry sodium sulfate. After the salt has been filtered off, the fitrate is evaporated to dryness in vacuo. The solid is taken up in 5-10 ml of ethyl acetate and the solution thus obtained is slowly poured into 250 ml of n-pentane. The product is obtained as a white amorphous precipitate.
  • Example 16 Preparation of N-5'-dimethoxytrityl-3'-deoxythymidin-3'-yl, N-propyl-3'-deoxythymid-5'-yl) acetamide from the effluent solution of an oligonucleotide synthesis reactor.
  • a large amount of a solution of 30 g of iodine, 20 ml of water, 200 ml of pyridine and 750 ml of tetrahydrofuran is added to the reaction mixture until the brown iodine color persists for at least 5 minutes.
  • the reaction mixture is evaporated to a yellowish solid in vacuo. It is taken up in an emulsion of 50 ml of pH 3-4 buffer and 40 ml of ethyl acetate.
  • the buffer used here consists of 24g NaOH, 117g citric acid and 35g sodium chloride per liter of aqueous solution.
  • the aqueous phase containing imidazole is separated off and the organic phase is extracted again successively twice with 50 ml of the buffer solution. This is followed by extraction of the organic phase with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and then with 50 ml of saturated sodium chloride solution. The organic phase is then dried over 2 g of dry sodium sulfate. After the salt has been filtered off, the fitrate is evaporated to dryness in vacuo. The solid is taken up in 3 ml of ethyl acetate / CHCl 3 (1: 1, V: V) and the solution thus obtained is slowly allowed to flow into 600 ml of n-pentane. The product is obtained as a white amorphous precipitate.
  • Example 17 Preparation of 5'-dimethoxytrityl-3'-propyl-5-methyluridine from the effluent solution of an oligonucleotide synthesis reactor.
  • a large amount of a solution of 30 g of iodine, 20 ml of water, 200 ml of pyridine and 750 ml of tetrahydrofuran is added to the reaction mixture until the brown iodine color persists for at least 5 minutes.
  • the reaction mixture is evaporated to a yellowish solid in vacuo. It is taken up in an emulsion of 50 ml of pH 3-4 buffer and 40 ml of ethyl acetate.
  • the buffer used here consists of 24g NaOH, 117g citric acid and 35g sodium chloride per liter of aqueous solution.
  • the aqueous phase containing imidazole is separated off and the organic phase is extracted again twice with 50 ml of the buffer solution. This is followed by extraction of the organic phase with saturated water sodium bicarbonate solution and then with 50 ml of saturated sodium chloride solution. The organic phase is then dried over 2 g of dry sodium sulfate. After the salt has been filtered off, the fitrate is evaporated to dryness in vacuo. After drying over P 4 0 1O / KOH for 24 hours in vacuo, 258 mg (86% of theory) of the compound 5'-dimethoxytrityl-3'-propyl-5-methyluridine are obtained as a yellow oil.
  • Example 18 Transesterification of a phosphite on a polymer using methanol as the acceptor alcohol
  • the support is washed 4 times with 2 ml of acetonitrile and then reacted with a solution of 30 g of iodine, 20 ml of water, 200 ml of pyridine and 750 ml of tetrahydrofuran for one hour.
  • the solid phase is then washed 10 times with 2 ml of acetonitrile, then 10 times with 2 ml of diethyl ether.
  • the carrier is dried and treated at 55-60 ° C with concentrated aqueous ammonia solution.
  • the solid phase, on which there is no longer any nucleoside, is then filtered off.
  • the filtrate is first lyophilized, then taken up with 0.1 M triethylammonium acetate at pH 7 and analyzed by HPLC.
  • a mixture of 5'-thymidine monophosphate, thymidine and thymidine-5'-methylphosphate can be seen.
  • the thymidine 5'-phosphate has arisen from the educt by iodine oxidation and ammonolysis.
  • the thymidine 5'-methylphosphate is derived from an intermediate product of dephosphitylation, the thymidine 5-methyl-H-phosphonate in the oxidative and hydrolytic workup.
  • the thymidine resulted from the product of dephosphitylation, the polymer-bound thymidine after saponification of the succinyl group bridging group.
  • the remaining amount of the carrier is subjected to the aforementioned oxidative and ammonolytic workup for a further 36 hours. Only thymidine is obtained in the filtrate of the carrier.
  • Example 19 Transesterification of a phosphite on a polymer using cyanoethanol as the acceptor alcohol
  • CPG controlled pore glass
  • the support is washed 4 times with 2 ml of acetonitrile and then reacted with a solution of 30 g of iodine, 20 ml of water, 200 ml of pyridine and 750 ml of tetrahydrofuran for one hour.
  • the solid phase is then washed 10 times with 2 ml of acetonitrile, then 10 times with 2 ml of diethyl ether.
  • the carrier is dried and treated at 55-60 ° C with concentrated aqueous ammonia solution.
  • the solid phase, on which there is no longer any nucleoside, is then filtered off.
  • the filtrate is first lyophilized, then taken up with 0.1 M triethylammonium acetate pH: 7 and analyzed by HPLC. A mixture of 5'-thymidine monophosphate and thymidine in a ratio of 3:97 can be seen.
  • the thymidine 5'-phosphate has arisen from the educt by iodine oxidation and ammonolysis.
  • the thymidine is the product of the dephosphitylation, the polymer-bound thymidine after saponification of the succinyl group bridging group.
  • Example 20 Transesterification of a phosphite on a polymer using methanol as the acceptor alcohol in the presence of magnesium di-trifluoroacetate Mg (OTf) 2 .
  • CPG Controlled Pore Glass
  • the support is washed 4 times with 2 ml of acetonitrile and then reacted with a solution of 30 g of iodine, 20 ml of water, 200 ml of pyridine and 750 ml of tetrahydrofuran for one hour.
  • the solid phase is then washed 10 times with 2 ml of acetonitrile, then 10 times with 2 ml of ether.
  • the support is dried and treated at 55-60 ° C with concentrated aqueous ammonia solution. The solid phase, on which there is no longer any nucleoside, is then filtered off.
  • the filtrate is first lyophilized, then taken up with 0.1 M triethylammonium acetate pH: 7 and analyzed by HPLC. A mixture of thymidine and thymidine 5'-methylphosphate can be seen.
  • the Thymidine -5'-methylphosphate is the result of an intermediate product of dephosphitylation, the thymidine-5-methyl-H-phosphonate in the oxidative and hydrolyric workup.
  • the thymidine is from the product of dephosphitylation, the polymer-bound thymidine after the saponification of the succinyl group bridge group.
  • the ratio of thymidine to thymidine 5'-monophosphate is 97: 3.
  • Example 21 Transesterification of a phosphite on a polymer using cyanoethanol as the acceptor alcohol in the presence of LiCl.
  • the nucleoside is covalently linked to the CPG via its succinyl group to form its 3'-OH group.
  • the support is washed 4 times with 2 ml of acetonitrile and then reacted with a solution of 30 g of iodine, 20 ml of water, 200 ml of pyridine and 750 ml of tetrahydrofuran for one hour.
  • the solid phase is then washed 10 times with 2 ml of acetonitrile, then 10 times with 2 ml of diethyl ether.
  • the carrier is dried and treated at 55-60 ° C with concentrated aqueous ammonia solution.
  • the solid phase, on which there is no longer any nucleoside, is then filtered off.
  • the filtrate is first lyophilized, then taken up with 0.1 M triethylammonium acetate pH: 7 and analyzed by HPLC. A mixture of thymidine and thymidine 5'-phosphate can be seen.
  • the thymidine 5'-phosphate has arisen from the educt by iodine oxidation and ammonolysis.
  • the thymidine resulted from the product of the dephosphitylation of the polymer-bound thymidine after saponification of the succinyl group bridging group.
  • the ratio of thymidine to thymidine 5'-monophosphate is 98: 2.

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Abstract

Verfahren zur Herstellung von natürlichen oder synthetischen Nukleosiden, Nukleosidanalogen oder Oligonukleotiden aus mindestens zwei solcher Nukleoside und/oder Nukleosidanalogen, deren Grundgerüst einen gegebenenfalls substituierten Rest einer Nukleinbase B und eine geschützte Hydroxylgruppe der Formel R1-O-, worin R1 für eine Schutzgruppe steht, enthält, oder die mit dem Sauerstoffatom einer Hydroxylgruppe direkt oder über eine Brückengruppe an ein festes Trägermaterial gebunden sind, aus Nukleosidmonomeren oder aus Oligonukleotiden, an deren Grundgerüst neben besagten Resten eine Gruppe der Formeln I, la oder Ib
Figure imga0001
gebunden ist, durch Überführung der Gruppe der Formeln I, la oder Ib in eine Hydroxylgruppe -OH, indem man die Nukleoside oder Oligonukleotide, gegebenenfalls in einem inerten organischen Lösungsmittel, mit einem Überschuss eines aliphatischen, cycloaliphatischen, araliphatischen oder aromatischen Alkohols mit 1 bis 30 C-Atomen, einem Polyol mit 2 bis 50 C-Atomen oder einem polymeren Polyol in Gegenwart einer mindestens katalytischen Menge einer anorganischen Base oder einer organischen Stickstoffbase umsetzt, wobei die Base einen pK-Wert von 4 bis 10 aufweist.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von natürlichen oder synthetischen Nukleosiden, Nukleosidanalogen oder Oligonukleotiden mit mindestens zwei gleichen oder verschiedenen solcher Nukleosidmonomeren.
  • Heute werden viele Oligonukleotide definierter Sequenz nach dem Phosphittriester-Verfahren synthetisiert. Hierbei wird ein Oligonukleotid von seinem 3'-Terminus aus sukzessive in 5'-Richtung synthetisiert. Die Synthese beginnt mit der Anbindung des 3'-terminalen Nukleosids, welches eine Schutzgruppe an seiner 5'-Hydroxylgruppe und, wenn nötig, an seiner Nukleosidbase trägt, an eine chemisch inerte feste Phase. Anschliessend wird die 5'-Hydroxyschutzgruppe abgespalten. Durch Umsatz mit einem 3'-Phosphoramidit eines adäquat geschützten Nukleosids erfolgt die Bildung der internukleotidischen Bindung. Der resultierende Phosphittriesterwird anschliessend zu der gewünschten Internukleotidbindung oxidiert. Nun kann der nächste Synthesekreislauf mit der Abspaltung der 5'-terminalen Schutzgruppe des auf der Festphase immobilisierten Dinukleotids eingeleitet werden. Die Synthesekreisläufe werden so lange wiederholt, bis man zu dem fertigen, an der Festphase gebundenen Oligonukleotid gelangt. Die Synthese endet mit der Abspaltung der Schutzgruppen an den Nukleosidbasen, Hydroxygruppen und den internukleotidischen Bindungen (Caruthers, M.H., Science 230;281-285, 1985). Je nach Art des Phosphoramidits enthält das eingesetzte Nukleosid oder Oligonukleotid zum Beispiel die Gruppen der Formeln
    Figure imgb0001
    Problematisch bei diesem Syntheseverfahren ist die Kondensationsreaktion zwischen dem Phosphoramidit und der freien Hydroxygruppe der auf der Festphase immobilisierten Nukleoside oder Oligonukleotide. Bei diesem Reaktionsschritt muss auf peinlichsten Ausschluss von Wasser geachtet werden. Selbst durch die Verwendung von absolutierten Lösungsmitteln ist die Wasserfreiheit nicht vollständig gewährleistet. Deshalb kommt es bei dem Kopplungsschritt der Festphasenoligonukleotidsynthese zur Überführung erheblicher Mengen an Nukleosidphosphoramidit in Nukleosidphosphoramidit-Hydrolysat, zum Beispiel das Nukleosidcyanoethylhydrogenphosphonat. Letzteres nimmt an der Kopplungsreaktion nicht teil. Um dennoch hohe Kopplungsausbeuten zu erreichen, müssen die Phosphoramidite in hohen Überschüssen eingesetzt werden. Bei modernen DNA-Syntheseautomaten werden bis zu 2- bis 20-fache Überschüsse an Nukleosid- phosphoramidit relativ zu der Menge der an der Festphase immobilisierten Hydroxykomponente eingesetzt. Hieraus ergibt sich eine Ausbeute an Internukleotidbindung von maximal 20 % relativ zum eingesetzten Phosphoramidit. Minimal 80 % der eingesetzten Nukleoside werden als Nukleosid-phosphoramidit-Hydrolysat verworfen. Dieses Problem kann auch durch apparitive Verbesserungen wie zum Beispiel speziellen Dosiervorrichtungen nicht vollständig beseitigt werden, siehe Chemische Rundschau Nr. 37, Seite 11 (1992).
  • Böhringer (Böhringer, M.P., Dissertation, Eidgenössische Technische Hochschule, ETH Nr. 9377, 1991) lässt das Hydrolysat eines Methylphosphoramidits eines Nukleosidanalogons mit Natronlauge zum Nukleosidanalogon mit einer freien Hydroxygruppe reagieren. Unter den von ihm verwendeten Hydrolysebedingungen werden jedoch die Schutzgruppen der Nukleosidbasen abgespalten.
