DD275704A1 - Verfahren zur herstellung von gerstenpflanzen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, das eine beta-Glukanase herzustellen erlaubt, die in der Brauindustrie zur Verarbeitung grosser Rohfruchtmengen eingesetzt werden kann, um die Viskositaet der Braumaische erhoehende Glukan-Verbindungen hydrolytisch zu spalten; dafuer soll nach Moeglichkeit kein oder nur in geringer Menge ein Glukanasepraeparat verwendet werden, sondern die Braugerste mit einem Glukanase-Gen bereits in der Pflanze versehen sein. Zu diesem Zweck wird ein Gen fuer die beta-Glukanase in einer Expressionskassette angeordnet, die auf einem Vektorplasmid konstruiert wird, das in Gerstenpflanzen transformiert werden muss. Die transformierten Pflanzen werden selektiert und regeneriert und liefern im Maischprozess die erforderliche beta-Glukanase.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Gerstenpflanzen, insbesondere für die Verwendung in der Brauindustrie, die mit dem Gen für eine thermostabile endo-beta-1,3-1,4-Glukanase ausgestattet sind.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Für die Herstellung verschiedener Nahrungs-, Genuß- und Futtermittel werden Glukanase-Präparate eingesetzt, wenn die hydrolytische Spaltung der beta-glykosidischen Bindungen von beta-1,3-1,4-Glukanen beabsichtigt ist; vor allem in der Brauindustrie wird durch den Einsatz solcher pflanzenglukan-hydrolislerender Enzyme die Verarbeitung größerer Rohfruchtmengen, zum Beispiel von Gerste anstelle von Malz, möglich, ohne daß dabei Schwierigkeiten bei der Filtration und Läuterung der Braumaische infolge ungenügend abgebauter, viskositätserhöhender Glukan-Verbindungen zu befürchten wären.

Es ist seit langem bekannt, die Viskosität der Braumaische mit Hilfe von beta-Glukanasen me?ophiler Bacillus-Stämme, wie von Bacillus amyloliquefaciens oder von Bacillus subtilis, herabzusetzen/1/. Auch die Verwendung gentechnisch manipulierter Bacillus-Stämme, die das beta-Glukanase-Gen von Bacillus amyloliquefaciens in ampiifizierter Form auf einem Vektorplasmid enthalten, ist zur Verbesserung der Ausbeute von mesophller Glukanase entsprechend einem älteren Vorschlag der gleichen Anmelderin bereits ins Auge gefaßt/2/.

Der Nachteil dieser votbekannten Verfahren besteht darin, daß ein spezielles Enzym der Braumaische zugesetzt werden muß lediglich, um deren Viskosität abzusenken, ohne daß ein solches Präparat sonst gebraucht würde, und daß nach Aufbereitung der Braumaische das zugesetzte Enzym inaktiviert ist.

Es ist auch schon bekannt, das Gen für endo-beta-1,3-1,4-Glukanase von Bacillus subtilis in verschiedenen Hefestämmen zur Expression zu bringen/3/; IAI', /5/; /β/. Dabei wird dieses Gen in ein in Saccharonyces cerevisiae autonom replizierendes Plasmid eingebaut und als Selektionsmarker die Resistenz gegenüber Kupfer genutzt. Leider sind bei diesen Konstruktionen die entstehenden Transformanten mitotisch Instabil, das heißt, nach mehreren Passagen auf nichtselektivem Medium gehen die Plasmide und damit das Glukanase-Gen verloren.

Ferner Ist es gelungen, eine Brauereihefe - Saccharomyces cerevisiae var. carlsbergensis - zu konstruieren, bei der das Gen für endo-beta-1,3-1,4-Glukanase des Pilzes Trichoderma reesel In das Genom einer Hefe integriert worden ist/7/. Dabei wird aber dieses Gen durch Austausch mit dem Gen für Phosphoglyzeratkinase In das Chromosom der Hefe eingebaut. Da diese Kinase ein E£zym der Glykolyse Ist und das zugehörige Gen beim Einbau des Gens für die Glukanase in mindestens einer Kopie verloren -geht, kommt es bei diesen Brauereihefen, die in der Regel polyploid sind, zur Verringerung der Aktivität der Phosphoglyzeratkinase und damit zu verminderter Wachstumsgeschwindigkeit.

