DD265426A5 - Verfahren zur Erhöhung der Geschwindigkeit der Kohlendioxid- und Ethanolerzeugung von Hefe - Google Patents

Abstract

Erfindungsgemaess erfolgt eine Erhoehung der Erzeugungsgeschwindigkeit von Kohlendioxid, Ethanol und anderer Gaerungsprodukte wie Zitronensaeure, die von Hefe wie Saccharomyces cerevisiae waehrend der Gaerung erzeugt werden, und eine Verringerung der Biomasseproduktion, indem die Glycolysegeschwindigkeit indirekt durch Veraenderung der Energiebilanz der Zelle, d. h. durch Verringerung der interzellulaeren ATP-Mengen, reguliert wird. Modifikationen fuer eine derartige Veraenderung der Glycolysegeschwindigkeit umfassen die Anwendung entweder einer regulierten ATP-Hydrolyse innerhalb der Zelle oder eine regulierte Ausscheidung von ATP aus der Zelle. Die Erfindung sieht verschiedene Wege fuer die Veraenderung der ATP-Menge der Hefe vor, wie (a) Anwendung futiler metabolischer Zyklen zur Erhoehung des ATP-Verbrauchs; (b) Verwendung einer veraenderten exozellulaeren Saeurephosphatase, so dass sie zur Erhoehung der interzellulaeren ATP-Hydrolyse interzellulaer wird; (c) Anwendung eines Stoffes, der die Plasmamembran-ATPase entkoppelt und dadurch eine ungewoehnlich hohe ATP-Menge verbraucht; (d) Anwendung eines Stoffes, der die Freisetzung von ATP aus der Zelle zur Senkung der interzellulaeren ATP-Menge ermoeglicht. Die Erfindung betrifft des weiteren die Regulierung der hier ausfuehrlicher beschriebenen genetischen Modifikationen. Durch diese Massnahmen koennen solche Modifikationen waehrend des Wachstums der Hefe auf grosstechnischer Basis unwirksam gemacht werden und anschliessend vor oder waehrend, vorzugsweise vor oder in einem sehr fruehen Stadium der Teigaufgehphase, in Gang gesetzt werden.

Description

Anwendung: gebiet der Erfindung

Dio Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Geschwindigkeit der Kohlendioxid- und Ethanolerzeugung von Hefe. Die Erfindung betrifft weiterhin Hefe, speziell Back- oder Bierhefe, die höhere Geschwindigkeiten der Kohlendioxid- und Ethanolerzeugung aufweist. Zum Beispiel wird durch eine höhere Geschwindigkeit der Koh'ondioxidentwicklung ein rascheres-Aufgehen bei Backhefe erzielt, oder durch eine höhere Geschwindigkeit de^r Eihanolerzeuguny -^;ne verringerte Brauzeit bei Bierhefe erreicht. Die Erfindung betrifft auch neue Maßnahmen zur Regulierung der Genexpression, die die regulierte Entfernung eines Transcnptionsblockes umfaßt.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Hefen sind oir ie der ältesten gezüchteten Pflanzen. Ihre Verwendung geht bis auf etwa 2000 v. u. Z. zurück. Von den verschiedenen anerkannten Hefearten haben Saccharomyces die größte wirtschaftliche und praktische Bedeutung, weil sie umfassend in der Packerei-, Brauerei- und Weinherstollungsindustrie sowie für die Herstellung von Biomassen verwendet werden. Siehe beispielsweise Reed, G., „Yeasts" (Hefen), in der Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 24: 771-806 (John Wiley & Sons. New York, 1984).

Dio wichtigste, wenn auch nicht die einzige Funktion der Hefe besteht bei der Gärung in der Schaffung einer Quelle von Kohlendioxid und Ethanol. Dem Teig, der Würzo oder einem anderen gärfähigen Substrat muß ausreichend Hefe zugesetzt werden, um die verlangte Geschwindigkeit der Kohlendioxid- und Ethanolerzeugung zu erreichen. Stünde eine aitivere Hefe zur Verfugung, brauchte weniger Hefe bei entsprechender Kosteneinsparung eingesetzt zu werden.

Dm Verbesserung der fermentativem Kraft von Hefe ist ein laufendes Forschungsthema. Sowohl die trockenen als nuch die feuchten Formen von Hefo müßten verbessert werden, um ihre Fähigkeit zur Kohlendioxiderzeugung zu verbessern, wie zum Beispiel 1) Senkung der Gärungszeit und/oder 2) die Vorwendung von woniger Hefe zu ermöglichen, ein beträchtlicher .

Kostentaktor in der Bäckerei und der Brauerei. Durch Verbesserungen der fermentativen Kraft der Hefe wird auch die Herstellung der haltbaren Form von aktiver Trockenhefe (ADY) attraktiver. Imallgerneinen gehen bei der Herstellung von ADY :ius frischen Hefekulturen etwa 40% der fermentativen Fähigkeit verloren. Nach Methoden zur Lösung oder Verringerung dieses Problems wird ständig gesucht.

Eine Möglichkeit zur Verbesserung der Aktivität von Trockenhofe sieht eine Modifikation des Trockenprozesses oder der Trockeneigenschaften des Hefestammes vor, um den während des Trocknens auftretenden Aktivitätsverlust zu vorhindern.

Prozoßverbesserungen sine erfolgt, und klassische genetische Versuche sind für dieses Problem durchgeführt worden, allerdings mit mäßigem Erfolg. Siehe beispielsweise US-PS 3.993.783.

Ein weiterer Versuch, um das Problem der geringen Aktivität von Trockenhofe lösen zu können, wird in US-PS 4.420.563 beschrieben. Hefe mit einer verbesserten Treibfähigkeit, vor allem in süßen Teigen mit hohem Zuckergehalt, wurde durch die stufenweise Zugabe von Salzen zu der wachsenden Hefekultur während der Setzten Vermehrungsstadien erzeugt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens zur Erhöhung der Geschwindigkeit der Kohlendioxid- und Ethanolerzeugung von Hefe.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Kohlendioxid- und Ethanolerzeugungsaktivität jedes Mofestammes durch chemisch induzierte Modifikationen zu verbessern.

Erfindungsgemäß werden Verfahren zur Erhöhung der Erzeugungsgeschwindigkeit von Kohlendioxid, Ethanol und anderen von der Hefo erzeugten Gärungsprodukten (zum Beispiel Zitronensäure) zur Verfügung gestellt. Im allgemeinen sehen die Verfahren eine Reduzierung der ATP-Menge in der Hefezelle vor, um dadurch die Glycolyse zu stimulieren. Nach einem erfindungsgemäßen Aspekt wird die ATP-Menge dadurch reduziert, daß in dem Hefegenotyp (z. B. über einen Einzelkopie· oder Multikopie-Vector odor durch Kointegration in das Hefegenom) ein regulierbarer Promotor für den natürlichen Promotor eines, ein metabolisches Enzym codierenden Gens substituiert wird, so daß die regulierbare Expression des Enzyms möglich wird, wodurch die durch das Enzym katalysierte metabolischo Reaktion gleichzeitig so mit der roversiblen Reaktion ablaufen kann, daß ATP verbraucht wild. Nach einem anderen erfindungsgemäßon Aspekt umfaßt die Modifikation auch die Einfügung eines, ein metabolisches Enzym codierenden Gens in den Hefegenotyp, aber bei diosem Aspokt war unter der Expressionskontrolle eines Promotors die konMitutive Expression des Gens möglich, so daß dadurch die durch das Enzym katalysierte metabolische Reaktion gleichzeitig so mit der reversiblen Reaktion ablaufen konnte, daß ATP verbraucht wurde. Weitere erfindungsgemäße Modifikationen umfassen die Modifizierung des das metaboliscne Enzym codiurenden Gens, um zum Beispiel die allosterische oder anderweitige Inhibition oder Inaktivierung des Enzyms zu verhindern oder auszuschalten.

Bei einem Ausfühmngsbeispiel ist das Enzym FDPase. Das FDPase-Gen kann zusätzlich so mutagenisiert werden, daß dasCodon für Ser-12 dos Enzyms durch ein Codon für eine andere Aminosäure als Serin ersetzt wird, oder daß die allostorischo Inhibition, z. B. durch AMP und/oder Fructose-2,6-diphosphat, reduziert oder ausgeschaltot wird. Bei einem anderen Ausfuhmngsbeiip'ol sieht die genetisch!) Modifikation das Modifizieren eines Gens für eine exozelluläre APase vor, z. B. durch Eni'crnen des Tei.es des Gons, das die F\ihrersequenz codiert, so daß da» modifizierte Enzym innerhalb des Hefecytoplasmas bleibt und die Hydrolyse von intrazellulärer ΛΤΡ katalysiert.

Ein durch die Erfindung erzielter Vorteil besteht darin, daß dia genetischen Modifikationen nur während, und vorzugsweise in dem frühen Stadium, der Gärungsphase und nicht während des Wachstums der Hefe auf Produktionsbasis „in Gang gesotzt" werden kann. Das mt ein bedeutsamer Vorteil bei Backhefen. Alternativ können die genetischen Modifikationen konctitutiv so verwirklicht werden, daß sie während der Großproduktion in Gang gesetzt worden, d. h. während des Wachstums der Hofe bei der Massenproduktion, um eine verstärkte Erzeugung von Gärungsprodukten wie Ethanol zu erzielen.

Die Regulierung der genetischen Modifikationen rnnn durch die Anwendung eines temperaturempfindlichen Promotors oder durcii einen Promotor, der durch die Gegenwart einer spezifischen Substanz induziert wird, erzielt werden, so daß das Enzym nur bei eine' bestimmten Temperatur oder in Gegenwart der Substanz verwirklicht wird. Alternativ kann die Expressionskontrolle durch die Einfügung eines FLP-Gens, dessen Konstruktion noch ausführlicher beschrieben wird, in das Hefegenom geschaffen werden.

Für diese Prozesse brauchbare Vectoren umfassen Einzelkopie-Centromero enthaltende Plasmide und Multikopieplasmide, die den Hefe-2u-Replikaiionsursprung enthalten, sowie Vectoren, die deren Kointegration in das Hefegenom ermöglichen.

Die Erfindung betrifft des weiteren Prozesse, in donen der ATP-Anteil dadurch verringert wird, daß die Hefe mit einer Chemiokalie, die den ATP-Verbrauch direkt oder indirekt induzieren kann, gezüchtet oder zusammengebracht wird Solche Chemikalien umfassen verhältnismäßig kleine organische Moieküle sowie Proteine wie Hefekillertoxin.

Schließlich betrifft die Erfindung auch genetisch modifizierte Hefen, die nach erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt wurden.

In der beiliegenden Zeichnung zeigen:

Fig. 1: die Konstruktion eines integrierten Hefoplasmids, das das von dem Gali-K;omotor verwirklichte FLP-Gen enthält,

Fig. 2: ein Hefeplasmid, das den mit der Beta-Gal-Codierungsrogion von E. coli verschmolzenen Gal-Promotor enthalt, Fig. 3: die Induktion von ß-Galectosidaso-Aktivität vom Gali-Promotor bei Wachstum mit Glucoseeinschränkung, Fig. 4: den Verlust eines heterologen Gens durch regulierte seitenspozifische Rekombination, Fig. 5: den Verlust eines Transcriptionsblockes von dem das Hofe-FDPase Gen verwirklichenden GPDH-Promotor, Fig. 6: ein Plasmid, das oinen durch Sa11 /Bglll-Restrikt onss'ellen gebundenen h'xpressionsblock enthält, Fig. 7: die Konstruktion oines Exprossionsvectors, der Replikationsursprünge enthält, und selektierbare Markioror für sowohl Hefe als auch E. coil,

Fig. 3: die Nucleotidsequenzdes clonierten Hefe-FDPase-Gens,

Fig. 9 A dip abgeleitete Aminosäuresequenz des clonierterFDPaso-Erjyms bzw. die Aminosäuresequenz von ' und B: Schweino-FDPase,

Fig. 10: die Konstruktion oinor FDPase-Kassette für die Expression von einem heterologen Prcmotor, Fig. 11: die Synthese eines Expressionsvectors, bei der die FD?ase von einem GPDH-Promotor verwirklicht wird, Fig. 12: die Konstruktion einer Aminoterminaldeletiori von TüPase,

Fig. 13: den Austausch des Serini ückotandes an der Protcinkinase-Erkenniingsstelle gegen ein Alanin, Fig. 14: Kohlendioxidentwicklung währond der Gärunp von Hefokul türen, die WildtypFDPase oder amino' b.-minal deletierte

FDPase verwirklichen, Fig. 15: Kohlendioxidentwicklung während der Gärung von Hotekulturon, die FDPase verwirklichen, der die Erkennungsstelle

für zyklische AMP- ibhängigeProteinkinaso fehlt, Fig. 16: diefürden Gasentwicklungstest verwendete Apparatur, Fig. 17: die Verbesserung der Gasentwicklungskraft eines Stummes von Hefe, der das Gen für das nicht phosphoryliorte FDPase-Enzym verwirklicht,

Fig. 18: die Einfügung dos Hefe-Säurephosphatase-Promotors in den h'efe-Expressionsvprtor, Fig. 19: dio DNS-Sequenz für den Hefe-Säurophosphatase-Promotor und den Beginn deo Strukturgens für Säurcphosphatase (PHO 5),

Fig. 20: die Einfügung einer einzigartigen Bg 1-ll-Stolle am 3'-Endn das Saurephosphataso-Promotors, Fig. 21: die Einfügung einer Restriktionsstelle in das Säurophosphatase-Gen zur Expression dos ausgereifton Proteins, Fig. 22: die Synthesr einos Expressionsvectors, der das ausgereifte Säurephosphatase-Gei. von dom

Säurephos./hatiistPromotor verwirklicht, Fig. 23: die Einfügung eines Hefe-Centomeren in das das modizifiziorte Säurephosphatase-Gen enthaltende Plasmid.