  • Auch die von Predvoditelev et al. (Predvoditelev, D.A., Tyuganova, M.A., Nifant'ev, E.E., Rogovin, Z.A., Zh. Prikl. Khim. 40:171-177, 1967), Nifnt'ev et al. (Nifnt'ev, E.E., Predvoditelev, D.A., Fursenko, LV., Zh. Obsh. Khim. 51:2435-2441, 1981), Troev und Simeonov (Troev, K., Simeonov, M., Phosphorus and Sulfur 19:363-367, 1984) und Westheimer et al. (Westheimer, F.H., Huang, S., Covitz, F., J. Am. Chem. Soc. 110:181-185, 1988) beschriebenen Verfahren zur Umesterung von nicht nukleotidischen Dialkylphosphiten haben alle den Nachteil, dass bei Anwendung auf geschützte Nukleoside als Nebenreaktion die Schutzgruppen der Nukleinsäurebasen leicht abgespalten werden. So wird in diesen Verfahren eine erhöhte Temperatur benötigt, was der generellen Anwendung wegen thermischer Zersetzungsreaktionen, beispielsweise die thermische Abspaltung von Schutzgruppen, insbesondere die Detritylierung, im Wege steht.
  • Ein weiteres Verfahren ist die Lewis-Säure-katalysierte Umesterung mit Terakis-benzyloxy-titan, welches bei 40°C innerhalb 72 Stunden mit mässigen Ausbeuten durchgeführt wird und bei die Hydrolyseempfindlichkeit des Titanats besonders nachteilig ist (Froneman, M., Modro, T.A., Synthesis 201-204, 1991).
  • Überraschenderweise wird nun durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung gestellt, Nukleosid-hydrogenphosphonate oder-hydrogenphosphinate in Nukleoside zu überführen, welche eine freie Hydroxylgruppe an jener Position haben, an der sich die Hydrogenphosphonat- bzw. -phosphinatfunktion befunden hatte. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird die Hydrogenphosphonatgruppe bzw. Hydrogenphosphinatgruppe hochselektiv gegenüber anderen Acylschutzgruppen auf einen Alkohol übertragen. Die Selektivität der Abspaltung kann in manchen Fällen so gross, dass selbst nach mehrtägiger Einwirkung unter den gegebenen Reaktionsbedingungen die Schutzgruppen der Nukleosidbasen nicht abgespalten werden. Bei dieser Reaktion werden darüberhinaus hohe Ausbeuten erzielt. Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht erstmals die Wiederverwertung der bei der Nukleotidkopplung nach dem gebräuchlichen Phosphittriesterverfahren anfallenden Nukleosidüberschüsse während des routinemässigen Dauerbetriebs der manuellen oder automatisierten Oligonukleotidsynthese.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von natürlichen oder synthetischen Nukleosiden, Nukleosidanalogen oder Oligonukleotiden aus mindestens zwei solcher Nukleoside und/oder Nukleosidanalogen, deren Grundgerüst einen gegebenenfalls substituierten Rest einer Nukleinbase B und eine geschützte Hydroxylgruppe der Formel R1-O-, worin R1 für eine Schutzgruppe steht, enthält, oder die mit dem Sauerstoffatom einer Hydroxylgruppe direkt oder über eine Brückengruppe an ein festes Trägermaterial gebunden sind, aus Nukleosidmonomeren oder aus Oligonukleotiden, an deren Grundgerüst neben besagten Resten eine Gruppe der Formeln I, la oder Ib
    Figure imgb0002
    gebunden ist, durch Überführung der Gruppe der Formeln I, la oder Ib in eine Hydroxylgruppe -OH, indem man die Nukleoside oder Oligonukleotide, gegebenenfalls in einem inerten organischen Lösungsmittel, mit einem Überschuss eines aliphatischen, cycloaliphatischen, araliphatischen oder aromatischen Alkohols mit 1 bis 30 C-Atomen, einem Polyol mit 2 bis 50 C-Atomen oder einem polymeren Polyol in Gegenwart einer mindestens katalytischen Menge einer anorganischen Base oder einer organischen Stickstoffbase umsetzt, wobei die Base einen pK-Wert von 4 bis 10 aufweist.
  • Die Gruppen der Formeln I, la und Ib können in den 3'- oder 5'-Stellungen der Nukleoside bzw. Oligonukleotide gebunden sein, wobei die Gruppe R1O- oder das feste Trägermaterial in den 5'- bzw. 3'-Positionen gebunden ist. Vorzugsweise ist die Gruppe der Formel in der 5'-Position gebunden, die Gruppe der Formel lb in der 3'-Stellung gebunden und die Gruppe der Formel la in den 3'- oder 5'-Positionen gebunden.
  • Für das erfindungsgemässe Verfahren geeignete Nukleoside, Nukleosidanaloge oder Oligonukleotide mit einer der Knüpfung der Nukleotidbindung dienenden vorzugsweise sekundären OH-Gruppe sind in grosser Vielzahl bekannt und in der Fachliteratur beschrieben, beispielsweise in Townsend (Townsend, L.B., Hrsg., Chemistry of Nucleosides and Nucleotides 1, Plenum Press, New York, 1988) oder nach bekannten Verfahren herstellbar. Es kann sich bei ihnen im allgemeinen um ein gegebenenfalls mit -O- oder -S- unterbrochenes offenkettiges C-Gerüst oder carbacyclisches oder O- bzw. S-heterocyclisches Grundgerüst mit einer Nukleinbase B handeln.
  • Das offenkettige Kohlenstoff-Gerüst kann zum Beispiel 3 bis 12, bevorzugt 3 bis 6 Kohlenstoff-Atome enthalten. Bei den carbacyclischen und heterocyclischen Grundgerüsten kann es sich zum Beispiel um monocyclische Ringsysteme mit 3 bis 12, bevorzugt 3 bis 8 und besonders bevorzugt 4 oder 5 Ringkohlenstoffatomen handeln. Es kann sich auch um bicyclische bis tetracyclische Systeme mit zum Beispiel 5 bis 16, bevorzugt 8 bis 16 Kohlenstoff-Atomen handeln. Die Grundgerüste können weitere Substituenten enthalten, zum Beispiel geschützte OH-Gruppen.
  • Wenn die Nukleinbase B einen Purinrest oder ein Analoges davon darstellt, so kann es sich um Reste der Formeln II, Ila, Ilb, llc, Ild oder Ile handeln,
    Figure imgb0003
    Figure imgb0004
    Figure imgb0005
    worin R7 für H, Cl, Br, NH2 oder OH steht, und R8, R9 und R10 unabhängig voneinander H, OH, SH, NH2, NHNH2, NHOH, NHOAlkyl mit 1 bis 12 C-Atomen, F, Cl, Br, Alkyl oder Hydroxyalkyl oder Aminoalkyl oder Alkoxy oder Alkylthio mit 1 bis 12 C-Atomen, wobei die Hydroxyl- und Aminogruppen unsubstituiert oder mit einer Schutzgruppe substituiert sind, Phenyl, Benzyl, Primäramino mit 1 bis 20 C-Atomen oder Sekundäramino mit 2 bis 30 C-Atomen bedeuten, und R11 H oder C1-C4-Alkyl darstellt.
  • Das Primäramino enthält bevorzugt 1 bis 12 und besonders bevorzugt 1 bis 6 C-Atome, und das Sekundäramino bevorzugt 2 bis 12 und besonders bevorzugt 2 bis 6 C-Atome.
  • Einige Beispiele für Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Hydroxyalkyl und Aminoalkyl, die bevorzugt 1 bis 6 C-Atome enthalten, sind Methyl, Ethyl und die Isomeren von Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl und Dodecyl, sowie entsprechende Alkoxy-, Alkylthio-, Hydroxyalkyl- und Aminoalkylreste. Das Alkyl, Alkoxy, Alkylthio, Hydroxyalkyl und Aminoalkyl enthält besonders bevorzugt 1 bis 4 C-Atome. Bevorzugte Alkyl-,Alkoxy-, Alkylthio-, Hydroxyalkyl- und Aminoalkylreste sind Methyl, Ethyl, n- und i-Propyl, n-, i- und t-Butyl, Methoxy, Ethoxy, Methylthio und Ethylthio, Aminomethyl, Aminoethyl, Hydroxymethyl und Hydroxyethyl.
  • Bei dem Primäramino und Sekundäramino kann es sich zum Beispiel um Reste der Formel R14R15N handeln, worin R14 für H steht oder unabhängig die Bedeutung von R15 hat, und R15 C1-C20-, bevorzugt C1-C12-und besonders bevorzugt C1-C6-Alkyl, -Aminoalkyl, -Hydroxyalkyl; Carboxyalkyl oder Carbalkoxyalkyl, wobei die Carbalkoxygruppe 2 bis 8 C-Atome enthält und die Alkylgruppe 1 bis 6, bevorzugt 1 bis 4 C-Atome; C2-C20-, bevorzugt C2-C12- und besonders bevorzugt C2-C6-Alkenyl; Phenyl, Mono- oder Di-(C1 -C4-Alkyl- oder - Alkoxy)phenyl, Benzyl, Mono- oder Di-(C1-C4-Alkyl- oder -Alkoxy)benzyl; oder 1,2-, 1,3- oder 1,4-Imidazolyl-C1-C6-Alkyl darstellt, oder R14 und R15 zusammen Tetra- oder Pentamethylen, 3-oxa-1,5-pentylen, -CH2-NR16-CH2CH2- oder -CH2CH2-NR16-CH2CH2- darstellen, worin R16 für H oder C1-C4-Alkyl steht. Die Aminogruppe im Aminoalkyl kann mit ein oder zwei C1-C4-Alkyl oder -Hydroxyalkylgruppen substituiert sein. Die Hydroxylgruppe im Hydroxyalkyl kann mit C1-C4-Alkyl verethert sein.
  • Beispiele für Alkyl sind zuvor angegeben worden. Beispiele für Aminoalkyl sind Aminomethyl, Aminoethyl, 1-Aminoprop-2-yl oder-3-yl, 1-Amino-but-2-yl oder -3-yl oder -4-yl, N-Methyl- oder N,N-Dimethyl- oder N-Ethyl- oder N,N-Diethyl- oder N-2-Hydroxyethyl- oder N,N-Di-2-hydroxyethylaminomethyl oder-aminoethyl oder -aminopropyl oder -aminobutyl. Beispiele für Hydroxyalkyl sind Hydroxymethyl, 1 -Hydroxy-eth-2-yl, 1-Hydroxy-prop-2- oder -3-yl, 1-Hydroxy-but-2-yl, -3-yl oder -4-yl. Beispiele für Carboxyalkyl sind Carboxymethyl, Carboxyethyl, Carboxypropyl und Carboxybutyl, und Beispiele für Carbalkoxyalkyl sind diese mit Methyl oder Ethyl veresterten Carboxyalkylgruppen. Beispiele für Alkenyl sind Allyl, But-1-en-3-yl oder - 4-yl, Pent-3- oder 4-en-1-yl oder -2-yl, Hex-3- oder -4- oder -5-en-1-yl oder -2-yl. Beispiele für Alkyl- und Alkoxyphenyl beziehungsweise -benzyl sind Methylphenyl, Dimethylphenyl, Ethylphenyl, Diethylphenyl, Methylbenzyl, Dimethylbenzyl, Ethylbenzyl, Diethylbenzyl, Methoxyphenyl, Dimethoxyphenyl, Ethoxyphenyl, Diethoxyphenyl, Methoxybenzyl, Dimethoxybenzyl, Ethoxybenzyl, Diethoxybenzyl. Beispiele für Imidazolylalkyl, in dem die Alkylgruppe bevorzugt 2 bis 4 C-Atome enthält, sind 1,2-, 1,3- oder 1,4-Imidazolylethyl oder -n-propyl oder -n-butyl. R16 stellt bevorzugt H, Methyl oder Ethyl dar.
  • Bevorzugte Beispiele für Primäramino und Sekundäramino sind Methyl-, Ethyl-, Dimethyl-, Diethyl-, Allyl-, Mono- oder Di-(1-hydroxy-eth-2-yl)-, Phenyl- und Benzylamino, Acetylamino und Benzoylamino.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stellt R7 Wasserstoff dar. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt R10 Wasserstoff dar. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeuten R8 und R9 unabhängig voneinander H, F, Cl, Br, OH, SH, NH2, NHOH, NHNH2, Methylamino, Dimethylamino, Benzoylamino, Methoxy, Ethoxy und Methylthio.
  • Einige Beispiele für Analoge der Purinreihe sind neben Purin Adenin; N-Methyladenin, N-Benzyladenin, 2-Methyladenin, 2-Methylthioadenin, 2-Aminoadenin, 3-Carbaadenin, 7-Carbaadenin, 1-Carbaadenin, 6-Hydroxypurin, 2-Amino-6-chlorpurin, 2-Amino-6-methylthiopurin, 2-Amino-6-hydroxypurin, 3-Carba-6- chlorpurin, Guanin, 2-Methylguanin. Besonders bevorzugt sind Adenin, 2-Aminoadenin und Guanin.
  • Wenn die Nukleinbase B einen analogen Pyrimidinrest darstellt, so handelt es sich bevorzugt um Uracil-, Thymin- und Cytosinreste der Formeln III, Illa und Illb,
    Figure imgb0006
    Figure imgb0007
    worin R11 H oder C1-C4-Alkyl bedeutet, und R12, R13 und R30 unabhängig voneinander die zuvor für R8 angegebene Bedeutung haben, einschliesslich der Bevorzugungen, und die Wasserstoffatome der NH2-Gruppe in Formel Illb mit C1-C6-Alkyl oder Benzoyl substituiert sein können, sowie die Dihydroderivate der Reste der Formeln III, Illa und Illb. Bevorzugt stellt R12 H, C1-C6-Alkyl oder Hydroxyalkyl, F, Cl, Br, NH2, Benzoylamino, Mono-oder Di-C1-C6-alkylamino dar und R13 stellt bevorzugt H, C1-C6-Alkyl oder -Alkoxy oder -Hydroxyalkyl, F, Cl, Br, NH2, Benzoylamino, Mono- oder Di-C1-C6-alkylamino dar.