Inzwischen wurden diese Schwierigkeiten durch einen Vorschlag der Anmelderln/8/ teilweise boseltlgt. Trotzdem ist es generell unpraktisch, daß mikroblelle Enzyme für den Brauvorgang speziell entweder direkt zugeführt werden müssen, was von manchen Herstellern als nicht natürlich strikt abgelehnt wird, oder die Brauhefe entsprechend manipuliert werden muß, wobei auf den fernoron Zusatz von Enzymen nicht vollständig verzichtet worden kann; in jedem Fall sind diese Verfahren durchweg kostspielig und erfordern ständige technologische Botreuung.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, die Wirtschaftlichkeit des Brauprozosses hinsichtlich der Verwendung von endo-beta-1,3-1,4-Glukanase zu verbessern und don weltgohendon Einsat: von Gorsten-P.ohfrucht anstelle von Malz zu ermöglichen, ohne die oben ausführlich beschriebenen Schwierigkeiten In Kauf nehmen zu müssen,

Darlegung des Wesens der Erfindung

Demzufolge hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, Gerstenpflanzen genetisch so zu verändern, daß sie im Brauprozeß selbst genügend endo-beta-1,3-1,4-Glukanase bereitstellen, ohne daß spezielle Zusätze direkt oder über die Brauhefe benötigt werden, und daß diese Glukanase bereits gebildet wird, wenn die Gerstensamen reifen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß eine Expressionskassette einschließlich des Gens für die thermostabile endo-beta-1,3-1,4-Glukanase auf einem Vektorplasmid konstruiert wird, das sich vorzugsweise in Escherichia coli vermehren läßt, daß die DNS dieses nunmehr rekombinanten Piasmids in Zellen von Gerstenpflanzen transformiert wird und nach Selektion von tatsächlich transformierten Zellen vollständige Gerstenpflanzen regeneriert werden, wobei die Expressionskassette aus einer pflanzlichen Promotor-Region, einer Transkriptions-Initiations-Region mit nachfolgender, für das Gen für endo-beta-1,3-1,4-Glukanase kodierenden Region einschließlich einem Stop-Signal für die Translation, und einer 3'-flankierenden Region für korrektes processing und Polyadenyliorung und damit die Expression der mRNS der endo-beta-1,3-1,4-Glukanase besteht. Auf diese Weise werden die Nachteile des Standes der Technik in überraschend einfacher Weise beseitigt. Durch die Erfindung läßt sich nun die Bildung der thermostabilen endo-beta-1,3-1,4-Glukanase beliebig steuern. Son kann man ohne Schwierigkeit erreichen, daß das Genprodukt bereits Im nichtgekeimten Gerstenkorn akkumuliert wird, so daß der Anteil unvermalzter Gerstenrohfrucht beim Maischvorgang ohne weiteres erhöht werden kann. Bemerkenswerterweise gestattet es die Erfindung, auf mikrobielles Enzym zu verzichten und damit den Brauvorgang zu verbilligen, ohne daß in den sonstigen technologischen Prozeß eingegriffen werden müßte.

Ausfuhrungebeispiel Die Erfindung wird nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Dazu wird in Tabelle 1 die Nukleotid-Sequenz

eines DNS-Fragmentes mit dem Gen für die endo-beta-1,3-1,4-Glukanase von Bacillus macerans angegeben.