Der glycolytische Wog vnn Hefo ist seit vielen Jahren ausgiebig erforscht worden. Siehe beispielsweise: Fraonkel, „Carbohydrate Metabolism" (Kohlenhydriit-Sioffwechsel), in The Moiecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression, Cold Spring H.irbor Laboratory, Now York. Die glykolytische Gärung von Zuckern ist unter dem Gesichtspunkt d 3S Energieverbrauchs und der Biomasse-Umwandlung ein sehr unwirksamer Prozeß. Dennoch können Hefen durch anaorobe Glycolyse, bei den die Energie von der Phosphorylierung des Substrates stammt, viel schneller wachsen als es durch dio oxydative Phosphorylierung bei aerobem Wachstum dor Fall ist.

Im Laufe der zu dioser Erfindung führenden Forschungsarbeiten wurde gefunden, daß dio Geschwindigkeit der Glycolyso durch die Hefezellenanteile von Adenosintriphosphat (ATP) reguliert wird. Diese Entdeckung ist wirklich überraschend, denn, obwohl eine regelnde Rolle von ATP bei oinigen enzymatischen Schritton beobachtet worden ist, ist nach unsorem Wissen «ine regelndo Rolle von ATP auf dem gesamten glycolytischen Weg niemals vorher demonstriort odor solbst vermutet wordon, obwohl eingehende Untersuchungen über Glycolyso bisher durchgeführt wurdon. Die Erfindung nutzt diese Entdeckung, indem sie Modifikationen für die Verringerung dor Zellmengen von cytoplasmatischem ATP vorschlägt, wodurch die Glycolyso stimuliort und dadurch die Entwicklungsgeschwindigkeit von Kohlendioxid und Ethanol durch die Hcfo erhöht wird. Wie oben erwähnt, knnn Backhefe verbossert werden, wenn ihre Fähigkeit zur Kohlendioxiderzeugung während des Treibens erhöht werden kann. Brauereihefe kann gleichfalls verbessert werden, indem die Gärungsgeschwindigkeit (d. h. Alkoholproduktion) erhöht und die Zeit verringert wird, dio für den Brauprozoß gebraucht w.:d. Durch die verringerte Produktion von Biomasse während des Garungsprozesr.es unter Veiwondung von erfindungsgemäß modifizierter Hefe wurdo auch dor Gärungsprozeß für de Ethanolorzeugung verbessert Die Erfindung stellt Modifikationen zur Erzielung dieser Verbesserungen zur Verfügung, indem dio Geschwindigkeit der Glycolyse durch eine ungewöhnliche Verringerung des zellulären ATP Anteils reguliert wird. Unter ,ungewöhnlicher" Verringerung dos zellulären ATP-Anteils" ist einfach die durch ein orfindungsgemäßes Verfahren erzielte Verringerung zu verstehen.

Da die an dor Glycolyse beteiligten Enzyme normalerweise im Überschuß vorhanden sind, kann die Geschwindigkeit dor Glycolyse durch die ellosterische Inhibi.on bestimmter glycolatischer Enzyme durch zelluläre Metabolien, die intrazolluläre Adenosintriphosphat (ATP)-Anteile einschließen, begrenzt wordon, wie im Laufe der anschließend beschriebenen Forschungsarbeiten ontdeckt wurdo. So wird durch die erfindungsgemäße Verringerung der zellulären ATP-Anteile die Glycolyse stimuliort und dadurch die Geschwindigkeit der Kohlendioxid- und Lthanolerzeugung erhöht und diu Biomasseproduktion verringert.

ImFaIIe van Backhefe würde jedoch, wenn die Veränderung der Hefe während dos normalen Wachstums wirksam werden sollte, die Hefe fur die Erzeugung von Biomasse sehr wirksam sein. Es wäre daher kommerziell undenkbar, die Hefe trotz erhöhter Produktionskosten zu züchten. Es ist daher wünschenswert, die erfindungsgemäßen genetischen Modifikationen bei der Produktion von Backhefe so zu regulieren, daß sie nur während des Treib- (oder Gärungs-)-Prozesses, aber nicht während der , Erzeugung (Wachstumsphase) der Hefe selbst wirksam werden. Ein wichtiger Vorteil der Erfindung besteht in der Fähigkeit, die genetische Modifikation und die damit verbundene Erhöhung der Kohlendioxiderzeugung so in Gang zu bringen, daß die erhöhte Produktion zu Beginn oder in den frühen Stadien der Teig-Aufgeh-Phase zu verzeichnen ist. Diese Einschränkung trifft jedoch nicht für Bier- oder ethanolerzeugende Hefen zu, bei denen die Produktion gleichzeitig während der Gärung erzielt wird. Verschiedene Versuche und spezifische Beispiele für die Verringerung der cytoplasmischen ATP-Mongen werden anschließend beschrieben. Im allgemeinen umfassen diese Versuche Ii) Festlegung eines regulierten futilen (wirkungslosen) metabolischen Zyklus, der ATP verbraucht, (ii) Einführung von oder Verstärkung der Aktivität cytoplasmischer ATPase in einer regulierten Form, und (iii) Verringerung von cytoplasmischen ATP-Mengen durch Beeinflussung der Plasmamembranfunktion. Wie aus der folgenden Beschreibung deutlich werden wird, wird bsi den obigen Versuchen (i) und (ii) ein Verändertes Gen oder eine veränderte Genfunktion durch Ftakombinant-DNS-Techniken in den Hefestamm eingeführt. Vor der ausführlicheren Beschreibung der oben genannten Versuche, kann es empfehlenswert sein, zuerst die „Werkzeuge" für die Auslösung solcher genetischen Modifikationen zu beschreiben, d. h. geeignete Vectoren, regulierte Promotoren und Verfahren zur Einführung solcher Veränderungen in Backhefe- und Bierhefestämme.

Vectoren

Das für die Auslösung oinos futilon Zyklus verantwortliche Gen oder das cytoplasmische Säurephosphatasegen kann unter der Tninscriptionskontrolle eines Promotors in zwei Typen von autonom replizierenden Expressionsvector cloniert werden: ein Einzelkopie-, Centromer enthaltendes Plasmid oder ein Multikopieplasmid. Alternativ kann die DNS durch Rekombination in das Hufechromosom eingebaut werden. Außerdem enthielten diese Vectoren ο η Selektionsgen und 3'nichtcodiorende Regiorion, wiij sie im Fachgebiet allgemein bekannt sind.

Din Vectoren werden in einen Hefestamm transformiert, und die Hefezellen werden für die den Vector enthaltenden durch ein im Fachgebiet allgemoin bekanntes Solektionsprotokoll ausgewählt. Die den Vector enthaltenden selektierten Hefezellen, d.h. transformierten Zellen, werden in einem geeigneten Nährsubstrat gezüchtet, und der Promotor wird zur Auslösung des Verlustes an cytoplasmischer ATP induziert.

Geeignete Selektionsgeno sind im Fachgebiet allgemoin bekannt. Es empfiehlt sich, als Selektionsmittel eines zu wählen, das das Zellwachstum in Abwesenheit des Selektionsgens verhindert. So werden Zellen, die das Plasmid bei der Massenkultur verlieren, das Seloktionsgon nicht enthalten und werden während der Gärung nicht überzüchtet. Es wird jedoch bei der großtechnischen Erzeugung dor verlangsamten Produkte empfehlenswert sein, die Verwendung bestimmter Zelltoxine zu vermeiden und dadurch die Produktreinigungsschritte zu vereinfachen. Somit ist ein wünschenswertes Selektionsgen eines, das das Wachstum von Transformanten in einem Substrat ermöglicht, dem ein für das Wachsen des Elternstammes erforderlicher Nährstoff fehlt. Nützliche Selektionsgene für dio praktische Anwondui j der Erfindung sind beispielsweise URA3, LEU 2 usw. Die hierbei nützlichen Vectoren können durch dem Fachmann gut bekannte Tochniken synthetisiert werden. Die Komponenten dor Voctoren, wie Selektionsgene, Promotoren und dergleichen, können aus natürlichen Quellen gewonnen oder synthetisiert werden, wie später erörtert wird. Grundsätzlich können Komponenten, die in großen Mengen zur Verfügung stehen (d. h. die bei natürlichen Plasmiden vorhanden sind, z. B. zu 2 u Plasmid von He'e, oder die leicht synthetisiert werden können), mit entsprechender Hilfe von Restriktionsenzymen und T4-DNS-Ligase zusammengefügt werden. Wenn eine Komponente nicht in großen Mengen zur Verfugung steht, kann sie durch Einfügung in einen Bakterienclonierungsvector, wie ein Plasmid oder eine Phage, vorstärkt werden, wie im Fachgebiet bekennt ist. Denn können durch die entsprechende Verwendung von Restriktionsenzymen große Mengen Vector durch im Fachgebiet allgemein bekannte Techniken gewonnen werden, indem die Bakterion einfach gezüchtet, ihre DNS mit einor entsprechenden Endonuclease digeriert dio DNS-Fragmente abgetrennt, die die in Frage kommende Komponente enthaltende DNS identifiziert und diese zurückgewonnen wird. Gewöhnlich wird ein Transformationsvector in geringer Menge zusammengesetzt und dann an einen geeigneten, autonom replizierenden Synthosovector, wie ein l'lasmid odor eine Phage, ligiert, um größere Mengen von Transformationsvector-DNS zu erzeugen. Das allgemein bekannte pBR322-Plasmid kann zum Beispiel in den meisten Fällen vorwendet werden.

Die Synthosevectoron worden vorwendet, um die logierten Transformationsvectoren in herkömmlicher Weise zu clonieren, z.B. durch Transformation eines freizügigen prokaryotischen Organismus, Peplikation des Synthesovectors zu hoher Kopieanzalil, und Gewinnung des Synthosevoctors durch Zell-Lysis und Trennung dos Synthosovectors von Zellbruchstückchen. Dio resultierende Ernte von Synthesevector kann direkt in Hefezellen transformiert werden. Viele verschiedene Typen von Hefevektoren stehon ohne weiteres zur Verfügung und können entsprechend dafür eingesetzt werden (Parent, u.a., Yeast 1:83-138|198G|).

Verschiedene Vectoren, einschließlich Transformationsvectoren una Vectoren, die verschiedene Elemente wie spezifische Promotoren, das FI.P-Gen und ein FDPaso-Gon enthalten, sind bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, MD, hinterlogt worden, die folgendes umfassen:

1. AZ 402 Plasmid, enthält URA 3 Transcriptionsblock, flankiert von FLP-Erkennungssequenzen innerhalb einer

BgI Il/Siil I-Kassette (ATCC Nr )

2. AU 125 Plasmid, enthält ein FDPase-Gon, das operativ mit dem GPDH-Promotor verknüpft ist (ATCC Nr )

3. AZ 823 Plasmid, enthält ein FDPase-Gen (ATCC Nr ._)

4. AR 900 Plasmid, enthält das FLP-Gen, das operativ an den GaI I-Promotor mit Restrikionsstellen für die Substitution von

anderen Promotoren für den GaI I-Promotor geknüpft ict; Plasmid sorgt für regulierte Expression des HP-Gens ATCCNr.___)

5. YOp 1 Plasmid ist ein erklärendes Beispiel eines selektierbaron 2 u Plasmids (ATCC Nr.. )

6. BA 601 Plasmid, enthält mutagenisiertes(Ser-12 bis AIa) FDPase-Gen, das operativ mit dem GPDH-Promotor verknüpft

(ATCCNr )

7. M 138 Multikopioplasmid für die Expression eines cy:oplasmischen (mutagenisierten)APase-Gens (ATCC Nr )

8. N 305 Ähnlich wie M 138, nur enthält das Plasmid ein Hefecenlromer und ist daher ein Einzelkopierplasmid (ATCC Nr )

Regulierte Pro lotoren

Zahlreiche, in Hefetransformetionsv-jctoren nützliche Promotoren sind im Fachgebiet bekannt und können für die praktische Anwendung dor Erfindung verwendet werden. Wie hier ausführlicher besprochen wird, werden regulinrte Promotoren, von denen viele im Fachgebiet bekannt sind, für verschiedene erfindungsgemäße Ausführungsbeispißle bevorzugt. Beispiele für regulierte Hefepromotoren sind diejenigen vom Galactose-, Maitose-, Phosphat- oder Stickstoffmetabolismus, Isocytochrome und Alkoholdehydrogenase II. Ein spezifisches Beispiel für einen regulierten Promotor ist der von dem H6fe-Säurephosphatase-Gen (PH05). Nach Berichten wirkt der Promotor in Abhängigkeit ν ">n dom Mengen anorganischen Phosphats in dem Substrat. Es ist möglich, daß ein starker Promotor, wie der von Säurephosphatase (APase), einen höheren als den optimalen Expressionsgrad bei verschiedenen erfindungsgemaßen Ausführungsbeispielen, z. B. futilem Zyklus, ergibt. Der verlangte regulierte Promotor kann in verschiedenen Formen moduliert werden. Zum Beispiel kann eine clonierte Kopie des Säurephosphatase-Promotors in vitro mutiert werden, wobei das Verfahren von Shortle (Shortle, u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79:1588 (1982)) angewandt wird, oder es können kleine Deletion/Substitutionen innerhalb des Promotors durch Einfügung von Linkern durch bekannte Techniken erzeugt worden (McKnight und Kingsbury, Science 217:316 [1982), Heffron und McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sei I¹SA 75:6012 (19781). Eine Gruppe von DNS-Fragmenten, diedon mutierten Säurephosphatase-Promotor enthält, wird in ein He!e/ E.co'i Sltuttleplasmid eingefügt, wobei der Promotor einen nachweisbaren Markierer, zum Beispiel das Beta-Galactosidaseodf.r Beta-Lactamase-Gon von E. coli verwirklicht (Guarente und Ptashne, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 2199 11981); Rose, u.a., Proc. Netl. Acad. Sei. USA 78:2460 [1981); Martinez und Gasadaben, Mol. Cell. Biol. 3:580 [1983]; und Silvermon, u.a., Mol. Cell. Biol., 2:1212 (1982)). Transformierte Hefekolonien werden danach für die Produktion des nachweisbaren Markierers gescroent, z. B. auf Subatraton, die 5-Brom-4-chlor-3-indolyt-beta-D-Galactosid (X-gal) enthalton, wobei der verlangte Phenotyp weiße Kolonien auf stark phosphathaltigen Substraten und hellblaue Kolonien auf schwach phosphathaltigen Substraten ergibt. Auf diese Weise können sowohl starke als auch schwache Promotoren identifiziert werden. DNS wird von den Hefezellen, die einen geeigneten Phenotyp zoigu.., gewonnen und in E. coli unter Anwondung von herkömmlichen Techniken transformiert. Ampicillin-resistente Kolonien müssen das Hefeplasmid enthalten. Plasmid-DNS wird von diesen E. coli-Transformanten und der Säurephosphatasepromotor von den für die Expression verwendeten Plasmidon erzeugt.