  • R11 steht bevorzugt für H oder Methyl. R12 bedeutet bevorzugt H, F, Cl, Br, NH2, NHCH3, N(CH3)2 oder C1-C4-Alkyl. R13 stellt bevorzugt H, C1-C4-Alkyl, besonders Methyl, oder NH2, NHCH3 oder (CH3)2N dar.
  • Einige Beispiele für Pyrimidinanaloge sind Uracil, Thymin, Cytosin, 5-Fluoruracil, 5-Chloruracil, 5-Bromuracil, Dihydrouracil, Pseudouracil, 1-Methylpseudouracil, 5-Methyluracil, 3-Methylcytosin und 5-Methylcytosin.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind mit Schutzgruppen allgemein in der Fachwelt bekannte Schutzgruppen gemeint. Beispiele für solche Schutzgruppen sind; C1-C8-Alkyl ; mono- oder bicyclisches C7-C12-Aralkyl; mono- oder bicyclisches C7-C12-Aralkoxy; mono- oder bicyclisches C7-C12-Haloaralkyl; Diphenylmethyl; Diphenylmethyl, substituiert mit 1 bis 4 Methyl oder Methoxy; Triphenylmethyl; Triphenylmethyl, substituiert mit 1 bis 6 Methyl oder Methoxy, oder 1 bis 3 tert.-Butyl; Xanthenyl, substituiert mit Phenyl oder Naphthyl; -Si(R4)(R5)(R6), worin (R4)(R5) und (Rs) unabhängig voneinander C1-C20 -Alkyl, Benzyl oder Phenyl bedeuten; R-C(O)-, worin R C1-C6-Alkyl, Benzyl, Benzyl, substituiert mit Methyl, Methoxy oder Halogen, C1-C12-Alkoxy, C1-C12-Alkoxy, substituiert mit Fluoren, Phenyloxy, Phenyloxy, substituiert mit Methyl, Methoxy oder Halogen, Benzyloxy oder Benzyloxy, substituiert mit Methyl, Methoxy oder Halogen bedeutet; R17-SO2-, worin R17 C1-C12-Alkyl, C5-Cs-Cycloalkyl, Phenyl, Phenyl, substituiert mit C1-C12-Alkyl oder Halogen, Benzyl oder Benzyl, substituiert mit C1-C12-Alkyl oder Halogen bedeutet; C1-C12-Alkoxyacetyl oder Phenoxyacetyl, das unsubstituiert oder mit linearem oder verzweigten C1-C6-Alkyl, C1-C6-Halogenalkyl, Halogen, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Alkylthio, Nitro oder Cyano ein- oder mehrfach substituiert sein kann.
  • Beispiele für C1-C8-Alkyl sind Methyl, Ethyl, n- und i-Propyl, n-, i- und t-Butyl; für ein monocyclisches C7-C12-Aralkyl sind Benzyl, Methylbenzyl, Dimethylbenzyl; für ein mono- oder bicyclisches C7-C12-Aralkoxy sind Methoxybenzyl, Dimethoxybenzyl; für ein mono- oder bicyclisches C7-C12-Haloalkyl ist Brombenzyl; für ein substituiertes Diphenylmethyl sind Di(methylphenyl)methyl, Di(dimethylphenyl)methyl, Di(methoxyphenyl)methyl, Di(dimethoxyphenyl)methyl; für ein substituiertes Triphenylmethyl sind Tri(methylphenyl)methyl, Tri(dimethylphenyl)methyl, Tri(methoxyphenyl)methyl, Tri(dimethoxyphenyl)methyl, Monomethoxytrityl, Dimethoxytrityl und tris-p-tert.-Butylphenylmethyl; für Silylgruppen sind Triphenylsilyl, Trimethylsilyl, Triethylsilyl, Tri-n-propylsilyl, i-Propyl-dimethylsilyl, t-Butyl-dimethylsilyl, t-Butyl-diphenylsilyl, n-Octyl-dimethylsilyl, (1,1,2,2-Tetramethylethyl)-dimethylsilyl; für die Gruppe R-C(O)- sind Acetyl, Trifluoracetyl , Propanoyl, Butanoyl, Pentanoyl, Hexanoyl, Benzoyl, Methylbenzoyl, Methoxybenzoyl, Chlorbenzoyl, Brombenzoyl, Methoxy-, Ethoxy-, n- oder i-Propoxy- oder n-, i- oder t-Butoxycarbonyl, oder Phenyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Methyl- oder Methoxy- oder Chlorphenyloxycarbonyl oder -benzyloxycarbonyl oder 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl; und fürdie Gruppe R17-S02- sind Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Phenyl-, Benzyl-, p-Brom-, p-Methoxy- und p-Methylphenylsulfonyl; und für Alkoxyacetyl und Phenoxyacetyl Methoxyacetyl, Ethoxyacetyl, Phenoxyacetyl, (p-Methylphenoxy)acetyl, (p-Tertiärbutylphenoxy)acetyl. In Nukleinsäurebasen werden auch häufig Amidinschutzgruppen verwendet.
  • Die Nukleoside und Oligonukleotide können kovalent über eine Brückengruppe an ein festes Trägermaterial gebunden sein. Geeignete Trägermaterialien sind zum Beispiel Kieselgele, Controlled Pore Glass, Polystyrol, Polyacrylamid, Polyurethane, Polyolefine, Melamin, Polyamide, Polester, Polyether, Polyalkohole, Cyclodextrin, Cellulose und veretherte oder acylierte Cellulosederivate, Glykogen, Stärke, Chitin und Chitosan. Die Brückengruppe kann je nach Wahl des Trägermaterials zum Beispiel von Dicarbonsäuren, Diurethanen oder Alkoxysilylurethanen abgeleitet sein.
  • Das erfindungsgemässe Verfahren kann gegebenenfalls in Gegenwart eines zusätzlichen Lösungsmittels durchgeführt werden. Ohne zusätzliches Lösungsmittel ist der im erfindungsgemässen Verfahren verwendete Alkohol, das Polyol oder das polymere Polyol, sofern flüssig, das Lösungsmittel. Als zusätzliche Lösungsmittel eignen sich solche Lösungsmittel, die im jeweiligen Reaktionsansatz weder mit der Base noch mit dem Alkohol, dem Polyol oder dem polymeren Polyol konkurrieren. Sie können allein oder in Mischungen aus mindestens zwei Lösungsmitteln verwendet werden. Bei Polyolen können auch Lösungsmittel oder Lösungszusätze verwendet werden, welche durch Quellen des Polyols die Alkoholgruppen dem erfindungsgemässen Verfahren zugänglich machen. Beispiele für derartige Lösungsmittel sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethern, halogenierten Kohlenwasserstoffen, Carbonsäureamiden, Lactamen, Sulfoxiden, Sulfonen; aromatischen Kohlenwasserstoffen, Nitrilen, aliphatischen und cycloaliphatischen Kohlenwasserstoffen, insbesondere Ether, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Nitrile, Carbonsäureamide und Lactame. Lösungszusätze im Rahmen der vorliegenden Erfindung können vorteilhafterweise Salze, beispielsweise Ammoniumacetate und Ammoniumhydrogencarbonate, sein.
  • Besonders geeignete Ether sind Dibutylether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Ethylenglykoldiethyl - und -dimethylether, Diethylenglykoldimethylether, Diethylenglykoldiethylether oder Triethylenglykoldimethylether, insbesondere Methyl-t-butylether, Dibutylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran oder Dioxan. Besonders geeignete halogenierte Kohlenwasserstoffe sind Methylenchlorid, Chloroform, 1,2-Dichlorethan, 1,1,1-Trichlorethan und 1,1,2,2-Tetrachlorethan.
  • Von den Amiden werden vorteilhafterweise N-alkylierte oder N-dialkylierte Amide verwendet. Typische Vertreter sind beispielsweise N,N-Dimethylformamid, N,N-Diethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff und Hexamethylphosphorsäuretriamid
  • Bevorzugte Lactame sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus y-Butyrolactam, s-Caprolactam, N-Methylpyrrolidon, N-Acetylpyrrolidon und N-Methylcaprolactam.
  • Weitere geeignete Lösungsmittel im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise Dimethylsulfoxid, Dimethylsulfon, Diethylsulfon, Trimethylensulfon, Tetramethylensulfon, Benzol, substituiertes Benzol, insbesondere Chlorbenzol, o-Dichlorbenzol, 1,2,4-Trichlorbenzol, Nitrobenzol, Toluol und Xylol, Acetonitril, Propionitril, Benzonitril, Phenylacetonitril, Pentan, Petrolether, Hexan, Cyclohexan und Methylcyclohexan.
  • Der im erfindungsgemässen Verfahren verwendete aliphatische, cycloaliphatische, araliphatische oder aromatische Alkohol, das Polyol oder das polymere Polyol werden nachfolgend als Akzeptor bezeichnet.
  • Vorteilhafterweise wird ein Alkanol mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, bevorzugt mit 1 bis 12 Kohlenstoff- atomen, insbesondere mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen verwendet, beispielsweise ein Vertreter der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, n- und i-Propanol, n-, i- und t-Butanol, Pentanol, Hexanol, Ethylenglykol-, Diethylenglykolmonomethyl- und -monoethylether. Eine bevorzugte Untergruppe der im erfindungsgemässen Verfahren verwendeten Alkohole sind C1-C4-Alkanole. Besonders bevorzugt wird Methanol verwendet.
  • Des weiteren eignet sich ein gegebenenfalls alkylsubstituiertes Cycloalkanol mit 5 bis 12 Ringkohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 5 bis 8 Ringkohlenstoffatomen, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cyclopentanol, Cyclohexanol, Methylcyclohexanol, Cycloheptanol und Cyclooctanol.
  • Beispiele für weitere geeignete Akzeptoren sind araliphatische Alkohole mit 7 bis 30 Kohlenstoffatomen, insbesondere mit 7 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus un-, Alkyl- oderAlkoxy-substituiertem Benzylalkohol und ß-Phenylethanol; aromatische Alkohole mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, insbesondere mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phenol und un-, Alkyl- oder Alkoxy-substituiertes Naphthol; Polyole mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykol, Propylenglykol, Butandiol, Pentandiol, Hexandiol, Cyclohexandiol, Dihydroxymethylcyclohexan, Diethylenglykol, Triethylenglykol, Polyethylenglykol, Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Dipentaerythrit, Glycerin und Saccharide; polymere Polyole, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylalkohol, Polysaccharide und Polyacryl- bzw. -methacrylsäurehydroxyalkylester. Die Substituenten Alkyl und Alkoxy enthalten bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Sacchariden als Akzeptoren beispielsweise Mono-und Oligosaccaride wie Mono-, Di-, Tri-, Tetra- und Pentasaccharide verstanden. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Mono- und Oligosacchariden um Aldosen oder Ketosen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Monosaccharid um Aldopentosen, Aldohexosen, Ketopentosen oder Ketohexosen.
  • Beispiele für eine Aldopentose sind D-Ribose, D-Arabinose, D-Xylose oder D-Lyxose; für eine Aldohexose D-Allose, D-Altrose, D-Glucose, D-Mannose, D-Gulose, D-Idose, D-Galaktose oder D-Talose; für eine Ketopentose D-Ribulose oder D-Xylulose; für eine Ketohexose D-Psicose, D-Fructose, D-Sorbose oder D-Tagatose.
  • Beispiele für ein Disaccharid sind Trehalose, Maltose, Isomaltose, Cellobiose, Gentibiose, Saccharose oder Lactose.
  • Als Trisaccharid sei beispielhaft Raffinose genannt.
  • Beispiele für Polysaccharide sind Cellulose, Stärke, Dextrane, Glykogen, Fructane, Inulin, Mannane, Xylane und Arabinane.
  • Bei der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten anorganischen Base handelt es sich vorzugsweise um einen Vertreter der Gruppe bestehend aus basischem Metalloxid, Schwermetalloxid und -hydroxid, bevorzugt um Si02 oder basisches Aluminiumoxid.
  • Weitere geeignete anorganische Basen sind solche, die die Umesterung nukleophil katalysieren können und Bestandteil eines Puffersystems sein können. Vorzugsweise handelt es sich um in Alkoholen oder dem Reaktionsgemisch lösliche Metall- oder Ammoniumfluoride, Metall- oder Ammoniumaldoximate, -ketoximate, -hydroxomate, -sulfate, -phosphate, -phosphonate, -phophosphate, -sulfamate, -nitite, -nitrate, -sulfonate, wobei Metall vorzugsweise für ein Alkalimetallion steht, zum Beispiel Na+, Li+, K+, Rb+ und Cs+. Die Metallaldoximate, -ketoximate, -hydroxomate, -sulfamate, -sulfonate und phosphonate können H-Atome oder unsubstituierte oder mit Halogen, C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkoxy, Cyano oder Nitro substituierte Ci-C6-Alkylgruppen oder Phenylgruppen enthalten. Bei den Ammoniumfluoriden handelt es sich bevorzugt um Tetra(C1-Cs-Alkyl)ammoniumfluorid, zum Beispiel Tetra(n-butyl)ammoniumfluorid.HF. Weitere Beispiele sind CsF, KF, CH3-C(O)-NH-O- und Mg(CF3C0)2. Es hat sich als besonders zweckmässig erwiesen, die nukleophilen Basen gemeinsam mit den organischen Stickstoffbasen zu verwenden, vorteilhaft in katalytischen Mengen.