Das Gen für die endo-beta-1,3-1,4-Glukanase - nachfolgend kurz Glukanase-Gen genannt- wird in bekannter Weise/9/ aus Bacillus macerans gewonnen und Moniert. Ausgehend von einem DNS-Fragment von 850 Basenpaaren, das die gesamte

kodierende Region für das Glukanase-Gen einschließlich der kompletten Promoter-Region trägt/9/, werden mittels des

Restriktionsdnzyms Dral die ersten 70 Nukleotide am 5'-Ende des DNS-Fragmentes entfernt. Diese Schnittstelle befindet sich

23 Nukleotide vor dem ATG-Startkodon und führt zu einer partiellen Entfernung des Promotors stromaufwärts der -10-Region.

Die bakterielle Ribosomen-Bindungsstelle bleibt erhalten. In der Tabelle ist die komplette Nukleotid-Sequenz des DNS-Fragmentes gezeigt. Nach Klonierung des verkürzten, nun aus nur noch 780 Basenpaaren bestehendon DNS-Fragmentes in

einen Vektor pUC 19/9/ enden Schnittstellen Hind III und Dra I/Hinc Il wird das partiell promotorlose, verkürzte DNS-Fragment in folgender Weise innerhalb der. multi cloning site" des Vektors pUC 19 eingebaut: 5'-Ende-Hindlll/Sph l/Pst I-DNS Fragment-

Xba l/BamH I/Sma I/Kpn l/Sacl/EcoR I - 3'-Ende. Damit hat man einen Modul für den Aufbau einer Expressionskassette

gewonnen.

Zur Steuerung der Expression des Gens während der Sⁿmenreife werden Promotoren aus der Ackerbohne/10/ verwendet, die

nachweislich auch In anderen Pflanzen nachgeschaltett Gene exprimieren/10/. Das Plasmld ρ delta 4/12/10/ enthält den

Promotor des Samenproteln-Gens Legumin B4/11/; rii.rch dessen Spaltung an seiner (unikalen) BamH 1-Schittstelle wird das Glukanase-Gen eingefügt; dabei ist seine richtige Orientierung zu sichern. Daran anschließend wird eine pflanzliche

3'-flanklerendc Region eingeschleust; ein Sau3 Α-Fragment des Samenprotein-Gens Legumin B4 enthält die notwendigen

Sequens-Stücke. Die 3'-flanklerende Region kann auch leicht aus einem vorbekannten Plasmid pOcs2/12/ mittels einer BamH I-Hindlll- Doppelspaltung gewonnen werden. Eine so hergestellte Expressionskassette gestattet es, das zugehörige Vektorplasmid unmittelbar zur direkten Transformation

von Zellen von Gerstenpflanzen einzusetzen.

Es ist auch möglich, eliien samenspezifischen Promotor P30.1 zu verwenden, der auf einem Plasmid pUC/USPP vorliegt/10/. Nach einer Linearisierung mittels des Restriktionsenzyms BgI Il kann wie oben beschrieben verfahren werden, und man erhält

auch auf diesem Wege ein für die direkte Transformation geeignetes Vektorplasmid.

In beiden Fällen können darüber hinaus Promotor-Gen-Fragmente gewonnen werden, die zusätzlich zum Promotor und zur für

die 5'-Reglon der mRNS kodierenden Sequenz Teile der Samenprotein-Kodierungs-Sequenz enthalten, um die korrekte

Kanalisierung und Speicherung der endo-beta-1,3-1,4-Glukanase im Gersten-Endosperm zu sichern. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Steuerelemente, also die Promotoren zusammen mit den 3'-Regionen, aus den Samenprotein-Genen der Gerste selbst oder anderer Getreide zu verwenden; beispielsweise ein Hindlll-BstXI-Fragment des Gersten-Hordeln-Gens B1 als Promotor und ein Xbal-Hindlll-Fragment als 3'-Region/13/. Diese Fragmente werden zusammen

mit dem aus 780 Basenpaaren bestehenden DNS-Fragment mit dem Glukanase-Gen In fachüblicher Weise in das bereits genannte Plasmld pUC 18 eingebaut und direkt transformiert, gegebenenfalls zusammon mit einem Selektionsmarker. Auch ein

Hafer-Samenprotein-Promotor als BamH 1-Hlnd Ill-Fragment aus einem Plasmld pPg 108/14/ ist für diesen Zweck geeignet. Schließlich kann dio Expressionskassotte, ohne die Erfindung zu verlassen, auch in einem Tl-Plasmld-Vektor transformiert

werden. In unmittelbarer Nachbarschaft dor Exprosslonskassette befindet sich wio bereits erwähnt ein In den Gerstenpflanzen solektlorbaros Marker-Gen, bolsplelsweiso das die Kanamyzin-Resistenz vermittelnde npt-Gon unter der Kontrolle eines konstitution Promotore wie otwa CaMV35S.