Alternativ kann ein temperaturempfindliches Regulatorgen verwendet werden. Zum Beispiel wurde gefunden, daß viele Mutationen in den pho R- und pho U-Regulotorgenen des Säurephosphataseweges konstitutive Expression bie 36^CC und normale Regulation bei 23³C ergeben (Ueda, u.a., J. Beet., 122:911 (19751). Das interessierende Plasmid, das den PHO5 enthält, wird in einen Hefestamm transformiert, der eine temperaturempfindliche pho R- oder phoU-Mutation enthält, und der Säurephosphatasepromotor wir;¹ durch Veränderung der Kulturtemperatur in einem stark phosphathaltigen Substrat reguliert. Diese Form der Regulierung wird auch in Verbindung mit einem schwachen (mutierten) Säurephophatasopromotor angewandt.

Ein anderes Verfahren zur Regulieiung der erfindungsgemäßen Modifikation besteht in der Anwendung eines anderen regulierten Promotors, der natürlich viel schwächer als der Säurephosphatasepromotor ist. Verschiedene derartige Promotoren sind identifiziert worden. Zum Beispiel der Promoter von dem Hefegen HO. Die Expression dieses Promotors wird indirekt durch Mutationen in der Sir-Stelle gesteuert (Rine „Regulation and Transposition of Cryptic Mating type genes in Saccharomyces cerevlsiae", Doktorarbeit, Universität von Oregon in Eugene [1979)). In einer normalen „Wildtyp"-Zelle, die Mat a an dor Paarungs-Typ-Stello, eine Alpha-Kassette HML und das HO-AIIeI an der homothallischen Stelle aufweist, würde der HO-Promotor in Gang gesetzt. Wenn der Stamm dagegen eine Sir-Mutation trägt, werden Mat a und Mat alpha (von HMD verwirklich, und der HO-Promotor würde unwirksam gemacht. Daher kann ein eine temperaturernpfindliche Sir-Mutation tragender Stamm dort verwendet werden, wo der HO-Promotor bei niedriger Temperatur ausgedrückt, abor bei hoher Temperatur unterdrückt wird.

Der (oguliorte Promotor wird während des Wachsens von Bäckoreihefe „unwirksam" gemacht und am Ende dor Gärung oder in dem Brotteig durch Veränderung der Hefekulturbedingungen „in Gang" gesetzt. Wird beispielsweise der APaso-Promoto^r verwondet, wird die Hefe in Gegenwart einer regulierten Menge von Phosphat so go?üchtot, daß die Kultur das gesamte Phosphat vor Beendigung der Gärung verbraucht. Zu diesem Zeitpunkt wird der APaso-Promotor durch die Erschöpfung des Phosphates im Garbehälter induziert. Wenn u'r, temperaturempfindlichos Exprei3ionssystem verwondot wird, wird dio Kullurlemperatur so festgesetzt, daß der Promotor während des Wachsens „unwirksam" und am Ende der Gärung „wirksam" gemacht wird.

Regulierte seitenspezifische Rekombination als Mechanismus für die Expression eines futilen Zyklus

Ein Problem bei dor Optimierung der Expression eines ATP-reduzierenden Prozesses bei Backhefe liegt in der Schwierigkeit, oinen Promotoi zu identifizieren, der so reguliert werden kann, daß er während des Wachsens der Hofe unwirksam und während ' des Treibens wirk-iam gemacht werden kann. Das ist besonders schwierig, weil die Hefe für viele vorschiedone Arten von Backvorgängon eingesetzt wird, bei donen dio Konsistenz der Hefe infolge der verschiedenen Bohandlungsbedingungen, die den regulierten Promotor bnainflussen können, nicht kontrollierbar ist. Wenn oin Promotor verwendot wird, der durch die gloichon Wachstumsbedingungen reguliert wird, wie sio normalerweise für die CO₇-Erzeugung, d. h. Glycolyse, erforderlich sind, dann sollte die Hofe so haltbar wie übliche Bnckhefe sein.

Leider werden glycolytische Gene weder stark transcriptionell reguliert noch kontinuierliche während des Wachstums der Backhefe unterdruckt. Die Auslösung der Expression eines ATP-reduzierenden Prozesses durch einen glycolytischen Promotor gegen Endo dor Wachstumsgärung würde jedoch diese Einwände beseitigen.

Es wurde daher ein Versuch vorgeschlaen, bei dem dio Hefe ohne Verschwendung von ATP heranwachson kann, wobei aber der ATP-reduziorende Prozeß von einem glycolytischen Promotor während des Treibprozessos verwirklicht wird. Das erfolgt mit Hilfe eines regulieren stellenspezifischon Rekombinationsereignisses, um einen Transcriptionsblock innerhalb des Promotors zu entfernen, zum Beispiel den GPDH-Promotor, was später ausführlicher beschrieben wird. Es ist zu beachten, daß diese ungewöhnliche Expressionsstrategie für die Regulierung der Expression eine großen Vielzahl von Genen, einschließlich derjenigen, aber nicht beschränkt darauf, die Enzyme für einen futilen Zyklus oder cytoplasmische Phosphatase codieren, angewandt werden kann.

Es wurde gezeigt, daß das 2-Mikron-Plasmid von Hefe seitenspozifischer Expression zwischen zwei umgekehrten Wiederholungen unterzogen wird (Hartley und Donelson, [19QO) N.iture 286:660-864). Diese Rekombination wird durch eine spezifische Rekombinase (FLP) kataiysiert, deren Gen sich auf dom 2-Mikron-Plasmid befindet (Broach und Hicks (1980) Cell 21:501-508). Der GaII-Promotor wird durch Glucose unterdrückt und durch Galactose indu?iert (Yocum, u.a., Mol. Cell. Biol. 4:1935-1998). Wenn also der GaI I-Promotor für die Regulierung der FLP-Expression in dei Backhefe verwendet würde, vorausgesetzt, daß das natürliche 2-Mikron-Plasmid verlorengegangen war. dann wird das FL°-Gen erst verwirklicht werden, wenn Galactose /orhandon ist. Ein Züchtungsgärbehälter wurde normalerweise unter Glucose-Einschränkung betrieben, um den Crabtree-Effekt sowie die Bildung von Ethanol zu verhindern und die Produktion von Zellen zu maximieren. Es wurde gefunden, daß der GaI I-Promotor unier diesen Bedingungen nicht durch Glucose unterdrückt wird. Durch Zugabe von Galactose zu dem Gärbehälter wird daher der GaI I-Promotor mit daraus entstehender Expression des FLP-Gens induziert. Das Härten des 2-'Viikron-Plasmids von Hefo kenn beispielsweise unter Anwendung des Verfahrens von Erhart und Hollenberg, J. Bact. 156:625-o35, vorgenommen werden. Das FLP-Gen könnte auch durcn einen anderen regulierbaren Projnotor nach obiger Beschreibung verwirklicht werden.

Ein Clon des Fl P-Gens wurde daher isoliert und von dem regulierten GaI I-Promotor verwirklicht. Zu diesem Zweck wurde das 2-Mikron-Plasmid von Hefe mit Xuai digeriert und danach mit Hind III digeriert, und ein 1450 BP (Blasenpaar) Xbal/Hind Ill-Fragment wurde durch preparative Gelelektrophorese isoliert. Das isolierte Fragment wurde danach in ein herkömmliches Hefeplasmid eingefügt, das den GaI I-Promotor en den Pvu Il/Sph I-Stellen enthielt, so daß das FLP-Fragment von dem GaII-Prorr.otor zur Erzeugung von Plasmid AR900 verwirklicht wurde (Fig. 1). Dadurch war die Expression des FLP-Genproteins von dem GaI I-Promotor möglich.

Regulierung des Gall-Promotors während der kontinuierlichen Züchtung unter (ilucose-Einschränkung

Zur werteren Prüfung des GaI I-Promotors als Mechanismus für die Regulierung des FLP-Gens wurde ein Plasmid (PRY 171, · Fig.V), das den mit der ß-Gaiactosidase-Copdierungsregion von E. coli verschmolzenen Gal-Promotor enthält (Parent, u.a., supra), durch Integration in das Genom eines Laboratorium-Hefestammes, z. B. KY114, transformiert. Dieser Stamm wurdu in einem Chemostat eingeimpft, m dem die Kultur unter Glucose-Einschränkung in Hefe-Minimal-Medium gezüchtet wurde. Die Kultur wurde durch das Wachstum bei einer Vordoppelungszeit von 3,5 Stunden 48 Stunden lang stabilisiert. Galactose wurde dem Gärbehälter mit 2% Endkonzentration zugesetzt, und Proben wurden in regelmäßigen Abständen entnommen. Die ß-Galactosidase-Aktivität und die Proteinkonzentration wurden mit Hilfe von Standardtechnikon gemessen (Miller 1972, Experiments in Molecular Genetics (Versuche zur Molekulargenetik], Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Rose, u. a., 1981 Pi oc. Natl. Acad. Sei 78:2460-246-1). Wie festzustellen ist (Fig. 3), hat der GaI I-Promotor Beta-Galactosidase-Aktivität unter Bedingungen von glucoseeingeschränkten Bedingungen induziert, wenn Galactose vorhanden war. Um die Möglichkeit der Verwendung dieses galactoseinduzierbaren FLP-Gens zur Regulierung der Rekombination zu prüfen, wurde ein Hefestamm, dem endogenes 2-Mikron-Plasmid fehlte und der vorher durch Integration mit einem Plasmid, das ein hetorologes, von Tandemwiederholungen von dem 2-Mikron-Plasmid von Hefe flankiertes Gen enthielt (Hartley und Donelson, 1980 Nature 286:860-864; Sonccoff, u. a., 1985 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7270-7274; Andrews, u. a., [ 19851 Cell 40:759-803), transformiert worden war, mit einem das GaI I/FLP-Fusion-Gen enthaltenden Plasmid transformiert. Wenn dia GaI I/FLP-Fusion funktioniert, dann müßte der Stamm das heterologe Gen verwirklichen, wenn die Züchtung auf Glucose erfolgt (die den GaI I-Promotor unterdrückt). Wenn der Stamm dagegen auf Galactose gezüchtet wird, dann sollte das heterologe Gen durch Rekombination, die zu Verlust des Gens führt, aus dem Genom ausgeschnitten werden (Fig.4). Es wurde festgestellt, daß das tats* Jiüch der Fall war, weil auf Glucosesubstrat 97% der Kolonien das heterologe Gen verwirklichten, während in Galactose-Substrat 0% der Kolonien die hetorologo Genaktivität enthielten. Als nächstes wird ein Expressionsblock, z. B. eine DNS-Sequenz, die einen Transcriptionsblock wie das URA3-Hind HI-Fragment oder eine Silencer-Region oder einen Transcriptionsterminator enthält, (Brand, u.a., 1985, Cell 21:501-508) in den Promotor, z.B. der.· GPDH-Promotor, zwischen der Upstream-Aktivierurgfsequenz und der Translations-Start-Stello eingefügt. Dieses Transcriptions-Blockelement wird von DNS-Sequenzen (eingefügt als synthetische Oligonucleotido, abgebildet in Tabelle 1) flankiert, von denen gezeigt wurde, daß sie durch das FLP-Genprodukt als Substtate für stellenspezifische Rekombination erkannt werden (Senecoff, u. a., supra; Andrews, u.a., supra). Somit funktioniert die Regulierung durch die Zugabe von Galactose zu einer wachsenden, nicht glucoseunterdrückten Hefekultur. Galactose induziert die Synthese des FLP-Proteins, das ein Rokombinationsereignis zwischen den Expressionsblock flankierenden DNS-Sequenzen katalysiert. Durch das Rekombinationsereiginis wird der Expressionsblock entfernt, wodurch die Expression des heterologen Gens, z. B. des Gens für FDPase von dem GPDH-Promotor ermöglicht wird, Fig. 5.