  • Als organische Stickstoffbase eignet sich vorteilhafterweise ein Vertreter der Gruppe bestehend aus aromatischem Amin, aromatischem N-Heterocyclus und N-C1-C4-Alkylmorpholin. Als typische Vertreter sind zu nennen Imidazol, Pyridin, N-Methylmorpholin, Anilin und o-Diaminobenzol, sowie Polyvinylpyridin.
  • Die im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzte Menge Base reicht von einer katalytischen Menge bis zu höheren Mengen, beispielsweise bis zu äquivalenten Mengen oder einem Überschuss. Eine katalytische Menge im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt im Bereich von 0,01 bis 20 Mol %, vorteilhafterweise von 0,1 bis 10 Mol %, insbesondere von 0,1 bis 5 Mol %, bezogen auf 1 Mol Nukleosid bzw. Oligonukleotid.
  • Im erfindungsgemässen Verfahren wird vorzugsweise ein Überschuss von mindestens 100 Moläquivalenten und bis zu 1000 Moläquivalenten oder mehr Hydroxylgruppen des Akzeptors pro Moläquivalent Gruppen der Formel eingesetzt.
  • Das erfindungsgemässe Verfahren kann durch die zusätzliche Verwendung von Lewissäuren in Mengen von vorzugsweise 0,01 bis 20 Mol %, vorteilhafterweise von 0,1 bis 10 Mol %, insbesondere von 0,1 bis 5 Mol %, bezogen auf 1 Mol Nukleosid bzw. Oligonukleotid wesentlich beschleunigt werden. Die erzielbare hohe Reaktionsgeschweindigkeit ist ein erheblicher Vorteil. Als Lewissäuren können zum Beispiel Metallsalze (LiCI), Borsäureester oder organische Metallkomplexe verwendet werden. Die gemeinsame Verwendung von organischer Stickstoffbase, nukleophile anorganische Base und Lewissäure im erfindungsgemässen Verfahren ist besonders vorteilhaft, da eine hohe Selektivität erzielt wird.
  • Das Verfahren wird vorteilhafterweise bei einer Temperatur von -20°C bis 55°C, besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 15°C bis 35°C, insbesondere bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • Das erfindungsgemässe Verfahren kann zum Beispiel so durchgeführtwerden, dass man zu einer Lösung oder Mischung aus Alkohol und Base ein Nukleosid oder Oligonukleotid mit Resten der Formeln I, la und Ib gibt und dieses Reaktionsgemisch ausreagieren lässt. Zur Isolierung der gewünschten Verbindungen können zum Beispiel gegebenenfalls zunächst unlösliche Bestandteile abfiltriert und dann das Lösungsmittel verdampft werden. Der Rückstand kann mit üblichen Methoden wie zum Beispiel Kristallisation oder Chromatographie gereinigt werden. In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemässen Verfahrens lässt man Abflusslösungen der Oligonukleotidsynthese direkt in eine Lösung oder Mischung aus Alkohol und Base laufen, um die im grossen Überschuss verwendeten Nukleosidbausteine zurückzugewinnen. Bei dieser Vorgehensweise wird die Abflusslösung, die eine Verbindung mit einem Rest der Formeln I, la und Ib enthält, in die Reaktionslösung oder das Reaktionsgemisch überführt, wobei zu Beginn der Reaktion ein sehr grosser Basenüberschuss auftritt und saure Bestandteile solcher Abflusslösungen neutralisiert werden können. Im Verlauf der Reaktion nimmt die Basenmenge ab und kann gegebenenfalls ersetzt werden. Diese sauren Bestandteile können vorzugsweise Tetrazol oder andere Säuren sein, die die Nukleotidkondensation gemäss des Phosphittriesterverfahrens bewirken.
  • Zur Aufarbeitung der Reaktionsgemische können die gebildeten Phosphite mit üblichen Oxidationsmitteln, zum Beispiel 12/H20/Pyridin oder S8/Pyridin zu den entsprechenden Phosphaten bzw. Thiophosphaten aufgearbeitet werden. Beim Eindampfen der Reaktionslösungen kann dann keine Rückreaktion mehr stattfinden und die Isolierung der gewünschten Produkte kann oft unter Vermeidung chromatographischer Methoden durch Extraktion erfolgen.
  • Es hat sich als zweckmässig erwiesen, die verwendete organische Stickstoffbase, zum Beispiel Imidazol, mit einer Citratpufferlösung (pH etwa 3 bis 4) mittels Extraktion zu entfernen. Hiermit erzielt man eine praktisch vollständige Abtrennung und eine gute Phasentrennung bei einer wässrigen Aufarbeitung.
  • In einer besonderen Ausführungsform wird Cyanoethanol als Akzeptor eingesetzt, wenn die Nukleoside bzw. Oligonukleotide an ein festes Trägermaterial gebunden sind und eine H-Phosphonat- oder H-Phosphinatgruppe enthalten und in Anwesenheit einer organischen Stickstoffbase umgesetzt werden. Hierbei werden Biscyanoethylphosphit bzw. Cyanoethyl-methylphosphinat gebildet, die mit schwach basischen polymeren lonenaustauschem irreversibel umgesetzt werden. Die entstehenden Phosphorverbindung bleiben durch Salzbildung am lonenaustauscher gebunden und gleichzeitig wird das gebildete Acrylnitril vom lonenaustauscher abgefangen. Mit dieser Ausführungsform wird eine Rückreaktion während des Umesterungsverfahrens vermieden und es können besonders hohe Akzeptorüberschüsse vermieden werden.
  • Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher. Die in den Beispielen 2, 5 und 7 verwendeten Abflusslösungen werden folgendermassen erhalten: Die Abflusslösungen eines Festphasenoligonukleotidsynthesereaktors werden gemäss des Verfahrens von Gao et al. (Gao, H., Gaffney, B.L., Jones, R.A., Tetrahedron Lett., im Druck, 1991) aufgefangen. Die Abflusslösungen fliessen direkt nach dem Austritt aus dem Reaktor nach Nukleosiden getrennt in eine Lösung aus 50 ml Methanol/Acetonitril 2:1.
    • Beispiel 1: Darstellung von 5'-Dimethoxytritylthymidin aus Dimethoxytritylthymidin-3'yl-ß-cyanoethylphos- phordiisopropylamidit
  • Zu einer Lösung aus 360 mg (0,48 mMol) Dimethoxytritylthymidin-3'-yl-ß-cyanoethylphosphordiisopro- pylamidit in 4 ml Acetonitril werden 270 mg (3,86 mMol) Tetrazol und 9 f..ll (0,5 mMol) Wasser hinzugegeben. Nach 5 Minuten ist die Hydrolyse des Phosphoramidits abgeschlossen und man erhält das 5'-Dimethoxytritylthymidin-3'-cyanoethyl-hydrogenphosphonat.
  • Dieser Lösung werden 4 ml Methanol und 350 mg Imidazol zugesetzt. Nach 24 Stunden wird die Reaktionslösung im Vakuum eingampft. Man erhält einen weissen bis schwach gelben Feststoff, der in 50 ml Dichlormethan aufgenommen wird.
  • Es folgen Extraktionen mit je 50 ml Wasser und Natriumhydrogencarbonat. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Man filtriert das Salz und eventuelle Imidazolreste ab. Das Rohprodukt wird eingedampft und durch Flashchromatographie (Still, W.C., Kahn, M., Mitra, A., J. Org. Chem. 43:2923, 1978) aufgetrennt. Die Produktfraktionen werden vereinigt und eingeengt. Anschliessend werden sie mit 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 50 ml 1 M Triethylammonium-hydrogencarbonat extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Das Salz wird abfiltriert und auf 1 ml im Vakuum eingeengt. Die konzentrierte Produktlösung wird bei Raumtemperatur in 50 ml n-Pentan ausgefällt. Die Fällung wird durch Zugabe von 200 ml n-Pentan und nachfolgendem Abkühlen auf-20°C vervollständigt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 50 ml n-Pentan gewaschen und im Vakuum über P401OKOH getrocknet. Das erhaltene Produkt ist 5'-Dimethoxytritylthymidin (5'-Dimethoxytritylthymidin: 431 mg, 82,5 % der Trockenmasse).
    • Beispiel 2: Darstellung von 5'-Dimethoxytritylthymidin aus der Abflusslösung eines Oligonukleotidsynthesereaktors
  • In 50 ml einer Lösung aus 1 g Imidazol in Methanol laufen 100 ml einer im Verlauf der DNA-Synthese anfallenden Abflusslösung des Reaktors ein, die 0,24 mMol 5'-Dimethoxytritylthymidin-3'-yl-ß-cyanoethylphosphonat enthält. Nach Abschluss der Reaktion wird die Reaktionslösung im Vakuum getrocknet. Man erhält einen weissen bis schwach gelben Feststoff, der in 100 ml Dichlormethan aufgenommen wird. Es folgen drei Extraktionen mit je 100 ml 1 M NaH2POJNaHP04, pH 5,5. Die vereinigte wässrige Phase wird mit 50 ml Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und anschliessend zwei Extraktionen mit je 100 ml gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung unterworfen. Die Natriumhydrogencarbonatphase wird mit 50 ml Dichlormethan extrahiert und alle organischen Phasen vereinigt. Die vereinigte organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Es folgt eine Umkristallisation aus 5 ml Benzol, die durch Abkühlen auf-20°C vervollständigt wird. Anschliessend werden 50 ml n-Hexan zugesetzt und die Kristallisation bei -20°C für 20 Stunden weitergeführt. Man filtriert den Niederschlag ab, wäscht ihn mit 50 ml n-Hexan und trocknet ihn anschliessend im Vakuum über P401O/KOH. Das erhaltene Produkt ist 5'-Dimethoxytritylthymidin (5'-Dimethoxytritylthymidin: 131 mg, 99 % der Trockenmasse bei 100 % Internukleotidkopplung im Synthesizer).
    • Beispiel 3: Darstellung von 2-i-Butyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyguanosin aus 2-i-Butyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyguanosin -3'-yl-ß-cyanoethylphosphordiisopropylamidit
  • Zu einer Lösung aus 839 mg (1 mMol) 2-i-Butyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyguanosin-3'-yl-ß-cyanoet- hylphosphordiisopropylamidit in 8 ml Acetonitril werden 350 mg (5 mMol) Tetrazol und 18 µl (1 mMol) Wasser hinzugegeben. Nach 5 Minuten ist die Hydrolyse des Phosphoramidits abgeschlossen und man erhält das 5'-Dimethoxytritylguanosin3'-cyanoethyl-hydrogenphosphonat.
  • Dieser Lösung werden 4 ml Methanol und 350 mg Imidazol zugesetzt. Nach 24 Stunden wird die Reaktionslösung im Vakuum eingedampft. Man erhält einen weissen bis schwach gelben Feststoff, der in 50 ml Dichlormethan aufgenommen wird.
  • Es folgen Extraktionen mit je 50 ml Wasser und Natriumhydrogencarbonat. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Man filtriert das Salz und eventuelle Imidazolreste ab. Das Rohprodukt wird eingedampft und durch Flaschromatographie aufgetrennt. Die Produkfraktionen werden vereinigt und eingeengt. Anschliessend werden sie mit 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 50 ml 1 M Triethylammonium-hydrogencarbonat extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Das Salz wird abfiltriert und auf 1 ml im Vakuum eingeengt. Die konzentrierte Produktlösung wird bei Raumtemperatur in 50 ml n-Pentan ausgefällt. Die Fällung wird durch Zugabe von 450 ml n-Pentan und nachfolgendem Abkühlen auf-20°C vervollständigt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 100 ml n-Pentan gewaschen und im Vakuum über P401O/KOH getrokknet. Das erhaltene Produkt ist 2-i-Butyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyguanosin (2-i-Butyryl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyguanosin: 577 mg, 90,3 % der Trockenmasse).
    • Beispiel 4: Darstellung von 6-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyadenosin aus 6-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyadenosin-3'-yl-ß-cyanoethylphosphordiisopropylamidit it
  • Zu einer Lösung aus 857 mg (1 mMol) 6-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyadenosin-3'-yl-ß- cyanoethylphosphordiisopropylamidit in 8 ml Acetonitril werden 350 mg (5 mMol) Tetrazol und 18 µl (1 mMol) Wasser hinzugegeben. Nach 5 Minuten ist die Hydrolyse des Phosphoramidits abgeschlossen und man erhält das 5'-Dimethoxytrityladenosin-3'-cyanoethyl-hydrogenphosphonat.
  • Dieser Lösung werden 4 ml Methanol und 350 mg Imidazol zugesetzt. Nach 24 Stunden wird die Reaktionslösung im Vakuum eingedampft. Man erhält einen weissen bis schwach gelben Feststoff, der in 50 ml Dichlormethan aufgenommen wird.
