DD292675A5 - Verfahren zur herstellung von 1,4-dehydro-11 alpha-hydroxysteroiden der pregnanreihe - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 1,4-Dehydro-11a-Hydroxysteroiden der Pregnanreihe aus 1,4-Dehydro-11-desoxysteroiden. Es ist dadurch gekennzeichnet, dasz die Ausgangsstoffe, die veresterte Hydroxylgruppen enthalten koennen, mit Absidia repens unter streng aeroben Bedingungen in einem p H-Bereich von 4 bis 6 hydroxyliert werden.
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist die Hydroxylierung von 12,4-Dehydro-11-desoxysteroiden der Pregnanreihe zu den entsprechenden 11a-0H-Derivaten.1,4-Dehydro-1 la-hydroxysteroide der Pregnanreihe eignen sich bevorzugt als Zwischenbzw. Schlüsselprodukte für Arzneimittel zur Behandlung der rheumatischen Arthridis, des Asthmas und anderer Krankheiten, sie sind essentiell im Arzneimittelsortiment. Die mikrobielle Hydroxylierung zur Einführung einer OH-Gruppe in die 11a-Position gestattet die Bereitstellung der benötigten Wirkstoffe der Pregnanreihe der Steroide. Sie macht ihre Produktion ökonomisch vertretbar.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Die Einführung einer Sauerstoffunktion in 11-Stellung durch Fungi ermöglicht die ökonomische Herstellung der Corticosteroide. Von den zahlreichen mikrobiellen Hydroxylierungen am Steroidgerüst besitzen die 11a und dia 11ß-Hydroxylierungen die größte Bedeutung.
No! rnalerweise verfährt man bei der Gewinnung der 11a-hydroxylierten Produkte der Steroide der Pregnanreihe so, daß man einem ausgewählten Mikroorganismus in einer geeigneten physiologischen Entwicklungsphase ein 11-Desoxysteroid der Pregnanreihe in einer der Transformation zugänglichen Darreichungsform bietet, nach vollständiger Transformation das Iia-OH-Steroid der Pregnanreihe extrahiert und isoliert. Die vorwiegend erhaltenen Haviya^i-Trihydroxy^-pregnan-S^O-dione werden vorteilhaft auf chemischem Wege zu Cortison und durch Derivatisierung mit den bekannten chemischen und biologischen Methoden zu Predniso- u.a. überführt.
Als Einsatzsubstanz für die Hydroxylierung haben sich Verbindungen durchgesetzt, die im Α-Ring des Moleküls zwischen den C-Atomen 1 und 2 keine Doppelbindung besitzen. Neben Progesteron wird für die industrielle Herstellung fas! ausschließlich Reichsteins Verbindung S (17,21-dihydroxy-4-pregnen-3,20-dion) umgesetzt. Als Mikroorganismen dienen Pilze der Gattungen:
Absidia
Aspergillus
Rhizopus
Calonectria
Cunninghamella.