Ein solcher, von Rekombinationsstellen umgebener Block, der in Fig.6 gozeigt wird, wurde hinterlegt und kann in den gewählten Promotor von Fachleuton eingefügt werden, indem zuerst ein BgI Il/Sal I-Linker in die Promotorsequenz an einer Stelle, die die Expression ermöglicht, eingefügt wird, wobei stellengorichtete Mutagenese gemäß der Beschreibung (Zoller und Smith NAR 10:6487-6500 (1982]; Methods Enzymol. 100:468-500 (1983), DNA 3:479-48811984)) angewandt wird, und anschließend der Transcriptionsblock von Plasmid AZ402 als ein BgI Il/SalI-Fragment eingefügt wird.

Tabelle 1 Sequenz für FLP-katelysierte stellenspezifische Rekomblnationsstelle

TCGACGCTTTGAAGITCCTATTCCGAAGTTCCTA Fortsetzung auf nächster Zeile

GCGAAACTTCAAGGATAAGGCTTCAACGAT

TTCl CTAGAAAGTATAGGAACTTCAGAGCGCTTA AAGAGATCTTTCATATCCTTGAAGTCTCGCGAATCTAG

Unter Einsatz der oben beschriebenen Vectoren und regulierten Promotoren wurden Hefestämme erzeugt, did durch höhero Geschwindigkeiten der COyErzeugung gekennzeichnet sind und solche Stämmo erzeugten, indem in den Wirtsstamm (i) ein ATP verbrauchender wirkungsloser 7yklus eingefügt wurde, und bei einem anderen erfindur.gsgomäßen Ausführungsbeispiel (ii) verstärkte cytoplasmische ATPase Aktivität erzielt wurde.

Genetische Modifikation von Back- und Bierhefestämmen

Back- und Bierhefestämme stellen ein schwierigeres Substrat für die Transfer lotion dar als Laboratoriumsstämme, weil sie polyploid sind und im allgemeinen keino a'jKO-rophen Markierer enthalten, die für die im Fachgebiet allgemein bekannten Selektionsverfahren verwendet werden können.

Allerdings kann eine modifizierte oder eine heterologe Gen/Promotor-Konstruktion, wie das an don GPDH-Promotor geknüpfte FDPase-Gen, nach später folgender Beschreibung in den für das Backen verwendeten Hefestamm eincefügt werden, wobei dominierende, drogenresistente Geno wie die antifungalen Mittel Gontamycin (G418) (Jiminez und Davies, Nature 287:869 (19801) oder Hygromycin B (Gritz und Davies, Gen 25:179-188 (1983)) verwendet werden. Als Beispiel für diesen Versuch wird ein Resistenz-Gen, das für Aminocyclitolphosphotransferase (ACTP) codiert, von dem bakteriellen Transposon TN 601 getragen, das Resistenz auf G418 überträgt, dessen Promotor aber zu schwach ist und daher bei der Verleihung von Resistenz nur teilweise wirksam ist, Jiminez und Davies, supra. Der Promotor wird gegen einen Hefepromotor ausgetauscht (;. B. den Hefe-Glyceraldehydphosphatdohydrogenase-Promotor). Es wird dann ein Plasmid konstruiert, das die verlangte Gen/Promotor-Konstruktion mit ihren natürlichen flankierenden Chromosomregionen zusammen mit dem oben beschriebenen TN 601 ACPT enthält. Dieses Plasmid enthält keinen Hefe-Replikationsursprung. Der Backhefestamm wird mit diesem Plasmid und auf G418-Platten ausgewählten Transformanten transformiert. Die Plasmid-Kopie von ACPT kann nur beständig erhalten werden, wenn das Plasmid in das Hefegenom an der natürlichen Genstelle integriert ist. Dieses führt zu einer Tandemduplikation des Gons (z. B. FDPase), getrennt durch das Plasmid und ACPT Sequenzen. Durch das Wachsen dieser Transformanten in Abwesenheit von G418 wird dor Verlust des Plasmids durch „Heraus-Drehen" (looping out) ermöglicht, wodurch entweder der „Wildtyp" oder eingeführte Sequenz übrig bleibt. Diese G418-sonsitiven Clone werden danach durch Southern-Hybridisierung von Genom DNS unter Anwendung von Oligonucleotidsonden in bezug auf das Vorhandensein der heterologen Konstruktion gescreent, wobei Standardtechniken eingesetzt werden.

(i)ATP-verbrauchende futile Zyklen

Eine genetische Modifikation zur Reduzierung der zellulären ATP-Mengen sieht dio Anwendung eines normalen metabolischen Weges in einer anormalen Weise zum Verbrauch von ATP vor, so daß die Glycolyse stimuliert wird. Am besten ist es, wenn der gewählte Weg zyklisch ist. so daß eine anormale Anwendung zu keiner signifikanten Nettoansammlung oder Erschöpfung irgendeines erforderlichen metabolischpn Zwischenproduktes, Substrates oder Produktes führt. Viele metabolische Wege können je flach den Wachstumsbedingungon oder den Anforderungen der Zelle in entgegengesetzten Richtungen verlaufen. Zum Beispiel kann Metabolit „A" in Metabolit „B", oder „B" in „A", umgewandelt werden, je nachdem, wie es von der Zelle verlangt wird. Legt man einen solchen Weg so fest, daß er gleichzeitig in beiden Richtungen verlaufen muß, dann ergibt sich keine Nettoansammlung oder kein Verlust von Metaboliten, sondern es wird die für die Einhaltung des Weges erforderliche Energie verbraucht, und es ist in dieser Hinsicht ein „futilor" Zyklus. Natürlich können andere, ι isatzliche Schritte umfassende futile Zyklen auch angewandt werden (z. B. A —· B —> C —♦ A). Transcriptions-, Translations- und i'ost-Translationsstouerungen können für das Ingangsetzen oder Abstellon solcher futiler Zyklen angewandt werden, bei denen für joden Umlauf des Zyklus ein Molekül ATP verbraucht wird, ohne daß irgendeine Nettoansammlung des Produktes oder Verlust von Substrat dabei erfolgt. In Backhefe wird die für die Verringerung der ATP-Mengen und dadurch zur Stimulierung der Glycolyse erforderliche metabolische Veränderung vorzugsweise so reguliert, daß sie nur während des Aufgehens wirksam wird.

Ein bevorzugter futiler Zyklus fur den Verbrauch von ATP ist Fructose-6-phosphat -» Fructoso-l,6-diphosphat —♦ Fructose-6-phosphat. Die an diesem Weg beteiligten Enzyme, Phosphofructokinase und Fructose-1,6-diphosphatase (FOPase oder FBPase) sind eingehend charakterisiert worden (Blocham und Lardy,The Enzymes, Bd.8, Boyer, Ph.D., Herausg. S.239-278 11973]; Uyeda, Adv. Enzymology, 48, 193-244 [1979]; Foy und Bhattachargee, Arch. Mlcroblol., 129, 215-220 [1981]; Funayama, u.a., 11979J). Durch Cionierun« des Gens für FDPase und Austausch seines Promotors gegen einen regulierten, wird das Gen beliebig verwirklicht. Es wurde gefunden, daß die Expression dieses Gens während des Wachsens auf Glucose ausreicht, um einen beträchtlichen Verlust von ATP und eine daraus folgende Erhöhung dor Geschwindigkeit der Glycolyse zu erzielen. Die Optimierung des von FDPase getriebenen futilen Zyklus verlangt Kenntnisse über die natürliche Regulierung von PDPase. Zur Erklärung wird eine kurz« Beschreibung der FDPase-Regulierung gebracht.

FDPase-Regulierung

Mit der Regulierung von FDPase haben oich eine Reihe von Wissenschaftlern beschäftigt. Um einen futilen Zyklus zwischen der Synthese und Hydrolyse von Fructose-1,6-diphosphat bei Wildtyp-Hofe zu verhindern, wird dieses Enzym schnell entaktiviert, wenn Glucose don auf nicht-f^rmentierbaren Kohlenstoffquellen wachsenden Zellen zugesetzt wird. Diese Inaktivierung von FDPase scheint in drei Stufen zu erfolgen. Eine anfängliche Inhibition von Enzymaktivität wird durch allosterische Regulierung erzielt (Lenz und Holzer, F. E. B. S. Lett., 109, 217-274 (19801; Wolf und Holzer, Transport und Utilization of Aminoacids, Peptide and Proteins by Microorganisms, Payne, J. W., Herausg. John Wiley, Chinchester, 1980; Totora, u.a., Biochem. Beiphys. Res. Comm., 100 688-695 [1981 ]). Wenn Glucose Hefezellen zugesetzt werden, steigt die Konzentration von Fructose-2,6-diphosphat innerhalb von Sekunden von nich! nachweisbaren Werten auf Konzentrationen von mehreren uM, ausreichend, um FDPase toilweise zu inhibieren. Die Mechanismen, die die Synthese von Fructose-2,6-diphosphat regulieren, sind ungeklärt (Gancedo, u. a., J. Bio!. Chem., 258,5998-599911983J). Nach anfangs schneller Inhibition läuft ein zweiter, die Phosphorylierung von FDPase umfassender Schritt in einem Zeitraum von mehreren Minuten ab (Müller und Holzer, Blochpm. Blophys. Res. Comm., 103, 926-933119811; Toiotra, u.a.. supra; Purman, u.a., Biochem. Blophys. Res. Comm., 107,1482-1489 (1982)). Das Stadium der Phosphorylierung von FDPase wird durch eine spezifische Kinase und eine spezifische Phosphatase gesteuert. Die Phosphorylierung e rfolgt bei einem bestimmten Serin-Rückstand (Muller und Holzer, supra; Mazon, u. a., J. Biol. Chem., 257 1128-1130 [1982]). Die modifizierte FDPase ist weniger aktiv als das unmodifiziorte Enzym. Schließlich scheint das phosphorylierto Enzym ein Substrat für eine spezifische Protease zu sein, die eine irreversible Inaktivierung der FDPase in einom Zeitraum von etwa einer Stunde katalysiert.

Genetische Modifikation zur Regulierung von FDPase

Es gibt mehrere genetische Möglichkeiten, die für die Blockierung dieser Inaktivierung von FDPase angewandt werden können. Mutanten, die Fructose-2,6-diphosphat nicht synthetisieren, oder die eine FDPase besitzen, die den Inhibitor nicht bindet, blockioren die Inakti vierungskaskade zu Beginn. Durch stellenspezifische Mutagenese des Serins, das ansonsten phosphoryliort

wira, entsteht ein gegenüber dem zweiten und dem dritten Schritt resistentes Enzym. Eine gewissen Enzyrnaktivität bleibt nach der anfänglichen teüwoisan inhibition durch Fructose-2,6-diphosphat zurück (Lenz und Holzer, supra; Wolf und Holzer, supra' Tortora, u.a., supra). Diese Enzymaktivität reicht aus, um einen beträchtlichen wirkungslosen Zyklus herbeizuführen. Es wurde eine Phosphorylierungsstelle (SPr₁;) in FDPase identifiziert, weil sie die einzige Konsensus-Erkennungsstelle für cAMP-abhängige Proteinkinase ist, die in dem clonierten FDPase-Gen vorhanden ist (Arg₉ - Arg,ο - Asp,, Ser,₂), und sie wurde ohne Schwierigkeiten durch herkömmliche stollenspezifische Mutagenese verändert (Zoller und Smith, supra). Es wurde gefunden, daß eine Aminosäure-Substitution für das Serin zur Verhinderung von Phosphorylierung genügt, um eine ausreichende Enzymaktivität zu erzeugen, damit ein erheblicher Grad von f utüem Zy nlus erfolgt. Allerdings wird das Enzym auch durch hohe Konzentrationen von AMP inhibiert (Taketa und Pogell, J. Biol. Chem., 240,651-662 (1965]). Für dio weitere Optimierung kann das Enzym (das schon eine gewisse Resistenz gegen AMP-Inibition infolge der Substitution an Ser,₂ hat) zusätzlich an seiner AMP-uindungsstello verändert werden, um diese Inhibition zu überwinden. Die Bindungsstelle von AMP am Enzym ist charakterisiert worden. Zur Erzielung einer verstärkten enzymatischen Aktivität für den futilon Zyklus kann diese Stelle in vitro mutagenisiert werden und wieder in Hefe eingofügt werden, und der Verlust von Inhibition durch AMP kann indirekt nachgewiesen werden. Auf Platten ermöglicht eine nicht länger durch AMP inhibierte Mutantenform des Enzyms das normale Wachsen der Hefe auf gluconeogener Kohlenstoifquelle, aber ein sehr geringfügiges auf Glucose, wodurch eine zweckmäßige Analyse einer solchen Modifikation möglich ist.

Da die an diesem futilen Zyklus beteiligten Enzyme ziemlich große HefepiOteine sind, reicht dieser Weg für den Verbrauch einer beträchtlichen Menge von ATP aus. Die Stimulierung der Glycolyse ist „fein abgestimmt", um jeden erwünschten Grad der Kohlendioxidabgabo durch Veränderung der Kopieanzahl des veränderten Fructosediphosphatase-Gens, der Stärke dos Promotors oder des in der l^:DPase oder dem FDPase-Variant-Expressionsvector verwendeten Promotors, wie beschrieben, zu erzielen.