  • Es folgen Extraktionen mit je 50 ml Wasser und Natriumhydrogencarbonat. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet Man filtriert das Salz und eventuelle Imidazolreste ab. Das Rohprodukt wird eingedampft und durch Flashchromatographie aufgetrennt. Die Produktfraktionen werden vereinigt und eingeengt. Anschliessend werden sie mit 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 50 ml 1 M Triethylammonium-hydrogencarbonat extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Das Salz wird abfiltriert und auf 1 ml im Vakuum eingeengt. Die konzentrierte Produktlösung wird bei Raumtemperatur in 50 ml n-Pentan ausgefällt. Die Fällung wird durch Zugabe von 450 ml n-Pentan und nachfolgendem Abkühlen auf -20°C vervollständigt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 100 ml n-Pentan gewaschen und im Vakuum über P401O/KOH getrokknet. Das erhaltene Produkt ist 6-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyadenosin-(6-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyadenosin: 562 mg, 85,5 % der Trockenmasse).
    • Beispiel 5: Darstellung von 6-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyadenosin aus der Abflusslösung eines Oligonukleotidsynthesereaktors
  • In 50 ml einer Lösung aus 1 g Imidazol in Methanol laufen 300 ml einer im Verlauf der DNA-Synthese anfallenden Abflusslösung des Reaktors ein, die 0,82 mmol 6-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyadenosin-3'-yl-ß-cyanoethylphosphonat enthält. Nach Abschluss der Reaktion wird die Reaktionslösung im Vakuum getrocknet. Man erhält einen weissen bis schwach gelben Feststoff, der in 100 ml Dichlormethan aufgenommen wird. Es folgen drei Extraktionen mit je 50 ml 1 M NaH2PO4/NaHPO4, pH 5,5. Die vereinigte wässrige Phase wird mit 50 ml Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und anschliessend zwei Extraktionen mit je 100 ml gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung unterworfen. Die Natriumhydrogencarbonatphase wird mit 50 ml Dichlormethan extrahiert und alle organischen Phasen vereinigt. Die vereinigte organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Das Rohprodukt wird eingedampft und durch Flashchromatographie aufgetrennt. Die Produktfraktionen werden vereinigt und eingeengt. Anschliessend werden sie mit 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 50 ml 1 M Triethylammonium-hydrogencarbonat extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Das Salz wird abfiltriert und auf 1 ml im Vakuum eingeengt. Die konzentrierte Produktlösung wird bei Raumtemperatur in 50 ml n-Pentan aüsgefällt. Die Fällung wird durch Zugabe von 200 ml n-Pentan und nachfolgendem Abkühlen auf-20°C vervollständigt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 50 ml n-Pentan gewaschen und im Vakuum über P401O/KOH getrocknet. Das erhaltene Produkt ist 6-Benzoyl- 5'-dimethoxytrityl-2'-desoxyadenosin(6-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'- desoxyadenosin: 380 mg, 75,5 % der Trockenmasse bei 100 % Internukleotidkopplung im Synthesizer).
    • Beispiel 6: Darstellung von 4-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxycytidin aus 4-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxycytidin-3'-yl-β-cyanoethylphosphordiisopropylamid
  • Zu einer Lösung aus 833 mg (1 mMol) 4-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxycytidin-3'-yl-ß- cyanoethylphosphordiisopropylamidit in 8 ml Acetonitril werden 350 mg (5 mMol) Tetrazol 1 und 18 µl (1 mMol) Wasser hinzugegeben. Nach 5 Minuten ist die Hydrolyse des Phosphoramidits abgeschlossen und man erhält das 5'-Dimethoxytritylcytidin-3'-cyanoethyl-hydrogenphosphonat.
  • Dieser Lösung werden 4 ml Methanol und 350 mg Imidazol zugesetzt. Nach 24 Stunden wird die Reaktionslösung im Vakuum eingedampft. Man erhält einen weissen bis schwach gelben Feststoff, der in 50 ml Dichlormethan aufgenommen wird.
  • Es folgen Extraktionen mit je 50 ml Wasser und Natriumhydrogencarbonat. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Man filtriert das Salz und eventuelle Imidazolreste ab. Das Rohprodukt wird eingedampft und durch Flashchromatographie aufgetrennt. Die Produktfraktionen werden vereinigt und eingeengt. Anschliessend werden sie mit 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 50 ml 1 M Triethylammonium-hydrogencarbonat extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Das Salz wird abfiltriert und auf 1 ml im Vakuum eingeengt. Die konzentrierte Produktlösung wird bei Raumtemperatur in 50 ml n-Pentan ausgefällt. Die Fällung wird durch Zugabe von 450 ml n-Pentan und nachfolgendem Abkühlen auf -20°C vervollständigt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 100 ml n-Pentan gewaschen und im Vakuum über P4O10/KOH getrokknet. Das erhaltene Produkt ist 4-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxycytidin (4-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxycytidin: 527 mg, 83,2 % der Trockenmasse).
    • Beispiel 7: Darstellung von 4-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxycytidin aus der Abflusslösung eines Oligonukleotidsynthesereaktors
  • In 50 ml einer Lösung aus 1 g Imidazol in Methanol laufen 100 ml einer im Verlauf der DNA-Synthese anfallenden Abflusslösung des Reaktors ein, die 0,27 mmol 4-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxycytidin-3'-yl-β-cyanoethylphosphonat enthält. Nach Abschluss der Reaktion wird die Reaktionslösung im Vakuum getrocknet. Man erhält einen weissen bis schwach gelben Feststoff, der in 100 ml Dichlormethan aufgenommen wird. Es folgen drei Extraktionen mit je 50 ml 1 M NaH2PO4/NaHPO4, pH 5,5. Die vereinigte wässrige Phase wird mit 50 ml Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt und anschliessend zwei Extraktionen mit je 100 ml gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung unterworfen. Die Natriumhydrogencarbonatphase wird mit 50 ml Dichlormethan extrahiert und alle organischen Phasen vereinigt. Die vereinigte organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Das Rohprodukt wird eingedampft und durch Flashchromatographie aufgetrennt. Die Produktfraktionen werden vereinigt und eingeengt. Anschliessend werden sie mit 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 50 ml 1 M Triethylammonium-hydrogencarbonat extrahiert. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet. Das Salz wird abfiltriert und auf 1 ml im Vakuum eingeengt. Die konzentrierte Produktlösung wird bei Raumtemperatur in 50 ml n-Pentan ausgefällt. Die Fällung wird durch Zugabe von 200 ml n-Pentan und nachfolgendem Abkühlen auf-20°C vervollständigt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit 50 ml n-Pentan gewaschen und im Vakuum über P401O/KOH getrocknet. Das erhaltene Produkt ist4-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxycytidin (4-Benzoyl-5'-dimethoxytrityl-2'-desoxycytidin: 163 mg, 91 % der Trockenmasse bei 100 % Internukleotidkopplung im Synthesizer).
  • Beispiel 8: Darstellung von N-Methyl,N-(5'-Dimethoxytrityl-3'- deoxythymid-3'-yl)-(5'-deoxythymid-5'-yl)acetamid aus der Abflusslösung eines Oligonucleotidsynthesereaktors.
  • In 50 ml einer Lösung aus 1 g Imidazol in Methanol laufen 5 ml einer im Verlauf der DNA-Synthese anfallenden Abflusslösung des Reaktors ein, die 160 mg N-Methyl,N-(5'-Dimethoxytrityl-3'-deoxythymid-3'-yl)-(3'cyanoethyl-H-phosphonyl-5'-deoxythymid- 5'-yl)acetamid enthält. Man lässt drei Tage bei 20-25°C reagieren. Die Reaktionsmischung wird mit 5ml Wasser versetzt. Anschliessend wird eine so grosse Menge einer Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200ml Pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran der Reaktionsmischung zugegeben, bis die braune Jodfarbe für mindestens 5 Minuten bestehen bleibt. Die Reaktionsmischung wird bis zu einem gelblichen Feststoff im Vakuum eingedamft. Man nimmt in einer Emulsion aus 100 ml 40% wässriger NaHSO3 und 50 ml Ethylacetat auf. Man trennt die wässrige Phase ab und extrahiert die organische Phase erneut zwei mal mit je 50 ml wässriger Natriumhydrogencarbonat Lösung. Die wässrigen Phasen werden vereinigt und erneut mit 10 ml Ethylacetat exrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, 2mal mit je 50 ml 1 M wässrigem MgS04 extrahiert und anschliessend über 2g trokkenem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren des Salzes wird das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man nimmt den Feststoff in 5ml CH-Cl3/Methanol(9:1) auf und chromatographiert über einer Kieselgelsäule. Die Produktfraktionen werden vereinigt und am Hochvakuum getrocknet. Das Produkt N-Methyl,N-(5'-Dimethoxytrityl-3'-deoxythymid-3'-yl)-(5'-deoxythymid-5'-yl)acetamid fällt als weisser Schaum in einer Ausbeute von 40 mg (31 % d. Th.) an. 1H-NMR: (CDCl3, Standard = TMS, d[ppm]): 8,8: 2s, NH; 7,7: s, 1H, H6; 7,45-7,2: DMTr; 7,09: s, 1H, H6; 6,82: 2m, 4H, DMTr; 6,33: t, 1H, 1'; 6,15: t,1H, 1'; 5,26, 4,95: m, 1H, 3' am NRCH3, 2 Rotamere 3:1; 4,25-4: m, 2H; 3,75: s, 6H, DMTr; 3,63, 3,4, 3,25: 3m, 4H; 2,9, 2,85: 2s, 3H, CH3 von NRCH3, 2 Rotamere: 3:1; 2,65-2: m; 1,88: 2H, 1,8: 1 H, 2s, CH3 5, 2 Rotamere: 3:1; 1,5: 1 H, 1,45; 2H, 2s, CH3 5, 2 Rotamere: 1:3.
  • Beispiel 9: Darstellung von 5'-Dimethoxytrityl-N6-pivaloyl-2'(-1-(2-fluorophenyl)-4-methoxy-piperid-4-yl)-adenosin aus der Abflusslösung eines Oligonucleotidsynthesereaktors.
  • In 50 ml einer Lösung aus 1 g Imidazol in Methanol laufen 5 ml einer im Verlauf der DNA-Synthese anfallenden Abflusslösung des Reaktors ein, die 160 mg N-Methyl,N-(5'-Dimethoxytrityl-3'-deoxythymid-3'-yl)-(3'cyanoethyl-H-phosphonyl-5'-deoxythymid-5'-yl)acetamid enthält. Man lässt drei Tage bei 20-25°C reagieren. Die Reaktionsmischung wird mit 5ml Wasser versetzt. Anschliessend wird eine so grosse Menge einer Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200ml Pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran der Reaktionsmischung zugegeben, bis die braune Jodfarbe für mindestens 5 Minuten bestehen bleibt. Die Reaktionsmischung wird bis zu einem gelblichen Feststoff im Vakuum eingedamft. Man nimmt in einer Emulsion aus 100 ml 40% wässriger NaHSO3 und 50 ml Ethylacetat auf. Man trennt die wässrige Phase ab und extrahiert die organische Phase erneut zwei mal mit je 50 ml wässriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung. Die wässrigen Phasen werden vereinigt und erneut mit 10 ml Ethylacetat exrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, 2mal mit je 50 ml 1 M wässrigem MgS04 extrahiert und anschliessend über 2g trokkenem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren des Salzes wird das Fitrat im Vakuum zur Trockne eingeengt wobei man 320 mg Rohprodukt erhält. Man nimmt den Feststoff in 5ml CH-Cl3/Methanol(9:1) auf und chromatographiert über einer Kieselgelsäule. Die Produktfraktionen werden vereinigt und am Hochvakuum getrocknet. Das Produkt 5'-Dimethoxytrityl-N6- pivaloyl-2'(-1-(2-fluorophenyl)-4-methoxy-piperid-4-yl)-adenosin fällt als ein gelbes Öl in einer Ausbeute von 233 mg (58 % d. Th.) an. 1H-NMR: (CDCl3, Standard = TMS, d[ppm]): 8,69: s, 1 H, Adenin; 8,48: s, 1 H, Adenin; 8,2: s, 1 H, Adenin; 7,5-7,2: m, 9H, DMTr; 7,12-6,88: m, 4H, 2-Fluorophenyl; 6,83: 2m, 4H, DMTr; 6,25: d, 1 H, 1'; 5,35; m; 4,43: m, 1 H; 4,3; m, 1 H; 3,76: s, 6H; 3,5, 3,38: 2m, 2H, 5'; 3,15: m, 1 H, Fpmp; 2,96: m, 2H; Fpmp; 2,78: s, 3H, CH3 von Fpmp, m, 1H, FPMP; 2,15-1,75: m, 4H, Fpmp; 1,4: 9H: Piv.
  • Beispiel 10: Darstellung von 5'-Dimethoxytrityl-2'(-1-(2-fluorophenyl)-4-methoxy-piperid-4-yl)-uridin aus dem Hydrolysat des 5'-Dimethoxytrityl-2'(-1-(2-fluorophenyl)-4-methoxy-piperid-4-yl)-uridin-3'-yl-cyanoetyl- phosphorodiisopropylamidits; Umesterung mit Methanol und KF, I2/H2O als Quenchlösung ohne 12-Fänger bei der Aufarbeitung.
