DD277697A1

DD277697A1 - Verfahren zur herstellung von 2 alpha, 3 alpha, 6 alpha -trihydroxy-5 alpha- androstan-17-on

Info

Publication number: DD277697A1
Application number: DD32258188A
Authority: DD
Inventors: Karl-Heinz Boehme; Hans-Matthias Vorbrodt; Claere Hoerhold; Guenter Adam; Sabine Daenhardt; Andrea Porzel
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1988-12-05
Filing date: 1988-12-05
Publication date: 1990-04-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren von 2a,3a,6a-Trihydroxy-5a-androstan-17-on durch mikrobiellen Abbau von 2a,3a-Dihydroxy-5a-cholestan-6-on. Erfindungsgemaess wird das Substrat in feinverteilter Form einer Kultur eines zum Sterol-Seitenkettenabbau befaehigten bakteriellen Mikroorganismus, vorzugsweise der Gattung Mycobacterium, zugesetzt und zu 2a,3a,6a-Trihydroxy-5a-androstan-17-on fermentiert. Wie gefunden wurde, laeuft das Verfahren bei Einsatz ausgewaehlter Staemme aus den Arten Mycobacterium vaccae sowie Mycobacterium fortuitum besonders effektiv ab. Die erfindungsgemaess hergestellte Verbindung dient als Zwischenprodukt fuer die Herstellung von Steroidpharmaka.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2α,3α,6α-Trihydroxy-5α-androstan-17-on. 2a,3a,6a-Trihydroxy-5aandrostan-17-on ist ein bisher nicht beschriebenes Steroid, welches auf Grund verschiedener reaktiver Zentren im Molekül als Zwischenprodukt zur Herstellung von Steroidpharmaka einsetzbar ist

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der pharmazeutisch-chemischen Forschung und Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es ist bekannt, daß Sterole, wie ζ. B. Cholesterol, Sitosterol, Stigmasterol, Campesterol und Ergosterol, durch Mikroorganismen aus zahlreichen Gattungen, insbesondere mit Enzymdefektmuianten von Mykobakterien, zu Ci₉-Steroiden, wie z. B. 4-Androsten-3,17-dion und 1,4-Androstadien-3,17-dion, abgebaut werden können (siehe z.B. die Patentschrift JP 7973191 oder JP 80148 083). Durch die mikrobielle Hydroxylierung von 4-Androsten-3,17-dion mit Penicillin sp. ATCC12556 erhielt man in geringen Ausbeuten als Nebenprodukt die 2ß-Hydroxy-Verbindung von 4-Androsten-3,17-dion (siehe Patentschrift US 2805231). Verfahren zur Herstellung von 2a,3a,6a-Trihydroxy-5a-androstan-17-on sind bisher nicht bekannt.

Ziel der Erfindung

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von 2α,3α,6α-Trihydroxy-5α-androstan-17-on.

Darlegung des Wecens der Erfindung

Dor Erfindung liogt din Aufgabe zugrunde, oin mil mhiollos Verfahron zur Herstellung von 2«,3a,6a-Trihydroxy-5aondrostan-17· on aus 2a,3a-Dihydioxy-5a-cholostan-6-on zu boschroibon.

Erfindungsgomaß wird clio Auigabo dadurch gelöst, daß man 2a,3a-Dihydroxy-5a-cholestan-6-on mit bakteriellen Mikroorganismen, dia zum Soitonkottonobbau von Storolen befähigt sind, beispielsweise aus der Gattung Mycobacterium, formontiort. Es wird formontiort in Modion, die Kohlenstoffquollon, wie beispielsweise Glukose, Saccharose, Glycerol, und Stickstoffquollon, wio boispiolswoiso Hofuoxtrakt, Harnstoff, Ammoniumsalze sowie Minoralsalzo verschiedener Zusammor sotzung onthalton. Dio Formontaüon orstreckt sich über 24 Stunden bis 72 Stunden und wird bei 2O⁰C bis 37°C,

vorzugsweise bei 28°C bei pH-Werten im Bereich von pH 6 bis pH 8 unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Das Fermentationsmedium wird nach beendeter Fermentation mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform, extrahiert und der Rohextrakt durch Destillation zur Trockne gebracht. Anschließend wird das gewünschte 2a,3a,6a-Trihydroxy-5a-androstan-17-on aus dem Produktgemisch durch an sich bekannte Trennmethoden wie Säulenchromatographie und/oder präparative Dünnschichtchromatographie isoliert und weiter durch an sich bekannte Verfahrensschritte, beispielsweise Umkristallisation, gereinigt.