Alternative futile Zyklen

Es gibt eine überraschend große Anzahl von alternativen futilen Zyklen, die zum Verbrauch von ATP herangezogen werden könnten. Zum Beispiel kann die Umwandlung von Phosphoenolpyruvat zu Pyruvat durch Pyruvatkinase umgekehrt werden (Katz, J. und Rognstad, R., Cur. Top. Cell. Reg., 10,237-28911976| und Reeves, R.E., Biochem. J. 125,531 [1971)). Alternativ können viele andere futile Zyklen ATP verschwenden, einschließlich der bei Aminosäurebiosynthese und -abbau, Polyphosphatsynthese und -abbau, Fettsäurebiosynthese und Pyrimidinbiosynthese festgestellten. Da alle auf dem Transcriptionsniveau streng kontrolliert werden, kann ein futiler Zyklus durch Veränderung der Regulierung dos beteiligten Enzyms durch Auswechseln seiner Promotoren induziert werden. Solche Zyklen haben jedoch zusätzliche Regelmechanismen. Im allgemeinen umfaßt die zusätzliche Regulierung Rückkopplungsinhibition oder allosterische Modulation der Enzymfunktion durch Zwischenprodukte oder Energiometaboliten. Auf Wunsch können solche allosterischen Bindungsstellen modifiziert werden, um die allosterische Inhibition in analoger Weise zu den hier im erläuterten Fall von FDPase beschriebenen Methoden auszuschalten oder zu verringern. Andere Klassen von Regulierung umfassen die Sequestierung eines der Enzyme in einer Organzelle, wenn die Substratverfügbarkeit gesteuert werden kann, odui das Einfangen unbeständiger Zwischenverbindungen in einem Enzymkomplex, so daß sie schnell in ein beständiges Zwischenprodukt umgewandelt werden können. Alle diese Wege sind potentielle induzierbare ATP-Hydrolysierungsprozesse und können daher zum Verbrauch von ATP über eine entsprechende genetische Modifikation angewandt werden.

Auf Wunsch kann die von der modifizierten Zelle verbrauchte ATP-Menge reguliert werden, um die CO₂- und Ethanolproduktion zu maximicren. Das kann durch die Verwendung eines stärkeren oder schwächeren Promoters oder durch die Modulierung seiner Aktivität erreicht werden, oder indem ein temperaturampfindliches Regulatorgan verwendet wird, dessen Grad der Regulierung von der Temperatur der Kultur abhängig ist, wie oben beschrieben wurde.

(ii) Einfügung von verstärkter Aktivität cytoplasmischorSfiurephosphatase

Eine alternative Modifikation /ur Regulierung der Glycolysegeschwindigkeit sieht die Erzeugung einer cytoplasmicchen Säurephosphataso vor, um ATP-enthaltende organische Phosphate zu hydrolysieren. Die normalerweise exozelluläre Säurephosphataso der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist eine induzierbare nicht-spezifische Phosphatase, die sich im Periplasma befindet. Das Gen für dieses Enzym wurde kürzlich cloniert und charakterisiert. (Siehe Rogers, u. a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79,2157-2161 (1982).) Wird verhindert, daß die Phosphatase in das Periplasma der Zelle ausgeschieden wird (z.B. durch genetische Modifikation, die den sekretorischen Führer des Enzyms entfernt), so wird das zur D-jphoshoryliorung organischer Phosphate im ATP-enthaltenden Cytoplasma führen. Diese nicht-spezifische Phosphävase wird jedoch auch andere wichtige organische Phosphate dephosphorylieren, wodurch schwere Senden bei dem Metabolismus der Zelle entstehen. Die Menge von „eingefangener" cytoplasmischer Phosphatase muß daher genau kontrolliert werden. Es wurde beispielsweise gefunden, daß der natürliche Promotor für Hefesäurephosphatase (PHO5) zu viel ATPase·Aktivität verwirklicht, wenn er voll induziert ist, um eine Erhöhung der Glycolysegeschwindigkeit erzielen i"u können. Um eine regulierte Methode z'im Hydrolysieren von ATP durch cytoplasmische Säurephosphatase zu erhalten, wird vorzugsweise ein schwächerer Promotor verwendet, so daß er die erwünschte Wirkung hat, wenn er voll induziert ist, oder es kann die Grundmenge eines induzierbaron Promotors verwend.it werden, wie unten erläutert wird. Dies kann auf verschiedenen Wegen erreicht werder, Beispiele dafür sind oben beschrieben worden.

(iii) Modifikation von Plasmamembrenfunktion

Ein anderes erfindungsgemäßes Ausführungsbeispiel betrifft die Plasmamembran-ATPase, bei der über ein Drittel der durch Gärung erzeugten ATP verbraucht wird, um die Konzontration von Ionen in dem Cytoplasma zu regulieren. Das ist dei Hauptweg der ATP-Hydrolyse in der Zelle. Die Stimulierung dieses Weges kann somit zur Verringerung der zollulären Mengen von ATP und dadurch zur Stimulierung der Gärung (d.h. Ethanol- und Kohlendioxiderzeugung) angewandt werden.

Es gibt gowisse Beweise, daß einige dio Plasma-Membran-Protonenpumpe beeinflussende Drogen die Zelle zur Stimulierung der Gärung anregen (Serrano, Eur, J. Biochem., 105:419 (198O]). Die ermittelte Stimulierung ist sehr gering. Die Bei utung dieses Nachweises scheint übersehen worden zu sein, und sie würde ohne weitere Arbeiten als Innerhalb des Ven> bsfehlers eingestuft werden. Die Gründe für diese Stimulierung sind noch nicht eindeutig geklärt, weil andere M'ttel (d. h.

Dicyclohexy'carbodiimid und Uiethylstilbestrol), die ebenfalls den Plasma-Membran-Protonengradienten unterbrechen, keine

Stimulierung der Gärung hervorrufen. Eine durch die vorliegende Arbeit gestützte Erklärung ist, daß Dicyclchexylcarbodiimid und Diethylstilbestrol die Plasma-Membran-ATPase inhibieren und daher die zellulären ATP-Mengen nicht verringern. Beträchtliche Schäden des allgemeinen Zellmetabolismus können auch durch die Unterbrechung anderer ATP-abhängiger Membranfunktionen hervorgerufen werden. Die Wirkung von Dinitrophenol scheint in direkter Unterbrechung cies Protonengradienten an der Plasma-Membran zu bestehen. Dadurch wird die Plasma-Membran-ATPase stimuliert, und somit werden die zellulären ATP-Mengen verringert.

Eine alternative Methode zur Stimulierung der Plasma-Membran ATPase würds in der Verwendung kleiner Proteine wie Ribonuclease bestehen (Alper, u.a., [19671, J. Baci. 93:759-765; Yphantis, u.a., (1967), J. Bact. 94:1509-1515) oder von Hefekillertoxin (Bussey und Sherman (1973] Biochimica et Biophysica Acta 298:868-875).

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird weiterhin unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert, die nur exemplarisch sind und nicht den eigentlichen Geltungsbereich der Erfindung, wie er in den Ansprüchen dargelegt wird, einschränken sollen.

Versuchebeispiele Materialien

AIIo DNS-Restriktion'j- um) Metabolismus-Enzyme wurden von New England Biolabs bezogen. Diese Enzyme wurden unter Bedingung rn und in Puffern verwendet, die von New England Biolabs vorgeschrieben wurden, mit Ausnahme von Miingbohp ..·< Exonuclease, die von PL Biochemicals bezogen und nach Vorschrift verwendet wurde. ATP und die Desoxynui leosidtriphosphate (dNTP'e), d. h. dATP, dGTP, d^TP und dTTP wurden von PL Biochemicals bezogen und I³²P) wurde von der N .w Eng'and Nuclear Corporation bezogen.

Ligations eaktionen wurden nach der Beschreibung vn Maniatis, u. a., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Molekülclonierung, Ein Lnboratoriumshandbuch) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982), dessen Offenbarung hier unter Bezugnahme einbezogen ist, unter Verwendung des auf Seite 246 beschriebenen Puffors und Anwendung einer DNS-Konzontration von 1 bis 100pg/ml bei einer Temperatur von 23 C bei stumpfendender DNS und von 16°C bei „klebrig endender" DNS durchgeführt. Die Elektrophorese wure in 0,5- bis 1,5%igen Agarosegelen vorgunommen, die 9OmM Tris-Borat, 1OmM EDTA enthielten.

Nach der DNS-Digestion wurden die Restriktionsenzyme durch 10 Minuten Erhitzen auf eine Temperatur von 65⁰C entaktiviert. Bei der Durchführung von sequentiellen Reaktionen wurde die DNS nach jedem Schritt mit 70%igem Ethanol ausgefällt. Nach dem „Einfüllen" einer Restriktionsstelle durch Reaktion mit dem großen Fragment von DNS-Polymerase (Klenow) und der vier dNTP'e wurdo das Reaktionsgemisch mit 1OmM Magnesiumchlorid zubereitet und ein gleiches Volumen von 5M Ammoniumacetat zugesetzt. Die DNS wurdo durch 10 Minuten Zentrifugieren bei 4°C in einer Eppendorf Mikrozentrifuge pelletisiert. Das Ethanol wurde abgegossen und das Pellet in lOpl/pg DNS von 0,2 M Natriumacetat gelöst. Die DNS wurde mit 2 Volumen Ethanol repräzipitiert und wie zuvor zentrifugiert. Das DNS-Pellet wurde unter Vakuum getrocknet, bevor der nächste Schritt bei der Konstruktion ausgeführt wurde. SynthetischeOligonucleotide wurden nach der Beschreibung von Maniatis, u.a., supra, kinasiert und durch Erhitzen auf CG C und langsames Abkühlen vor Gebt auch auf 4 'C wärmebehandelt. DNS-Herstellung und Transformation

Die Reinigung von „Superhelix" Plasmid-DNS von E. coli und die Transformation von E. coil erfolgten nach der Beschreibung von Maniatis, u.a., 1982, supra. Die Transformation von Hefe wurde nach der Beschreibung von Hinnen, u.U., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 7S, S. 1929 bis 1933 (1978) vorgenommen, nur wurde 1,2 M Sorbitol anstelle von 1,0M eingesetzt. Die Plasmidherstellung im geringen Umfang zum Screenen transformierter Bakterien wurde im wesentlichen nach der Beschreibung (Maniatis, u.a., 1982, supra; Holmesund Quigley, Anal. Biochem. 14, S. 19311981]) durchgeführt, nur wurde die RNAsö-Digestion nach der Restriktionsenzymdigestion durch die Zugabe von 1 μΙ einer 1 mg/ml Lösung von RNAse (Boehringer, Mannheim) zu der Vertiefung des Agarosegels unmittelbar vor der Elektrophorese ausgeführt. Stimme und Nährmpdien

Der E. coli Stamm HB101 wurde für alle bakteriellen Transformationen benutzt. Die Hefestämme DB745 (Botstein, u.a., Gene, 8, S. 17-2411979I), KY 114odorATCC26675 wurden verwendet. E. coil wurden in LB-Nährmedien mit oder ohne Ampicillin (49pg/ml) nach der Beschreibung (Maniatis, u. a., 1982, supra) gezüchtet. Vor der Transformation wurde die Hefe bei 3O⁰C in Nährmedien, die 1 % Hefooxtrakt (Difco), 1 % Bacto Peptone (Difco) und 2% Glucose enthielten, gezüchtet. Hefe-Minimal-Nährmedien enthielten 5g Ammoniumsulfat, 10gGluco?3,40mgAdenin,60mgLeucin, 2 pg Biotin, 400 pgCalciumpentothenat, 2 g Folsäure, 2g Inositol, 400pg Niacin, 100|jg p-Aminobenzoesäure, 400pg Kupfersulfat, 100pg Kaliumiodid, 200Mg Natriummolybdat, 400pg Zinksulfat, 500 mg Magnesiumsulfat, 100mg Natriumchlorid, 100mg Calciumchlorid, und 1 g (hoch-phosphathaltige Medion) oder 10mg (gering-phosphthaltige Medien) Kaliumphosphat (einbasig) je Liter. Für die Induktion dcis Säurephophiitasepmmotors wurden Zellen bei 3O⁰C auf stark phosphathaltigem Hefe-Minimal-Medium vorgezüchtet, von Phosphat frei gewaschen und auf gering-phosphathaltiges Hefe-Minimal-Medium übertragen, um die Züchtung bei 3O⁰C fortzusetzen. Die maximale Induktion erfolgte 8 bis 12 !Stunden nach der Übertragung.

Für die Dinitrophenol-Versuche wurds bei den vorliegonden Untersuchungen als Hefestamm Fleishman's aktive Trockenhefe verwendet. Die Hefe wurde in CO gezüchtet, das 1 % Hofeextrakt (Difco), 1 % Bactopepton (Difco), 0.05M Di-Kaliumphosphat enthielt, und mit Zitronensäure auf einem pH-Wert von 5,6 titriert. Die Nährmedien wurden in 10 Liter Chargen in 15-Liter-Glasballons zubereitet und 2 Stunden lang bei 121 C irn Autoklaven behandelt. Nach dem Kühlen wurde sterile Glucose bis 2% (M/V) zugesetzt. Antischaummittel wurde zur Verhinderung der Schaumbildung alle 24 Stunden zugegeben. Dinitrophenol wurde direkt in den mit Nährmedium gefüllten 15-Litei-Glaaballon gegeben, und zwar unmittelbar vor dem Zusammenbringen des Einsatzmediums mit dem Chemostaten und dem Kulturgefäß, um die gleiche Konzentration im F.insatzmndium zu erzielen. Dinitrophenol wurde als Vorratslösung in Ethanol hergestellt. Die Zellen wurden über Nacht in CO vor der Inokulation in den Chemostaten gezüchtet. Die Chemostat-Kultur wurdo in einem Modell F-2000 von New Brunswick Scientific gezüchtet. Das Kulturgefäß war durch die Anbringung eines Seitenarmes zur Erzielung eines Arboitsvolumens von 1 Liter verändert worden. Erschöpfte Kultur konnte mit Hilfe eines eingetauchten offenen Rohres aus dem Gefäß ausfließen, um Verlust an Antischaummittel zu verhindern, das sich auf der Oberfläche der Kultur anzusammeln pflegte.