  • In 50 ml einer 0,1M methanolischen KF-Lösung lässt man 10 ml einer Lösung von 0,138 mmol 5'-Dimethoxytrityl-2'(-1-(2-fluorophenyl)-4-methoxy-piperid-4-yl)-uridin-3'-yl-cyanoethyl-H-phosphonat und 0,694mmol Tetrazol in Acetonitrileinfliessen. Die Reaktion ist innerhalb 2 Tagen bei 20-25°C beendet. Die Reaktionsmischung wird mit 5ml Wasser versetzt. Anschliessend wird eine so grosse Menge einer Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200m1 Pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran der Reaktionsmischung zugegeben, bis die braune Jodfarbe für mindestens 5 Minuten bestehen bleibt. Die Reaktionsmischung wird bis zu einem gelblichen Feststoff im Vakuum eingedampft. Man nimmt in einer Emulsion aus 50 ml Wasser und 50 ml Ethylacetat auf. Man trennt die wässrige Phase ab und extrahiert die organische Phase erneut vier mal mit je 50 ml Wasser. Die wässrigen Phasen werden vereinigt und erneut mit 10 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit je 50 ml gesättigter NaCI-Lösung extrahiert und anschliessend über 2g trockenem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren des Salzes wird das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man nimmt den Feststoff in 5-10 ml Ethylacetat auf und lässt die so erhaltene Lösung in 200 ml n-Pentan langsam einfliessen. Das Produkt fällt hierbei als weisser amorpher Niederschlag an. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und anschliessend mit 50 ml n-Pentan gewaschen. Nach dem Trockenen über P401O/KOH für 24 Stunden im Vakuum erhält man 67,7 mg (69 % d. T.) der Verbindung 5'-Dimethoxytrityl-2'-(-1-(2-fluorophenyl)-4-methoxy-piperid-4 -yl)-uridin (75 % d. Th.) an.
  • 1H-NMR; (CDCl3, Standard = TMS, d[ppm]); 7,75; d, 1 H, H6; 7,45-7,15; m, 9H, DMTr; 7,1-6,75: m, 4H, Fpmp, 2m, 4H, DMTr; 6,15: d, 1 H, 1'; 5,2: d, 1 H, H5; 4,74: m, 1 H, 2'; 4,33: m, 1 H, 3'; 4,15: m, 1 H, 4'; 3,76: s, 6H, DMTr; 3,38: m, 2H, 5'; 3,12: s, 3H, CH3 von Fpmp; 3,2-2,8: m, 4H, Fpmp; 2,15-1,8: m, 4H.
    • Beispiel 11: Darstellung von 5'-Dimethoxytrityl-N4-benzoyl-2'-(1-(2-fluorophenyl)-4-methoxy-piperid-4-yl)-cytidin aus dem Hydrolysat des 5'-Dimethoxytrityl-N4-benzoyl-2'-(1 -(2-fluorophenyl)-4-methoxy-piperid-4-yl)-cytidin-3'-yl-cyanoetylphosphorodiisopropylamidits
  • In 50 ml eine 0,1 M methanolische KF-Lösung lässt man 10 ml einer Lösung von 0,129 mmol 5'-Dimethoxytrityl-N4-benzoyl-2'-(1-(2-fluorophenyl)-4-methoxy-piperid-4-yl)-cytidin-3'-yl-cyanoet hyl-H-phosphonat und 0,645 mmol Tetrazol in Acetonitril einfliessen. Die Reaktion ist innerhalb 2 Tagen bei 20-25°C beendet. Die Reaktionsmischung wird mit 5ml Wasser versetzt. Anschliessend wird eine so grosse Menge einer Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200ml pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran der Reaktionsmischung zugegeben, bis die braune Jodfarbe für mindestens 5 Minuten bestehen bleibt. Die Reaktionsmischung wird zu einem gelblichen Feststoff im Vakuum eingedamft. Man nimmt in einer Emulsion aus 50 ml Wasser und 50 ml Ethylacetat auf. Man trennt die wässrige Phase ab und extrahiert die organische Phase erneut vier mal mit je 50 ml Wasser. Die wässrigen Phasen werden vereinigt und erneut mit 10 ml Ethylacetat etrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit je 50 ml gesättigter NaCI-Lösung extrahiert und anschliessend über 2g trockenem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren des Salzes wird das Fitrat im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man nimmt den Feststoff in 5-10 ml Ethylacetat auf und lässt die so erhaltene Lösung in 200 ml n-Pentan langsam einfliessen. Das Produkt fällt hierbei als weisser amorpher Niederschlag an. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und anschliessend mit 50 ml n-Pentan gewaschen. Nach dem Trockenen über P401O/KOH für 24 Stunden im Vakuum erhält man 83 mg (69 % d. T.) der Verbindung 5'-Dimethoxytrityl-N4-benzoyl-2'-( 1-(2-fluorophenyl)-4-methoxy-piperid-4-yl)-cytidin (80 % d. Th.) an.
  • 1H-NMR: (CDCl3, Standard = TMS, d[ppm]): 8,28: d, 1 H; 7,82: d, 2H, Bz; 7,6-7,23: m, 14H, Bz, DMTr, C; 7,03-6,77: d, 4H, DMTr, 2d, 4H, Fpmp; 4,66: t, 1 H, 1'; 4,38: t, 1 H, 2'; 4,17: m, 1 H, 3', 3,74: s, 6H, DMTr; 3,48: m, 2H, 5'; 3,25-2,85: s, 3H, CH3, Fpmp, m, 4H, Fpmp; 2,18-1,95: m, 4H, Fpmp.19F-NMR: (CDCl3, Standard = TFA, d[ppm]): -123,5.
  • Beispiel 12: Darstellung von 5'-Dimethoxytrityl-N4-(4-tert.-butylphenoxyacetyl)-2'-deoxycytidin aus dem Hydrolysat des 5'-Dimethoxytrityl-N4-(4-tert.-butylphenoxyacetyl)2'-deoxycytidin-3'-yl-cyanoethyl-phospho- rodiisopropylamidits.
  • In 40 ml eine 0,2M methanolische KF Lösung lässt man 4 ml einer acetonitrilischen Lösung, die 200 mg 5'-Dimethoxytrityl-N4-(4-tert.-butylphenoxyacetyl)-2'-deoxycy tidin aus dem Hydrolysat des 5'-Dimethoxytrityl-N4-(4-tert.-butylphenoxyacetyl)-2'-deoxycytidin-3'-yl-cyanoethyl-H- phosphonat und 2 mmol Tetrazol enthalten einfliessen. Die Dephosphitylierung ist binnen 4 Stunden bei 20-25°C beendet. Die Reaktionsmischung wird nun mit 1 ml Pyridin, dann mit 50 mg Schwefel versetzt. Nach 60 minütigem Rühren bei 20-25°C wird die Reaktionsmischung filtriert und dann auf 100 ml Eiswasser gegossen. Man extrahiert die hieraus resultierende Emulsion drei mal mit je 30 ml Ethylacetat. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit je 50 ml gesättigter NaCI-Lösung extrahiert und anschliessend über 2g trockenem Natriumsulfat getrocknet Nach dem Abfiltrieren des Salzes wird das Fitrat im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man nimmt den Feststoff in 10 ml Ethylacetat auf und lässt die so erhaltene Lösung in 300 ml n-Hexan langsam einfliessen. Das Produkt fällt hierbei als weisser amorpher Niederschlag an. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und anschliessend mit 50 ml n-Pentan gewaschen. Nach dem Trockenen über P401O/KOH für 24 Stunden im Vakuum erhält man 112,8 mg (72,1 % d. Th.) der Verbindung 5'-Dimethoxytrityl- N4-(4-tert.-butylphenoxy-acetyl)-2'-deoxycytidin.
    • Beispiel 13: Umesterung mit Imidazol, Quenchmittel mit 12/Wasser, Aufarbeitung mit Citratpuffer: Darstellung von 5'-Dimethoxytrityl-(3-N-trifluoroacetylaminopropyl)-2'-deoxyuridin aus der Abflusslösung eines Oligonucleotidsynthesereaktors.
  • In 80 ml einer Lösung aus 1 g Imidazol pro 50 ml Methanol laufen 5 ml einer im Verlauf der DNA-Synthese anfallenden Abflusslösung des Reaktors ein, die 120 mg 5'-Dimethoxytrityl-(3-N-trifluoroacetylaminopropyl)-2'-deoxyuridin-3'-yl-cyanoethyl-H-phosphonat enthält. Man lässt die Mischung drei Tage bei 20-25°C reagieren. Die Reaktionsmischung wird nun mit 8 ml Wasserversetzt. Anschliessend wird eine sogrosse Menge einer Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200ml Pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran der Reaktionsmischung zugegeben, bis die braune Jodfarbe für mindestens 5 Minuten bestehen bleibt. Die Reaktionsmischung wird zu einem gelblichen Feststoff im Vakuum eingedamft. Man nimmt in einer Emulsion aus 50 ml pH:3-4 Puffer und 40 ml Ethylacetat auf. Der hierbei verwendete Puffer besteht aus 24g NaOH, 117g Zitronensäure und 35g Natriumchlorid pro Liter wässriger Lösung. Man trennt die Imidazol enthaltende wässrige Phase ab und extrahiert die organische Phase erneut zwei mal mit je 50 ml der Pufferlösung. Anschliessend folgt eine Extraktion der organischen Phase mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat Lösung und danach mit 50 ml gesättigter Kochsalz-Lösung. Die organische Phase wird anschliessend über 2g trockenem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren des Salzes wird das Fitrat im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man nimmt den Feststoff in 5-10 ml Ethylacetat auf und lässt die so erhaltene Lösung in 250 ml n-Pentan langsam einfliessen. Das Produkt fällt hierbei als weisser amorpher Niederschlag an. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und anschliessend mit 50 ml n-Pentan gewaschen. Nach dem Trockenen über P401O/KOH für 24 Stunden im Vakuum erhält man 80 mg (86% d. Th.) der Verbindung 5'-Dimethoxytrityl-(3-Ntrifluoroacetylaminopropyl)-2'-deoxyu- ridin.
  • 1H-NMR(CDCl3, Standard = TMS, d[ppm]): 7,45-6,9: m, 9H, DMTr; 6,73: 2m, 4H, DMTr; 6,48: t, 1H, 1'; 4,56: m, 1 H, 3'; 4,04: m, 1 H, 4'; 3,7: s, 6H, DMTr; 3,5-3,4: 2m, 3,35-3,25: 2m, 2H, 5'; 2,97: s, 2H, NH2; 2,47-2,37 m, 1 H, 2'; 2,35-2,2 m, 1 H, 2'; 1,82, m, 1 H; 1,6,m, 1H; 1,45-1,15, m, 4H, Aminopropyl.
    • Beispiel 14: Darstellung von 5'-Dimethoxytrityl-(propin-1-yl)-2'-deoxyuridin aus der Abflusslösung eines Oligonucleotidsynthesereaktors.
  • In 67 ml einer Lösung aus 1 g Imidazol pro 50 ml Methanol laufen 5 ml einer im Verlauf der DNA-Synthese anfallenden Abflusslösung des Reaktors ein, die 250 mg 5'-Dimethoxytrityl-(propin-1-yl)-2'-deoxyuridin-2'-de- oxyuridin-3'-yl-cyanoethyl-H-phosphonat enthält. Man lässt drei Tage bei 20-25°C reagieren. Die Reaktionsmischung wird nun mit 8 ml Wasser versetzt. Anschliessend wird eine so grosse Menge einer Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200ml Pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran der Reaktionsmischung zugegeben, bis die braune Jodfarbe für mindestens 5 Minuten bestehen bleibt.Die Reaktionsmischung wird zu einem gelblichen Feststoff im Vakuum eingedamft. Man nimmt in einer Emulsion aus 50 ml pH:3-4 Puffer und 35 ml Ethylacetat auf. Der hierbei verwendete Puffer besteht aus 24g NaOH, 117g Zitronensäure und 35g Natriumchlorid pro Liter wässriger Lösung. Man trennt die Imidazol enthaltende wässrige Phase ab und extrahiert die organische Phase erneut zwei mal mit je 50 ml der Pufferlösung. Anschliessend folgt eine Extraktion der organischen Phase mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat Lösung und danach mit 50 ml gesättigter Kochsalz Lösung. Die organische Phase wird anschliessend über 2g trockenem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren des Salzes wird das Fitrat im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man nimmt den Feststoff in 5-10 ml Ethylacetat auf und lässt die so erhaltene Lösung in 250 ml n-Pentan langsam einfliessen. Das Produkt fällt hierbei als weisser amorpher Niederschlag an. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und anschliessend mit 50 ml n-Pentan gewaschen. Nach dem Trockenen über P4O10/KOH für 24 Stunden im Vakuum erhält man 125 mg (68 % d. Th.) der Verbindung 5'-Dimethoxytrityl-(propin-1-yl)-2'-deoxyuridin.
  • 1H-NMR(CDCl3, Standard = TMS, d[ppm]): 7,95: s, 1 H, NH; 7,4-7,15: m, 10H, DMTr; 6,78: 2s, 4H, DMTr; 6,24: t, 1 H, 1'; 4,5: m, 3'; 4,06: m, 4'; 3,73: s, 6H, DMTr, 3,28: m, 2H, 5'; 2,43: m, 1 H, 2'; 2,22: m, 1 H, 2'; 1,61: s, 3H, CH3 von propinyl.
    • Beispiel 15: Darstellung von 5'-Dimethoxytrityl-(3-trifluoroaminopropin-1-yl)-2'-deoxyuridin aus der Abflusslösung eines Oligonucleotidsynthesereaktors.