Im weiteren Ausbau des Verfahrens werden Mikroorganismen der Art Mycobacterium vaccae oder Mycobacterium fortuitum zur Fermentation eingesetzt.

Das Verfahren wird vorteilhaft wie folgt ausgeführt:

Die für das Verfahren dienende Ausgangssubstanz kann nach M.Kondound K. Mori (siehe Agric. Biol.Chem.47,97 [1983) hergestellt werden. Ein Bakterienstamm der Gattung Mycobacterium, vorzugsweise Mycobacterium vaccae LA 12 oder Mycobacterium fortuitum N3/138 wird auf Schrägagar (20g Glycerol, 5g Bacto-Pepton, 3g Fleischextrakt, 15 g Agar-Agar ad 1000ml Aqua dest.; pH7) in Kulturröhrchen bei 28⁰C 48 Stunden bis 96 Stunden kultiviert.

Ein Röhrchen dieser Vorkultur wird als Impfmaterial für je einen Standkolben mit 50ml einer Nährlösung folgender Zusammensetzung verwendet: 10g Glucose, 10g Hefeextrakt, 0,5g KH₂PO₄,0,5g K₂HPO₄,1,5g (NH₄I₂HPO₄,0,2g MgSO₄ · /H₂O, 0,01 g FeSO₄ · 7 H₂0,0,002g ZnSO₄ · 7 H₂O, Aqua dest. ad 1000 ml; pH 7. Nach Schütteln bei 28⁰C + 3°C werden nach 24 Stunden bis 36 Stunden mit 5% bis 10% der so erhaltenen Submerskultur weitere Standkolben, die das gleiche Nährmedium erhalten, beimpft. Zu diesen Standkolben wird nach 24stündigem Schütteln bei 28⁰C ± 3°C das Substrat (2a,3a-Dihydroxy-5a-cholestan-6-on) in einer Konzentration von 0,05g/l bis 1 g/l, gelöst in wenig Methanol, Äthanol, Dimethylformamid u.a. zugesetzt und weiter fermentiert, bis eine maximale Substratumwandlung erreichbar ist. Nach Beendigung der Fermentation wird das Kulturmedium mit einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Chloroform, Methylenchlorid, Äther, Äthylacetat, Butylacetat u. a.

extrahiert und der Rohextrakt durch Destillation zur Trockne eingedampft und an Kieselgel unter Verwendung von Cnloroform/ Methanol oder Essigsäureethylester/Benzin als Elutionsmittel chromatographiert.

Im Zusammenhang mit Herstellungsverfahren von Androst-4-en-3,17-dion und 9a-Hydroxy-androst-4-en-3,17-dion wurden in früheren Anmeldungen des Zentralinstitutes in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR - ZIMET, Beutenbergstr. 11, Jena, DDR-6900 unter den Registriernummern die Mikroorganismen-Stämme Mycobacterium vaccae LA 12 ZIMET 11094 und Mycobacterium fortuitum N3/138 ZIMET10850 hinterlegt.

2a,3a,6a-Trihydroxy-5a-androstan-17-on besitzt eine Aromatase-Hemmer-Wirkung der menschlichen Placenta. Weiterhin ist es ein günstiges Ausgangsprodukt für Brassinosteroide und deren Analoga, die gegenwärtig als Antistressfaktoren in der Landwirtschaft getestet werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Mycobacterium vaccae LA 12 wird 48 Stunden bis 96 Stunden bei 28°C auf Schrägagar folgender Zusammensetzung kultiviert:

20g Glycerol, 5g Bacto-Pepton, 3g Fleischextrakt, 15g Agar-Agar ad 1000ml Aqua dest.; pH 7,0. Mit den abgeschwemmten Zellen je eines Röhrchens werden 5 Stück 500-ml-S;~ndkolben mit je 50ml Nährlösung folgender Zusammensetzung beimpft:

10g Glukose, 10g Hefeextrakt, 0,5g KH₂PO₄, 0,5g K₂HPO₄,1,5g (NH₄I₂HPO₄,0,2g MgSO₄ · 7H₂0,0,01 g FeSO₄ · 7H₂O, 0,002g ZnSO₄ · 7H₂O, Aqua dest. ad 1000ml; pH 7,0. Nach 36stündigem Schütteln bei 28⁰C wird diese Submerskultur bei einem In'pfverhältnisvon 1:10 zur Beimpfung von weiteren 20 Standkolben mit je 100 ml Nährlösung verwendet. Zu diesen 20 Standkolben werden nach 24stündigem Schütteln bei 28^rC 200mg 2a, Sa-Dihydroxy-öa-cholestan-e-on, gelöst in 20ml Methanol, gleichmäßig verteilt zugegeben. Nach weiterem 72stündigem Schütteln wird die vereinigte Kulturlösung 3mal mit Chloroform extrahiert, das Lösungsmittel abdestilliert und der eingeengte Rohextrakt im Vakuum zur Trockne gebracht.

Der Rückstand wirdan 25g Kieselgel G 60 unter Verwendung von CHCI₃/CH₃OH (9:1) chromatographiert.

Elution mit Chloroform/Methanol (9:1) liefert 2a,3a,6a-Trihydroxy-androstan-17-on.

Ausbeute: 50mg (40%), lall⁹ + 44,6"(CHCI₃, c = 1,5)

I_R γ CDCI_{3 cm} 1-3350 (oh); 1740 (Fünfringketon); max

ORD:/0/₂₇₅ - 5098°, /0/_3OO O^o,/0/_32O+67O8°,a=+161; ¹H-NMR (200MHz, Py-d5-TMS):50,778(s,H₃-18);0,919(s,H₃-19); 2,982

(ddd.J = 13,9; 3,4 und 2~,6Hz(H,-4); 3,715 (ddd, J = 10,7,10,7 und 4,5Hz H,-6ß), 4,125 (ddd, J = 11,4, 5,2 und 5,5Hz H,-2ß); 4,476 (dd, J = 5,5 und 2,6Hz H,-3ß);

MS m/z (%): 322 (M*, 61), 304 (72), 286 (80), 260 (100), 229 (20), 216 (48), 197 (18); HA-MS: 322,2150 (C₁₉H₃₀O₄); 304,2032 (C₁₉H₂₈O₃), 286,1924 (C₁₃H₂₆O₂), 260,1768 (C₁₇H₂₄O₂), 216,1514 (C₁₅H₂₀O).

Beispiel 2

Bei Einsatz von 1 mg 2a,3a-Dihydroxy-5a-cholestan-6-on in 10ml Nährlösung in einer 100-ml-Stoilbrustflasche, jedoch mit dom Stamm Mycobacterium fortuitum N3/138 konnte unter Boispiol 1 beschriebenen Formentations- und Extraktionsbedingungen dünnschichtchromatographisch dio Bildung von 2a,3a,6a-Trihydroxy-5a-androstan-17-on nachgewiesen werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 2a,3a,6a-Trihydroxy-5a-androstan-17-on_/gekennzeichnet dadurch, daß

- 2a,3a-Dihydroxy-5a-cholestan-6-on in feinverteilter Form in Konzentrationen bis zu 10g/l einem mit einem zum Steroi-Seitenkettenabbau befähigten bakteriellen Mikroorganismus beimpften Fermentationsmedium, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, zugesetzt,

- dieser Ansatz bei Temperaturen von 20⁰C bis 37°C für die Dauer von 24 Stunden bis 72 Stunden bei pH6 bis pH8 unter aeroben Bedingungen fermentiert sowie

- aus der Kulturbrühe die "nietverbindung auf extraktivem Wege gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß zur Fermentation ein Mikroorganismus der Gattung Mycobacterium eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur Fermentation ein Mikroorganismus der Art Mycobacterium vaccae eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch Ί und 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur Fermentation ein Mikroorganismus der Art Mycobacterium fortuitum eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß zur Fermentation der Stamm Mycobacterium vaccae L12 eingesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch, daß zur Fermentation der Stamm Mycobacterium fortuitum N 3/138 eingesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß 2a,3a-Dihydroxy-5a-cholestan-6-on

- als Lösung in einem organischen Lösungsmittel,

- als Ultraschallsuspension,

- als mittels Naßvermahlung hergestellte Präparation,

- als mittels Mikronisation hergestellt·} Präparation oder

- als mittels Sprühtrocknung hergestellte Präparation
zugesetzt wird.