Der Fermentator wurde bei 30°C und einer Rührwerkeinstellung von 4 betrieben. Stickstoff wurde kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 500cm³/min durch das Gefäß geblasen, und das Abgas wurde durch eine Feuchtigkeitsfalle aus Dry-Rite und in einen Perkin-Elmer Massonspektrometer-Gasanalysator zur Messung des Kohlendioxids geleitet. Bei kontinuierlicher Kultur wurde Nährmedium mit einer Geschwindigkeit von 250ml/ unter Einsatz einer Pharmacia-Pumpe, Modeli M 3 zugeführt. Bei der Ausführung der Kohlendioxidmessungen wurden alle Einstellungen, Volumen und Temperatui en überprüft und notfalls reguliert. Einsatzmedium, Temperatur und Bewegung erwiese;· sich als ziemlich gleichbleibend, aber die Stickstoffgaszuführung voi änderte sich bis zu 10% im Laufe eines Zeitraumes von vier Stunden. Daher wurde der Ausgang von dem Gasanalysator in einen Bandrekorder eingegeben, und die Strömungsgeschwindigkeit des Stickstoffs über einen Zeitraum von zwei Stunden manuell eingestellt. Die Strömungsgeschwindigkeit von Stickstoff und der Anteil von Kohlendioxid in dem Abms wurden in diesem Zeitraum auf Stabilität hin überprüft, bevor Messungen der Zelldichte in der Kultur vorgenommen wu ι iien. Die Kultur erwies sich daher innerhalb der Nachweisgrerizen als stabil, bevor die Messungen erfolgten. Das ergab sich aus der Reproduzierbarkeit der Daten. Die Kulturdichte wurde durch die zehnfache Verdünnung äer Kultur mit Wasser und die Ablesung der Dichte in einem Spectronic Modell 20 von Bausch und Lomb bei 600ηm gemessen. Vectorkonstruktion

Zur Minimierung der Größe es Expressionsplasmides und der Verringerung der Anzahl von Rostriktionsstellen wurde ein Plasmid konstruiert, das das Uracil 3 Gen (URA3) als Selektin isgen und den 2 u Replikationsursprung enthielt. Alternativ könnte ein anderes Hefeplasmid verwendet werden, wie YEp24 oder YEp13 oder äquivalent (Parent, u.a., supra). Das erfindungsgemäße Plasmid wurde von YIp5 (Coiaiein, u.a., supra) mit der Addition eines Haelll/Hpal-Fragmentes, dasdon Replikationsursprung vor dem 2u-Plasmid der Hefe enthielt, abgeleitet. Das Plasmid YOpI (Fig.7) wurde durch die Einfügung des 2u Ursprungs in dieEcoRI Stelle von Ylp5 konstruiert. Plasmid-DNS von YEp24 (Botstein, u.a., supra) wurde mit den Restriktionsenzymen Haelll und Hpa1 zerschnitten, und die DNS wurde auf einem 1,0%igen präparativen Agarosegel laufen gelassen. Das 1,4kb-Fraginent, das den 2u Replikationsursprung enthielt, wurde durch einen Vergleich mit dem Migrationsmuster von molekularen Markiererfrapmenten idontifiziort und in eine in die Agarose geschnittene Vertiefung elektroeluiert. Das DNS-Fragment wurde dadurch gereinigt, daß der Puffer von der Vertiefung über eine DEAE Sephacel-Säule (Maniatis, u.a., supra) geleitet wurde. Plasmid YIp5 wurde mit EcoRI unterbrochen, und die „klebrigen" Enden wurden unter Verwendung des Klenow-Fragmentes von DNS-Polymerase 1 und aller vier dNTP'e „ausgefüllt". Das Hae Ill/Ηρα 1-Fragment von YEp24 wurde in die „ausgefüllte" EcoR I-Stelle von YIp5 ligiert (Fig.7). Das Ligationsgemisch wurde in HB101 transfo" .liert, und die resultierenden ampicillin-resistenten Kolonien wurden auf das Vorhandensein des 2u Ursprungsfragmentes hin gescreant. Weil eine „ausgefüllte" EcoR 1 -Stelle, die an eine HaeIll-Stelle ligiert ist, die EcoR 1 -Stelle neu erschafft, wurde die Orientierung des Fragmentes durch Kartierung (mapping) der resultierenden EcoR 1-Stelle an Restriktionsstellen an dem Plasmid bestimmt. Für nachfolgende Konstruktionen wurde oin Plasmid (YOp 1) verwendot, dessen EcoP ' -Stelle der Psti-Stelle innerhalb des ampir.illin-resistenten Gens eng benachbart war.

Beispiel 1 Verlust von ATP durch futilen Zyklus Isolierung des Gens für Fructo <e-1,6-diphosphatase

Das Gen für FDPase wurde durch Vervollständigung einer Deletionsmutante von FDPase in E. coil (Stamm DF657, CGSC Nummer 6659) isoliert. Eine Plasmid-Reihe von „Wildtyp" Hefo-Genom-DNS in einem pBR322-Plasmidvector wurde in DF657 durch Selektion für Antibiotika-Resistenz transformiert, und ein das Hefe-FDPase-Gen tragendes Plasmid wurde durch seino Fähigkeit, das Wachsen von Bakterien auf einer gluconeogenischen Kohlenstoffquelle zu ermöglichen, identifiziert. Das Hefe FDPase-Clon wurde unter Anwendung der Didesoxynucleotid-Sequenzierungsmethode von Sanger, u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467,1977, sequentiert, Fig.8. Ein Vergleich der von der DNS-Sequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz von Hefe-FDPase zeigte eine über 50% liegende Homologie mit der Aminosäuresequenz von gereinigter Schweine-FDPase (Marcus, u.a. 119821 Proc. Notl. Acad. Sei. USA 79: 7161-7165) (Fig.9), wodurch die einwandfreie identifizierung dos Hefeclons bestätigt wurde.

Da ein fuiüer Zyklus sorgfältig reguliert werden muß, um eine vorzeitige Verschwendung von ATP zu verhindern, bestand die erste Anpassung des naturlichen FDPase-Gons im Austausch seines Promotors gegen den einer Soquenz, die während der Gärung reguliert werden konnte. Eine Analyse der Restriktionsstelle der DNS-Sequenzen von Hefe-FDPase identifizierte eine sehr dicht am Beginn der Codierungsregion liegende Ndu I-Stelle (Fig. 10). Die in vitro Mutagenese wurde für die Anpassung des 5'-Endes des C'ons für die Expression aus einem heterologen Hefepromotor verwendet, indem die Nde I-Stelle in eine Sph I-Stelle umgewandelt wurde. Das FDPase-Gen wurde zuerst in pBR322 subcloniert, um Plasmid AR705 zu erzeugen, Fig. 10. Plasmid AR 705 wurde mit Nd I digeriert und mit Mui igbohne-Exonucleas3 behandelt. Ein vier der sechs Basenpaare einer Sph I-Stelle an einem Ende und einen Xhol-Überhang an dem anderen Ende enthaltender Adapter wurde mit dem Plasmid ligieit, mit Xhol digeriert und das Plasmid unter Verwendung von T4-DNS-Ligase geschlossen, um Plasmid AT823 zu erzeugen, Fig. 10. Das Ligationsgemisch wurde in Bakierien transformiert, und ampicillin-resistente Kolonien wurden auf das Vorhandensein der Sph I- und Xhol-Stellen hin gescreent.

Das FDPase-Gen in Plasmid AT823 wurde wie folgt mit dem Promotor von dem Gen für Glycoroldehydphosphatdehydrogenase (GAP491) ligiert (Holland und Holland (1980), J. Biol. Chem. 255:2596-2600). Plasmid C603 (Fig. 13), abgeleitet von Plasmid M 903, wurde mit Kpn I digeriert, mit dem Klenow-Fragment von DNS Pol I behandelt und mit Hind III unterbrochen. Plasmid AT823 wurde mit Sph I unterbrochen, mit dem Klenow-Fragment von DNS Poll behandelt, mit Hind III unteibrochen, und das 3,8 kb Sph I/Hind HI-Fragment wurde isoliert und an das Hind Ill/Kpn l-digorierte 0605 ligiert, um Plasmid AU 125 zu erzeugen. Die Expression des FDPase-Gens in Plasmid AU 125 wird nun durch den GPDH-Promotor reguliert.

FOPase-Mutagenese

Das die FDPase mit dem heterologen Promotor enthaltende Plasmid wurde in Hofe transformiert, und die Transformantan wurden hinsichtlich dor Expression des FDPase-Clons netestet. FDPaso-Aktivität war nachweisbar, wenn die Zellen unter induzierenden Bedingungen auf einer gluconeogenischen oder glycolytischen KohlenstoHquelle gezüchtet worden waren. Bei der Züchtung unter Gärung könnten allosterische Inhibitoren und Enzymentaktivierung möglicherweise die Enzymaktivität reduzieren.

Da die Inaktivierung durch Phosphorylierung eines Serinrückstandes zustande gebracht wird, besteht eine Veränderung des erfindungsgemäßen Strukturgens in der Eliminierung dieser Phosphorylierungsstelle. Der phosphorylierte Serinrückstand wurde als Rückstand 12 identifiziert (von der einzigen cAMP-abhängigen Proteinkinase-Erkennungsstelle in der Sequenz und von Peptid-Kartierung (mapping) von gereinigtem phüsphoryliertem Enzym und Aminosäuresequenzierung des phosphorylierten Peptids [Rittenhouse, u.a., (1986) J. Biol. Chem. 261:3939-3943|). Kürzlich wurde gefunden, daß durch die Vornahme einer milden Trypsh-Digostion auf Leber-FDPase eine Aminoterminaldeletior erzeugt werden konnte, die Aktivität behielt (Chatterjee, u.a. 1985). Säugetier- ni:d Hefe-FDPase zeigen einen sehr hohen Konservierungsgrad. Es wurde eine Arninoterminaldeletion des Hefeenzyms hergestellt und auf Aktivität getestet.

Fructose-I.O-diphosphatase (FDPase) wurde auf den Hefe-GPDH-Promotor von der EeoRV-Rostriktionsstelle, die in der DNS-Sequenz innerhalb des Aminoterminus des Gens vorhanden ist, aufgesetzt (Fig. 12, AX4). Das ergab eine Aminotorminaldeletion, für Rückstand 19, der die Proteinkinase-Erkennungsstelle fehlte.

Außeidem wurde Serin !Rückstand 12) in ein Alanin unter Anwendung slellengerichteter Mutagenes umgewandelt (Zoller und Smith, supra). Es handelt sich dabei um eine konservative Umwandlung, von der nicht anzunehmen war, daß sie die Aktivität des nicht-phosphorylierten Proteins beeinflussen sondern die Phosphorylierung des Enzyms verhindern würde. Das Sei in könnte auch in ein Threonin, Valin oder Cystein oder eine andern Aminosäure unter Anwendung von stellengerichteter Mutagenese umgewandelt werden (Fig. 13). Das wurde durch Clonierung des Teiles der Sequenz um diesen Rückstand herum in einen Virus einsträngiger DNS, M13, erreicht. Es wurde ein synihetischer Oligonucleotid hergestellt, das zu dieser Region der DNS hybridisierte, aber oine solche Fehlanpassung an dem Serinrückstand war, daß die Sequenz ein alternatives Codon substituiert. Unter Anwendung des KlenowFragmentes von DNS-Polymerase Pol 1 wurde ein doppelsträngiges Molekül von diesem Hybrid erzeugt. Die Reaktion wird in Gegenwart aller vier Desoxynucleotidtriphosphate und von DNS-Ligase vorgenommen. Dieses Hybrid doppelsträngiger DNS wurde dann in Bakterien cloniert, repliziert, re-isoliert und in Bakterien zur Auflosung der beiden Stränge re-transformiert. Die Hälfte der Nachkommenschaft enthält die Sequenz für das- Surin und die andere Hälfte die substituierte Sequenz für das Alanin oder ein anderes wahlweises Codon. Sie konnten durch die Hybridisierung an ein kurzes Oligonucleotid (17 BP), das die substituierte Sequenz ergänzt, unterschieden werden. Dieses subsiituieite Gen wurde anschließend wieder in den Multikopie-GPDH-Expressionsvector nach obiger Beschreibung gesetzt und in einen Laboratoriums-Hefestamm, z.B. KY114, transfoi.-niert.

Zur Messung der Glycolyssgeschwindigkeit wurden Hefekulturen, die Clone von FDPase von dem Glyceraldehydphosphatdehydrogenase (GPDH)Promotor verwirklichen, in kleinen 1-Litef-Fermentatoren untersucht. Die Kulturen wurden chargenweise gezüchtet, und Stickstoff wurde mit 110ml/min durch die Kultur geblasen. Kohlendioxid und Zelldichie wurden regelmäßig gemessen.

Anfangs wurden Hefekulturen, die das Wildtyp-Enzym (Plasmid AU 125) und die Aminoterminaldeletion (Plasmid AX4) vorwirklichen, mit einem Konirollplasmid verglichen, das eine nicht-verwirklichte FDPase (Plasmid Ai J110) enthielt (Fig. 14). Die Menge des von den Kulturen zu Beginn des Wachstumszyklus erzeugten Kohlendioxids ist sehr ähnlich. Am Ende des Wachstumszyklus wurden jedoch erheblich größere Mengen CO? erzeugt. Die Zunahme der Kohlendioxidabgabe des die Aminoterminal-FDPase-Deletion tt igenden Stammes ist geringer als die des Stammes, der das Wildtyp-Enzym verwirklicht. Allerdings scheint die FDPase in ( esem Hefestamm nicht inaktiviert zu werden, und die Aminoterminaldeletion zeigt eine beträchtlich geringere spezifisch Aktivität als das „Wildtyp"-Enzym. Man könnte daher annehmen, daß das Wildtyp-Enzym eine größere Stimulierung der Glycolyse als das die Deletion enthaltende Enzym ergeben müßte. Es ist sehr interessant, daß die Kohlendioxidabgabe erst am Ende des Wachstumszyklus zunimmt. Das könnte bedeuten, daß FDPase allosterisch während dei oxponentiellen Wachstumspl.j-.e reguliert wird. Die wahrscheinlichsten Kandidaten für diese Regulierung sind Fruitose-2,6· diphosphat oder AMP.