  • In 78 ml einer Lösung aus 1 g Imidazol pro 50 ml Methanol laufen 5 ml einer im Verlauf der DNA-Synthese anfallenden Abflusslösung des Reaktors ein, die 200 mg 5'-Dimethoxytrityl-(3-aminopropin-1-yl)-2'-deoxyuri- din-2'-deoxyuridin-3'-yl-cyanoethyl-H-phosphonat enthalten. Man lässt drei Tage bei 20-25°C reagieren. Die Reaktionsmischung wird nun mit 7,8 ml Wasser versetzt. Anschliessend wird eine so grosse Menge einer Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200m1 Pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran der Reaktionsmischung zugegeben, bis die braune Jodfarbe für mindestens 5 Minuten bestehen bleibt. Die Reaktionsmischung wird zu einem gelblichen Feststoff im Vakuum eingedamft. Man nimmt ihn in einer Emulsion aus 50 ml pH-3-4 Puffer und 40 ml Ethylacetat auf. Der hierbei verwendete Puffer besteht aus 24g NaOH, 117g Zitronensäure und 35g Natriumchlorid pro Liter wässriger Lösung. Man trennt die Imidazol enthaltende wässrige Phase ab und extrahiert die organische Phase erneut zwei mal mit je 50 ml der Pufferlösung. Anschliessend folgt eine Extraktion der organischen Phase mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat Lösung und danach mit 50 ml gesättigter Kochsalz Lösung. Die organische Phase wird anschliessend über 2g trockenem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren des Salzes wird das Fitrat im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man nimmt den Feststoff in 5-10 ml Ethylacetat auf und lässt die so erhaltene Lösung in 250 ml n-Pentan langsam einfliessen. Das Produkt fällt hierbei als weisser amorpher Niederschlag an. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und anschliessend mit 50 ml n-Pentan gewaschen. Nach dem Trockenen über P401O/KOH für 24 Stunden im Vakuum erhält man 113 mg (73 % d. Th.) der Verbindung 5'-Dimethoxytrityl-(3-trifluoroacetylaminopropin1-yl)-2'-deoxyuridin. 1H-NMR(CDCl3, Standard = TMS, d[ppm]): 8,15: s, 1H, NH; 7,4-7,15: 10H, DMTr, H6; 6,26: t, 1H, 1'; 4,53: m, 1 H, 3'; 3,97: m, 2H, 5';3,73; s, 6H, DMTr; 3,3; m, 2H, CH2 von Propinyl; 2,48, m, 1 H, 2'; 2,25: m, 1 H, 2'.
    • Beispiel 16: Darstellung von N-5'-Dimethoxytrityl-3'-deoxythymidin-3'-yl,N-propyl-3'-deoxythymid-5'-yl)-acetamid aus der Abflusslösung eines Oligonucleotid-synthesereaktors.
  • In 78 ml einer Lösung aus 1 g Imidazol pro 50 ml Methanol laufen 5 ml einer im Verlauf der DNA-Synthese anfallenden Abflusslösung des Reaktors ein, die 200 mg N-5'-Dimethoxytrityl-3'-deoxythymidin-3'-yl,N-propyl-3'-deoxythymid-3'-cyanoethyl-H-phosphonyl-5'-yl)-acetamid enthält. Man lässt sieben Tage bei 20-25°C reagieren. Die Reaktionsmischung wird nun mit 20 ml Wasser versetzt. Anschliessend wird eine so grosse Menge einer Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200 ml Pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran der Reaktionsmischung zugegeben, bis die braune Jodfarbe für mindestens 5 Minuten bestehen bleibt. Die Reaktionsmischung wird zu einem gelblichen Feststoff im Vakuum eingedamft. Man nimmt ihn in einer Emulsion aus 50 ml pH-3-4 Puffer und 40 ml Ethylacetat auf. Der hierbei verwendete Puffer besteht aus 24g NaOH, 117g Zitronensäure und 35g Natriumchlorid pro Liter wässriger Lösung. Man trennt die Imidazol enthaltende wässrige Phase ab und extrahiert die organische Phase erneut zwei mal mit je 50 ml der Pufferlösung sukzessive. Anschliessend folgt eine Extraktion der organischen Phase mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonat Lösung und danach mit 50 ml gesättigter Kochsalz Lösung. Die organische Phase wird anschliessend über 2g trockenem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren des Salzes wird das Fitrat im Vakuum zur Trockne eingeengt. Man nimmt den Feststoff in 3 ml Ethylacetat/CHCl3 (1:1, V:V) auf und lässt die so erhaltene Lösung in 600 ml n-Pentan langsam einfliessen. Das Produkt fällt hierbei als weisser amorpher Niederschlag an. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und anschliessend mit 50 ml n-Pentan gewaschen. Nach dem Trockenen über P401O/KOH für 24 Stunden im Vakuum erhält man 107 mg (66% d. Th.) der Verbindung N-5'-Dimethoxytrityl-3'-deoxythymidin-3'-yl,N-propyl-3'-deoxthymid-5'-yl)-acetamid.
  • 1H-NMR(CDCl3, Standard = TMS, d[ppm]): 1H-NMR(CDCl3, Standard = TMS, d[ppm]): 7,65: s, 1 H, H6; 7,4-7,15: m, 9H, DMTr; 7,1: s, 1H, H6; 6,77: 2s, 4H, DMTr; 6,53: t, 1H, 1'; 6,13: t, 1H, 1'; 4,28: m, 1H, 3'; 4,1: m, 2H, 3',4'; 3,72: s, 6H, DMTr; m, 1 H; 3,52: m, 4', 1 H; 3,5, d, 1 H; 3,15-2,85: m, 3H, 5', CH2 von acetamid; 2,56; m, 1 H, 2'; 2,45-2,25: m, 3H, 2' CH2 von Propyl; 2,2-2,1: 2H, 2'; 1,83: s, 3H, CH3 5; 1,45: s, 3H,CH3 5; 1,22: m, 2H, CH2 von Propyl; 0,73: t, 3H, CH3 von Propyl.
    • Beispiel 17: Darstellung von 5'-Dimethoxytrityl-3'-propyl-5-methyluridin aus der Abflusslösung eines Oligonucleotidsynthesereaktors.
  • In 100 ml einer Lösung aus 1 g Imidazol pro 50 ml Methanol laufen 5 ml einer im Verlauf der DNA-Synthese anfallenden Abflusslösung des Reaktors ein, die 400 mg 5'-Dimethoxytrityl-3'-propyl-5-methyluridin-3'-cyanoethyl-H -phosphonat enthält. Man lässt sieben Tage bei 20-25°C reagieren. Die Reaktionsmischung wird nun mit 20 ml Wasser versetzt. Anschliessend wird eine so grosse Menge einer Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200 ml Pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran der Reaktionsmischung zugegeben, bis die braune Jodfarbe für mindestens 5 Minuten bestehen bleibt. Die Reaktionsmischung wird zu einem gelblichen Feststoff im Vakuum eingedamft. Man nimmt in einer Emulsion aus 50 ml pH-3-4 Puffer und 40 ml Ethylacetat auf. Der hierbei verwendete Puffer besteht aus 24g NaOH, 117g Zitronensäure und 35g Natriumchlorid pro Liter wässriger Lösung. Man trennt die Imidazol enthaltende wässrige Phase ab und extrahiert die organische Phase erneut zwei mal mit je 50 ml der Pufferlösung. Anschliessend folgt eine Extraktion der organischen Phase mit gesättigterwässriger Natriumhydrogencarbonat Lösung und danach mit 50 ml gesättigter Kochsalz Lösung. Die organische Phase wird anschliessend über 2g trockenem Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Abfiltrieren des Salzes wird das Fitrat im Vakuum zur Trockne eingeengt. Nach dem Trockenen über P401O/KOH für 24 Stunden im Vakuum erhält man 258 mg(86% d. Th.) der Verbindung 5'-Dimethoxytrityl-3'-propyl-5-methyluridin als gelbes Öl. 1H-NMR(CDCl3, Standard = TMS, d[ppm]); 8,45: s, 1 H, NH; 7,57: s, 1 H, H6; 7,45-7,15: m, 9H, DMTr; 6,75: 2s, 4H, DMTr; 5,9: d, 1 H, 1'; 4,38; m, 1 H, 3'; 4,0: m, 1 H, 4'; 3,95: m, 1 H, 2'; 3,72: s, 6H, DMTr,; 3,8-3,4: m, 2H: propyl; 3,6-3,3: 4m, 2H, 5'; 1,56: m, 2H, propyl; 1,88: t, 3H, propyl.
    • Beispiel 18: Umesterung eines Phosphits auf einem Polymer mittels Methanol als Akzeptoralkohol
  • 685 mg eines mit Thymidin-5'-cyanoethyl-H-phosphonat derivatisierten Controlled Pore Glass (CPG), das eine Belegungdichte des Nucleosids von 36 mmol/g aufweist, wird mit 10 ml einer Lösung aus 2% N-Methylmorpholin in Methanol umgesetzt. Das Nucleosid ist hierbei übereine Succinylgruppe zu seiner 3'-OH-Gruppe mit dem CPG kovalent verbunden. Nach einer Stunde wird eine Probe von 137 mg der festen Phase aus dem Reaktionsgemisch entfernt. Der Träger wird 4 mal mit je 2 ml Acetonitril gewaschen und anschliessend miteiner Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200m1 Pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran eine Stunde umgesetzt. Anschliessend wird die feste Phase 10 mal mit je 2 ml Acetonitril, dann 10 mal mit je 2 ml Diethyletherther gewaschen. Der Träger wird getrocknet und bei 55-60°C mit konzentrierter wässriger Ammoniaklösung behandelt. Anschliessend wird die feste Phase, an der sich nun kein Nukleosid mehr befindet abfiltriert. Das Filtrat wird zunächst lyophilisiert, dann mit 0,1 M Triethylammoniumacetat bei pH 7 aufgenommen und mittels HPLC analysiert. Man erkennt ein Gemisch aus 5'-Thymidinmonophosphat, Thymidin und Thymidin-5'-methylphosphat. Das Thymidin-5'-Phosphat ist aus dem Edukt durch Jodoxidation und Ammonolyse hervorgegangen. Das Thymidin- 5'-methylphosphat ist aus einem Zwischenprodukt der Dephosphitylierung ,dem Thymidin-5-methyl-H-phosphonat bei der oxidativen und hydrolytischen Aufarbeitung hervorgegangen. Das Thymidin ist aus dem Produkt der Dephosphitylierung, dem polymer gebundenen Thymidin nach Verseifung der Succinylgruppe-Brückengruppe hervorgegangen. Die Restmenge des Trägers wird noch 36 Stunden der vorgenannten oxidativen und ammonolytischen Aufarbeitung unterzogen. Man erhält ausschliesslich Thymidin in dem Filtrat des Trägers.
    • Beispiel 19: Umesterung eines Phosphits auf einem Polymer mittels Cyanoethanol als Akzeptoralkohol
  • 139 mg eines mit Thymidin-5'-cyanoethyl-H-phosphonat derivatisierten Controlled Pore Glass (CPG), das eine Belegungdichte des Nucleosids von 36 mmol/g aufweist, wird mit 10 ml einer Lösung aus 10% N-Methylmorpholin in Cyanoethanol umgesetzt. Das Nukleosid ist hierbei über eine Succinylgruppe zu seiner 3'-OH-Gruppe mit dem CPG kovalent verbunden. Nach 100 Minuten wird der Träger 4 mal mit je 2 ml Acetonitril gewaschen und anschliessend mit einer Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200m1 Pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran eine Stunde umgesetzt. Anschliessend wird die feste Phase 10 mal mit je 2 ml Acetonitril, dann 10 mal mit je 2 ml Diethylether gewaschen. Der Träger wird getrocknet und bei 55-60°C mit konzentrierte wässriger Ammoniaklösung behandelt. Anschliessend wird die feste Phase, an der sich nun kein Nukleosid mehr befindet abfiltriert. Das Filtrat wird zunächst lyophilisiert, dann mit 0,1 M Triethylammoniumacetat pH: 7 aufgenommen und mittels HPLC analysiert. Man erkennt ein Gemisch aus 5'-Thymidinmonophosphat und Thymidin im Verhältnis 3:97. Das Thymidin-5'-Phosphat ist aus dem Edukt durch Jodoxidation und Ammonolyse hervorgegangen. Das Thymidin ist aus dem Produkt der Dephosphitylierung, dem polymer gebundenen Thymidin nach Verseifung der Succinylgruppe-Brückengruppe, hervorgegangen.
    • Beispiel 20: Umesterung eines Phosphits auf einem Polymer mittels Methanol als Akzeptoralkohol in Anwesenheit von Magnesium-di-trifluoracetat Mg(OTf)2.