Aus der Literatur ist bekannt, daß sich 1,4-Dehydro-i 1 -desoxysteroide der Pregnanreihe für eine ökonomische mikrobieile Hydroxylierung in 11a-Stellung nicht eignen.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, mit einem ausgewählten Pilz bzw. dessen Enzymsystem in konventioneller Fermentationsweise der Batch-Kultur oder der semikontinuierlichen bzw. kontinuierlichen Fermentationsführung und/oder mit immobilisierten Zellen, Sporen oder Konidien des Mikroorganismus im trägerfixiertem Zustand 1,4-Dehydro-11 -desoxysteroide der Pregnanreihe in 11 a-Steli .ng zu hydroxylieren. Die Auswahl des geeigneten Mikroorganismus ist sozu treffen, daß neben den Eigenschaften, die eine ökonomische Herstellung der A1,4-Dehydro-11a-hydroxysteroide der Pregnanreihe garantieren im Enzymbesteck neben der 11 a-Hydrolase Esterasen enthalten sind, so daß der alternative Fermentationsweg zur freien Ha-hydroxylierten Verbindung oder den gewünschten Estern der 1,4-Dehydrosteroide der Pregnanreihe gewählt werden kann. Das Verfahren muß insgesamt eine ökonomische Herstellung des 1,4-Dehydro-11a-hydroxysteroids der Pregnanreihe gestatten, einen Steroiddurchsatz von bis 10 g/l Kulturlösung garantieren, wobei relativ einfache in 17-Stellung substituierte Steroide als Ausgangssubstanzen dienen, die Zahl der Nebenprodukte gering ist und ihr mengenmäßiger Anteil bei der Isolierung nicht stört.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Mit der Erfindung wird die Aufgabe gelöst(mit einem ausgewählton Mikroorganismus 1,4-Dehydro-11-desoxysteroide ökonomisch günstig in 11a-Stellung zu hydroxylieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 11α-Hydroxysteroiden der Pregnanreihe ist dadurch charakterisiert, daß 1,4-Dehydro-11 -desoxysteroide, die in anderen Positionen veiesterte Hydroxylgruppen enthalten können, mit einem Pilz transformiert werden. Es wurde gefunden, daß sich speziell dL Art
Absidia repens, vanTiegham 1876(Nr.22O)
zur Einführung der Hydroxylgruppe in die 11α-Position eignet. Der gefundene* Pilz besitzt außerdem Esterasen, so daß die Ester bzw. Acetate der 1,4-Dehydro-11 -desoxysteroide als Ausgangssubstanzen dienen können, wenn man die freien Verbindungen der in 11 α-Stellung hydroxylierten Steroide erhalten will. Außer der angegebenen Art der Gattung Absidia können andere aus der Literatur bekannte und für die 11α-Hydroxylierung befähigte Pilze für die Erfindung genutzt werden. Es wurde weiterhin gefunden, daß die Transformation zur Einführung einer 11a-Hydroxylgruppe in der stationären Wachstumsphase bei einer Wasserstoffionenkonzentration von pH4 bis 6 unter streng aeroben Bedingungen vorgenommen werden muß. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, zur Einführung der 1 Ία-Hydroxylgruppe das Mycel in Form der Pellets wachsen zu lassen, um bei kurzen Transformationszeiten hohe Substratdurchsätze zu erhalten. Das Mycel kann in der Form der Pellets zu wiederholten Hydroxylierungen unter aseptischen Bedingungen genutzt werden.
Die Phase der optimalen Ha-Hydroxylierung der 1,4-Dehydro-11-desoxysteroide ist erreicht, wenn mit den analytischen Methoden:
- keine Kohlenhydrate
- kein organischer und anorganischer Stickstoff mehr nachzuweisen ist und
- die Wasserstoffionenkonzentration einen pH-Wert von 4 bis 6 erre cht hat.
Die Ausgangssubstanzen der 1,4-Dehydro-11 -desoxysteroide werden mikronisiert oder in einem geeigneten Lösungsmittel wie Aceton, Dimethylformamid-Wasser-Gemisch gelöst, zugegeben. Besondere Eignung zur Zugabe haben methanolische CaCI2-Lösungen, in denen die Lösung des Ausgangssteroides bei Zimmertemperatur möglich ist.
Die Zugabe kann während des Rührstadiums der Submerskultur erfolgen, es ist aber auch möglich, beim optimalen Mycelstadium die Biomasse von der Kulturlösung abzutrennen und die Pellets in einem Medium zu resuspendieren, das frei von Kohlenhydrat und Stickstoffverbindungen ist.