DIo Transformation wird wie folgt durchgeführt. Aus einer Sutponslons-Zellkultur von Gerste werden Protoplasten In bekannter Wolse/15/ isoliert und In einom Medium

rosuspondiert, wolchos 0,6MoI Mannit sowie 60 · 10"' Mol CaCI₁ und 10"¹ Mol MES-Puffer mit einem pH-Wert von 6,6 enthält.

DIo Protoplaston wordon einer Hitzebehandlung von 45'C über 5mln unterzogen und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu

10* Protoplaston In einem Volumon von 0,26 · 10"¹I worden 15 · 10"· g Vektor-DNS In zirkulärer Form in oinem Volumen von

16 · 10"'l zugesetzt sowie daran anschließend 0,1 · 10"' I Polyethylonglykol 6000 (24'C In 0,6 Mol Mannit und 10"' Mol

M£S-Puffor mit einem pH-Wert von 5,6). Nach 30min Inkubation bei Raumtemperatur wird in 2 · 10"' I KAO-Medlum/16/ eingebettet,

das nur Vs der Konzentration an Makro- und Mikrosalzen enthält und als Osmotikum Mannit (Gesamtmolarität - 0,7 osmol), als Hormone 10~³g/l Zeatln und 10~³g/l 2,4-D sowie niedrigschmelzende Agarose (Endkonzentration = 0,6%) von BRL/17/ und als selektives Agens 10...20 · 10~³g/l G418, Heranwachsende Kolonien werden auf Aktivität der vom npt-Marker-Gen kodierten Neomyzin-Phospho-Transferase und auf korrekte Integration der Expressionskassette, (Southern-Hybridlsierung) getestet. Auf diese Weise selektierte CaIIi werden zu Gerstenpflanzen regeneriert und auf Expression des Glukanase-Gens während der Samenreife kontrolliert.

Lherinir

IM Borr!8t,R.u.Schroeder,K.-UZbl.Bokt.ll.Abt.,136(1S81),S.324-329 /2/ DD-Patentschrlft 226012 /3/ GB-Patentschrift 2175590 /4/ EP-Patentschrift 147198 /5/ Cantwell, B.A.etal.,Curr.Genet. 11 (1986), S.65-70 /6/ Hinchliffe,E./Box,W.G.,Curr. Genet.8(1984),S.471-475 /7/ Penttilae, M. E. et al., Curr. Genet. 12 (1987), S.413-420

IBI DD-PatentanmeldungWPC12N/3175184

/9/ DD-Patentanmeldung WP C12 N/315 7061 /10/ DD-PatentanmeldungWPC12N/3051366 /11/ DD-Patentschrift 240911 /12/ Montagu, M. ν. et al., tab. Genet./Univ. Gent, unveröffentl. /13/ Brandt, A. et al., Carlsberg Res. Comm. 50 (1985), S. 333-345 /14/ Schubert, R. et al., Zentralinstitut für Genetik und Kulturpflanzenforschung der AdW der DDR, unveröffentl. /15/ Luehrs, R./Loerz, H., Planta (im Druck) /16/ Kao, K.M./Michayluk, M. R., Planta 115 (1974), S.355-367 /17/ Hersteller: Gribzo/BRL GmbH (BW)