  • 139 mg eines mit Thymidin-5'-cyanoethyl-H-phosphonat derivatisierten Controlled Pore Glass (CPG), das eine Belegungdichte des Nukleosids von 36 mmol/g aufweist, wird mit 10 ml einer Lösung aus 0,1 M Mg(OTf)2 in N-Methylimidazol : Methanol (1:9) umgesetzt. Das Nukleosid ist hierbei über eine Succinylgruppe zu seiner 3'-OH-Gruppe mit dem CPG kovalent gebunden. Nach 30 Minuten wird der Träger 4 mal mit je 2 ml Acetonitril gewaschen und anschliessend mit einer Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200ml Pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran eine Stunde umgesetzt. Anschliessend wird die feste Phase 10 mal mit je 2 ml Acetonitril, dann 10 mal mit je 2 ml Ether gewaschen, Der Träger wird getrocknet und bei 55-60°C mit konzentrierte wässrigerAmmoniaklösung behandelt. Anschliessend wird die feste Phase, an der sich nun kein Nukleosid mehr befindet abfiltriert. Das Filtrat wird zunächst lyophilisiert, dann mit 0,1 M Triethylammoniumacetat pH: 7 aufgenommen und mittels HPLC analysiert. Man erkennt ein Gemisch aus Thymidin und Thymidin-5'-methylphosphat. Das Thymidin -5'-methylphosphat ist aus einem Zwischenprodukt der Dephosphitylierung,dem Thymidin-5-methyl-H-phosphonat bei der oxidativen und hydrolyrischen Aufarbeitung hervorgegangen. Das Thymidin, ist aus dem Produkt der Dephosphitylierung, des polymer gebundenen Thymidin nach Verseifung der Succinylgruppe-Brückengruppe. Das Verhältnis Thymidin zu Thymidin-5'-monophosphat ist 97:3.
    • Beispiel 21: Umesterung eines Phosphits auf einemPolymer mittels Cyanoethanol als Akzeptoralkohol in Anwesenheit von LiCI.
  • 139 mg eines mit Thymidin-5'-cyanoethyl-H-phosphonat derivatisierten Controlled Pore Glass (CPG), das eine Belegungdichte des Nukleosids von 36 mmol/g aufweist, wird mit 10 ml einer Lösung aus 0,1 M LiCI in N-Methylmorpholin: Cyanoethanol (1:9) umgesetzt. Das Nukleosid ist hierbei über eine Succinylgruppe zu seiner 3'-OH-Gruppe mit dem CPG kovalent verbunden. Nach 30 Minuten wird der Träger 4 mal mit je 2 ml Acetonitril gewaschen und anschliessend mit einer Lösung aus 30 g Jod, 20 ml Wasser, 200ml Pyridin und 750 ml Tetrahydrofuran eine Stunde umgesetzt. Anschliessend wird die feste Phase 10 mal mit je 2 mi Acetonitril, dann 10 mal mit je 2 ml Diethylether gewaschen. Der Träger wird getrocknet und bei 55-60°C mit konzentrierter wässriger Ammoniaklösung behandelt. Anschliessend wird die feste Phase, an der sich nun kein Nukleosid mehr befindet, abfiltriert. Das Filtrat wird zunächst lyophilisiert, dann mit 0,1 M Triethylammoniumacetat pH: 7 aufgenommen und mittels HPLC analysiert. Man erkennt ein Gemisch aus Thymidin und Thymidin-5'-phosphat. Das Thymidin-5'-Phosphat ist aus dem Edukt durch Jodoxidation und Ammonolyse hervorgegangen. Das Thymidin ist aus dem Produkt der Dephosphitylierung des polymer gebundenen Thymidin nach Verseifung der Succinylgruppe-Brückengruppe hervorgegangen. Das Verhältnis Thymidin zu Thymidin-5'- monophosphat ist 98:2.

Claims (36)

1. Verfahren zur Herstellung von natürlichen oder synthetischen Nukleosiden, Nukleosidanalogen oder Oligonukleotiden aus mindestens zwei solcher Nukleoside und/oder Nukleosidanalogen, deren Grundgerüst einen gegebenenfalls substituierten Rest einer Nukleinbase B und eine geschützte Hydroxylgruppe der Formel R1-O-, worin R1 für eine Schutzgruppe steht, enthält, oder die mit dem Sauerstoffatom einer Hydroxylgruppe direkt oder über eine Brückengruppe an ein festes Trägermaterial gebunden sind, aus Nukleosidmonomeren oder aus Oligonukleotiden, an deren Grundgerüst neben besagten Resten eine Gruppe der Formeln I, la oder Ib
Figure imgb0008
gebunden ist, durch Überführung der Gruppe der Formeln I, la oder Ib in eine Hydroxylgruppe -OH, indem man die Nukleoside oder Oligonukleotide, gegebenenfalls in einem inerten organischen Lösungsmittel, mit einem Überschuss eines aliphatischen, cycloaliphatischen, araliphatischen oder aromatischen Alkohols mit 1 bis 30 C-Atomen, einem Polyol mit 2 bis 50 C-Atomen oder einem polymeren Polyol in Gegenwart einer mindestens katalytischen Menge einer anorganischen Base oder einer organischen Stickstoffbase umsetzt, wobei die Base einen pK-Wert von 4 bis 10 aufweist.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethern, halogenierten Kohlenwasserstoffen, Carbonsäureamiden, Lactamen, Sulfoxiden, Sulfonen, aromatischen Kohlenwasserstoffen, Nitrilen, aliphatischen und cycloaliphatischen Kohlenwasserstoffen.
3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethern, halogenierten Kohlenwasserstoffen, Nitrilen, Carbonsäureamiden und Lactamen.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel Tetrahydrofuran oder Dioxan ist.
5. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acetonitril, Propionitril, Benzonitril und Phenylacetonitril.
6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der aliphatische, cycloaliphatische, araliphatische oder aromatische Alkohol, das Polyol oder das polymere Polyol in einem Überschuss von mindestens 100 Moläquivalenten und bis zu 1000 Moläquivalenten Hydroxylgruppen pro Moläquivalent Gruppen der Formel I vorliegt.
7. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer Temperatur von -20°C bis 55°C erfolgt.
8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei einer Temperatur von 15°C bis 35°C erfolgt.
9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung bei Raumtemperatur erfolgt.
10. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ein Alkanol mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ist.
11. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ein Alkanol mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen ist.
12. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ein Alkanol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
13. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, n- und i-Propanol, n-, i- und t-Butanol, Pentanol, Hexanol, Ethylenglykol-, Diethylenglykolmonomethyl- und -monoethylether.
14. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ein Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist.
15. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol Methanol ist.
16. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ein Cycloalkanol mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen ist.
17. Verfahren gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ein Cycloalkanol mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen ist.
18. Verfahren gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cyclopentanol, Cyclohexanol, Methylcyclohexanol, Cycloheptanol und Cyclooctanol.
19. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ein araliphatischer Alkohol mit 7 bis 30 Kohlenstoffatomen ist.
20. Verfahren gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ein araliphatischer Alkohol mit 7 bis 20 Kohlenstoffatomen ist.
21. Verfahren gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus un-, Alkyl- oder Alkoxy-substituiertem Benzylalkohol und β-Phenylethanol.
22. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ein aromatischer Alkohol mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen ist.
23. Verfahren gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ein aromatischer Alkohol mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen ist.
24. Verfahren gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenol, Naphthol und un-, Alkyl- oder Alkoxy-substituiertem Phenol oder Naphthol.
25. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyol 2 bis 20 Kohlenstoffatomen enthält.
26. Verfahren gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykol, Propylenglykol, Butandiol, Pentandiol, Hexandiol, Cyclohexandiol, Dihydromethylcyclohexan, Diethylenglykol, Triethylenglykol, Polyethylenglykol, Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Dipentaerythrit, Glycerin und Sacchariden.
27. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das polymere Polyol ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylalkohol, Polysaccharide und Polyacryl- bzw. -methacrylsäurehydroxyalkylester.
28. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die anorganische Base ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus basischem Metalloxid, Schwermetalloxid und -hydroxid.
29. Verfahren gemäss Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die anorganische Base basisches Aluminiumoxid ist.
30. Verfahren gemäss Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die anorganische Base basisches Aluminiumoxid ist.
31. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die katalytische Menge Base im Bereich von 0,01 bis 20 Mol % liegt.
32. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Stickstoffbase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus aromatisches Amin, aromatischer N-Heterocyclus und N-Alkylmorpholin.
33. Verfahren gemäss Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Base ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Imidazol, Pyridin, Polyvinylpyridin, N-Methylmorpholin, Anilin und o-Diaminobenzol.
34. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleoside und Oligonukleotide an ein festes Trägermaterial gebunden sind.
35. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich katalytische Mengen einer nukleophilen anorganischen Base zugegen sind, die die Umsetzung katalysieren.
36. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich katalytische Mengen einer Lewissäure zugegen sind.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2781229A1 (fr) * 1998-07-17 2000-01-21 Univ Nice Sophia Antipolis Nouveaux composes analogues des nucleotides, leurs procedes de preparation et leurs applications
US6184347B1 (en) 1998-11-19 2001-02-06 Agilent Technologies Inc. Minimization of blooming in high-density arrays by using reactive wash reagents

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5610289A (en) * 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5386023A (en) * 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5955591A (en) * 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
DE59404522D1 (de) * 1993-09-17 1997-12-11 Ciba Geigy Ag TTTr als Schutzgruppe in der Nukleotidsynthese
DE4415370A1 (de) * 1994-05-02 1995-11-09 Hoechst Ag Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung
US5808045A (en) * 1994-09-02 1998-09-15 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US6232465B1 (en) 1994-09-02 2001-05-15 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5763594A (en) * 1994-09-02 1998-06-09 Andrew C. Hiatt 3' protected nucleotides for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds
US5872244A (en) * 1994-09-02 1999-02-16 Andrew C. Hiatt 3' protected nucleotides for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds
US5990300A (en) * 1994-09-02 1999-11-23 Andrew C. Hiatt Enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US6214987B1 (en) 1994-09-02 2001-04-10 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent formation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US6441150B1 (en) * 1997-12-16 2002-08-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds for the Synthesis of Nucleotide or oligonucleotide phosphoramidites
JP4945129B2 (ja) * 2004-01-27 2012-06-06 株式会社キラルジェン フルオラス担体およびそれを用いたオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法
US7897378B2 (en) * 2004-03-18 2011-03-01 Roche Molecular Systems, Inc. Method and device for purifying nucleic acids
US7214791B2 (en) * 2004-07-01 2007-05-08 Shenzhen Hande Technology Co., Ltd. Method for preparation of 2′-deoxy-2′, 2′-difluoro-β-cytidine or pharmaceutically acceptable salts thereof by using 1,6-anhydro-β-d-glucose as raw material
WO2010039543A2 (en) 2008-09-23 2010-04-08 Traversa Therapeutics, Inc. Self delivering bio-labile phosphate protected pro-oligos for oligonucleotide based therapeutics and mediating rna interference
EP2599785A1 (de) * 2011-11-30 2013-06-05 Agilent Technologies, Inc. Neuartige Verfahren für die Synthese und Reinigung von Oligomeren
JP2015529073A (ja) 2012-08-20 2015-10-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 生物可逆性基を有するポリヌクレオチド
MA46427A (fr) 2015-10-09 2018-08-15 Wave Life Sciences Ltd Compositions d'oligonucléotides et procédés associés
WO2018035380A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Solstice Biologics, Ltd. Polynucleotide constructs
US11603532B2 (en) 2017-06-02 2023-03-14 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof
US11597744B2 (en) 2017-06-30 2023-03-07 Sirius Therapeutics, Inc. Chiral phosphoramidite auxiliaries and methods of their use
CA3098624A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods of use thereof

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE271328C (de) * 1920-11-12
JPS5229749A (en) * 1975-09-02 1977-03-05 Mitsubishi Electric Corp Optical equipment and its manufacturing process
SU809866A1 (ru) * 1979-05-14 1982-03-30 Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Молекулярной Биологии Способ удалени цианэтильной защитной группы с производных моно-и олигонуклеотидов
US4458066A (en) * 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
IL62834A0 (en) * 1980-05-14 1981-07-31 Ens Bio Logicals Inc Polynucleotide synthesis
US4373071A (en) * 1981-04-30 1983-02-08 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
JPS5927900A (ja) * 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4672110A (en) * 1983-11-29 1987-06-09 Northwestern University Method of deprotecting polynucleotide trimethylethyl phosphotriesters
US4849513A (en) * 1983-12-20 1989-07-18 California Institute Of Technology Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups
US4818681A (en) * 1985-02-22 1989-04-04 Molecular Diagnostics, Inc. Fast and specific immobilization of nucleic acids to solid supports
EP0216357A3 (de) * 1985-09-25 1988-08-31 Nippon Zeon Co., Ltd. Phosphoramidit-Verbindungen und Verfahren zu deren Herstellung
US4950745A (en) * 1986-10-30 1990-08-21 Daicel Chemical Industries, Ltd. Process for synthesis of oligonucleotides and compound for forming polymeric protecting group
JPH0291088A (ja) * 1988-09-29 1990-03-30 Central Glass Co Ltd ホスファイトおよびヌクレオシド‐３’‐ホスファイト誘導体およびこれを用いるオリゴヌクレオチドの合成法
FR2651130B1 (fr) * 1989-08-23 1991-12-13 Roussel Uclaf Sequence d'oligonucleotides anti-sens, anti-arn message du tnf alpha, procede de preparation, application a titre de medicaments et compositions pharmaceutiques.
US5042524A (en) * 1989-09-29 1991-08-27 Metlund Enterprises Demand recovery hot water system
US5430138A (en) * 1990-07-27 1995-07-04 Chiron Corporation Hydroxyl-protecting groups attached to cytidine nucleotide compounds which are orthogonally removable

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2781229A1 (fr) * 1998-07-17 2000-01-21 Univ Nice Sophia Antipolis Nouveaux composes analogues des nucleotides, leurs procedes de preparation et leurs applications
US6184347B1 (en) 1998-11-19 2001-02-06 Agilent Technologies Inc. Minimization of blooming in high-density arrays by using reactive wash reagents

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