Für die Erfindung ist durch die Wahl des Mikroorganismus, einem Fhycomyceden der Gattung Absidia durch die Fermentationsführung ein Regime gegeben, daß hohe Ausbeuten von 1,4-Dehydro-i 1 a-hydroxysteroicen der Pregnanreihe gestattet, Es wurden vollständige Transformationen der Ausgangssteroide der Pregnanreihe erzielt, Durchsätze von 5g bis 10g
Ausführungsbeispiele
1.1. Inkubation von i-Dehydro-RSS-17-acetat mit Absidia repens 220
Laborfermentation
2,51 Steilbrustflaschen mit 500ml Nährlösung folgender Zusammensetzung:
| Maisquellwasser (100% Trockengewicht) | 0,3% |
| Pepton (für bakt. Zwecke) | 0,2% |
| MgSO4 | 0,025% |
| KH2PO4 | 0,025% |
| Aquadest | auf 11 |
| pH 5,2 bis 5,4 |
werden mit 10% einer 22 h alten Kultur der gleichen Nährlösung beimpft, die bei 25°C ± 0,50C auf einer Rotationsschüttelmaschine kultiviert wurde (240UZmJn, Amplitude: 4cm). 50ml dieser Kultur genügen zur Beimpfung von 500ml Nährlösung der Transformationsstufe in den 2,5-l-Kulturflaschen. Die Kulturbedingungen sind:
Temperatur: 250C ± 10C
Nach 32- bis 36stündigem Wachstum hat sich das Mycel in Form von Pellets entwickelt, der Feuchtmycelgehalt beträgt 15 bis 17,5% (3000U/min über 3min). Zu diesem Zeitpunkt erfolgt die I.Zugabe von 125mg 17-Acetoxy-21 -hydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion, gelöst in 2,5ml methanolischer CaCI2-Lösung unter aseptischen Bedingungen. Dieser Prozeß wird in Abstand von je 3 Stunden noch 3mal wiederholt, so daß in einem Ansatz von 500ml 500mg 17-Acetoxy-21-hydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion enthalten sind.
Der Transformationsverlauf wird mit dünnschichtchromatographischen Methoden verfolgt, er wird beendet, wenn keine Einsatzsubstanz mehr nachweisbar ist.
Nach vollständigem Umsatz wird der Versuch aufgearbeitet.
Nach Abfiltrieren des Mycels wird das Kulturfiltrat dreimal mit 5Vol.-% Methylisobutylketon extrahiert.
Die vereinigten Extrakte werden in Vakuum zum Öl eingeengt und danach in 25ml Methanol gelöst. Nach dem Abfiltrieren der unlöslichen Bestandteile wird zur Trockne unter verminderten Druck eingeengt, der Rückstand in 10ml Essigester gelöst, kalt mit 10ml 0,1 η Natriumhydroxid-Lösung und anschließend mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen.
Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird die organische Phase im Vakuum bis zur beginnenden Kristallisation eingeengt.
Nach 24 Stunden bei 5°C wird das Rohkristallisat abfiltriert und mit kaltem Essigester gewaschen. Das Rohkristallisat wird aus 4,5ml Essigester umkristallisiert.
Das so erhaltende Produkt besteht aus 379mg 17-Acetoxy-11a,21-dihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion. Aus der Mutterlauge können weitere 83mg n-Acetoxy-Ha^i-diriydroxY-pregna-i/l-dien-S^O-dion isoliert werden, so daß die Gesamtausbeute auf 89% der Theorie steigt.