Nachdem spezifische Punkt-Mutanten in der Phosphorylierungsstelle der FDPase geschaffen worden waren, wurdei die Ga.-ungsversucho wiederholt. Bei dicken Verbuchen wurde Stamm ATCC 26675, der FDPase verwirklicht, die die Serii. oder Alaninmulation von dem GPDH-Promotör enthält (Plasmid BA601) oder ein Kontrollplasmid, bei dem FÜPase nicht verwirklicht wurde (Plasmid BA802) getestet. Es zeigte sich, daß Stamm ATCC 26675 zum höchsten Grad der Inaktivierung von vielen getesteten Hofestämmen führte. Diese Kulturen müßten daher eine vorsichtige Schätzung für die mögliche Erhöhung der Gasbildungskraft erlauben.

Gärungen wurden wie zuvor vorgenommen und Kohlendioxid und Zelldichte gemessen. Die Kohlendioxidabgabe stieg auch wieder gegen Ende des Wachstumszyklus bei dem FDPase verwirklichenden Stamm an (Fig. 16). Das Gärungsexperiment wurde wiedorholt und ergab eine gute Reproduzierbarkeit. Die Kulturen wurden am Ende des Wachstumszyklus geerntet, zentrifugiert und unter Vornahme eines unten beschriebenen Gasbildungstests untersucht.

Die Gasbildungstests wurden in einer in Fig. 16 abgebildeten Apparatur vorgenommen. Der Kolben enthielt ein Gramm Zellen, ein Gramm Glucose und 10ml Nährmedium (Hefestickstoffbase, Difco) und hatte einen endgültigen OD600nm von 12. Alle Lösungen wiesen 32X auf. Das Wasserbad hatte gleichfalls eine Temperatur von 32°C. Das Rohr a blieb, nachdem der Kolben ·" in das Wasserbad gesetzt worden war, die ersten 10 Minuten offen. Die Messungen der CGyEntwicklung erfolgten regelmäßig durch Schließen von Rohr a und Messen der in Bürette Y entwickelten CGyMenge, nachdem die Menge der in Bürette Y vorhandenen Flüssigkeit auf die in Bürette X eingestellt worden war, um das in Bürotte X enthaltene Gas auf atmosphärischen Druck zu bringen. Die Messungen wurden bis zur Erzeugung von 100ml CO? vorgenommen. Die Geschwindigkeit der CO2-Erzeugung in dem die oben beschriebenen Plasmide enthaltendem Stamm wird in Fig. 17 gezeigt. Bei diesem Test wiesen die die Mutanten-FDPiise verwirklichenden Stämme eine Erhöhung der Gasbildungskraft von 25% auf.

Außer den oben be schriebenen Modifikationen betrifft die Erfindung noch die Veränderung der allosterischen Regulierung von FDPase durch Fructose-2,6-diphosphat oder AMP.

Fructose-2,6 diphosphat wird über einen enzymatischen Weg von Fructose-6-phosphat durch das Enzym Fructose-6-phosphat-2-kinase synthetisiert (Clifton und Fraenkel, J. Biol. Chem. 258:9245 [1983] und Pilkis, u.a., J. BIoI. Chem., 259:949 [1949)). Eine Methode für die Reduzierung der Inhibition von Enzymaktivität besteht in der Mutation der clonierten Kopie von FDPaso in vitro (siehe z. B. Shortle, u.a., Proc. Natl. Acad. Sei., 79:1588 (1982]) und ihre Wiedereinsetzung in die Zelle auf einom selbstreplizierenden selektierbaren Hefeplasmid, worauf die Analyse hinsichtlich des Verlustes der inhibitorischen Wirkungen von Fructose-2,6-diphosphat und AMP folgt. Im Prinzip ist der Verlust einer Stelle, an der ein allosterischer Inhibitor gebunden ist, oft eine ziemlich konservative Veränderung in der Enzymstruktur, weil selbst von einer geringfügigen Modifikation der Bindungsstelle angenommen wird, daß sie deren Affinität für Fructose-2,6-diphosphat stark verändert. Diese Annahme verlangt

eine gute Analyse für das veränderte Enzym. Da die FDPase bei gründlichem Ablauf des f utilen Zyklus unter der Kontrolle eines induzierbaron Promotors steht, sind Mutantenkolonien, die auf einer fermentierbarer, Kohlenstoffquelle wachsen, unter induzierenden Bedingungen sehr klein, aber unter nicht-induzierenden Bedingungen haben die Kolonien normale Größe. Die verdächtigen Mutantenkolonien werden ebenfalls auf eine gluconeogenische Kohlenstoffquelle aufgestrichen, auf der sie unter induzierenden Bedingungen normal wachsen. Solche Kolonie-Screening-Methoden können daher für die Analyse des veränderten Enzyms angewandt werden.

Schließlich wird die veränderte FDPase in den für das Backen verwendeten Hefestamm mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren eingefügt. Von Backhefe, die die veränderte FDPase enthält, wurde festgestellt, daß sie eine erheblich verstärkte Gehfähigkeit besitzt.

Beispiel 2 Expression von cytoplasmi&cher Säurephosphatase Herstellung des Promotorfragmentes von APase

Plasmid YIpAPII (Rogers, u. a., 1982, supra), das eine vollkommeno Kopie der großen Subeinheit, P60 (PH05) des Säurephosphataseenzyms c nthielt wurde mit verschiedenen Kestriktionsenzymen kartiert (mapped), und von Hpall wurde ermittelt, daß es ein 700BP Hes.mktionsfragment ergab, das 600BP Upstream-DNS-Sequenz von dem Initiator- (oder Start-)· Codnn für das Strukturgen enthielt, dessen Position durch Bezugnahme auf die Clal-Stelle an dem Fragment bekannt ist (ThiM, u.a., Molecular Cell Biology. 3, S. 570-579 [1983I) Plasmid YIpAPII wurde mit Hpall unterbrochen und die DNS auf einem 1,5°/cigen präpcrativen Agatosegel laufen gelassen. Die Bande von 700BP, dioden Promotor enthielt, wurde in eine in das Gel geschnittene Vertiefung wie zuvor elektroeluiert und auf einer DEAE Sephacel Säule gereinigt. Das Fragment wurde nvi YOpI vermischt, mit CIaI unterbrochen, und die DNS wurde mit T4-DNS-Ligase ligiert. Da Hpall und CIaI sich selbst ergänzende „klebrige Enden" haben, werden d »se DNSn zusammen ligieren. Das Ligationsgemisch wurde in HB101 transformiert, und die Ampicillin-Kolonien wurden auf das Vorhandensein des Promotorfragmentes hin gescreent. Ein solches Plasmid, 9?0 (siehe Fig. 18), wurde für weitere Konstruktionen verwendet.

Von der DNS-Sequenz des Fragmentes des Säurephosphatase-(PH05)-Gens, Fig.3, (Thill, u.a., 1983, supra; Arima, u.a., N. A. R. 11, S. 1657-1672 [1983]) wurde ein Gebiet mit vier der sechs Basen emer BgI H-Restriktions-tndonucloaso-F.rkennungsstelle 5BP aufwärts von dem Initiator-ATG identifiziert. Diosos Gebiet wurde zur Schaffung einer Bglll-Stelle an diesem Punkt in der APase-Promotorsequenz unter Anwendung eines synthetischen Oligonucleotid-Linkers mit der sich selbst-'j;gänzenden Sequenz CTAGCATGCTAG verwondet.

Plasmid 920 wurde mit Kpnl unterbrochen (siehe Fig.20), und die DNS wurde mit der cioppelsträngigen Exonucleaso Bal31 behandelt (Legerski, u.a., N. A.R., 5, S. 1145-1463 11978]). In bestimmten Zeitintervallen wurde die Reaktion durch die Zugabe von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bis0,05M gestoppt (Legerski, u.a., J1978]), supra). Eine Portion dosPlasmids von jedem Zeitintervall wurde mit CIaI digeriert und auf einem 12%igen Polyacrylamidgel laufen gelassen. Der Zeitpunkt, zu dom das 300 BP Clal/Kpnl-Fragment zu annähernd 270 BP digeriert worden war, wurde notiert. Der Rest des BaI 31 -behandelten Plasmids von diesem Zeitpunkt wurde mit dem Klenow-Fragment von DNS-Polymerase I und den vier dNTPE'n behandelt. Ein Linker mit der selbst-ergänzenden Sequenz CTAGCATGCTAG wurde kinasiert, wärmebehandelt und an diese Plasmid-DNS ligiert. Die DNS wurde danach mit T4-DNSLigaso zirkuliert und in HB101 transformiert. Annähernd zweitausend ampicillin-resistente Kolonien wurden von den Platten abgewaschen und Superhelix-(supercoiled)-Plasmid-DNS wurde von diesen E. coil Zellen erzeugt (Maniatis, u.a., 1982, supra). Diese gesammelte Plasmid-DNS wurde mit dem Restriktionsenzym BgIII unterbrochen, und die DNS wurdo auf einen präpnrativen Agarosegol auslaufen gelassen. Die als eine unterbrochene lineare Bande laufende DNS wurde in eine in das Agarosegel geschnittene Vertiefung eluiert und auf eine DEAE Sephacel-Säule gereinigt. Diese gereinigte DNS wurde mit TIDNSLijjaso rezirkuliert und in HB101 transformiert. Ampicillin-resistente Kolonien wurden auf das Vorhandensein von einer BGIII-Stelle pescreent. Der e'nzige Weg für das Plasmid, eine BGIII·Stelle zu erhalten, bestand darin, daß diese Stelle an der Verbindungsstelle dor BaI 31 -digerierten DNS und des Linkers geschaffen wurde. Die einzige verfügbare Sequenz, an der das innerhalb mehrerer Hundert BP vor der Kpnl-Stelle stattfinden konnte, liegt 5B vordem ATG-Initiierungscodon. Ein solches, eine Bglll-Stelle enthaltendes Plasmid, D718, (Fig.20) wurde überprüft und erfüllte nach der Didesoxynucleotid-Sequenziurungemethode von Sanger (Sanger, u.a., Proc. Netl. Acad. Sei., 74, S. 5463-5467 119771) die Erwartungen.

Plasmid YIpAP 11 wurde bei der American Type Culture Collection in E. coli HB101 wie folgt hinterlegt: E. coll HB101 (YIpYPII) — ATCC Nr.39570

Schaffung einer Restriktionsstelle an der Führer/Nativprotein-Verbindungsstelle

Bei eier Sequenz von Säurephosphatase-Gen kann man erkennen (Fig. 18), daß es eine Kpnl-Stelle nahe dem Beginn der ausgereiften Sequenz gibt. Dadurch konnte eine Restriktionsstelle an der Verbindungsstelle von Führersoquenz und Sequenz dos ausgereiften Proteins unter Anwendung eines synthetischen Oligonucleotids der Sequenz GCTCGAGGTAC

CGAGCTC

eingeführt werden. Da es mehrere Kpn !-Stellen in dem Säurephosphatase-Gen gibt, mußte ein Fragment von dem D'-Ende dos Gens subcloniert weiden. Plasmid YIpAP 11 wurde mit BamH! und Sal I unterbrochen, und das den Promotor enthaltende Fragment wurde in die BamH I/Sal !Stellen von YOp I »ubcloniert (Fig. 21). Transformierte Bakterien wurden gescreent, <jnd von Plasmid 801 wurde eimittclt, daß es die richtige Sequenz hat. Zur Einfügung einor Restriktionsstelle an dem fi'-F.nde der ausgereiften Sequenz wurde Pliismid 801 mit KPn I unterbrochen und der oben beschriebene Adapter mit der Kpn I-Stelle ligiert (Fig. 21). Das Plasmid wurde anschließend mit BamH I unterbrochen, und die Stelle wurde mit dem Klenow-Fragment von DNS-Pclmorase I „ausgefüllt" und das Plasmid rezirkuliert. Transformierte Bakterienkolonien wurden auf das Vorhandensein des Adapters gescreeni. Ein derartiges Plasmid (J 401) wurde für weitere Konstruktionen verwendet. Wie aus Fig. 21 zu sehen ist, schafft der Adapter eme Xhol-Stelle an der Verbindungsstelle der Führer- und ausgereiften Säurephosphatase, so daß bei Unte¹ brechung des Piasmids mit Xhol und Digestion des Überhbnges mit Mungbohnen-Exonuclease eine stumpfe Stelle in der richtigen Position in der Sequenz am Beginn der ausgereiften Codierungsregion geschaffen wird.

Synthese eines „führerlosen" Clons von Säurephosphutase

Zunächst wurde von Plasmid 401 eine Kopie voller Länge von Säurephosphatase konstruiert. Plasmid YIpAP 11 wurde mit RamHI unterbrochen, der 5'-Überhang mit dem Klenow-Fragment von DNS-Polymerase I „ausgefüllt" und danach mit Sail unterbrochen, und das das APase-Gen enthaltende BamH I/Sal I-Fragment wurde durch präp arative Gelelektrophorese gereinigt.