Tabelle 1 INTERNATIONAL BIOTECHNOLOGIES, INC. IBI Copyright 1982,83,84

by: Jim Pustel I

29.8.88TRANSLATIONVON BGLMACNSO Seite 1

DNA SEQUENCE TRANSLATION PROGRAM VERSION 4.1-J. PUSTELL1982 ZIGuK Gatersleben Version 43- H.-W.Jank 1987

70 80 90 100 110 120 130 140 150

TAAAATCAmrTGGAGGTGTATTATGAAAAAGAAGTCCT ICACTGGTGACCACATTTGCI I ¹I I GI I ICTGTAAGC MetLysLysLysSerCysPheThrLeuValThrThrPheAlaPheSerLeullePheSerValSer

160 170 180 190 200 210 220 230 240

AlaLeuAlaGlySeΓValPheTrpGluProLeuSerTyrPheAsnProSerThrTφGluLysAlaAspGlyTyΓSerAsnGlyGlyVal

250 260 270 280 290 300 310 320 330

PheAsnCysTlirTrpArgAlaAsnAsnValAsnPheThrAsnAspGlyLysLeuLysLeuGlyLeuThrSerSerAlaTyrAsnLysPho

340 350 360 370 380 390 400 410 420

* ♦ ♦ · * ♦ ♦ * ♦

Asp^ysAlaGluTyrArgSerThrAsnlleTyrGlyTyrGiyLeuTyrGluValSerMelLysProAlaLysAsnThrGlylleValSer

4X) 440 450 460 470 480 490 500 510

SerPhePheThrTyrThrGlyProAlaHisGlyThrGInTrpAspGlulleAsplleGluPheLeuGlyLysAspThrThrLysValGln

52C 530 540 550 560 570 580 590 600

PheAsnTyrTyrThrAsnGlyValGlyGlyHisGluLysVallleSerLeuGlyPheAspAlaSerLysC'vPheHisThrTyrAlaPhe

610 620 630 640 650 660 670 (380 690

GATTGGCAGCCAGGGTATATTAAATGGTATGTAGACGGTIGAAACATACCGCCACCGCGAATATTCCGAGTACGCCAGGCAAAATT AspTrpGlnProGlyTyrlleLysTrpTyrValAspGlyValLeuLysHisThrAlaThrAlaAsnlleProSerThrProGlyLyslle

700 710 720 730 740 750 760 770 780

790 . 800 810 820 830 840 850

·♦♦·♦♦♦

AAATATACGAGCAATTAATATGATTGCAGCTGGGCATGAGCTiTrrAGTCCACTCCAGGCATGC LysTyrThrSerAsn—

DieTranslation begann mit der Base 93 (erstes ATG nach Base 90) Translation am Stop-Codon (Base 804) abgebrochen Sequenz von Base 70 bis Base 852 gedruckt Sequenz ab Base 1 numeriert.

238 Codons insgesamt 4 Start (ATG)-Codon(s), 1 Stop-Codon(s), 0 unidentifizierte(s) Codon(s)

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von Gerstenpflanzen, insbesondere für die Verwendung in der Brauindustrie, die mit dem Gen für eine thermostabile endo-beta-1,3-1,4-Glukanase ausgestattet sind dadurch gekennzeichnet, daß eine Expressionskassette einschließlich des Gens für die thermostabile endo-beta-1,3-1,4-Glukanase auf einem Vektorplasmid konstruiert wird, das sich in Escherichia coli vermehren läßt, daß die DNS dieses nunmehr rekombinanten Plasmids in Zellen von Gerstenpflanzen transformiert wird und nach Selektion von tatsächlich transformierten Zellen vollständige Gerstenpflanzen regeneriert werden, wobei die Expressionskassette aus

   - einer pflanzlichen Promotor-Region,

   - einer Transkriptions-Initiations-Region mit nachfolgender, für das Gen für endo-beta-1,3-1,4-Glukanase kodierenden Region einschließlich einem Stop-Signal für die Translation, und

   - einer 3'-flankierenden Region für korrektes processing und Polyadenylierung und damit die Expression der mRNS der endo-beta-1,3-1,4-Glukanase

   besteht.