1.2. Inkubation von i-Dehydro-RSS-17-acetat mit Absidia repens 220 im Fermenter <2g/l Kulturlösung) 31 Nährlösung folgender Zusammensetzung:
| Glucose | 0,5% |
| Maisquellwasser | 0,75% |
| Pepton (f. bakt. Zwecke) | 0,05% |
| MgSO4 | 0,025% |
| ZnSO4 | 0,012% |
| KH2PO4 | 0,05% |
| AntaphronR | 0,005% |
| Leitungswasser | |
| pH 5,2 bis 5,5 |
Btii 26°C wird mit 0,31 eine Impfkultur (24 Stunden alt) beimpft, dessen Nährlösung die Zusammensetzung wie bei 1.1. (submerse Vorzuchtstufe) hat. Nach einer Wachstumsphase von 33 h (Rührung: 620 U/min; Belüftung: 11 Luft/11 Kulturlösung/min. Temp.: 26°C) ist ein Wachstum von 15 bis 17,5% Biomasse (3000U/min/3Min. lang) in Form der Pellets erreicht, ein pH-Wert von 4 bis 6 und eine NH4-Konzentration von 35 bis 50mg/l zu der Kulturlösung gegeben. Die Wasserstoffionenkonzentration wird während des gesamten Transformationsverlaufes bei pH4 bis 6 gehalten. Die Zugabe von 6g 17-Acetoxv-21-hydroxv-pregna-1,4-dien-3,20-dion gelöst in methanolischer CaCI2-Lösung erfolgt 35 Stunden nach der Beimpfung über einen Zeitraum von 18 Stunden. Die Transformation wird (wie bei 1.1. beschrieben) kontrolliert. In der Regel ist bei Einhaltung des Fermentationsregims das Ausgangsmaterial 24 bis 36 Stunden nach Ende der Zugabe umgewandelt. Die Aufarbeitung erfolgt nach Beispiel 1. Man erhält nach Vakuumdestillation 4,87g 17-Acetoxy-11a,21-dihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion, was einer Ausbeute von 78% entspricht.
1.3. Inkubation von 17,21-Diacetoxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion mit Absidia repens (220) Dio Bedingungen der Transformation und Fermentation entsprechen 1.1.
Gleichfalls erhält man nach Aufarbeitung entsprechend Beispiel 1.1.332mg n-Acetoxy-Ha^i-dibydroxy-pregna-M-dien-3,20-dion (Ausbeute d.Th.: 70,7%)
1.4. Inkubation von 17a,21 -(1 -Ethoxy-ethyliden-dioxy)-pregna-1,4-dien-3,20-dion mit Absidia repens 220
Die Bedingungen des Umsetzungsprozesses entsprechen 1.1. Der I7a,21-Orthoester ist gelöst in Ammoniakalischer Methanollösung. Nach Aufarbeitung erhält man 388 mg 17-Acetoxy-11,a-dihydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion (Ausbeute: 80%).
epi-Prednisolon wird erhalten, wenn man wie bei 1.1. und 1.2. verfährt und als Pilz Absidia repens 220 unter streng aeroben
pH-Bereich über 7,0, bevorzugt bei 7,5 bis 8,5 und bei einer Temperatur von 27,5 bis 28"C geführt.
extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und im Vakuum zurTrockne eingeengt. Der Rückstand wird in 28ml warmen Butylacetatmit 1 Vol.-% Methanol gelöst und über einer Kieselgelsäule fraktioniert. Die Fraktionen werden dünnschichtchromatographischüberprüft, vereinigt und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird aus 2,3ml Methylenchlorid umkristallisiert.
dien-3,20-dionmiteinerAusbeutevon33%.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von 1,4-Dehydro-i 1a-hydroxysteroiden der Prognanreihe aus 1,4-Dehydro-11-desoxysteroiden, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsstoffe, die in anderen Positionen veresterte Hydroxylgruppen enthalten können, mit einem Phycomyceten dem Pilz AbsidiarepensvonTieghem 1876 (Nr. 220) unter streng aeroben Bedingungen hydroxyliert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wasserstoffionenkonzentration 4 bis 6 betragen muß.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD28331485A DD292675A5 (de) | 1985-11-27 | 1985-11-27 | Verfahren zur herstellung von 1,4-dehydro-11 alpha-hydroxysteroiden der pregnanreihe |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD28331485A DD292675A5 (de) | 1985-11-27 | 1985-11-27 | Verfahren zur herstellung von 1,4-dehydro-11 alpha-hydroxysteroiden der pregnanreihe |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD292675A5 true DD292675A5 (de) | 1991-08-08 |
Family
ID=5573434
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD28331485A DD292675A5 (de) | 1985-11-27 | 1985-11-27 | Verfahren zur herstellung von 1,4-dehydro-11 alpha-hydroxysteroiden der pregnanreihe |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD292675A5 (de) |
-
1985
- 1985-11-27 DD DD28331485A patent/DD292675A5/de not_active IP Right Cessation
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