Dieses Fragment wurde dann in SaI I/Nru I-Stellen von Plasmid J 401 ligiert (Fig. 22). Eine an tfine Nru I-Stelle ligierte „ausgefüllte" BamH I-Stelle erschafft die BamH I-Stelle neu. Als nächstes wurde der Säurephosphatase-Promotor wieder an das Strukturgen angefügt. Plasmid 0718 wurde mit BgIiI unterbrochen, und ein Adapter mit der Sequenz GATCACCAATG TGGTTAC,

der die Säurephosphatase-Promotorsequenz für das Initiator-Methionin-Codon neuerschafft, wurde mit der BgLII-Stelle ligiert. Das Plasmid wurde anschließend mit EcoRI unterbrochen, und das EcoRI bis Bglll-Adapter-Fragment (Fig. 22) wurde in Plasmid K 219 cloniert, das mit Xhol unterbrochen, mit Mungbohnen-Exonuclease behandelt, um die Enden der DNS zu ebnen, und dann mit EcoRI unterbrochen worden war. Transformanten wurden gescreent, und die richtigen Restriktionsfragmente enthaltende Plasmide wurden untei Anwendung der Didosoxynucleotid-Sequenzierungsmethode sequenziert. Von Plasmid M138 wurde ermittelt, daß es die richtige Sequenz an der Verbindungsstelle des Promotors und des ausgereiften Gens hat.

Addition eines Hefe-Centromeren zu dem Plasmid

Der Säurephosphatase Promotor ist etwa 10OOfach induzierbar. Die Kopieanzahl eines 2 u-Ursprung-Plasmids auf etwa 1 Kopie pro Zelle.

Plasmid M138 wurde mit EcoRI unterbrochen, und die Enden wurden mit dem KlenowFragment von DNS-Polymeraso I geebnet. Als nächstes wurde Plasmid YCP19 (Fig. 23), das das Centromere von Chromosom 4 von Hefe enthält (Parent, u.a., supra), mit Hindlll unterbrochen, und die Enden wurden mit dem Klonow-Fragment von DSN-Polymerase i geebnet. Das das Centomere enthaltende Fragment wurde dann in die EcoRI-Stelle von M138 ligiert, um Plasmid N305 zu er/euyen (Fig. 22).

Expression cytoplasmischer Säurephosphatase

Die Plasmide M 138 und N305 wurden zusammen mit einem Kontrollplasmid M721 in Hefe transformiert. UracÜ-Pro'otrophe wurden ausgewählt und in stark-phosphathaltigem MO-Medium, das einen Überschuß von Glucose (4%) enthielt, in einem 1-Liter-Fermenter, Modoll F-200 von New Brunswick Scientific, gezüchtet. Während des Wachsens wurde die Zelldichte unter Einsatz eines Spectronic, Modell 20 von Bausch und Lomb, bei 600nm gemessen. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 1 und 2 enthalten. Der Fermentef wurde bei 3O⁰C und einer Rührwerkeinstellung von 4 betrieben. Stickstoff -vurde kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit Von 430Cm³ZmJn durch das Gefäß geblasen, und das Abgas wurde durch eino Feuchtigkeitsfalle von Dry-Rite und in einen Massenspektromoter-Gasanalysatoi von Porkin Eimer zur Messung von CO; geloitet.

Tabelle 2 Kohlendloxid-Entwicklung in uninduzierten Kulturen KontrollPlasmid M 721

Zeit, Minuton	Zellanzahl (x 106)	% Kohlendioxid
0	0,25	0,08
80	0,64	0,21
150	0,90	0,16
215	1,35	0,19
280	1,8	0,26
340	2,3	0,34
405	3,3	0.45
470	4,75	0,61
520	6,25	0,73
580	7,0	0,79
630	8,5	0,85
690	10,0	0,85
710	11,0	0,75
Plasmid N 305
Zeit, Minuten	Zellenzahl (x 106)	% Kohlendioxid
0	1,1	0,17
60	1.35	0,22
108	1,5	0,26
165	2,0	0,35
245	3,0	0,50
345	5,0	0,76
390	6,5	0,92
465	8,5	1,05
520	10,0	1,15
610	14,5	1,02
685	16,0	0,86

Plasmid M 138	Zellanzahl (χ 106)	'/ο Kohlendioxid
Zeit, Minuten	2,7	3,72
O	3,5 (	),77
48	4,0 (	),87
77	5,0	,02
107	7,2	,31
165	8,0	1,56
TO	8,5	1,70
238	10,5	,75
286	13,0 1	,75
363	16,5 1	.65
450	20,0	,60
568	21,0	,44
632

Die von den Stämmen, die i.'ie drei verschiedenen Plasmide tragen, während der Züchtung auf hoch-phosphathaltigen Medien erzeugte Kohlendioxidmenge erwies sich als variabel (Tabelle 1). Danach reicht die grundlegende Höhe der Promotoraktivität in hoch-phosphathaltigen Medien aus, um einen Einfluß auf die Glycolysegeschwindigkeitzu erzielen. Beim Zusammenstellen der Dalfin und deren Normalisierung für das gleiche Stadium in dem Wachstumszykl'is wurde festgestellt, daß die Kohlendioxidmenge, die von in hoch-phosphathaltigen Medien wachsenden Kulturen erzeugt wird, mit der Kopieanzahl des Plasmids zunahm. Der das Mullikopie-Plasmid tragende Stamm erzeugte die doppelte Menge Kohlendioxid als d'j Kontrolle, und der das Emzelkopie-Plasmid tragende Stamm erzeugte eine mittlere Menge. Somit kann die Menge von Säurephosphatase gesteuert werden, wodurch die Menge cytoplasmischer ATP erfindungsgemäß gesteuert und die Produktionsgeschwindigkeit von Kohlendioxid erhöht warden kann.

Beitpiel 3

Der Einfluß von Plasma-Membran-Entkopplern auf die Glycolysegeschwindigkeit

Wenn zunehmende Mengen 2,4-Dinitrophenol zu stabilen Chemostat-Kulturen von Fleishman's Backhefe gegeben wurden, war eine erhebliche Stimulierung der Kohlendioxiderzeugung <u beobachten.

Anfängliche Versuche wurden zur Bestimmung der grundlegenden Menge von Kohlendioxid pro Zelle unter durch den Ciibmostaten definierten Wachstumsbedingungen und zur Ermittlung der Stabilität der Kul.'ur durchgeführt. Eine Über-Nacht-Kultur wurde in den Chemostaten eingeimpft und vierundzwanzig Stunden lang aus Chargenkultur gezüchtet. Mit der Nährme diumszugabe wurde begonnen, und die Kultur wurde zur Stabilisierung weitere vierundzwanzig Stunden lang stehen gelassen, bevor die Messungen » jrgenommen wurden. Die Kohlendioxiderzeugung und die Zellenanzahl wurden über einen Zeitraum von achtundvierzig Stunden verfolgt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3 onthalten. Die Zeit ist in Stunden nach Beginn der Nährmediumzugabe angegeben. Kohlendioxid wird als %-Anteil in dem Gasstrom angeführt.

Tabelle 3: Chemostat-Stabilitat

Zeit nach Beginn	Kulturdichte	Zellanzahl	Kohlendioxid
			im
Stunden	O. D. 600 nm	Zellen/ml χ 10~8	Abgas, %
26	0,33	1,1	2,4
29,5	0,32	1,1	2,3
32	0,31	1,1	2,2
34	0,33	1,1	2,2
50	0,31	1,0	2,3

Die Kultur erwies sich als verhältnismäßig stabil.

Dinitrophenol wurde dem Nährmedium mit 5uM zugesetzt. Dinitrophenol wurde ebenfalls dem Kulturkolbon mit 5uM zugesetzt, wie in Experimental Procedures angegeben wir*

Die KuKur wurde achtundvierzig Stunden lang zum Stabilisieren stehen gelassen. Wie aus Tabelle 4 zu erkennen ist, hatten 5uM Dinitrophenol wenig Einfluß auf die Kohlendioxiderzeugung.

Tabelle 4: Der Einfluß von Dinitrophenol auf die Garungsgeschwindigkeit

Konzentration Kulturdichte Kohlendioxid Relative Kohlen-

von Dinitrophenol Zellen/ml χ 10 ⁸ im Abgas % dioxiderzeugur^

pro Zelle

1,1

1,1

0,75

0,75

0,67

0,55

1,1

2,2

2,3

1,8b

2,0

2,0

1,9

2,3

1,0 1,0 1,2 1,3 1,5 1,7 1,0

O 3 Konzentration von Dinitrophenol in der Kultur wurde schrittweise allmählich auf 20OuM erhöht. Nach jeder schrittweisen Zugebe von Dinitrophenol wurde die Kultur sechsunddreißig bis achtundvierzig Stunden lang zum Stabilisieren stehen gelassen, bevor die Zelldichte und die Kohlendioxidkonzentration gemessen wurden. Wie aus der obigen Tabelle 4 hervorgeht, war mit zunehmender Konzentration von Dinitrophenol eine Zunahme in der pro Zelle erzeugten Kohlendioxidmenge festzustellen.

Hätte der Einfluß von Dinitrophenol auf den Zellmetabolismus in der Entkopplung der Plasma-Mombran-ATPase bestanden, dann wäre eine Zunahme der Kohlendioxiderzeugung und eine entsprechende Veiringerung der Zelldichte zu erwarten gewesen. Es sollte beachtet werden, daß die Dissipation des Plasma-Membran-Ionsngradionten gleichfalls andere zelluläre Prozesse, die von diesem lonengradienten abhängig sind, d. h. Transport, boeinflußt. Es dürfte daher kaum überraschen, wenn sich herausstellt, daß der metabolische Wirkungsgrad der Zelle durch diese Behandlung reduziert worden ist. Dieser Grad der Stimulierung der Glycolyse wäre daher als ein Minimum anzusehen.

Die Versuche haben gezeigt, daß die Kohlendioxiderzeugung in einer dosisabhängigen Weise durch Dinitrophenol stimuliert werden kann. Dor Stirmilicrungsgrad orwies sich als ausgesprochen reproduzierbar und führte zu einer mehr als doppelten Zunahme der Kohlendioxiderzougung bei den höchsten angewandten Konzentrationen.

Claims (18)

1. Verfahren zur Erhöhung der Geschwindigkeit der Kohlendioxid- und Ethanolerzeugung von Hefe, gekennzeichnet dadurch, daß die innerhalb der Zelle vorhandene ATP-Menge reduziert und
dadurch die Glycolyse stimuliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die ATP-Menge reduziert wird, indem in dem Hefegenotyp ein regulierbarer Promotor für den natürlichen Promotor eines Gens, das ein metabolisches Enzym codiert, substituiert wird, der die regulierbare Expression des Enzyms
ermöglicht, wodurch die durch das Enzym katalysierte metabolische Reaktion gleichzeitig mit der reversiblen Reaktion so ablaufen kann, daß ATP verbraucht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß das metabolische Enzym codierte Ger, genetisch modifiziert wird, um allosterische oder anderweitige Inhibition oder Inaktivierung des Enzyms zu verhindern oder auszuschließen.

4. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Enzym um Fructose-1,6-diphosphat (FDPase) handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß das FDPase codierende Gen so
mutagenisiertwird, daß Codon 12 des mutagenisierten Genseine andere Aminosäure als Serin codiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, d&ß das FDPase codierende Gen weiterhin so mutagenisiert wird, daß die allosterische Inhibition des Enzyms durch Fructose 2,6-cliphosphat verringert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß das FDPase codierende Gen weiterhin so mutagenisiert wird, daß die allosterische Inhibition des Enzyms durch Adenosinmonophosphat verringert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym codierende Gen während der Produktionsphase der HefezC' .htung nicht verwirklicht wird.

9. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem regulierbaren Promotor um einen temperaturempfindlichen Promotor handelt, so daß das Enzym codierende Geil nur bei einer bestimmten Temperatur verwirklich* wird.

10. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Expression unter der Kontrolle einer durch FLP-Protein katalysierten, regulierten genetischen Rekombination stattfindet.

11. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß die ATP-Menge durch genetische
Modifizierung eines Gens für eine exozelluläre Säurephosphatase (Apase) reduziert wird, so daß die Apase innerhalb des Hefecytoplasmas bleibt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, daß die genetische Modifizierung darin
besteht, daß ein Vector, der ein eme ausgereifte Apase ohne eine funktionell« sekretorische
Führersequenz codierendes Gen enthält, in die Hefe eingefügt wird.

13. Verfahrennach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß der Vector ein autonom replisierendes Einzelkopie-, Centromer enthaltendes Plasmid aufweist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß der Vector ein den Hefe 2u-Ursprung oder eine Replikation enthaltendes Multikopie-Plasmid aufweist.

15. Verfahrer nach Anspruch 12, gekennzeichnet dadurch, daß der Vector in das Genom der Hefe
eingefügt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die ATP-Menge verringert wird, indem in den Hefe-Genotyp ein Gen eingefügt wird, das ein metabolisches Enzym unter der
Expressionskontrolle eines Promotors, der die konstitutive Expression des Gens ermöglicht,
codiert, wodurch die durch das Enzym katalysierte metabolische Reaktion gleichzeitig mit der
reversiblen Reaktion so ablaufen kann, daß ATP verbraucht wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, gekennzeichnet dadurch, daß die Expression weiterhin unter der
Kontrolle einer durch FLP-Protein katalysierten, regulierten genetischen Rekombination erfolgt.

18. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die ATP-Menge durch die Behandlung der Hefe mit <*iner Chemikalie verringert wird, die die Fähigkeit zur direkten oder indirekten
Induzierung des Verbrauchs von ATP besitzt.

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